Спосіб мікробіологічного знезараження тромбоцитів

Спосіб інактивації мікробіологічних забруднювачів у препаратах, виготовлених із тромбоцитів крові людини, який включає - отримання тромбоцитів крові, які можливо забруднені мікроорганізмами, - обробку вищезгаданих тромбоцитів людини фіксатором протягом часу, що достатній для їх фіксаЧ"> - висушування вищезгаданих тромбоцитів з отриманням фіксованих сухих тромбоцитів крові, причому Даний винахід відноситься до способу отримання та очищення від мікробних забруднювачів сухих фіксованих кров'яних пластинок (тромбоцитів), придатних для використання у лікуванні людей Концентрати тромбоцитів успішно застосовуються у переливанні крові вже протягом тридцяти років Проте, швидка втрата функціональної активності під час зберігання та ризик бактеріального забруднення дуже ускладнює ефективний облік та зберігання концентратів тромбоцитів у банках крові У багатьох випадках обмежені терміни зберігання концентратів тромбоцитів значно зменшують - вищезгадану обробку проводять протягом часу, що достатній для того, щоб знищити вищезгадані мікроорганізми і - вищезгадану обробку проводять протягом часу, що недостатній для того, щоб вищезгадані тромбоцити втратили такі властивості, як а) адгезія дотромбогенних поверхонь, б) відсутність адгезії до нетромбогенних поверхонь, в) зміну форми (округлення) під час адгезії до тромбогенних поверхонь, г) агрегацію та формування гемостатичного згустку під час контакту з тромбогенними поверхнями, д) викид вмісту внутрішніх гранул 2 Спосіб за п 1, де вищезгадані мікроорганізми обираються з групи, що складається з бактерій та вірусів 3 Спосіб за п 1, де вищезгадану обробку проводять, змішуючи вищезгадані тромбоцити з розчином, що містить згаданий фіксатор 4 Спосіб за п 1, де висушування проводять шляхом люфілізацм 5 Спосіб за п 1, де згаданий фіксатор обирається з формальдегіду, параформальдегіду та глутаральдепду 6 Спосіб за п 1, де фіксатор є перманганатом 7 Спосіб за п 1, де після фіксації тромбоцити стабілізують альбуміном 8 Спосіб за п 1, де після фіксації тромбоцити стабілізують трегалозою рівень їх використання Е Клейн (Е Klein et al , J Pediatrics 49, 517522, (1956)), описав приготування люфілізованих препаратів тромбоцитів та їх застосування у лікуванні дітей з гострою лейкемією та апластичною анемією При цьому введення супроводжувалося болем та спазмами судин у МІСЦІ інфекції Обмежену ефективність застосування таких препаратів продемонстровано в таблиці 2 згаданої роботи Упродовж більше, ніж ЗО років застосування, такі препарати тромбоцитів не показали задовільних терапевтичних результатів З метою зробити використання концентратів О C O (О Ю 56131 тромбоцитів у переливанні крові більш зручним для банків крові, виник значний інтерес у розробці засобів для усунення або принаймні зменшення втрати функціональної активності концентратами тромбоцитів під час зберігання Один ПІДХІД полягав у створенні вільного від плазми середовища для зберігання (S Holme, US Patent №4695460) Інший ПІДХІД полягав у розробці біохімічних технологій для стабілізації тромбоцитів (A Bode et al , US Patent №4994367) Хоча ці підходи забезпечують корисне продовження терміну зберігання, вони не дозволяють збільшити термін зберігання на значний період часу Врешті, було описано приготування мікровезикул з тромбоцитарних мембран, виходячи з, серед інших, прострочених препаратів тромбоцитів (F Chao, US Patent №5185160) Описано використання висушених фіксованих тромбоцитів у діагностиці (Bnnkhous et al , US Patent №4287087) Такі сухі фіксовані препарати тромбоцитів можуть зберігатися протягом значного часу для діагностичних цілей, проте раніше вони не мали форми, придатної для фармацевтичного використання Таким чином, все ще існує потреба у розробці нових засобів приготування кров'яних тромбоцитів, які мали б довгий термін зберігання та були придатними для використання у лікуванні людей Сухі фіксовані тромбоцити та спосіб їх приготування було описано раніше (М Read et al , РСТ Application W093/23997, опубліковано у грудні 1993 Р) Даний винахід відноситься до способу інактивації мікробіологічних забруднювачів у препаратах тромбоцитів крові людини Спосіб включає, поперше, отримання тромбоцитів, зокрема тромбоцитів людини, можливо забруднених мікроорганізмами (бактерії, віруси) Тромбоцити обробляють фіксатором протягом часу, достатнього для фіксації тромбоцитів Після фіксації тромбоцити переважно промивають та висушують для отримання сухих фіксованих тромбоцитів Час фіксації тромбоцитів підбирається таким чином, щоб його було досить також для знищення частини або всіх мікроорганізмів, які забруднюють препарат Однак, час фіксації підбирається також таким чином, щоб він був недостатнім для втрати тромбоцитами після висушування та ресуспендування наступних властивостей 1) адгезія до тромбогенних поверхонь, 2) відсутність адгезії до нетромбогенних поверхонь, 3) зміна форми (округлення) під час адгезії до тромбогенних поверхонь, 4) агрегація та формування гемостатичного згустка під час контакту з тромбогенними поверхнями, 5) викид вмісту внутрішніх гранул Іншими словами, тромбоцити мають залишатися життєздатними після процедури фіксації Ці та ІНШІ аспекти даного винаходу детально пояснюються нижче Приготування бюфармацевтичних препаратів на основі крові потребує усунення або знищення принаймні кількох логарифмічних циклів мікробної інфекційності У випадку часткового знищення (ба ктеріцидні та віроцидні методи) або повного знищення (процеси стерилізації) така інактивація дає гарантію, що кінцевий продукт не містить побічних агетів, включаючи забруднювачі, які можуть надходити з вихідним матеріалом Спосіб згідно даного винаходу можна здійснювати з використанням фіксатору, який обирають серед формальдегіду, параформальдегіду та глутарового альдегіду Фіксація такими сполуками потребує ретельної модифікації способу, описаного у US Patent №4287087, щоб запобігти втрати життєздатності тромбоцитів В цілому, ВІДМИТІ тромбоцити фіксують шляхом їх інкубації, звичайно при кімнатній температурі, до 60 хвилин (переважно від ЗО до 45 хвилин, внаслідок того, що деякі віруси потребують для інактивації всього ЗО хвилин) у 1,8% розчині фіксатора (переважно від 1 до 2% фіксатора) Як детальніше обговоритиметься нижче, достатня фіксація також необхідна, щоб запобігти небажаного лізису під час подальшого етапу висушування Може бути застосована альтернативна техніка фіксації тромбоцитів шляхом їх інкубації у розчині перманганату, (наприклад, перманганату натрію або перманганату калію) В цілому, згідно вказаної методики, ВІДМИТІ тромбоцити шкубують у розчині КМпО4 або NaMnO4 з концентрацією від 0,01 до 10г/л протягом 5-20 хвилин, переважно у розчині КМпО4 або NaMnO4 з концентрацією від 0,05 до 5г/л протягом 5-15 хвилин, найкраще у розчині КМпО4 або NaMnO4 з концентрацією від 0,05 до 0,5г/л протягом 8-12 хвилин Для приготування фармацевтичних сполук препарати тромбоцитів обов'язково мають бути очищені від сторонньої речовини, зокрема від лізованих тромбоцитів, які можуть бути джерелом вільних тромбогенних факторів при введенні пацієнтові Таким чином особливу увагу слід приділити достатній фіксації тромбоцитів (без порушення життєздатності за вищевказаними характеристиками) перед висушуванням В іншому випадку процес висушування може супроводжуватися небажаним лізисом Наприклад, препарати тромбоцитів, що придатні для приготування фармацевтичних сполук для людини, характеризуються такими показниками при розведенні до концентрації 109 тромбоцитів на 1мл розчину-не більше 107 мікрочастинок (фрагментованих залишків лізованих тромбоцитів) на 1мл та не більше 150 міжнародних одиниць (IU) на літр лактатдегідрогенази у супернатанті при ресуспендуванні та осадженні (лактатдегідрогеназа у концентрації 2200іи/л повністю лізує 109 клітин у 1 мл) Висушування тромбоцитів після фіксації може бути проведене одним з придатних способів, але переважно здійснюється шляхом люфілізацм Слід приділити увагу стабілізації тромбоцитів перед висушуванням, щоб запобігти небажаного лізису Стабілізація здійснюється, наприклад, шляхом ресуспендування тромбоцитів у розчині, який містить молекули придатного замісника води ("стабілізатора"), такого як альбумін або трегалоза, та подальшого висушування розчину На практиці застосовують розчин альбуміну у масовій концентрації від 0,1 до 20%, переважно розчин альбуміну у масовій концентрації від 1 до 10%, найкраще 56131 розчин альбуміну у масовій концентрації від 5 до 10% Для застосування у лікуванні важливе значення має видоспецифічність альбуміну (наприклад, для людини - людський альбумін) В іншому випадку, для стабілізації можна застосовувати альбумін іншого виду з подальшим його вилученням Перед введенням суб'єкту у препарат додають видоспецифічний альбумін Щоб запобігти антигенних реакцій у суб'єкта лікування, треба подбати про повне очищення препарату від видонеспецифічного альбуміну Фармацевтичні препарати згідно даного винаходу можуть складатися просто з сухих (переважно люфілізованих) тромбоцитів, вільних від пірогенів, стерильних та у стерильній антисептичній упаковці Препарати можуть також містити альбумін, як було зазначено вище Фармацевтичні суміші можуть також містити препарат тромбоцитів згідно даного винаходу, ресуспендований у фармацевтичне придатному ноем В ролі такого носія може бути використаний будь-який водний носій, здатний пдратувати тромбоцити таким чином, щоб вони мали вищезгадані характеристики та придатний для внутрішньовенної інєкцм (наприклад, стерильний, вільний від пірогенів фізіологічний сольовий розчин) Суспендована суміш також може містити ІНШІ додаткові агенти, такі як буферні розчини, консерванти та ІНШІ фармацевтично активні речовини (див US Patent №4994367, зміст якого приведено вище) Для лікування хворих людей фармацевтичні суспензії згідно даного винаходу звичайно застосовують у вигляді внутрішньовенних ІН'ЄКЦІЙ Такого лікування потребують пацієнти, які страждають на тромбоцитопенію, геморагічну дисфункцію тромбоцитів, а також важкотравмовані пацієнти, які зазнали великої втрати крові Доза фармацевтичного препарату буде залежати від ваги та стану пацієнта, та звичайно складатиме від 20 до 350мл за об'ємом у концентрації від 1 х109 до 3x109 тромбоцитів на 1 мл (найкраще від 2x109 до 3x109 тромбоцитів на 1мл) Фармацевтичні препарати можуть бути розфасовані у стерильні, ВІЛЬНІ ВІД пірогенів контейнери у дозованих об'ємах Даний винахід детальніше описано у наступних прикладах Ці приклади ілюструють винахід, але ніяким чином не обмежують його Приклад 1 Приготування сухих фіксованих тромбоцитів А Приготування люфілізованих тромбоцитів людини (Протокол 1) Тромбоцити отримують, виходячи з суміші крові та розчину кислого цитрату декстрози (ЦД) в ролі антикоагулянту (0.085М цитрат натрію, 0.0702М лимонної кислоти, 0,111М декстрози, рН=4,5) у співвідношенні атникоагулянт-кров 1 5,66 Тромбоцити виділяють шляхом диференційного центрифугування та відмивають кислим цитратним буфером (0.00544М цитрату натрію, 0.154М NaCI, pH доводять до 6,5 за допомогою 0,1Н НС1) Після відмивання тромбоцити фіксують, інкубуючи тромбоцити, які отримано з ЮОмл крові, у 5,0мл 1,8% розчину параформальдегіду (приготований, виходячи з 9,0мл 4% розчину параформальдегіду, додаючи 1,0мл ЦД та 10мл 0.135М C^) протягом 45 хвилин при кімнатній тем пературі (час фіксації можна збільшити до 60 хвилин) Альтернативний спосіб полягає в інкубації відмитих тромбоцитів, отриманих з ЮОмл крові в 1% розчині параформальдегіду протягом 45 хвилин при кімнатній температурі (час фіксації можна збільшити до 60 хвилин) Для усунення параформальдегіду після інкубації у кожну пробірку додають рівну КІЛЬКІСТЬ ІМІдазольного сольового буферу (0.084М імідазолу, 0.146М NaCI, pH доводять до 6,8 за допомогою 1,0Н НСІ) Після ЦЬОГО тромбоцити осаджують центрифугуванням при 1500д протягом 8 хвилин при кімнатній температурі Супернатант зливають, а осад тромбоцитів промивають, ресуспендуючи його в 5-1 Омл імідазольного буферу, рН=7,35 Промивання повторюють ще ДВІЧІ ДЛЯ ПОВНОГО видалення параформальдегіду Після третього промивання тромбоцити ресуспендують у 5% розчині сироваткового альбуміну (5г альбуміну на ЮОмл цитратного буферу 0.0054М цитрату натрію, 0.154М NaCI, pH 6,5) Тромбоцити підраховують, використовуючи фазовоконтрастний мікроскоп та гемоцитометр (American Optical Bright-Line Hemocytometer) Концентрацію тромбоцитів доводять до 800000 на мм Аліквоти ПО Ю М Л суспензії тромбоцитів доведеної концентрації у розчині сироваткового альбуміну вносять у скляні пробірки та заморожують до -70°С Потім тромбоцити люфілізують протягом 12 годин до отримання розсипчастого білого порошку Препарати тромбоцитів також можуть бути заморожені у більших об'ємах (від 100 до 500мл) та люфілізовані протягом 4 годин при температурі 40°С, після чого на решту часу висушування температуру підвищують до -25°С Люфілізовані продукти зберігають при температурі від -20°С до 70°С до використання Люфілізовані тромбоцити репдратують у 0.084М імідазольному безсольовому буфері, рН якого доводять до 7,35 за допомогою 1,0М NaOH Після додавання імідазольного буферу суміш залишають на декілька хвилин, потім обережно перемішують, обертаючи пробірки, для отримання гомогенної суспензії репдратованих окремих тромбоцитів Б Приготування люфілізованих тромбоцитів людини (Протокол 2) Цілісну кров отримують від здорових добровільних донорів у стандартні контейнери для збирання крові (Fenwal 4R6402, Baxter Health Care), які містять стандартну КІЛЬКІСТЬ антикоагулянту (CPDA-1) Кінцевий об'єм кожного зразку отриманої крові після змішування з цитратом становить 500см3 Кожний контейнер з ЦІЛІСНОЮ кров'ю центрифугують для отримання збагаченої тромбоцитами плазми, яку вилучають з контейнерів та відмивають, проводячи три цикли центрифугування/ресуспендування у фосфатному буферному розчині (такому, як описано у пункті А) Після ЦЬОГО ВІДМИТІ тромбоцити осаджують центрифугуванням, та обробляють осад буферним розчином, що містить 1,8% параформальдегіду (описаного у пункті А), протягом 45 хвилин-1 години при кімнатній температурі Вихід тромбоцитів після вилучення стабілізуючого агенту та подальшого промивання для видалення параформальдегіду складає 60-80% від вихідної КІЛЬКОСТІ, 56131 підрахованої перед стабілізацією Якщо буферний розчин, яким промивають тромбоцити після стабілізації, не містить альбуміну, відсоток виходу тромбоцитів зменшується Склад суспензії тромбоцитів перед заморожуванням та висушуванням є важливим для отримання необхідного кінцевого виходу тромбоцитів В цілому, для забезпечення виходу 85-100% після процедури люфілізацм та репдратацм необхідно, щоб буферний розчин містив ефективну КІЛЬКІСТЬ стабілізатору, такого як альбумін або трегалоза Альбумін вводять у концентрації від 1 до 500г/л, переважно у концентрації від 10 до 250г/л, найкраще у концентрації від 50 до 100г/л Трегалозу вводять у концентрації від 0,1 до 10М, переважно у концентрації від 0,2 до 5М, найкраще у концентрації від 0,5 до 1,0М Можна застосувати декілька типів депдратуючих розчинів без помітної різниці кінцевих параметрів фосфатний сольовий буферний розчин, рН=7,3, трис-сольовий буферний розчин, рН=7,4, імідазольний сольовий буферний розчин, або UNISOL™ збалансований фізіологічний сольовий розчин Приклад 2 Очищення тромбоцитів від бактерій Метою цього експерименту було дослідження кінетики інактивації бактерій 1,8% розчином формальдегіду під час процесу консервації тромбоцитів Дванадцять контейнерів тромбоцитів були отримані від Американського Червоного Хреста Bacillus cereus були введені в кожний контейнер до отримання колонієутворюючих одиниць (КО) у кінцевій концентрації 50КО/мл у всіх контейнерах З вмісту шести контейнерів приготували люфілізовані препарати тромбоцитів згідно прикладу 1 (протокол 1) та повернули їх у нові контейнери для зберігання тромбоцитів Шість інших зразків залишились у вихідних зберігальних контейнерах Щоденно протягом семи днів у всіх контейнерах КІЛЬКІСНО оцінювали рівень росту бактеріальних культур (розсівання 0,1 мл суспензії після серії розведень на чашки з агаром та інкубація протягом 48 годин при температурі 37°С, зразки продубльовано) В результаті спостерігали ріст Bacillus cereus на всіх шести зразках, що зберігались за нормальних умов, але не на оброблених тромбоцитах У другому експерименті шість контейнерів з тромбоцитами були інокульовані Staphylococcus epidermis у кінцевій концентрації 50КО/мл Вміст кожного контейнеру розділили на дві рівні частини Одну частину з кожного контейнеру обробили згідно прикладу 1 (протокол 1) та повернули після цього у нові контейнери для зберігання Решту зразків зберігали за нормальних умов В результаті на необроблених зразках усіх контейнерів на третій день спостерігали ріст S epidermis У попередніх експериментах було показано, що ураження препаратів тромбоцитів, інокульованих 5 epidermis у кінцевій концентрації 50КО/мл, спостерігалося у 100% випадків на 7 день (М Вгеcher et al , Trnsfusion 34, 750-755 (1994)) Фіксовані та ВІДМИТІ згідно прикладу 1 тромбоцити залишились стерильними протягом всіх 7 днів спостереження 8 Приклад З Очищення тромбоцитів від вірусів В цьому експерименті модельні віруси, що репрезентують широкий спектр вірусних характеристик, були випробувані на інактивацію через п'ять різних проміжків часу при інкубації у 1,8% розчині параформальдегіду згідно прикладу 1 Для досліду були обрані наступні віруси, які представляють спектр біофізичних та структурних рис, що можуть відображувати характеристики потенційних забруднювачів вихідного матеріалу 1) Вірус діареї великої рогатої худоби (BVD, штам КУ-22)-розмір 40-70нм, має ліпідну оболонку, РНК-вмісний вірус Останні дослідження вірусного геному та фізичні характеристики вірусу гепатиту С (HCV, відомий як гепатит ні-А ні-В) показали, що він належить до родини флавовірусів, роду пестівірусів Зважаючи на те, що HCV не може бути культивований in vitro, та для нього не існує придатних модельних тварин, крім шимпанзе, BVD був використаний як модель HCV в даному експерименті 2) Вірус енцефаломюкардиту (ЕМС, штам ЕМС)-розмір 28-ЗОнм, не має ліпідної оболонки, РНК-вмісний пікорнавірус, дуже стійкий до багатьох стандартних методів інактивації вірусів Цей вірус належить до тієї ж родини, що й вірус гепатиту А та є, ВІДПОВІДНО, непоганою моделлю для нього 3) Вірус імунодефіциту людини (HIV, штам HTLV-IIIBJ-розмір 80-ЮОнм, має оболонку, РНКвмісний ретровірус, є потенційним забруднювачем крові людини HIV було титровано in vitro синцитіальним методом СЕМ-А Через 7-10 днів після інфікування HIV клітини СЕМ-А утворюють багатоядерні клітини (синцитії), які легко спостерігаються Всі роботи з HIV проведено на спеціалізованому обладнанні BCL-3 (Biotech) І Методика А Матеріали АЛІКВОТНІ проби стерильного вихідного продукту (тромбоцитів у цитратному сольовому буферному розчині) приготували за описаною вище методикою Контрольний матеріал зберігали при температурі від 22°С до 28°С Аліквоти 4% параформальдегіду, 0.135М буферний розчин фосфату натрію, буферний розчин ЦД та імідазольний сольовий буферний розчин зберігали при кімнатній температурі Б Дослідження токсичності В попередньому дослідженні було перевірено токсичність контрольного матеріалу на індикаторних клітинах ВТ-1, які використовували для титрування BVD, індикаторних клітинах VERO, які використовували для титрування ЕМС та індикаторних клітинах СЕМ-А, які використовували для титрування HIV-1 Для кожного вірусу було перевірено на цитотоксичністьтакі ДОСЛІДНІ зразки 1) розчин тромбоцитів перед обробкою параформальдегідом, 2) розчин тромбоцитів після обробки 1,8% розчином параформальдегіду На початку аналізу 1,8мл дослідного зразку І (PV-001) обробили 0,2мл суспензії вірусу в буфері, потім додали 1,8мл 4% розчину параформальдегіду Таким чином створено зразки PV-004, PV-006 56131 та PV-008 Другу аліквотну пробу приготували, обробивши 3,3мл вихідного розчину тромбоцитів (PV-001) 0,7мл суспензії вірусу в буфері Таким чином створено зразки PV-003, PV-005 та PV-007 Усі зразки перевірено в двох екземплярах на цитотоксичність на ВІДПОВІДНИХ індикаторних клітинах Перевіряли нерозведені розчини, розведені у 10 разів та розведені у 100 разів (в мінімальному середовищі Ігла (ЕМЕМ)) ВІДПОВІДНО стандартного протоколу титрування кожного вірусу (див Розділ 4 60) Якщо внаслідок дії зразку, злиття моношару індикаторних клітин було меншим 50%, то такий зразок вважали цитотоксичним За результатами попереднього дослідження токсичності, проби, що містили параформальдегід, показали досить високий ступінь цитотоксичності Тому взяли додаткові зразки, що містили тромбоцити, оброблені параформальдегідом, але параформальдегід було видалено шляхом центрифугування та промивання Такі зразки аналізували безпосередньо, без зараження, за методикою, описаною вище Таким чином створено зразки PV032, PV-033 та PV-034 В Дослідження шактиваційних властивостей Для кожного з вірусів, що аналізувалися, контроль проведено в таких точках 1)Т 0 , 2) То 5-30 хвилин, 3) Т-і=1 година, 4) Ті 5=1 година ЗО хвилин, 5) Тг=2 години Вихідний продукт (3,6мл тромбоцитів у цитратному сольовому буферному розчині), температура якого була 25±3°С, обробили 0,4мл вірусу з високим титром Рівень рН зразку довели до 6,87,6, та зразок поділили на дві рівні аліквотні проби Одну з проб одразу ж заморозили до температури -70°С або нижче для того, щоб використати її як дублікат Паралельно зробили аналіз іншої аліквотної проби, використовуючи відповідну методику вірусного титрування, як описано нижче у розділі Д Таким чином створено зразок "То" 21,6мл вихідного продукту (тромбоцити у цитратному сольовому буферному розчині) центрифугували протягом 8 хвилин при 800д та при температурі 25±3°С для осадження тромбоцитів Приготували свіжий 2% розчин параформальдегіду, змішавши 12,5мл 4% розчину параформальдегіду з 11,5мл 0,135М фосфатного буферного розчину та 1,0мл буферного розчину ЦД Після того, як видалили цитратний сольовий супернатант, осаджені тромбоцити ресуспендували у 21,6мл свіжого 2% розчину параформальдегіду Таку тромбоцитарну суспензію обробили 2,4мл вірусу з високим титром, довівши таким чином концентрацію параформальдегіду до 1,8% Вихідний продукт, що обробили 1,8% розчином параформальдегіду, поділили на чотири аліквоти, три об'ємом по 4мл і одну об'ємом 10л Після цього зразки шкубували на водяній бані з температурою 25±3°С За змінами температури спостерігали та реєстрували Для створення зразків То 5, лина) взяли аліквоти об'ємом аліквоти об'ємом 4мл додали сольового буферного розчину Ті та Т-і 5 (± 1 хвипо 4мл До кожної 4мл імідазольного Ці зразки тричі пе 10 ремішали, перевертаючи, і центрифугували протягом 8 хвилин при 800д та при температурі 25±3°С Супернатант злили та тромбоцити ресуспендували у 4мл імідазольного сольового буферного розчину Зразки тричі перемішали, перевертаючи, і центрифугували протягом 8 хвилин при 800д та при температурі 25±3°С Цю процедуру повторили ще ДВІЧІ Після останнього центрифугування тромбоцити ресуспендували у 4мл імідазольного сольового буферного розчину Зразок поділили на дві рівні частини Одну з частин одразу ж заморозили до температури -70°С або нижче для того, щоб використати и як дублікат Паралельно зробили аналіз іншої аліквотної проби, використовуючи відповідну методику вірусного титрування, як описано нижче у розділі Д Для аналізу на BVD та ЕМС 0,5мл розведених та нерозведених зразків нанесли у кожну з трьох лунок до кінцевого об'єму 1,5мл Для аналізу на HIV, 0,2мл розведених та нерозведених зразків нанесли у кожну з чотирьох лунок до кінцевого об'єму 0,8мл Для створення зразку І2 (±1 хвилина) вийняли зразок об'ємом Юмл До кожної аліквоти об'ємом Юмл додали Юмл імідазольного сольового буферного розчину Ці зразки перемішали, перевертаючи, три рази і центрифугували протягом 8 хвилин при 800д та при температурі 25±3°С Супернатант злили та тромбоцити ресуспендували у Юмл імідазольного сольового буферного розчину Зразки перемішали, перевертаючи, три рази і центрифугували протягом 8 хвилин при 800д та при температурі 25±3°С Цю процедуру повторили ще ДВІЧІ Після останнього центрифугування тромбоцити ресуспендували у Юмл імідазольного сольового буферного розчину Зразок поділили на дві рівні частини Одну з частин одразу ж заморозили до температури -70°С або нижче для того, щоб використати її як дублікат Паралельно зробили аналіз іншої частини, використовуючи відповідну методику вірусного титрування, як описано нижче у розділі Д Для аналізу на BVD та ЕМС, 0,5мл нерозведених зразків нанесли у кожну з восьми лунок до кінцевого об'єму 4мл Для аналізу на HIV, 0,2мл нерозведених зразків нанесли у кожну з двадцяти лунок до кінцевого об'єму 4мл Усі розведені зразки наносили у лунки, як описано для перших чотирьох часових точок Г Контроль (1) Позитивний контроль Як позитивний контроль для кожного вірусу використовували материнський розчин вірусу (2) Негативний контроль Як негативний контроль в кожному аналізі використовували чисте середовище для культивування клітин, яке застосовували при титруванні вірусів Д Титрування вірусів На початку процедури одну аліквотну пробу від кожного зразку та контролю розвели у середовищі для культивування клітин у таких пропорціях 10° в 3 рази, 10 , 10 2, Ю 3 , Ю 4 , Ю 5 , Ю 6 , Ю У т а 10 е Кожне розведення аналізували на присутність інфекційних вірусних часточок, використовуючи стандартну процедуру вірусного титрування, яка описана нижче для кожного вірусу BVD кожне розведення зразків, які містять 56131 12 11 BVD, аналізували на присутність інфекційних віруТест виявився валідним Позитивний контроль сних часточок за допомогою тесту на стерильні виявив ознаки інфекційних вірусів, і негативний плями з використанням індикаторних клітин ВТ контроль не виявив вірусів EMC кожне розведення зразків, які містять Б Дослідження токсичності ЕМС, аналізували на присутність інфекційних віруРезультати дослідження токсичності на індисних часточок за допомогою тесту на стерильні каторних клітинних ЛІНІЯХ ВТ, СЕМ-А та VERO, що плями з використанням індикаторних клітин VERO використовувалися для титрування вірусів, подано в Таблиці 1 Вимивання параформальдегіду після HIV кожне розведення зразків, які містять HIV, обробки ним тромбоцитів, значно знижує токсичаналізували на присутність інфекційних вірусних ність, яка спричинена такою обробкою (PV-032, часточок за допомогою синцитіального тесту з PV-033 та PV-034) Усі дослідження вірусів прововикористанням СЕМ-А індикаторних клітин дили, використовуючи таке вимивання II Результати та пояснення А Валідність Таблиця 1 Результати дослідження токсичності Номер зразку PV-003 PV-004 PV-032 PV-005 Pv-006 PV-033 PV-007 PV-008 PV-034 Опис зразку Розчин тромбоцитів перед обробкою параформальдегідом Розчин тромбоцитів після обробки 1,8% розчином параформальдегіду Після вимивання параформальдегіду Розчин тромбоцитів перед обробкою параформальдегідом Розчин тромбоцитів після обробки 1,8% розчином параформальдегіду Після вимивання параформальдегіду Розчин тромбоцитів перед обробкою параформальдегідом Розчин тромбоцитів після обробки 1,8% розчином параформальдегіду Після вимивання параформальдегіду В Дослідження шактиваційних властивостей Титри вірусів у кожному зразку та контрольному зразку для дослідження шактиваційних властивостей вказано в таблицях 2-4 Титр вірусів виражено через КІЛЬКІСТЬ плямоутворюючих одиниць (ПО) на 1 мл або КІЛЬКІСТЬ синцитій-формуючих одиниць (СО) на 1 мл Якщовиявлено менше 5ПО(СО) у 1мл або не виявлено зовсім, титри вірусів виражали як