Спосіб пригнічення життєдіяльності мікроорганізмів блокуванням сигнатурних послідовностей їх рибосомальних рибонуклеїнових кислот комплементарними (антисигнатурними) олігодезоксирибонуклеотидами

Винахід відноситься до області бактеріології - тієї її галузі, яка має на меті створення таких хімікотерапевтичних засобів контролю за життєдіяльністю мікроорганізмів (у тому числі збудників захворювань людини, тварин і рослин), до яких у останніх не вироблялася б стійкість, як це спостерігається у відношенні антибіотиків. Він полягає у використанні в клітинах мікроорганізмів в якості мішеней особливих ділянок рибосомальних рибонуклеїнових кислот (рРНК) - так званих сигнатурних послідовностей (СП) та синтезі комплементарних до них олігонуклеотидів (антисигнатурних олігонуклеотидів - АСО), при взаємодії яких буде селективне пригнічуватись життєдіяльність відповідних видів мікроорганізмів. Областями використання винаходу можуть стати охорона здоров'я, ветеринарія, сільське господарство, галузі науки і біотехнологічних виробництв, в яких застосовуються культури тканин і гібридоми, та де потрібний точний контроль за життєдіяльністю певних видів мікроорганізмів. Принцип використання синтетичних олігонуклеотидів, механізм дії яких базується на явищі їх комплементарності у відношенні до своїх мішеней, не новий і був запропонований ще в 1978 році [1]. З тих пір на цю тему опубліковано багато робіт, узагальнених і детально проаналізованих у двох фундаментальних публікаціях [2], [3]. У винахідницькому (патентоспроможному) плані розробки, створення і використання антисенсових олігонуклеотидів узагальнені та запатентовані в США в 1990 р. [4]. Остання публікація про створення і використання антимікробних антисенсових олігонуклеотидів з'явилась в 1996 р. [5]. Однак до сих пір всі дослідження, розробки і публікації відносились до створення олігонуклеотидів, комплементарних до відповідних ділянок геномної ДНК чи окремих ділянок відповідних інформаційних рибонуклеїнових кислот (iРНК). Через те, що ці ділянки ДНК і ІРНК несуть відповідне інформаційне, чи, іншими словами, сенсове навантаження, такі олігонуклеотиди були названі антисенсовими. Однак практика показала, що для використання антисенсових олігонуклеотидів необхідно подолати багато перепон, які в сумі стають неподолані. В першу чергу необхідно досягти надійного закріплення олігонуклеотиду на мішені (ДНК чи ІРНК), щоб він не був "скинутий" з ДНК потужними в енергетичному відношенні реплікативним або транскрипційним комплексами ферментів, а з ІРНК -рибосомами в процесі трансляції. В нативному стані (у вигляді фосфодіефіру), чи навіть в модифікованому для захисту проти нуклеаз, олігонуклеотиди нездатні утриматись ні на ДНК, ні на ІРНК. Для підвищення стабільності утворених антисенсовими олігонуклеотидами з мішенями дуплексів їх необхідно модифікувати інтеркаляторами. Через те, що інтеркалятори мають великий ступінь спорідненості до нуклеїнових кислот, модифіковані ними синтетичні олігонуклеотиди катастрофічне втрачають свою специфічність і адресну спрямованість: вони набувають здатності взаємодіяти з нуклеїновою кислотою будь-якого походження, в т.ч. і з нуклеїновими кислотами організму, який необхідно звільнити від збудника відповідного захворювання. Через втрату такими антисенсовими олігонуклеотидами специфічності і смислової спрямованості їх використання як терапевтичних препаратів втрачає сенс. Певної, але не абсолютної, стабільності дуплексів досягають подовженням ланцюга синтетичного олігонуклеотиду (більше 20 нуклеотидів у молекулі), як це робили цитовані вище Rapaport et al. (1996 p.). Однак цей шлях у кілька разів здорожує синтез олігонуклеотидів. Але головний недолік у використанні антисенсових олігонуклеотидів полягає, як і у випадку з антибіотиками, у швидкій мінливості мішеней через мутацію і появу у мікроорганізмів стійкості до препаратів. Таким чином, перед розробниками нових ген-спрямованих засобів для хіміотерапії інфекційних захворювань мікробної етіології стоїть задача знайти такі мішені в мікроорганізмах, які були б практично незмінні в часі, видо- або родоспецифічні і щоб на них не функціонували ніякі ферментні системи. Рибосомні рибонуклеїнові кислоти (рРНК) є такими лінійними однонитковими мішенями: 1) на них не працюють ферментні системи, бо основна їх функція слугувати основою (каркасом) рибосомних субодиниць; 2) видоспецифічність рРНК давно встановлена і широко використовується в методі ідентифікації мікроорганізмів за допомогою рибосомальних зондів; 3) рРНК - найбільш консервативні біологічні молекули (практично незмінні в часі, через що використовуються як молекулярні годинники при вивченні еволюції всіх організмів на Землі). Отже, при використанні рРНК як мішеней надбання стійкості до антимікробних засобів, комплементарно взаємодіючих з цими молекулами, неможливе. Використання рРНК як мішеней для олігонуклеотидних хіміотерапевтичних антимікробних препаратів привабливе ще й тому, що незважаючи на консерватизм їх молекул у їх складі є менш консервативні ділянки, саме в яких і закодована специфічність відповідного рівня: видового, родового або навіть штамового. Ці ділянки називаються "сигнатурними" (signature = підпис). Мікроорганізм цими ділянками ніби підписується: "Я саме той, кого Ви шукаєте". Враховуючи такі унікальні властивості сигнатурних ділянок рРНК ми вперше запропонували їх як мішені для контролю життєдіяльності мікроорганізмів за допомогою комплементарних до них антисигнатурних синтетичних олігодезоксирибо-нуклеотидів (АСО), що і є суттю даного винаходу. Слід зазначити, що спроби використання окремих ділянок рРНК мікроорганізмів як мішеней для боротьби з шкідливими представниками царства прокаріот були описані в літературі і раніше. Роботи були спрямовані на використання в якості мішені З'-кіцевої відкритої послідовності 168 рРНК. Однак ця несигнатурна послідовність надто консервативна, і "розрізняє" мікроорганізми лише на рівні їх забарвлювання по Граму. У грам-позитивних бактерій вона представлена послідовністю 3'-UCCU (UCCUCC) ACUAG-5', а у грам-негативних - 3'-AU (UCCUCC) ACUAG-5'. Лише 3'-кінцевими основами (у першому випадку - 3'-UCCU-5', а у другому - 3'-AU-5') відрізняються ці послідовності у Грам+ і Грамбактерій, а решта основ у них ідентичні, в тому числі і послідовність З'-UCCUCC-S' (подана в дужках), комплементарна до так званої послідовності Шайна-Далгарно (5'-AGGAGG-3') інформаційних РНК (ІРНК). Блокування цієї послідовності комплементарними олігонуклеотидами запобігає приєднанню до 3'-кінця 16S рРНК інформаційних РНК, їх трансляції на рибосомах і синтезу білка. Танігучі і Вейсман [6], а також Екхард і Лурман [7], які першими звернули увагу на 3'-кінцеву послідовність 16S рРНК як можливу мішень, досягли за допомогою комплементарних до неї синтетичних пентануклеотидів 70% пригнічення зв'язування ІРНК з рибосомами в системі in vitro. В 1981 році інша група дослідників [8] повторно звернулась до 3'-кінцевої послідовності 16S рРНК Е.соlі і досягла в неклітинній системі майже 90% пригнічення синтезу білка, а в клітині - майже 50%. Однак враховуючи високий консерватизм 3'-кінцевої послідовності 16S рРНК мікроорганізмів та відсутність в ній якої-небудь видової специфічності, дослідники втратили до неї інтерес, як і до 16S рРНК в цілому, як можливої мішені. Інші, відкриті на рибосомах ділянки цієї нуклеїнової кислоти, навіть не розглядались в якості мішеней через їх надзвичайну консервативність. Видо- і родоспецифічні ділянки (сигнатурні послідовності) 16S рРНК у всіх мікроорганізмів приховані рибосомними білками і недосяжні для комплементарних олігонуклеотидів у зібраних рибосомах. Тому вони не розглядались дослідниками як можливі мішені. Така, в основному, була ситуація з розробкою та використанням олігонуклеотидів, як засобів антимікробної терапії, на той час, коли автори пропонованого винаходу приступили до створення антисигнатурних олігонуклеотидів. Значно кращий стан справ у розробці антисенсових олігонуклеотидів для контролю за збудниками окремих вірусних захворювань. Вже створені олігонуклеотиди проти вірусів саркоми Рауса, герпесу, віспи, папіломи, кліщового енцефаліту, ВІЛ та ін. Однак вони ще не доведені навіть до клінічних випробувань. Лише у випадку з мієлогенною лейкемією олігонуклеотиди успішно пройшли дві стадії клінічних випробувань на хворих з гострою формою цієї хвороби. В модельних дослідах антисенсові олігонуклеотиди успішно пригнічували розвиток фібросарком, карцином, меланом і, навіть атеросклерозу, а також збудників таких паразитарних захворювань, як малярія (Plasmodium falciparum) та лейшманіоз (Leishmania amazonensis). Через 10 років дослідники знову звернули увагу на З'-кінцеву послідовність 16S рРНК, комплементарні послідовності Шайн-Далгарно на ІРНК, як можливу мішень для синтетичних олігонуклеотидів з метою контролю за життєдіяльністю мікроорганізмів, і за допомогою трьох-, п'ятиланкових олігомерів було досягнуто повного інгібування росту Е.соlі [9]. В розвиток цього в 1998 році в США був зареєстрований патент W09814567 "Methods and Composition for inhibition bacterial growth", автори якого P.Wisniowski та M.William звернулись до 3'-послідовності 16S рРНК і запропонували комплементарні до послідовності Шайна-Далгарно на ІРНК олігонуклеотиди, як засіб для пригнічення синтезу білків у мікроорганізмів, а отже, і пригнічення життєдіяльності збудників бактеріальних інфекцій. Цей винахід, в якому за мішень використовується (розглядається) надзвичайно консервативна послідовність молекули 16S рРНК мікроорганізмів, можна розглядати як найбільш близький аналог пропонованого нами винаходу, де також використовується молекула 16S рРНК, проте інші по локалізації, властивостям і функції її послідовності. Інших аналогів, де б використовувались в цій якості які-небудь послідовності 16S рРНК просто не існує в природі. Щодо патенту WO9811114567, як найбільш близького аналога, відзначимо, що цьому винаходу властиві всі недоліки, відмічені нами при аналізі публікацій, цитованих вище. Найбільш суттєвим з них є неспецифічність дії. Олігонуклеотиди, комплементарні до послідовності Шайна-Далгарно, через консервативну природу цієї послідовності (вона в усіх мікроорганізмів має однакову структуру), яку ми наводили вище, з однаковим успіхом пригнічують ріст як шкідливої, так і корисної (резидентної) мікрофлори. Селективність цих олігонуклеотидів у відношенні різних видів мікроорганізмів дорівнює нулю, і їх дія в зв'язку з цим може бути порівняльна з антибіотиками широкого спектру дії, (наприклад, цефалоспорини), при використанні яких разом з виліковуванням відповідного інфекційного захворювання розвивається дисбактеріоз, який теж необхідно довго і трудно лікувати. При місцевому використанні таких олігонуклеотидів (у вигляді примочок), а також для деконтамінації культур клітин, користь від них буде очевидною. Крім висококонсервативної 3'-кінцевої послідовності 16S рРНК, яка, як показано вище, не є специфічною чи селективною мішенню, на молекулі цієї нуклеїнової кислоти можна знайти багато аналогічних мішеней. Так, ми пробували використовувати як мішені несигнатурні послідовності 1009-1017 и 1024-1035 на молекулі 16S рРНК. Виявилось, що синтетичний олігонуклеотид 5'-GTTAAGCTC-3', комплементарний до послідовності 1009-1017, пригнічував ріст усіх досліджуваних молікутів і деяких грампозитивних і грам-негативних бактерій і проявляв деяку специфічність на рівні порядку, або навіть класу молікутів. Олігонуклеотид 5'-TGCACCACCTGT-3', комплементарний до послідовності 1024-1035 16S рРНК, проявляв загальномікробну дію, пригнічуючи ріст молікутів, інших досліджуваних бактерій, в тому числі молочнокислих, що відносяться, як відомо, до резидентно'! мікрофлори. Практично він мав таку ж специфічність дії, як і олігонуклеотиди - предмет патенту WO9814567, тобто йому не була властива навіть мінімальна спеціалізація у відношенні різновидності бактерій. Пропонований нами винахід позбавлений наведених вище недоліків. Сигнатурним послідовностям 16S рРНК (а, природно, і антисигнатурним олігонуклеотидам) властивий відповідний (заданий) рівень специфічності: видової, родової, сімейної. Використовуючи цю якість можна створити олігонуклеотиди антивидові, які будуть пригнічувати ріст лише одного виду мікроорганізму, не завдаючи шкоди іншим видам, навіть якщо вони відносяться до одного роду; антиродові, які будуть пригнічувати ріст усіх представників даного роду; антисімейні, що спрямовані проти усіх представників сімейства, и т.д. Такі олігонуклеотиди не будуть подавляти ріст мікроорганізмів, якщо останні не знаходяться у відповідних родинних відношеннях з тими мікроорганізмами, проти яких дані олігонуклеотиди були розроблені. Таким чином, пропоновані антисигнатурні олігонуклеотиди, на противагу антисуперконсервативним олігонуклеотидам, які пропонують автори патенту W09814567, суперспецифічні терапевтичні засоби, направлені на пригнічення життєдіяльності відповідних видів мікроорганізмів шляхом адресного блокування унікальних для кожного виду (або роду, чи сімейства та ін.) послідовностей на рибосомальних РНК, в результаті чого запобігається самозбирання рибосом і повністю виключається синтез білка в клітині мікроорганізму. Запобігання самозбирання рибосом - це основна відмінність в механізмі дії антисигнатурних олігонуклеотидів, пропонованих нами, від тих олігонуклеотидів, які пропонують автори патенту WО9814567 - найближчого і єдиного аналога нашого винаходу. Запропоновані його авторами олігонуклеотиди не впливають на процес самозбирання рибосом, а пригнічують трансляцію інформаційних РНК на рибосомах і синтез білка шляхом блокування прикріплення цих молекул до 3'-кінцевих послідовностей 16S рРНК. Задачею даного винаходу є створення комплементарних до пропонованих нами мішеней олігонуклеотидів, взаємодія яких дозволить селективне інгібувати ріст конкретних збудників, не наносячи шкоди корисним мікроорганізмам, і до яких не могла б вироблятися стійкість. Сигнатурні ділянки рРНК, які відображають в собі видову або родову специфічність мікроорганізмів, якраз і є тими мішенями про які мріють хіміотерапевти. Ці мішені лінійні, невеликі (від 7 до 14 нуклеотидів в ланцюзі), функціонально значимі (з ними взаємодіють білки, з котрих починається самозбирання рибосом). Антисигнатурні олігонуклеотиди, комплементарні (в залежності від потреби) до видо-, родо-, або сімейно-специфічних "сигнатурних" послідовностей, при взаємодії з останніми запобігають посадці на рРНК рибосомальних білків, які носять назву "серцевинних", і з яких починається самозбирання рибосом, чим повністю блокують цей процес, тотально зупиняючи синтез білка в мікробній клітині. Вирішення поставленого завдання базувалось на нашому досвіді використання розробленого іншими авторами методу рибосомальних зондів для видової ідентифікації мікроорганізмів і, зокрема, молікутів [Ю], [11]. При цьому нами було відмічено, що окремі ділянки рибосомального оперону мають різний рівень специфічності: починаючи від сімейного і закінчуючи навіть такою вузькою специфічністю як штамова. Це наштовхнуло нас на думку, що використовуючи ці ділянки як мішені, особливо ділянки рибосомальних кислот, які транскрибуються з цих ділянок, і які є однонитковими, лінійними ланцюгами нуклеотидів різної довжини, можна створити антимікробні засоби різного призначення: а) для контролю за життєдіяльністю окремих видів мікроорганізмів, чи окремих представників (штамів) цих видів; б) для контролю за життєдіяльністю групи споріднених видів мікроорганізмів, тобто цілого їх роду; в) для контролю за життєдіяльністю представників декількох родів окремих мікроорганізмів, тобто цілих їх окремих сімейств та ін. Виходячи з властивостей унікальних сигнатурних ділянок рРНК можна розробити антимікробний засіб зі заздалегідь заданим спектром дії. Враховуючи унікальні властивості сигнатурних послідовностей, вони пропонуються нами вперше як мішені для контролю за життєдіяльністю мікроорганізмів за допомогою блокування їх за рахунок уотсонкриківських взаємодій комплементарними (антисигнатурними) до цих послідовностей синтетичними олігодезоксирибонуклеотидами, які теж пропонуються нами вперше, що є суттю вирішення задачі даного винаходу. Для того, щоб викликати загибель любого мікроорганізму достатньо створити в його клітинах умови неможливості самозбирання 30S субодиниці рибосоми. Процес трансляції і синтез білка в клітині при цьому повністю припиняється і мікроорганізм гине. Структурою, на базі якої здійснюється самозбирання 30S субодиниці рибосоми, є 16S рРНК. Як тільки після транскрипції рибосомного оперону 16S рРНК вирізається з попередника, на ній уже в цей момент знаходяться в зв'язаному стані білки - ініціатори самозбирання рибосомної частинки. До них відносяться білки S4, S20, S13, S8, S15 і S17 (перелічені в порядку черговості їх взаємодії з 16S рРНК), місцями посадки яких як раз і є сигнатурні послідовності 16S рРНК. Враховуючи те, що згадані білки (їх називають серцевинними) взаємодіють з 16S рРНК - саме з тими її ділянками, які є сигнатурними послідовностями, то блокуючи ці ділянки комплементарними (антисигнатурними) до них синтетичними олігонуклеотидами можна запобігти посадці на них білків, зупинити процес самозбирання 30S субодиниці рибосоми і, таким чином, повністю призупинити синтез білка в клітині. Наприклад, білок S4 першим взаємодіє з 16S рРНК. З нього починається самозбирання субодиниці 30S рибосоми, і на ньому розташовані місця, до яких прикріплюються інші білки, в тому числі і ті, які безпосередньо не взаємодіють з 16S рРНК. Якщо заблокувати лише ті послідовності 16S рРНК, з якими взаємодіє цей білок, то можна запобігти самозбиранню 30S субодиниці рибосоми, повністю виключивши процес синтезу білка в клітині мікроорганізму, викликавши його загибель. Зокрема, у таких шкідливих мікроорганізмів, як молікути (мікоплазми), які викликають багато захворювань людини, теплокровних тварин, комах і рослин, і є головними контамінантами культур клітин і гібридом, білок S4 зв'язується з послідовностями, що утворюють "шпильку" в 16S рРНК, і складаються з одного боку з послідовності S'-GCCAACGG (CUAACUAUG) UG-3', а з протилежного (комплементарного) - з послідовності 5'-(UAAUACAUAG) GUGGC-3', у яких взяті в дужки послідовності є сигнатурними для цього класу мікроорганізмів: у першому випадку це послідовності 16S рРНК під номерами 499-507, а в другому 523-532. Основною проблемою даного винаходу був пошук саме сигнатурних послідовностей 16S рРНК. Для того, щоб ідентифікувати сигнатурні послідовності ми отримували препарати міченої t32?] 16S рРНК мікроорганізмів. Для цього останніх вирощували на середовищах, на яких ті чи інші мікроорганізми давали найбільший врожай клітин. Бактерій вирощували на синтетичних середовищах без фосфору. Молікутів, що ростуть лише на збагачених органічними добавками середовищах (гідролізат дріжджів, триптичний перевар м'язу серця бика, сироватка крові коня та ін.), вирощували на спеціально створеному для цього класу мікроорганізмів середовищі СМІМВ-72 [12]., яке на сьогодні стало загальноприйнятим серед спеціалістів. Середовище попередньо дефосфорилювали по методу Кімбала та ін.[13]. Дефосфорильоване середовище СМІМВ-72 для молікутів і синтетичні середовища для бактерій збагачували аденозином, гуанозином, цитидином, уридином (кожного нуклеозиду по 20 мг на 1л середовища) і тимідином (10мг на 1л). Приготовлені таким способом поживні середовища розливали по 300 мл в колби, засівали відповідним видом мікроорганізму і вирощували в умовах, оптимальних для досліджуваного виду організму (температура, аерація, освітлення). На ранній стадії лаг фази росту в середовище вносили [32РO4] з розрахунку 100 мкСі/мл (1,0 Сі =3,7 х 1010 бекерелів). Клітини мікроорганізмів збирали центрифугуванням, відмивали від середовища водним розчином 0,24 М NaCI і руйнували загальноприйнятими способами. Мічену 168 рРНК екстрагували фенольним методом, виділяли електрофорезом в поліакриламідному гелі і проводили доочистку на колонці, заповненій целюлозою CF-11 (Whatman), як описано в посібнику [14]. Кожний отриманий таким чином препарат міченої [32P] і очищеної 16S рРНК розщеплювали рибонуклеазою Т1 за методом, описаним у вищезгаданому посібнику. Рибонуклеаза Т1 специфічно діє на 3'-фосфатні групи гуанозинових нуклеотидів і розщеплює 5'фосфатний зв'язок з сусіднім нуклеотидом. Кінцевими продуктами реакції є гуанозин-3'-фосфати і олігонуклеотиди з кінцевими гуанозин-3'фосфатними групами. Ці продукти розділяли, як описано у вищезгаданому посібнику (Molecular cloning, див. вище) і секвенували за допомогою двоспрямованого електрофорезу за методом Сенгера і співавт. (J.Mol.Biol.,1965,v.13, P.373-398) в модифікації Вуза і співавт. [15]. Одержані дані про склад і порядок нуклеотидів у ланцюзі кожного з олігонуклеотидів, що складають молекулу 16S рРНК досліджуваних мікроорганізмів і що закінчуються гуаніловою кислотою на З'-кінці, порівнювали з каталогами олігонуклеотидів 16S рРНК інших мікроорганізмів. Такі каталоги отримували з банків даних Національного центру біотехнологічної інформації США і Європейської молекулярнобіологічної лабораторії. В результаті були встановлені сигнатурні послідовності в складі 16S рРНК бактерій Escherichia со//, Bacillus subtilis, Agrobacterium tumefaciens та багатьох штамів різних видів молікутів (мікоплазм). Наприклад, найбільш значимі для молікутів (блокування яких комплементарними до них синтетичними олігонуклеотидами викликає загибель цих мікроорганізмів) є послідовності, перелік яких подано в таблиці 1. Таблиця 1 Деякі сигнатурні послідовності 16S рРНК молікутів і комплементарні (антисигнатурні) до них олігонуклеотиди № пп Структура сигнатурної послідовності 1 2 3 4 5 6 7 8 5'-AA(U)5CACAAUG-3' 5'-CUAACUAUG-3' 5'-UAAUACAUAG-3' 5'-CAAAUAG-3' 5'-AUACCCUAG-3' 5'-UACUAAG-3' 5'-UUCUCG-3' 5'-UAUCCCUACG-3' Кількість Локалізація основ у послідовності на 16S послідовності рРНК (№ основ) 14 355-368 9 499-507 10 523-532 7 771 -777 9 784-792 7 816-822 6 1357-1363 10 1486-1496 Структура синтетичного антисигнатурного олігонуклеотиду 5'-CATTGTG(A)5TT-3' 5'-CATAGTTAG-3' 5'-CTATGTATTA-3' 5'-CTATTTG-3' 5'-CTAGGGTAT-3' 5'-CTTAGTA-3' 5'-CGAGAA-3' 5'-CGTAGGGATA-3' Описаний вище спосіб встановлення сигнатурних послідовностей у мікроорганізмів достатньо громіздкий, методично складний і можна стверджувати, що він зжив себе. Зараз в згаданих вище банках є дані якщо не про структуру молекул 16S рРНК і сигнатурних послідовностей багатьох відомих і шкідливих для людини мікроорганізмів, то, у крайньому випадку, про структуру рибосомального оперону того чи іншого мікроорганізму. Ці дані при необхідності ми без проблем одержували. їх можуть одержати звідти і всі бажаючі. Якщо ці дані ми одержували з банку даних у вигляді сиквенсу рибосомального оперону мікроорганізмів, в т.ч. ділянки, яка кодує 16S рРНК, то переводили дані про склад і порядок основ в цих ділянках з ДНКового коду на рибонуклеїновий і, виходячи зі знання механізму дії рибонуклеази Т1, здійснювали комп'ютерний сиквенс 16S рРНК і одержували олігонуклеотиди з кінцевими гуанозин-3'-фосфатними групами. З цього набору олігонуклеотидів відбирали за допомогою комп'ютерної програми Infor Max Vector NNI Suite "сигнатурні" послідовності. Їх довжина складала від 6 до 14 нуклеотидів у ланцюзі, а в кількісному відношенні від усієї маси отриманих олігонуклеотидів їх було біля 25%. Зараз дані про структуру рибосомальних оперонів, 16S рРНК, або каталоги їх сигнатурних олігонукпеотидів практично будь-якого з мікроорганізмів можна одержати з Національного центру біотехнологічної інформації США (GenBANK) (URLhttp: //www.ncbi.nlm.nih.gov; e-mail: gbsub@ncbi.nlm.nih.gov); Європейської молекулярно-біологічної лабораторії (EMBL) (URL:http://www.ebi.ac.uk; e-mail: datasubs@ebi.ac.uk); Бази даних Японії (DDBJ) (URL:http://www.ddbj. nig.ac.jp.a6o http: //www.genome.ad.jp; e-mail: ddbjub@ddbj.nig.ac.jp); і Франції (URL:http:// genolist.pasteur.fr), а також з приватних банків. Наприклад: http:www.tigr.org /tdb/mdb/hidb. Через адресу http://www.genome.ad.jp, наприклад, ми одержали інформацію про структуру рибосомального оперону Mycobacterium tuberculosis. Після переводу даних про структуру його ділянки, що кодує 16S рРНК (всього 1537 нуклеотидів) з ДНКового коду на РНКовий, і проведення комп'ютерного сиквенсу, як описано вище, був одержаний каталог з 97 олігонуклеотидів, 23 з яких виявились різного рівня сигнатурності (сімейного, родового або видового). Кожний вид мікроорганізму має такий набір сигнатурних послідовностей. Видоспецифічні сигнатурні олігонуклеотиди виду Mycobacterium tuberculosis мають унікальну структуру. Олігонуклеотиди, розміщені в ділянках 16S рРНК, які взаємодіють з серцевинними білками, мають структуру, що відрізняється від структури аналогічних олігонуклеотидів, які знаходяться в цих ділянках 16S рРНК інших мікооооганізмів, в тому числі і у молі кутів. (Таблиця 2). Таблиця 2 Структура сигнатурних послідовностей 16S рРНК Mycobacterium tuberculosis, розміщених в ділянках, ідентичних до ділянок 16S рРНК молікутів №пп Локалізація сигнатурної послідовності на 16S рРНК (№ основ) Структура сигнатурної послідовності Кількість основ у ланцюзі послідовності 1 2 3 4 503 - 509 524 - 534 769 - 777 816-821 5'-CACACAG-3' 5'-CCUAUCUCUAG-3' 5'-CUCCCCACG-3' 5'-CCUUCG-3' 7 11 9 6 З наведених прикладів видно наскільки унікальними для мікроорганізмів є сигнатурні послідовності їх 16S рРНК і, природно, наскільки ж специфічною, цілеспрямованою буде дія антисигнатурних олігонуклеотидів: вони будуть діяти лише на конкретний вид мікроорганізмів, або групу споріднених видів мікроорганізмів, не наносячи шкоди корисній і резидентній мікрофлорі. Синтез комплементарних до сигнатурних послідовностей олігодезоксирибо-нуклеотидів (антисигнатурних олігонуклеотидів) здійснювали різними, описаними в літературі та, у ряді випадків, модифікованими нами методами. Антисигнатурні олігонуклеотиди були синтезовані у вигляді фосфодіефірів (природної ДНК), тіо- і дитіофосфатних та метилфосфонатних аналогів олігодезоксирибонуклеотидів. Синтез природних олігодезоксирибонуклеотидів здійснювали твердофазним Н-фосфонатним методом (Nucl.Acid.Res.-1986.-14,№13.-Р.5399-5407), синтез тіо- і дитіофосфатних аналогів олігонуклеотидів блочним методом у розчині по модифікованій триефірній методиці (Tetrahedron Lett.-1990.-31(14).-P.19531956; Биоорг.химия.-1990.-16(№7).-С. 1574-1576; там же - 1992.-18(4).-С.550-553) з використанням мономерів, захищених по міжнуклеотидних фосфатах і екзоциклічних аміногрупах основ. Після видалення всіх захисних груп цільовий тіофосфат виділяли іонообмінною хроматографією, а дитіофосфат - препаративним гель-електрофорезом в 20 % поліакриламідному гелі, що містив 7 М сечовину. Синтез метилфосфонатних аналогів олігонуклеотидів здійснювали згідно з описаним методом (Биоорг.химия.-1989.-15(2).-С.267-276). Антисигнатурні синтетичні олігонуклеотиди (АСО) досліджували на такі характеристики: стійкість до нуклеазної активності, здатність проникати в мікробну клітину і активізація в ній РНКази Н, яка вирізає в клітині з нуклеїнових кислот гетеродуплекси (ДНК+ РНК), що утворюються, в тому числі і АСО з СП на 16S рРНК. Стійкість до дії нуклеаз у АСО вивчали в природних умовах: при дії на них живих клітин молікутів, які, як відомо, мають потужні комплекси неспецифічних РНКаз (Микробиол.журн„1991.-53(5).-С.26-30; там же 1992.-54(1).-С.58-61; там же 1993.-55(5).-С.25-30) і ДНКаз (Микробиол.журн.-1993.-55(1).-С.12-19; там же 1993.-55(3).-С. 17-24), які функціонують як внутріклітинне, так і позаклітинне. Результати вивчення стійкості до нуклеазного розщеплення на прикладі АСО, комплементарних до 355-368 послідовностей 16S рРНК, наведені в таблиці 3. Через те, що більшості мікроорганізмів властива фосфатазна активність, для захисту від фосфатаз 5'-кінцевого міченого фосфату олігонуклеотиди були синтезовані у вигляді 5'-бензиламідних фосфодіефірів метилфосфонатів, тіо- і дитіофосфатів (Биоорган.химия. -1986.-12,№4. -С. 475-481): Реагент: 1. 5'-BnzNHp*CATTGTG(A)5TTp-3' 2. 5'-BnzNHp*CATTGTG(A)5TTpSCH3-3' 3.5'-BnzNHp*CpsApsTpsTpsGpsTpsGps(Aps)5TpsTpSCH3-3' 4.5'-BnzNHp*CpssApssTpssTpssGpssTpssGpss(Apss)5TpssTpSCH3-3' де p*- [32Р]-фосфат; BnzNH - СН2С6Н5; С - цитозин; А - аденозин; Т - тимідин; G - гуанозин; Процент деградації АСО в клітинах Acholeplasma laidlawii і Mycoplasma fermentans № п.п. 1 2 3 4 Реагент 1 2 3 4 24 79,7 72,5 0 0 Інкубація АСО з клітинами, (год.) і деградація, (%) A.laidlawii M. fermentans 48 72 96 24 48 72 98,0 100,0 100,0 63,1 83,2 100,0 98,0 100,0 100,0 59,0 79,5 100,0 2 3 8 0 2 4 0 0 0 0 2 3 Таблиця 3 96 100,0 100,0 8 4 З отриманих даних видно, що тіо-, дитіофосфатні аналоги АСО достатньо стійкі до дії нуклеаз. Вони залишались стабільними протягом 96 год. (тривалість досліду). Крім того, як було встановлено окремими дослідами (які описувати тут немає потреби), тіо- і дитіофосфатні аналоги АСО, маючи негативно заряджений рибулозофосфатний скелет, цілеспрямовано взаємодіяли з клітинами мікроорганізмів і за рахунок активного АТФ-залежного транспорту легко проникали в них. Це не було властиво ні фосфодіефірам, ні метилфосфонатам. Завдяки цьому механізму тіо- і дитіофосфатні аналоги АСО накопичувались в клітинах мікроорганізмів у концентраціях в 104-105 разів вищих, ніж їх концентрація поза клітиною. Таким чином, тіо- і дитіофосфатні аналоги АСО при використанні навіть в наномолярних концентраціях можуть стати ефективним засобом пригнічення життєдіяльності мікроорганізмів завдяки здатності активно проникати в їх клітини і накопичуватися там. Мічені 5'-бензиламідні похідні АСО були використані лише з метою вивчення таких їх властивостей, як стабільність до дії нуклеаз, здатність проникати в клітини і накопичуватися в них, визначення для них мішеней в клітині та ін. Для пригнічення росту мікроорганізмів АСО використовували без мітки у вигляді тіоаналогів, наприклад, комплементарних до послідовностей 499-507 (нонануклеотид) і 524-533 (декануклеотид) на 16S рРНК молікутів: 5'-CpsApsTpsApsGpsTpsTpsApsGp-3' 5' -CpsTpsApsTpsGpsTpsApsTpsTpsAp-3' і дитіоаналогів: 5'-CpssApssTpssApssGpssTpssTpssApssGp - 3' 5'-CpssTpssApssTpssGpssTpssApssTpssTpssAp - 3' На вдалий вибір АСО, використаного для пригнічення росту мікроорганізмів впливає, в першу чергу, значимість послідовності(ей), котру вони повинні блокувати. Найбільш функціонально значимими послідовностями 16S рРНК звичайно є ті, з котрими взаємодіють "серцевинні" білки, наприклад, послідовності 499-507 і 523-532, з якими взаємодіє білок S4 - головний з "серцевинних" білків. Для порівняння в таблиці 4 наведені дані про пригнічення росту молікутів тіоаналогами АСО, комплементарними до послідовностей 499-507 і 523-532 на 16S рРНК і послідовності 355-368, з якою не взаємодіють "серцевинні" білки. АСО до цієї послідовності також був синтезований у вигляді тіофосфату. В таблиці АСО до послідовності 355-368 наведений як реагент 1; 499-507 - реагент 2; 523-532 - реагент 3; суміш реагентів 2 і 3 (по 50нМ кожного) - реагент 4. Концентрація кожного АСО в поживному середовищі складала 100 нМ. Таблиця 4 Пригнічення росту різних видів молікутів тіофосфатами АСО, комплементарними до "сигнатурних" послідовностей 16S рРНК різної функціональної значимості Використаний реагент і процент пригнічення життєдіяльності молікутів 1 2 3 4 1 Acholeplasma laidlawi 2 73 76 98 2 A.granulum 2 74 68 96 3 Mycoplasma pneumoniae 38 68 74 98 4 M.fermentans 40 76 78 98 5 M.capriocolum 35 62 67 95 6 M.hominis 37 76 78 98 Примітки: 1) Ріст молікутів спостерігався протягом 96 год. в оптимальних для росту умовах. 2) Ефективність дії АСО визначали по кількості живих клітин, утворюючих колонії одиниць у порівнянні з контролем, в якому АСО не використовували. № пп. Вид молікута Дитіофосфатні аналоги АСО по ефективності інгібування росту молікутів виявились ідентичними з тіофосфати и ми. Те, що в жодному випадку не було досягнуто 100% пригнічення росту молікутів пояснюється тим, що вони ростуть лише на тих середовищах, до складу яких входять нуклеїнові кислоти. В середовищі СМІМВ72, на якому проводились досліди, присутні як мінімум Імг/мл екзогенних нуклеїнових кислот, які, звичайно, конкурують з АСО в процесі їх засвоєння тестованими мікроорганізмами, знижуючи ефективність цих препаратів. Крім того, АСО взаємодіють лише з синтезованою "de novo" 16S рРНК, і ця кислота недосяжна для них у вже зібраних рибосомах. Клітини інокуляту містять готові рибосоми і, природно, 96 год. недостатньо для того, щоб ці рибосоми перестали повністю існувати. Після 96 год. живі клітини молікутів з такими рибосомами впадають в анабіоз, і "оживають" лише при висіванні на свіже середовище, і враховуються при підрахунку колоній, які утворюються залишками живих клітин, так званими колонієутворюючими одиницями (КОО). Це пояснює неможливість досягнення 100% пригнічення росту молікутів у таких дослідах. Тандемне (спільне) використання двох коротких антисигнатурних олігонуклео-тидів (реагент 4), комплементарних до послідовностей 499-507 і 523-532 16S рРНК, забезпечувало майже 100% пригнічення життєдіяльності молікутів (табл. 4). Висока ефективність тіо- і дитіофосфатних аналогів АСО в пригніченні життєдіяльності мікроорганізмів, наприклад молікутів, визначається не тільки їх унікальним механізмом дії, (блокують на 16S рРНК місця посадки білків і самозбирання 30S субодиниці рибосоми), а й тим, що вони активують рибонуклеазу Н атакованого мікроорганізму. Остання руйнує гетеродуплекси, утворені АСО з їх СП на 16S рРНК, і розщеплюють в цих місцях ділянки 16S рРНК, які комплементарно зв'язуються з АСО. Внаслідок цього 16S рРНК ділиться на фрагменти, які зазнають подальшого нуклеазного розщеплення, а кількість зібраних рибосом в клітині непохитно знижується. АСО, які звільнюються після розщеплення РНК/ДНК дуплексів, готові для атаки своєї комплементарної мішені на новосинтезованій 16S рРНК вже при транскрипції рибосомного оперону. Через те, що кожний з вивчених олігонуклеотидів, застосованих індивідуально, пригнічував процес трансляції в клітинах молікутів на 100% при інгібуванні життєдіяльності цих мікроорганізмів до 80%, то в умовах тривалого знаходження АСО в досліді (наприклад, культурі клітин тканин) вони здатні забезпечити 100% інгібування життєдіяльності мікроорганізмів. З даних, які свідчать про те, що концентрація АСО в клітині може в 104-105 разів перевищувати позаклітинну, нами вирахувано, що кожна з клітин молікутів поглинає приблизно 500000 молекул АСО, з яких більше 200000 уже за 2 год. їх контакту з клітинами утворювали усередині останніх дуплекси з комплементарними до них СП на 16S рРНК. Такої кількості молекул АСО в клітинах молікутів цілком достатньо, щоб "виключити" всі наявні в клітині молекули 16S рРНК з процесу самозбирання 30S субодиниці рибосоми і повністю зупинити в ній процес синтезу білка. Молікути відрізняються від інших мікроорганізмів тим, що вони інтенсивно поглинають АСО й інші нуклеїнові кислоти, і пояснюється це тим, що вони нездатні самостійно синтезувати пурини і пиримідини, мають потребу в екзогенних джерелах нуклеїнових кислот, які вони, завдяки наявності потужного набору позаклітинних та внутріклітинних ДНКаз і РНКаз, розщеплюють до нуклеотидів для потреб синтезу власних нуклеїнових кислот. Ця властивість молікутів полегшує вирішення проблем доставки АСО в їх клітини. В деяких наших експериментах вони, без проблем, "затягували" в середину клітини синтетичні олігодезоксирибонуклеотиди, ланцюг яких складався з 24 основ. Сигнатурної послідовності такої довжини немає, а отже, і потреби в синтезі великих молекул АСО також нема. Більшості бактерій екзогенні джерела нуклеїнових кислот не потрібні, і, природно, синтетичні олігонуклеотиди без відповідної модифікації в їх клітини навряд чи попадуть. Проте зараз і ця проблема вирішена шляхом приєднання до 3'- або 5'-кінців олігонуклеотидів речовин-лігандів, у відношенні до яких той чи інший мікроорганізм ауксотрофний (залежний). "Затягуючи" в клітину таку речовину, мікроорганізм разом з ним затягує і олігонуклеотид, де останній взаємодіє зі своєю мішенню. Способи створення олігонуклеотидів з відповідними лігандами у відношенні до цільових мікроорганізмів відомі і описані [16]. Таким чином, отримані результати дозволяють стверджувати, що АСО, які містять від 6 до 14 нуклеотидних одиниць є оптимальними за розміром молекулами, здатні повністю пригнічувати мікроорганізми, а для таких з них як молікути, вони вже зараз можуть бути рекомендовані як антимікоплазменні препарати для деконтамінації культур клітин. Латентно інфікована культура клітин Не/а, наприклад, була вилікувана від молікутів за три пересіви. Кожний пересів здійснювали на 4-й день росту культури на середовищі 199 антисигнатурними олігонуклеотидами у вигляді тіофосфатів (5'-CpsApsTpsApsGpsTpsTpsApsGps-3' і 5'CpsTpsApsTpsGpsTpsApsTpsTpsAps-3' no 50 нМ кожного). В кінці третього періоду (12-ий день) в зразках культури, взятої для аналізу, при фарбуванні барвником 4,6-діамідино-3-феніліндолом (ДАПІ), який взаємодіє лише з прокаріотичною ДНК, клітин молікутів-контамінантів виявлено не було. Про це свідчило і підвищення життєдіяльності культури: до лікування вона не могла бути життєздатною більше 8 діб, а після лікування - 14 діб без заміни середовища. При заміні середовища життєздатність вилікуваних культур зростала до 24-30 днів, а в інфікованих - не перевищувала 12-14 днів. Завдяки універсальності дії вказаних вище тіофосфатів (вони однаково ефективно діють на молікути родів Acholeplasma і Mycoplasma – основних контамінантів культур клітин) вони можуть бути рекомендовані як основні препарати для лікування і інших культур клітин від мікоплазма-інфекції. Після відповідних клінічних випробувань і створення лікарських форм, АСО можна буде використовувати і для терапії ряду важковиліковних захворювань людини і тварин. Враховуючи такі якості АСО, як майже повна нешкідливість (нетоксичність) для людини, теплокровних і їх клітин, а також легку розчинність у воді, фізіологічному розчині і водних розчинах інших речовин (спирту, борної кислоти та ін.), з них легко приготувати фармацевтичні композиції як для ін'єкцій, так і інших способів використання. Так, для лікування туберкульозу, пневмоній, хламідіозів, системних інфекційних захворювань людини, сепсисів можна буде використовувати (звичайно, після клінічних випробувань) для ін'єкцій стерильні розчини відповідних АСО в концентрації 100 нМ і вище в фізіологічному розчині. Для лікування бактеріальних захворювань дихального і урогенітального трактів людини можна буде використовувати АСО в концентрації 100 нМ і вище у вигляді водних розчинів (з 2% борною кислотою або без неї) для спринцювання, аплікації, або зрошення інгаляцією. Враховуючи надспецифічність дії АСО, в організмі вони самі зможуть знайти мішень для ураження. Використані джерела: 1. Zamecnik P.C., Stephenson M.L, 1978. Inhibition of Rous sarkoma virus replication and cell transformation by a specific oligonucleotide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:280. 2. Uhlmann E., Peyman A. Antisense oligonucleotides: A new therapeutic principle // Chemical Reviews.1990.-90, №4.-p. 543-581. 3. Helene С., Toulrne J.-J. Specific regulation of gene expression by antisense, sense and antigene nucleic acids // Biochim. Biophys. Acta.-1990.-1049.- P.99-125. 4. Патент США 4,904,582 від 27 лютого 1990 р.; автор: Richard H.Tullis; назва патенту: Novel amphiphilic nucleic acid conjugates. 5. Rapaport E., Levina F., Metelev V., Zamecnik P.C. Antimycobacterial activities of antisense oligodeoxynucleotide phosphorothioates in drug-resistant strains // Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.-1996.-93.-P.709713. 6. Taniguchi T, Weissman C. Inhibition of SBRNA 70S ribosome initiation complex formation by on oligonucleotides complementary to the 3'- terminal region of Е.соlі 16S ribosomal RNA // Nature.-1978.- V.275, N 3.- P.770-772. 7. Eckhardt H, Luhrrman R. Blocking of the initiation of protein biosynthesis by a pentanucleotide complementary to the 3'-end of Escherichia coli 16S rRNA //J.Biol.Chem.-1979.-254, N 22.-P.11183-11188. 8. Jayaramen K., Me Pariand K., Miller P., Ts'o P. Selective inhibition of Escherichia coli protein synthesis and growth by nonionic oligonucleotides complementary to the 3'-end of 16S rRNA// Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.-1981.78, N 3.-P.1537-1541. 9. Rahman et al., Antibacterial activity and inhibition of protein synthesis in Escherichia coli by antisense DNA analogs // Antisense Res Dev.-1991.- Winter, 1, N4.-P. 19-27. 10. Johansson K.E., Bolske G. Evaluation and practical aspects of the use of a commercial DNA probe for detection of mycoplasma infections in cell cultures // Biochem. & Biophys. Methods.-1989.-19.-P. 185-200. 11. F.J.M. van Kuppeveld et al. Genus- and Species-Specific Identification of Mycoplasma by 16S rRNA Amplification // Appl. & Environ.Microbiol.-1992.-58, N 8.-P.2606-2615. 12. Скрипаль И.Г., Малиновская Л.П. Микробиол. журн.-1984,-46, № 2.-С.71-75. 13. Nucleic Acids Res.-1974.-V. 1 .-P. 1721 -1732. 14. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning (A laboratory manual), Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, P.582. 15. J.Mol.Biol.,1976,v.7,P.197-213. 16. Amirkhanow N.V., Zarytova V.F. Nucleosides & Nycleotides,1995, V.14.-P.935-937; E.Rapaportetal., Proc. Natl.Acad. Sci, 1996, v.93, P.709-713.