Спосіб отримання моделі генералізованого кандидозу

Реферат: Спосіб отримання моделі генералізованого кандидозу включає введення клітин Candida внутрішньовенно і контроль за перебігом розвитку захворювання у піддослідних тварин протягом визначеного строку. Як піддослідних тварин використовують щурів лінії Вістар, яких піддають рентгенівському опроміненню тричі однаковими дозами 0,5 Гр, сумарна доза (1,5±0,02) Гр на одну тварину з інтервалом в добу, після чого піддослідних тварин інфікують 6 штамом Candida albicans АТСС 885-653 в дозі 2,5×10 КУО, при цьому строк контролю за піддослідними тваринами встановлюють 7-14 діб. UA 76250 U (12) UA 76250 U UA 76250 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до радіаційної біології та медицини, а саме - до експериментальної біології та медицини, і може бути використана при випробуванні нових засобів імунокорекції та дослідженні загальних закономірностей розвитку патологічних процесів на тлі імунодефіциту, зокрема таких, що виникають внаслідок малих доз іонізуючого випромінювання. Проблема кандидемії та гострого дисемінованого кандидозу набуває вагомості внаслідок значного збільшення випадків цієї патології у хворих з порушеннями антиінфекційного захисту, а також тяжкості клінічних проявів і надзвичайно високої летальності [1]. Важливий теоретичний та практичний інтерес становить питання про особливості радіаційно-індукованих змін імунологічної реактивності. Розширення області використання сучасного медичного обладнання, в якому застосовується іонізуюче випромінювання, веде до збільшення ризиків радіаційних ускладнень. Радіаційно-індуковані зміни імунологічної реактивності складають патогенетичну основу розвитку аутоімунних та інфекційних процесів, тому виникла проблема в оцінці особливостей дії різних видів радіації на функцію імунної системи [2, 3]. На теперішній час добре вивчений перебіг гострої інфекції на тлі опромінення у великих дозах, по суті, на фоні гострої променевої хвороби але імунотропні ефекти низькодозового опромінення, досить поширеного, на перебіг та прогноз інфекційного процесу досліджені в значно меншій мірі [4]. Тому одним з актуальних питань експериментальної радіобіології та медицини є дослідження ефективності засобів імунокорекції при інфекційних процесах, зокрема викликаних Candida albicans на фоні радіаційно-індукованої нестабільності в організмі, що потребує адекватної та відтворюваної моделі даної патології. Відомий спосіб отримання моделі радіаційно-індукованого імунодефіциту [5]. При здійсненні способу самиць щурів лінії Вістар одноразово піддають рентгенівському опроміненню в дозовому діапазоні 0,5 Гр на третю добу після запліднення. Отримане потомство, внаслідок радіаційного впливу в доімплатанційний період ембріогенезу, має характерні порушення лімфогемопоетичного гомеостазу, підвищений рівень геномної нестабільності та достовірні функціональні дефекти як специфічної, так і неспецифічної ланок імунітету. Як і в запропонованій корисній моделі, у відомому способі отримання моделі радіаційноіндукованого імунодефіциту, модель відтворюють на щурах лінії Вістар при застосуванні низьких доз рентгенівського опромінення при одноразовій дозі опромінювання 0,5 Гр. Причиною, що перешкоджає отриманню технічного результату, є відсутність у самиць лінії Вістар, опромінених в дозі 0,5 Гр в антенатальному періоді, порушень резистентності, що мали б тенденцію до прояву на тлі інфекційного процесу. Крім того, дана модель не дозволяє досліджувати ранні ефекти, індуковані опроміненням. Відомий спосіб отримання моделі радіаційно-індукованого дефекту антиінфекційної резистентності [6]. Згідно із способом-прототипом щурів лінії Вістар на 30 добу після народження одноразово піддають рентгенівському випромінюванню в дозовому діапазоні 0,75-2 8 Гр та інфікують культурою S. typhimurium в дозі 510 КУО інтраперитонеально. Інтраперитонеальне введення культури S. typhimurium в дозі 510 КУО викликає у щурів лінії Вістар розвиток сальмонельозного перитоніту та септичного стану, що супроводжується генералізацією інфекції, гематогенною дисемінацією та персистенцією збудника в крові і внутрішніх органах (печінці, селезінці, товстому кишечнику). Важкість перебігу та наслідки (тривалість персистенції S. typhimurium в організмі, ступінь ураження внутрішніх органів) визначаються станом антиінфекційної резистентності піддослідної тварини, а також залежать від кількості збудника, введеного при зараженні. Дозу збудника інфікування підбирають експериментальним шляхом таким чином, щоб забезпечити у одномісячних щурів лінії Вістар мінімальний показник летальності. Як і в запропонованій корисній моделі, у відомому способі створюють радіаційноіндукований дефект імунної системи шляхом впливу низької дози рентгенівського випромінювання на щурів лінії Вістар, інтраперитонеального інфікування піддослідних тварин та спостереження за ними визначений проміжок часу. Причиною, що перешкоджає отриманню технічного результату, є використання значних доз рентгенівського опромінення, що іноді призводить до значного летального ефекту піддослідних тварин. Крім того, термін спостереження за перебігом розвитку процесу безпосередньо після радіаційного впливу не відповідає оптимальному терміну створення стандартної моделі при інфікуванні тварин штамом Candida albicans. Прототипом вибраний спосіб отримання внутрішньовенної інфекції у мишей для вивчення вірулентності циркулюючих штамів Candida albicans [7]. При здійсненні способу клітини Candida 1 UA 76250 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вводять безпосередньо у хвостову вену, що дозволяє грибу уникати епітеліальних та ендотеліальних бар'єрів для проникнення в кровоток. На цій моделі на мишах, яка схожа з інвазивною інфекцією у людини, що розвивається при введенні катетерів, грибкові культури виявляються у всіх органах, але розвиток захворювання спостерігається лише в нирках і мозку. Мікробне навантаження залежить від об'єму інокулята і використаної лінії тварин. По мірі розвитку захворювання у тварин розвивається сепсис, який приводить до загибелі тварини. На цій моделі інфекції Candida вірулентність визначається рівнем летальності інфікованих мишей і виміром кількості клітин гриба в органах тварин у певні строки після інфікування. В разі використання інших лабораторних тварин для досягнення генералізованого процесу розвитку захворювання потрібні досить високі дози інокулятів, що збільшує рівень летальності тварин і зменшує точність факторів, необхідних для одержання стабільної відновлюваної моделі генералізованого кандидозу. Як і в запропонованій корисній моделі, у відомому способі отримання моделі генералізованого кандидозу, що включає введення клітин Candida внутрішньовенно і контроль за перебігом розвитку захворювання у піддослідних тварин протягом визначеного строку. Причиною, що перешкоджає отриманню технічного результату, є використання для створення моделі генералізованого кандидозу як піддослідних тварин мишей, які природньо мають слабку резистентність організму. При цьому для розвитку генералізованого процесу перебігу захворювання вони потребують значних доз інокулятів, що призводить до збільшення рівня летальності тварин, зокрема до кінця дослідного періоду, що зменшує вірогідність одержання стабільної відтворюваної моделі генералізованого кандидозу. Задачею, на вирішення якої спрямована запропонована корисна модель, є створення способу отримання моделі генералізованого кандидозу. В основу корисної моделі поставлена задача полягає у збільшенні вірогідності одержання стабільної відтворюваної моделі генералізованого кандидозу. Поставлена задача вирішується тим, що в способі отримання моделі генералізованого кандидозу, що включає внутрішньовенне введення клітин штаму Candida в організм тварин і контроль за перебігом розвитку захворювання протягом визначеного строку, як піддослідних тварин використовують щурів лінії Вістар, яких піддають рентгенівському опроміненню тричі однаковими дозами з інтервалом в добу при сумарній дозі опромінення (1,5±0,02) Гр на одну 6 тварину, після чого тварин інфікують штамом Candida albicans ATCC 885-653 в дозі 2,510 КУО, при цьому строк контролю за перебігом захворювання встановлюють 7-14 діб. Запропонована корисна модель відрізняється від прототипу тим, що як піддослідні тварини використовують щурів лінії Вістар, яких піддають рентгенівському опроміненню тричі однаковими дозами з інтервалом в добу при сумарній дозі опромінення (1,5±0,02) Гр на одну 6 тварину, після чого тварин інфікують штамом Candida albicans ATCC 885-653 в дозі 2,510 КУО, при цьому строк контролю за перебігом захворювання встановлюють 7-14 діб. Між суттєвими ознаками запропонованої корисної моделі і технічним результатом, який може бути досягнутий при її використанні, існує такий причинно-наслідковий зв'язок. Використання фракціонованого рентгенівського опромінення щурів лінії Вістар знижує імунітет піддослідних тварин, що в свою чергу дозволяє зменшити дозу збудника інфекції при інфікуванні тварин стандартизованим штамом Candida albicans АТСС 885-653, який володіє сталими біологічними властивостями та є доступним для одержання з колекцій мікроорганізмів, та збільшити вірогідність одержання стабільної відтворюваної моделі генералізованого кандидозу в проміжок часу 7-14 діб. Доза опромінення, що проводиться тричі однаковими 6 дозами з інтервалом 24 години, а також доза інфікування, що дорівнює 2,510 КУО були визначені експериментальним шляхом і є оптимальними для одержання мінімального рівня летальності піддослідних тварин, що дуже важливо для одержання моделі генералізованого кандидозу. Запропонований спосіб здійснювався таким чином. Щури лінії Вістар - самці - були опромінені рентгенівським опроміненням в дозовому діапазоні 1,5 Гр на одну тварину протягом 3 діб з інтервалом 24 години, після чого розділені на 5 груп по 6 тварин в кожній. Групу А 4 складали тварини, які були інфіковані штамом Candida albicans АТСС 885-653 в дозі 2,510 6 КУО, групу В - тварини, які були інфіковані тим же збудником в дозі 2,510 КУО на одну 8 тварину, групу С - тварини, які були інфіковані тим же збудником в дозі 2,510 на одну тварину, 9 і групу D, де доза інфікування складала 2,510 КУО. Тваринам контрольної групи вводили 0,5 мл стерильного фізіологічного розчину. Дослідження стану піддослідних тварин здійснювали протягом 2 тижнів. На 7 та 14 добу перебігу інфекційного процесу тварини були декапітовані (по 3 з кожної групи). Досліди проводили відповідно до "Правил проведення робіт із експериментальними тваринами" з 2 UA 76250 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дотриманням Міжнародних принципів "Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментів та інших наукових цілей" (Страсбург, 18 березня 1986 p.). Результати досліджень, а саме динаміка елімінації Candida albicans АТСС 885-653 з внутрішніх органів піддослідних тварин в залежності від дози інфікування, наведені в Таблиці 1. Спостереження за тваринами, які були інфіковані мінімальною дозою Candida albicans АТСС 4 885-653 (2,510 КУО) (група А), свідчить, що симптоми захворювання відсутні, тварини за поведінкою не відрізнялися від тварин контрольної групи. При бактеріологічному дослідженні внутрішніх органів штам Candida albicans АТСС 885-653 був вилучений лише в одному випадку з печінки. 6 Спостереження за тваринами, які були інфіковані дозою 2,510 КУО (група В) свідчать, що на 2-3 добу у всіх тварин спостерігалась відсутність апетиту, зниження рухливості, диспептичні явища, які зникали на 5-6 добу після інфікування. Наявність збудника перитонеального сепсису через 7 діб після інфікування бактеріологічно підтверджено у всіх обстежених тварин тільки в печінці, що вірогідно свідчить про локалізацію інфекційного процесу. Через 14 діб штам Candida albicans був виявлений тільки у однієї тварини. Спостереження за тваринами групи С, які були інфіковані дозою 2,510 КУО на одну тварину, свідчить що симптоматика захворювання у тварин зростала: посилились диспептичні явища, апетит був відсутній. При бактеріальному дослідженні штам Candida albicans ATCC 885653 був виявлений в печінці, серці, товстому кишечнику, що свідчить про генералізацію інфекційного процесу. Ознаки септичного стану спостерігались у 2 тварин через 14 діб після інфікування. 9 В групі D, де тварини були інфіковані дозою 2,510 КУО на одну тварину, всі тварини загинули протягом 3 діб після інфікування. В контрольній групі ознак захворювання не спостерігалось, штам Candida albicans не вилучено жодного разу. Спостереження за тваринами контрольної групи провадилось протягом 14 діб. Дослідженнями було встановлено (таблиця 2), що при рентгенівському опроміненні щурів лінії Вістар сумарною дозою 1,5 Гр протягом 3 діб з інтервалом 24 години (одноразова доза 8 складала 0,5 Гр) і інфікуванні тварин штамом Candida albicans ATCC 885-653 в дозі 2,510 КУО на одну тварину стабільна картина захворювання мала місце протягом 7-14 діб після інфікування. При цьому спостерігався 50 % показник летальності тварин. Оптимальну фракціоновану дозу рентгенівського опромінення визначали наступним способом. Щури-самці лінії Вістар були розділені на 3 групи по 6 тварин в кожній, які опромінювались щоденно протягом 3 діб різними дозами рентгенівського опромінення. В групу І входили тварини, які підлягали опроміненню сумарною дозою 0,75 Гр (добова доза - 0,25 Гр), в групу II - щури, які отримували 1,5 Гр рентгенівського опромінення (добова доза 0,5 Гр), то групи III відносились тварини, які опромінювались сумарною дозою 3 Гр (добова доза 1 Гр). Всі тварини після опромінення на 3 добу підлягали інтравенозному інфікуванню штамом Candida 6 albicans А ТСС 885-653 в дозі 2,510 КУО на одну тварину. Дослідження стану опромінених та інфікованих тварин здійснювали протягом 2 тижнів. На 7 та 14 добу перебігу інфекційного процесу тварини були декапітовані (по 3 з кожної групи). Динаміка елімінації штаму Candida albicans ATCC 885-653 з внутрішніх органів піддослідних щурів в залежності від дози опромінення наведені в Таблиці 2. За результатами нашого дослідження, у тварин, опромінених сумарною дозою дозі 0,75 Гр (І група), відмінностей в характері перебігу інфекційного процесу та в динаміці зниження рівня обсіменіння внутрішніх органів у порівнянні з інфікованими неопроміненими тваринами (група С) не було виявлено. У тварин, які підлягали опроміненню сумарною дозою 1,5 Гр, підвищувався рівень летальності: 3 тварин з II групи після інфікування штамом Candida albicans загинули до кінця дослідного періоду. Тварини з цієї ж групи, що вижили, мали триваліший період клінічної маніфестації. Дослідженнями було встановлено, що при рентгенівському опроміненні щурів лінії Вістар сумарною дозою 1,5 Гр на одну тварину протягом 3 діб з інтервалом 24 години (одноразове опромінення складало 0,5 Гр) і інфікуванні тварин штамом Candida albicans ATCC 885-653 в дозі 6 2,510 КУО на одну тварину стабільна картина захворювання мала місце протягом 7-14 діб після інфікування. При цьому спостерігався нульовий показник летальності тварин. Запропонована корисна модель була використана для оцінки можливостей корекції одержаного типу дефекту антиінфекційної резистентності та терапевтичної ефективності імунотропних препаратів з широким спектром можливих терапевтичних ефектів. Приклад 3 UA 76250 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Порівняльний аналіз стану антимікотичної резистентності у щурів лінії Вістар, опромінених в 6 дозі 0,75 Гр, внутрішньовенно інфікованих штамом Candida albicans в дозі 2,510 (група І), опромінених в дозі 1,5 Гр та інфікованих (відповідним за прототипом способом) (група II), опромінених в дозі 3 Гр та інфікованих тим же збудником (група III) та інфікованих без 6 попереднього опромінення Candida albicans в дозі 2,510 (група D) і інтактних тварин (контроль), проводився на основі даних, наведених в таблиці 3. В групі І стан імунологічних показників (концентрація інтерлейкинів IFN-, IL-10) фагоцитарний індекс макрофагів та нейтрофілів (ФІ мф, ФІ нф), фагоцитарне число (ФЧ) достовірно не відрізнявся від аналогічних показників тварин, які не підлягали рентгенівському опроміненню як на 7, так і на 14 добу досліджень. Цей стан можна інтерпретувати як цілком компенсований, навіть на тлі функціонального навантаження. Дослідження, інфекційного процесу у щурів II групи, які були опромінені сумарною дозою 1,5 Гр, не виявили прогресивного зростання IFN- протягом 1 тижня, характерного для звичайного інфекційного процесу, що, вірогідно вказує на депресивну дію обраного режиму опромінення на протиінфекційний захист. Що стосується показників імунологічної реактивності, то у опромінених щурів виявлені більш високі рівні циркулюючих імунних комплексів (ЦІК), що, вочевидь, зв'язано з порушенням функції елімінації з боку фагоцитуючих клітин і призвело до загибелі 3 щурів. Що стосується інфікованих щурів, що отримали сумарну дозу рентгенівського опромінення 3 Гр, то у них було виявлено різке зниження рівнів усіх досліджуваних цитокінів, різке зростання рівня ЦІК, що призвело до зниження показників активності фагоцитів, що, в свою чергу, призвело до гибелі усіх піддослідних тварин цієї групи до кінця 1 тижня спостережень. Таким чином, нами було встановлено, що при рентгенівському опроміненні щурів лінії Вістар сумарною дозою 1,5 Гр протягом 3 діб з інтервалом 24 години (одноразове опромінення 0,5 Гр) 6 та інфікуванні тварин штамом Candida albicans в дозі 2,510 КУО на одну тварину картина захворювання мала місце протягом 7-14 діб після інфікування. Дані фактори дозволяють використовувати запропоновану корисну модель для оцінки загальних закономірностей патологічних процесів на тлі імунодефіциту, зокрема таких, що виникають внаслідок різних доз іонізуючого випромінювання, а також можливостей корекції одержаного типу дефекту антиінфекційної резистентності та терапевтичної ефективності імунотропних препаратів з широким спектром можливих біологічних ефектів. Джерела інформації: 1. Климко Н.Н. Диагностика и лечение кандидемии и острого диссеминированного кандидоза [Електронний ресурс]/ Н.Н. Климко// Инфекции и антимикробная терапія. - 2002. Том 4, № 1. - режим доступу http://www.consilium-medicum.com/article/8012. 2. Самбур М.Б., Мельников О.Ф., Тимченко С.В. Реакция иммунной системы обезьян на однократное и фракционированное -облучение в малых дозах. - Радиационная биология. Радиоэкология.-1993. - № 2 (5). - Т. 33. - С. 706-713. 3. Шойхет Я.Н., Козлов В.А., Коненков В.И., Киселев В.И., Сенников СВ., Колядо И.Б., Алгазин А.И., Колядо В.Б., Зайцев Е.В. Иммунная система населения, подвергшегося воздействия на следе ядерного взрыва/ Барнаул, 2000. - 179 с. 4. Иммунные и цитогенетические эффекты плотно- и редкоионизирующих излучений: Монография/ Гриневич Ю.А., Демина Э.А.; Под ред… Ярилина. А.А. - К.: Здоров'я, 2006. - 200 с. 5. Патент України на винахід 76549, МПК А01К 67/00 Спосіб отримання моделі радіаційноіндукованого імунодефіциту [Текст]/ Т.І. Коляда та ін., дата подання 29.06.2004. 6. Патент України на корисну модель 41472, МПК А01К 67/00 Спосіб отримання моделі радіаційно-індукованого дефекту антиінфекційної резистентності [Текст]/ Т.І. Коляда та ін., дата подання 15.12.2008. 7. MacCallum Donna M. Temporal events in the intravenous challenge model for experimental Candida albicans infections in female mice [Текст]/ Donna M. MacCallum, Frank С Odds// Mycoses.2005. - Vol. 48, № 3. - P. 151-І61 (прототип). 4 UA 76250 U Таблиця 1 Динаміка елімінації Candida albicans ATCC 885-653 з внутрішніх органів піддослідних тварин в залежності від інфікуючої дози Групи тварин Строк дослідження 7 діб (n=3) 14діб(n=3) 7 діб (n=3) 14 діб (n=3) 7 діб (n=3) 14 діб (n=3) 7 діб (n=6) А В С D* Кількість тварин, у яких висіялась Candida albicans ATCC 885-653 з внутрішніх органів Печінка Серце Нирки 1 0 0 0 0 0 3 0 0 1 0 0 3 3 3 3 2 2 3 3 3 Примітка: * - всі тварини загинули протягом 3 діб після зараження Таблиця 2 Динаміка елімінації Candida albicans ATCC 885-653 з внутрішніх органів піддослідних тварин в залежності від дози опромінення. Групи тварин І II III Кількість тварин, у яких висіялась Candida albicans з внутрішніх органів Печінка Серце Нирки 1 0 0 0 0 0 3 3 2 3 2 1 3 3 3 Строк дослідження 7 діб (n=3) 14 діб (n=3) 7 діб (n=3)* 14діб(n=3) 7 діб (n=3)** * - 3 тварини загинули протягом 1 тижня ** - усі тварини загинули протягом 1 тижня 5 UA 76250 U Таблиця 3 Вплив фракціонованого тотального рентгенівського опромінення на дисемiнований кандидоз щурів лінії Вістар Доза опромінення І група 0,75 Гр II група 1,5 Гр III група 3 Гр Неопромiнені Інтактні 14 14 7 доба 7 доба 14 доба 7 доба 7 доба 14 доба доба доба 1 2* ;2** 1** 176,4 25,5 116,6 **; 85,6'** 57,7 181,7 23,8 20,3 41,6 10,8 30,9 23,9 10,2 48,9 16,4 8,5 1 1 ;2 2 15,8 3,8 16,41** 11,1 ** 8,3 17,7 ** * 4,1 ** 3,7 4,2 1,6 3,6 4,6 1,7 2,6 3,4 0,1 2 2 1 70,3 52,7 55,8 ** 49,7 * 27,3 74,7 ** 57,8 52,8 6,5 7,3 4,6 5,4 9,6 7,1 6,1 5,1 1 ;2** 1**;2** 1** 1** 10,8 12,6 7,4 ** 7,9 3,5 13,4 15,7 9,5 2,6 3,4 0,6 0,9 0,9 1,5 1,6 0,8 2* 1 69,9 66,8 65,4 62,2 31,7 73,4 * 69,5 62,8 5,7 6,3 5,6 6,4 7,1 6,5 6,8 5,4 1*;2** 1** 1 10,5 8,3 7,2 10,4 3,5 12,4 ** 9,2 8,5 2,4 1,6 0,7 0,9 0,7 1,4 1,1 0,9 1 ;2 1**;2 1** 1** 127 138 154 ** ** 166 277,1 131 142 85 11,6 14,1 7,1 15,7 20,5 8,4 13,2 5,3 Показник IFN-, пг/мл IL-10, пг/мл ФІ мф, % ФЧ мф, од. ФІ нф, % ФЧ нф, од. ЦІК, МО М m М m М m М m М m М m М m 1 Примітки: - достовірність відмінностей від інтактної групи тварин; відмінностей від групи тварин, які не підлягають опроміненню. * - р