Спосіб встановлення генетично обумовленої схильності до розвитку алергічних захворювань

Реферат: Спосіб встановлення генетично обумовленої схильності до розвитку алергічних захворювань включає виявлення однонуклеотидних поліморфізмів гена TLR2 Arg753Gln та гена TLR4 Asp299Gly, Thr399lle, використання аналізу відповідних поліморфізмів з метою оцінки ризику розвитку алергічних захворювань. UA 76525 U (12) UA 76525 U UA 76525 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузей біології та медицини та може бути використана для встановлення генетично обумовленої схильності до розвитку алергічних захворювань. Роль рецепторів клітин системи вродженого імунітету у захисті від патогенів має велике значення, що стало очевидним з моменту відкриття Toll-подібних рецепторів (TLRs). Члени цього сімейства відіграють ключову роль в індукції імунних і запальних відповідей у ссавців, стимулюють активацію NF-kB сигнального шляху і експресію різних цитокінів та костимуляторів. Функціональний поліморфізм генів TLR, який обумовлений замінами одиничних нуклеотидів, у деяких випадках викликає порушення, що призводять до зміни протікання захисних реакцій організму і визначають ризик розвитку патології [Симбирцев А.С. Толл-белки: специфические рецепторы неспецифического иммунитета // Иммунология.-2005. - № 6. - С. 368-377]. Відомо ряд способів прогнозування генетичної схильності до хвороби Крона і виразкового коліту з урахуванням поліморфізму генів TLR4 [Deficient host-bacteria interactions in inflammatory bowel disease? The toll-like receptor (TLR)-4Asp299Gly polymorphism is associated with Crohn's disease and ulcerative colitis / D. Franchimont, S. Vermeire, H. Housni [et al.] // Gut.-2004. - Vol. 53 (7). - P. 978-992]. Є дані про асоціацію поліморфізмів генів TLR2 і TLR4 із підвищеним ризиком розвитку раку шийки матки [Impact of Toll-like receptors [TLR] 2 (-196 to-174 del) and TLR4 (Asp299Gly, Thr399Ile) in cervical cancer susceptibility in North Indian women / S. Pandey, R. D. Mittal, M. Srivastava [et al.] // Gynecol Oncol.-2009. - Vol. 114(3). - P. 501-505]. Також, відомий спосіб на основі вивченої асоціації поліморфізмів TLR4 Asp299Gly і Thr399Ile із наявністю у кров'яному руслі інфекції Candida Albicans [Toll-like receptor 4 Asp299Gly/Thr399Ile polymorphisms are a risk factor for Candida bloodstream infection / C. A. Van der Graaf, M. G. Netea, S. A. Morre [et al.] // Eur Cytokine Netw.-2006. - Vol. 17(1). - P. 29-34]. Встановлений зв'язок із підвищеною частотою зустрічності мутацій гена TLR4 Asp299Gly i Thr399Ile у осіб iз септичним шоком, що викликаний грамнегативною інфекцією [Relevance of mutations in the TLR4 receptor in patients with gram-negative septic shock / Lorenz E., Mira J.P., Frees K.L., Schwartz D.A. // Arch. Intern. Med.-2002. - Vol.162. - P. 1028-10321. Відомо про підвищений ризик розвитку грамнегативного і гематогенного остеомієліту у осіб із поліморфізмом гена TLR4 [The tlr4 (tlr4 Asp299Gly) polymorphism is a risk factor for gram-negative and haematogenous osteomyelitis / A. H. Montes, V. Asensi, V. Alvarez [et al.] // J. Clin. Exp. Immunol.-2006. - Vol. 143 (3). - P. 404-413]. Найбільш близьким аналогом до способу, що заявляється, є спосіб діагностики генетичної схильності до розвитку бактеріальних інфекцій, що передаються статевим шляхом (Пат. 58647 Україна, МПК G01N 33/50. Спосіб діагностики генетичної схильності до розвитку бактеріальних інфекцій, що передаються статевим шляхом / І.П. Кайдашев, О.В. Ізмайлова, О.А. Шликова // заявник і власник ВДНЗУ "УМСА". - u201008818, заявл. 15.07.2010; опубл. 26.04.2011, бюл. № 8). Суть цього способу полягає у виявленні однонуклеотидних поліморфізмів гена TLR2 Arg753Gln та гена TLR4 Asp299Gly, Thr399Ile методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та прогнозування iндивідуальної схильності до розвитку поширених урогенітальних інфекцій із урахуванням генотипу. Загальною ознакою способу, що заявляється, i найближчого аналога є визначення однонуклеотидних поліморфізмів гена TLR2 Arg753Gln та гена TLR4 Asp299Gly, Thr399Ile методом ПЛР. Недоліком відомого способу є відсутність можливості прогнозування розвитку алергічних захворювань та урахування генетичної схильності до підвищеного синтезу IgE, що обмежує можливість його використання в алергології. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб прогнозування розвитку алергічних захворювань та схильності до підвищеного синтезу IgE із урахуванням генотипу. Поставлена задача вирішується шляхом створення способу прогнозування розвитку захворювань, що включає виявлення однонуклеотидних поліморфізмів гена TLR2 Arg753Gln та гена TLR4 Asp299Gly, Thr399Ile методом полімеразної ланцюгової реакції, який відрізняється тим, що аналіз відповідних поліморфізмів використовується з метою оцінки ризику розвитку алергічних захворювань. Запропонований спосіб дозволяє прогнозувати iндивідуальну схильність до підвищеного синтезу IgE із урахуванням генетичних маркерів ризику розвитку алергічних захворювань. Заявлений спосіб виконується наступним чином: До групи контролю увійшли 95 студентів Української медичної стоматологічної академії, у яких були зібрані детальний анамнез життя, алергологічний анамнез, а також проведена оцінка клінічного стану на час огляду та об'єктивного стану різних органів і систем з метою виключення алергічних захворювань (AЗ). Забір крові проводився з отриманням сухої плями. Групу хворих склали 38 осіб з діагностованими AЗ згідно з критеріями ВООЗ: атопічна бронхіальна астма - 19, атопічний дерматит - 13 і атопічний риніт - 6 чоловік. Критерієм для 1 UA 76525 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 відбору в групу була наявність підвищеної концентрації алерген-специфічних IgE (slgE) (від 3,5 до 100 kU/l) хоча б до одного з алергенів. Для верифікації IgE-залежних AЗ всім пацієнтам проводили дослідження специфічних IgE до 20 найбільш значущих причинних алергенів (молоко, арахіс, білок курячого яйця, жовток курячого яйця, картопля, морква, риба тріска, яблуко, соя, пшенична мука, пилок бородавчастої берези, польова тимофіївка, пилок полину, кліщ D.pteronyssinus, кліщ D.farinae, епідерміс собаки, епідерміс кішки, епідерміс коня, грибки Asp. fumigatus і Cladosp. herbarum). Рівні алерген-специфічних IgE визначали за допомогою імуноферментної тест-системи "Polycheck" (Німеччина). Для аналізу поліморфізму гена TLR2 Arg753Gln методом ПЛР на ампліфікаторі "Терцик" ("ДНК-Технология", Москва) були використані специфічні олігонуклеотидні праймери: 5'GAGTGGTGCAAGTATGAACTGGA-3' та 5'-TCCCAACTAGACAAAGACTGGTCT-3'. Ампліфікація проводилася за такою програмою: денатурація 94 °C, 5 хв, 1 цикл; 32 цикли: 94 °C, 30 сек., 62 °C, 1 хв, 72 °C 1 хв; заключний цикл - 72 °C 3 хв. Зберігання при 10 °C. Ідентифікацію поліморфного варіанту проводили методом рестрикційного аналізу з використанням ендонуклеази рестрикції Pst І (НВО "Сибензим", Новосибірськ). Продукти розщеплення поліморфної ділянки гена TLR2 Arg753Gln виявляли за допомогою електрофорезу в 3 % агарозному гелі ("Helikon", Москва) в 1 х ТВЕ (50 мМ трис-Н3ВО3 та 2 мМ ЕДТА, рН 8,0), забарвленому етидіумом бромідом, протягом 2 годин при напрузі 2V на 1 см гелю із подальшою візуалізацією результатів в УФ-світлі. Поліморфну ділянку Asp299Gly гена TLR4 ампліфікували за допомогою методу ПЛР на ампліфікаторі "Терцик" ("ДНК-Технология", Москва) із використанням специфічних олігонуклеотидних праймерів: 5'-GATTAGCATACTTAGACTACTACCTCCATG-3' та 5'GATCAACTTCTGAAAAAGCATTCCCAC-3' за такою програмою: денатурація 94 °C, 30 сек., 52 °C, 1 хв, 72 °C 1 хв, 1 цикл; 30 циклів: 94 °C, 30 сек., 55 °C, 30 сек., 72 °C 30 сек.; заключний цикл - 72 °C 5 хв. Зберігання - 10 °C. Поліморфний варіант ідентифікували за допомогою подальшого рестрикційного аналізу з використанням ендонуклеази рестрикції Nco І (НВО "Сибензим", Новосибірськ). Продукти розщеплення поліморфної ділянки гена TLR4 (Asp299Gly) виявляли за допомогою електрофорезу в 3 % агарозному гелі ("Helikon", Москва) в 1 х ТВЕ (50 мМ трис-Н3ВО3 та 2 мМ ЕДТА, рН 8,0) протягом 2 годин при напрузі 2V на 1 см гелю. Гель забарвлювали етидіумом бромідом із подальшою візуалізацією результатів в УФ-світлі. Генотипування гена TLR4 по поліморфізму Thr399Ile проводили за допомогою ПЛР. Як специфічні олігонуклеотидні праймери використали: 5'GGTTGCTGTTCTCAAAGTGATTTTGGGAGAA-3' та 5'ACCTGAAGACTGGAGAGTGAGTTAAATGCT-3'. Режим ампліфікації: денатурація 94 °C-5 хв; 30 циклів: 94 °C, 30 сек., 55 °C, 30 сек., 72 °C 30 сек. Зберігання - 10 °C. Для ідентифікації алелей проводили рестрикційний аналіз ампліконів за допомогою ендонуклеази рестрикції Msp І (НВО "Сибензим", Новосибірськ). Продукти рестрикції аналізували за допомогою електрофорезу в 3 % агарозному гелі ("Helikon", Москва) в 1 х ТВЕ (50 мМ трис-Н3ВО3 та 2 мМ ЕДТА, рН 8,0) протягом 2 годин при напрузі 2V на 1 см гелю. Гель фарбували етидіумом бромідом із подальшою візуалізацією результатів в УФ-світлі. Математичну обробку отриманих даних проводили з використанням програмного пакету "STATISTICA 7.0. for Windows" і електронних таблиць MS Excel. Статистично значимими вважали відмінності при р