Спосіб діагностики генетичної схильності до розвитку бактеріальних інфекцій, що передаються статевим шляхом

Спосіб прогнозування індивідуальної схильності до розвитку поширених урогенітальних інфекцій 3 редаються статевим шляхом, методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) у генітальних екскретах та в тканині передміхурової залози, яка вилучена під час операції у хворих на доброякісну гіперплазію передміхурової залози. В основу цього способу покладено завдання підвищення ефективності діагностики інфікованості збудниками урогенітальних інфекцій у хворих на доброякісну гіперплазію передміхурової залози [Пат. 35799 Україна, МПК G01N33/569. Спосіб діагностики урогенітальних інфекцій у хворих на доброякісну гіперплазію передміхурової залози / Возіанов О.Ф., Пасєчніков С.П., Мітченко М.В., Грицай В.С; заявник і власник ДУ «Інститут урології АМН України». №u200804098; заявл. 01.04.08; опубл. 10.10.08, Бюл. №19/2008]. Суть цього способу полягає в тому, що за допомогою методу ПЛР виявляли наявність збудників захворювань, що передаються статевим шляхом (Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum, Trichomonas vaginalis, Chlamydia trachomatis), у генітальних екскретах (зіскрібок із сечівника і секрет передміхурової залози) та у видаленій під час операції тканині передміхурової залози у хворих на доброякісну гіперплазію передміхурової залози. Проте, даний спосіб має недостатній ступінь ефективності прогнозування, оскільки не враховувалась генетична схильність до підвищеної сприйнятливості до збудників бактеріальних інфекцій, які передаються статевим шляхом, що обмежує можливість його використання в клінічній і профілактичній медицині. В основу корисної моделі поставлено завдання розробити спосіб прогнозування індивідуальної схильності до розвитку поширених урогенітальних інфекцій із урахуванням генотипу. Поставлене завдання вирішується шляхом створення способу діагностики генетичної схильності індивіда до інфікування бактеріальними інфекціями, які передаються статевим шляхом, що включає виявлення однонуклеотидних поліморфізмів гену TLR2 Arg753Gln та гену TLR4 Asp299Gly, Thr399Ile методом ПЛР і оцінці ризику розвитку поширених урогенітальних інфекцій, який відрізняється тим, що для підвищення ефективності діагностики інфікованості збудниками даних захворювань, у якості генетичних маркерів використовували аналіз поліморфних ділянок генів TLR2 Arg753Gln та TLR4 Asp299Gly/ Thr399Ile методом ПЛР. Запропонований спосіб дозволяє прогнозувати індивідуальну схильність до інфікування збудниками поширених урогенітальних інфекцій із урахуванням генетичних маркерів ризику розвитку патології та індивідуальної імунної відповіді до бактеріальних компонентів захворювань. Заявлений спосіб вирішується наступним чином: Після проведеного детального збору анкетних даних, анамнезу, даних клінічного стану на час огляду і об'єктивних даних зі сторони різних органів та систем була сформована група популяційного контролю, до якої увійшли 299 практично здорових жителів Полтавської області врівноважених за статтю, віком від 19 до 62 років. Матеріа 58647 4 лом для дослідження була периферична кров. Групу хворих на урогенітальні інфекції склали 156 осіб, різного віку та статі. Матеріалом для дослідження був зіскріб епітеліальних клітин із уретри і цервікального каналу, який отримували за допомогою спеціальних одноразових стерильних урогенітальних зондів. Наявність інфекцій було діагностовано методом ПЛР, що виконувалась по стандартним методикам, регламентованим виробником тест-систем із використанням наборів реагентів для виявлення ДНК збудників Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma genitalium, Gardnerella vaginalis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis (НПФ «Литех», Москва). Із 156 інфікованих осіб були виявлені: 16 осіб із хламідіозом, 102 особи із уреаплазмозом, 4 - із мікоплазмозом, 9 - із гарднерельозом, 2 - трихомоніазом і 23 - із наявністю декількох інфекцій. Для аналізу поліморфізму гена TLR2 Arg753Gln методом ПЛР на ампліфікаторі «Терцик» («ДНК-Технология», Москва) були використані специфічні олігонуклеотидні праймери: 5'-GAGTGGTGCAAGTATGAACTGGA-3' та 5'-TCCCAACTAGACAAAGACTGGTCT-3'. Ампліфікація проводилася за такою програмою: денатурація 94°С, 5хв., 1 цикл; 32 цикли: 94°С, 30сек., 62°С, 1хв., 72°С 1хв.; заключний цикл - 72°С 3хв. Зберігання при 10°С. Ідентифікацію поліморфного варіанту проводили методом рестрикційного аналізу з використанням ендонуклеази рестрикції Pst І (НВО «Сибензим», Новосибірськ). Продукти розщеплення поліморфної ділянки гену TLR2 Arg753Gln виявляли за допомогою електрофорезу в 3% агарозному гелі («Helikon», Москва) в 1×ТВЕ (50мМ трис-Н3ВО3 та 2мМ ЕДТА, рН 8,0), забарвленому етидіумом бромідом, протягом 2 годин при напрузі 2V на 1 см гелю із подальшою візуалізацією результатів в УФ-світлі. Поліморфну ділянку Asp299Gly гена TLR4 ампліфікували за допомогою методу ПЛР на ампліфікаторі «Терцик» («ДНК-Технология», Москва) із використанням специфічних олігонуклеотидних праймерів: 5'-GATTAGCATACTTAGACTACTACCTCCATG-3' та 5'-GATCAACTTCTGAAAAAGCATTCCCAC-3' за такою програмою: денатурація 94°С, 30сек., 52°С, 1хв., 72°С 1хв., 1 цикл; 30 циклів: 94°С, 30сек., 55°С, 30 сек., 72°С 30 сек.; заключний цикл - 72°С 5хв. Зберігання - 10°С. Поліморфний варіант ідентифікували за допомогою подальшого рестрикційного аналізу з використанням ендонуклеази рестрикції Nco І (НВО «Сибензим», Новосибірськ). Продукти розщеплення поліморфної ділянки гену TLR4 (Asp299Gly) виявляли за допомогою електрофорезу в 3% агарозному гелі («Helikon», Москва) в 1×ТВЕ (50мМ трис-Н3ВО3 та 2мМ ЕДТА, рН 8,0) протягом 2 годин при напрузі 2V на 1см гелю. Гель забарвлювали етидіумом бромідом із подальшою візуалізацією результатів в УФ-світлі. Генотипування гену TLR4 по поліморфізму Thr399Ile проводили за допомогою ПЛР. В якості специфічних олігонуклеотидних праймерів використали: 5'-GGTTGCTGTTCTCAAAGTGATTTTGGGAGAA-3' та 5’-ACCTGAAGACTGGAGAGTGAGTTAAATGCT 5 58647 3'. Режим ампліфікації: денатурація 94°С - 5хв.; 30 циклів: 94°С, 30сек., 55 °С, 30сек., 72°С 30сек. Зберігання - 10°С. Для ідентифікації алелей проводили рестрикційний аналіз ампліконів за допомогою ендонуклеази рестрикції Msp I (HBO «Сибензим», Новосибірськ). Продукти рестрикції аналізували за допомогою електрофорезу в 3% агарозному гелі («Helikon», Москва) в 1×ТВЕ (50мМ трис-Н3ВО3 та 2мМ ЕДТА, рН 8,0) протягом 2 годин при напрузі 2V на 1см гелю. Гель фарбували етидіумом бромідом із подальшою візуалізацією результатів в УФ-світлі. 6 Математичну обробку отриманих даних проводили з використанням програмного пакету «STATISTICA 7.0. for Windows» і електронних таблиць MS Excel. Статистично значимими вважали відмінності при р