Спосіб визначення антигенної спорідненості вірусу хвороби ауєскі модифікованим мікрометодом реакції нейтралізації

Реферат: UA 77294 U UA 77294 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ветеринарної вірусології, зокрема для індикації та ідентифікації штамів, клонів та ізолятів збудника вірусу хвороби Ауєскі в перехрестній реакції нейтралізації з постійною дозою специфічної сироватки. Методические рекомендации по определению антигенного родства, различий и доминантности вирусов в серологических реакциях. Прискока В.А., Собко А.И., Манзий К.Б. - К., 1987.-20 с. В даних методичних вказівках запропоновано загальний підхід по визначенню антигенної спорідненості і домінантності вірусів у таких серологічних тестах, як реакції нейтралізації (РН), реакції дифузної переципітації (РДП) та реакції зв'язування комплементу (РЗК) шляхом постановки макрометоду, з використанням скляних пробірок, матраців, мірних піпеток. Нами за аналог було взято саме реакцію нейтралізації, оскільки остання є найбільш чутливою та специфічною при діагностиці хвороби Ауєскі. Постановку класичної реакції нейтралізації проводять з використанням чутливих до вірусів біологічних моделей перещеплювані культури клітин, що вирощені на скляних матрацах та пробірках. Реакція нейтралізації базується на явищі нейтралізації інфекційної активності вірусу специфічними антитілами, які знаходяться в сироватці. Для цього в пробірки вносять рівні об'єми сироватки і суспензії вірусу після контакту та шляхом зараження чутливого тест-об'єкта (культури клітин) визначають чи нейтралізувався активний вірус специфічними антитілами сироватки за ознакою наявності чи відсутності цитопатичної дії (ЦПД) вірусу. Відсутність прояву цитопатичної дії вірусу в культурі клітин розцінюється як ознака нейтралізації його біологічної активності і вказує на наявність специфічних антитіл в досліджуваній сироватці. В залежності від мети постановку реакції нейтралізації проводять з постійною дозою вірусу при зменшуваних кількостях сироватки або з постійною дозою сироватки при зменшуваних концентраціях вірусу. Реакція нейтралізації з постійною дозою вірусу дозволяє виявляти специфічні гуморальні антитіла проти збудників інфекційних хвороб з визначенням їх рівнів (титрів) та потребує знати інфекційний титр вірусу. Реакція нейтралізації з постійною дозою сироватки дозволяє проводити ідентифікацію виділених ізолятів вірусу та потребує знати титр сироватки (сироваток) і є найбільш універсальною та високоспецифічною реакцією та служить еталоном при оцінці інших реакцій у вірусології. Суть постановки реакції нейтралізації з постійною дозою сироватки і різними розведеннями вірусу полягає в наступному. Найбільш вживаною та актуальною при визначенні антигенної спорідненості штамів у вірусологічній практиці є перехресна реакція нейтралізації, котра потребує наявності штамів або ізолятів збудника та одержаних до них специфічних сироваток крові. Для її постановки готують постійні розведення специфічних (5 нейтралізуючих доз) і контрольної (негативної) сироваток. У пробірках розтитровують (на кожне розведення кожного з вірусів беруть по 4 пробірки) досліджувані віруси в десятикратних розведеннях таким чином, що останнє розведення вірусу, взяте в досліді, повинно перевищувати його біологічний титр. Титр вірусу вираховують за методом Ріда і Менча та виражають у логарифмах (lg) ТДЦ 50/мл. Титри інфекційної активності 3 вірусів мають бути не нижчими 5,0 лог ТДЦ 50/см . Всі розведення вірусів випробовують проти гомологічної сироватки, гетерологічної та негативної (контрольної) сироваток. Для цього до 1-го ряду пробірок з розведеннями вірусу А додають рівний об'єм гомологічної сироватки (5 НД). До 2-го ряду ряду пробірок з розведеннями вірусу А додають рівний об'єм гетерологічної сироватки вірусу Б (5 НД). Аналогічно до 1-го ряду пробірок з розведеннями вірусу Б додають рівний об'єм гомологічної сироватки (5 НД) та до 2-го ряду ряду пробірок з розведеннями вірусу Б додають рівний об'єм гетерологічної сироватки вірусу А (5 НД). Об'єм сироватки і вірусу повинен бути однаковим (1:1). Одночасно ставлять контролі. 1. Контроль культури клітин. В 4 пробірки вносять тільки живильне середовище, для виявлення неспецифічної дегенерації клітин. 2. Контроль токсичності сироватки. Кожну досліджувану сироватку в найменшому розведенні, яке використовували в реакції, вносять в окремі 4 пробірки. Отримані проби змішують та витримують 1 годину для контакту в інкубаторі, після чого суміші переносять в пробірки з вирощеним моношаром клітин, з якого попередньо зливають ростове середовище, і ставлять в термостат на 5-7 діб. Облік результатів реакції проводять наступним чином. Спочатку вираховують титри штамів вірусу в присутності специфічної та негативної сироваток за проявом ЦПД. Титром вірусу вважають останнє його розведення, в якому відсутня цитопатична дія на культуру клітин. Число, яке показує у скільки разів специфічна (позитивна) сироватка знижує титр вірусу порівняно з контрольною, називається індексом нейтралізації (ІН). Він представляє собою відношення титру вірусу в присутності контрольної сироватки до титру вірусу із специфічною сироваткою 1 UA 77294 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Позитивною рахують реакцію з індексом нейтралізації 2 lg і вище або 100 і більше разів в числовому підрахунку. За допомогою запропонованих формул на основі одержаних показників відношення ІН, вираховують антигенну спорідненість між досліджуваними вірусами. Традиційний метод визначення антигенної спорідненості між досліджуваними штамами чи ізолятами вірусу шляхом постановки реакції нейтралізації в пробірках з культурою клітин потребує значних витрат посуду, реактивів, живильних середовищ, діагностичної вірусної сировини та специфічних сироваток, кропіткої та довготривалої роботи дослідників. Саме тому, нами, було запропоновано мікромодифікацію (мікрометод) реакції нейтралізації зокрема для визначення антигенної спорідненості вірусу хвороби Ауєскі та доповнено постановку цієї реакції етапом видалення компонентів реакції попередньо внесених в лунки з культурою клітин, промиванням лунок планшета та внесенням підтримуючого середовища з метою уникнення токсичної дії досліджуваних сироваток на клітини. Даний аналог взято, як найближчий прототип. В основу корисної моделі поставлена задача технічно модифікувати постановку реакції нейтралізації з постійною дозою сироватки для визначення антигенної спорідненості штамів, клонів та ізолятів вірусу хвороби Ауєскі, шляхом розробки мікрометоду та доповнити дану реакцію процедурами видалення її компонентів з лунок плоскодонного планшета, промивання (2-3 рази) та подальшого внесення підтримуючого середовища з метою зниження ефекту токсичності сироваток на клітини. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб визначення антигенної спорідненості вірусу хвороби Ауєскі модифікованим мікрометодом реакції нейтралізації включає: висів суспензії клітин чутливої культури на 96-лункові пластикові мікропланшети з плоским дном та культивуванням її в СО2 інкубаторі 24-48 годин з концентрацією вуглекислоти 5 %; розташовування досліджуваних вірусів (ізоляти, клони, штами) десятикратними розведеннями в 96-лункових пластикових мікропланшетах з круглим дном; внесення специфічної (специфічних) сироватки в постійній дозі; експозицію компонентів для контакту протягом 1 години при 37 °C в СО2 інкубаторі; перенесення вмісту лунок планшета з круглим дном в плоскодонний планшет з експозицією 1 годину при 37 °C в СО2 інкубаторі; видалення вмісту та промивання (2-3 рази) живильним середовищем лунок плоскодонного планшета з додаванням підтримуючого ростового середовища; інкубацію протягом 5-7 діб в умовах СО2 інкубатора та облік результатів дослідження під інвертованим світловим мікроскопом. Процес постановки модифікованого мікрометоду реакції нейтралізації для визначення антигенної спорідненості вірусу хвороби Ауєскі полягає в наступному. Компоненти необхідні для реакції. Специфічні сироватки крові отримують шляхом багаторазової гіперімунізації здорових та попередньо досліджених на предмет відсутності специфічних антитіл проти вірусу хвороби Ауєскі тварин. Як біологічну модель для гіперімунізації можуть служити кролі, мурчаки, щурі, кози, свині, велика рогата худоба, коні. Збудник хвороби Ауєскі пантропний і здатний викликати захворювання у різних видів сільськогосподарських та диких тварин. Перед імунізацією готують вірусну сировину, в якій попередньо очищають, концентрують та піддають інактивації вірус. З метою одержання більш високих титрів специфічних антитіл до вірусної сировини додають ад'ювант Монтанід в концентрації 25-75 %, в залежності від виду тварин. Перед кожною реімунізацією проводять відбір крові та дослідження сироватки на предмет наявності специфічних антитіл. Об'єм та доза введеної вірусної сировини визначається дослідником в кожному окремому випадку. Негативна сироватка крові. Негативну (контрольну) сироватку крові одержують також від здорових, не імунізованих тварин того ж виду (частіше за все перед початком циклу імунізацій). Крім того негативна сироватка крові не повинна містити антитіл проти вірусу хвороби Ауєскі. Вірус хвороби Ауєскі. Використовують депоновані штами вірусу хвороби Ауєскі "Петриківський-2006", "Арський", "18 в", а також виділені його ізоляти або клони та визначають їх інфекційну активність (титр). Зберігають віруси в ліофільновисушеному вигляді або в нативному (вірусутримуюча культуральна рідина). Найкращі умови зберігання t-196 °C, або при t-80 °C. Вірус нестійкий при t-20 °C. Заморожування та розморожування вірусутримуючої рідини сприяє зниженню інфекційної активності вірусу. Тому при постановці реакції для впевненості в точності розрахунку робочого розведення вірусу слід постійно визначати його інфекційну активність шляхом титрування в чутливій культурі клітин. Культури клітин. В дослідженнях використовують чутливі культури клітин - СНЕВ, ВНК-21, ПТП, РК-15, НСГК та ін. З метою об'єктивної оцінки одержаних результатів, досліди, пов'язані з титруванням вірусів, визначенню їх інфекційної активності, антигенної спорідненості необхідно проводити в тій культурі клітин в якій пасажувалися віруси. У разі використання іншої 2 UA 77294 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 культуральної моделі обов'язково проводиться пасаж (пасажі) штамів, ізолятів, клонів вірусу на вибраній культурі з визначенням їх інфекційної активності. Перед постановкою реакції досліджувані специфічні та контрольні сироватки прогрівають у водяній бані при 56 °C протягом 30 хвилин для інактивації неспецифічних інгібіторів (класичний спосіб). Специфічні сироватки крові попередньо досліджують та визначають рівень специфічних антитіл проти вірусу хвороби Ауєскі в реакції нейтралізації з постійною дозою вірусу. За необхідності вірус (штами, ізоляти, клони) хвороби Ауєскі та сироватки крові піддають ліофілізації. Перед дослідженням висушені вірус і контрольні сироватки (позитивну і негативну) 3 розчиняють в 1 см живильного середовища. Живильні середовища (ГЛА, ДМЕМ, 199 тощо) підігрівають до температури 37 °C. Слід пам'ятати, що діагностичним титром антитіл при хворобі Ауєскі в реакції нейтралізації вважається рівень 1:8 (3 Log2). Тому для реакції використовують специфічні сироватки з активністю не нижче розведення 1:40 і в дозі 5 нейтралізуючих доз (НД) 50/мл. Перед дослідженням клітини чутливої культури в концентрації 250-270 тис клітин на 1 см висівають за допомогою автоматичної восьмиканальної піпетки на планшет з плоским дном. При цьому в кожну з лунок вносять по 200 мкл суспензії і культивують при температурі 37 °C в СО2 інкубаторі з концентрацією вуглекислоти 5 %. Стан моношару клітин оцінюють шляхом перегляду планшета в бінокулярному інвертованому мікроскопі. Моношар клітин, придатний для постановки реакції, утворюється, як правило, через 24-48 годин. В планшетах з круглим дном розтитровують досліджувані штами, ізоляти або клони вірусу хвороби Ауєскі (на кожне розведення кожного з вірусів беруть по 4 лунки) в десятикратних розведеннях таким чином, щоб останнє розведення вірусів взяте в досліді перевищувало його біологічний титр. Титр вірусу вираховують за методом Ріда і Менча та виражають у логарифмах 3 (lg) ТДЦ 50/мл. Титри інфекційної активності вірусів мають бути не нижчими 5,0 lg ТДЦ 50/см . 3 Наприклад, якщо титр вірусу становить 8,0 lg ТЦД 50/см , то в дослід необхідно брати вірус в 9 3 розведенні 10- ТЦД 50/см . Всі розведення вірусів випробовують проти гомологічної сироватки, гетерологічної та негативної (контрольної) сироваток. Для цього в першу колону рядів лунок планшета з розведеннями вірусу А додають рівний об'єм гомологічної сироватки (5 НД). До 2-ої колони рядів з розведеннями вірусу А додають рівний об'єм гетерологічної сироватки вірусу Б (5 НД). Аналогічно до 1-ої колони рядів лунок планшета з розведеннями вірусу Б додають рівний об'єм гомологічної сироватки (5 НД) та до 2-ої колони рядів пробірок з розведеннями вірусу Б додають рівний об'єм гетерологічної сироватки вірусу А (5 НД). Об'єм сироватки і вірусу повинен бути однаковим (1:1). Одночасно ставлять контролі. 1. Контроль культури клітин. В 4 лунки вносять тільки живильне середовище, для виявлення неспецифічної дегенерації клітин. 2. Контроль токсичності сироватки. Кожну досліджувану сироватку в найменшому розведенні, яке використовували в реакції, вносять в окремі 4 лунки. Внесені компоненти змішують коловими рухами планшета та витримують 1 годину для контакту в інкубаторі, після чого переносять в планшет з вирощеним моношаром клітин, з якого попередньо зливають ростове середовище, і ставлять на 1 годину при 37 °C в термостаті. Після експозиції вміст лунок планшета обережно видаляють та промивають (2-3 рази) живильним середовищем з послідуючим внесенням підтримуючого ростового середовища та інкубують протягом 5-7 діб в умовах СО2 інкубатора. Облік результатів дослідження проводять під інвертованим світловим мікроскопом. Схема перехресного дослідження вірусів № 1 і № 2 з імунними (специфічними) та негативними сироватками в реакції нейтралізації наведена в таблиці. 3 UA 77294 U Таблиця Постановка реакції нейтралізації при перехресному дослідженні вірусів хвороби Ауєскі з імунними та негативною сироватками та визначенням індексів нейтралізації Позитивна сироватка до Позитивна сироватка до Негативна сироватка вірусу № 1 вірусу № 2 Розведення вірусу вірус № 1 вірус № 2 вірус № 1 вірус № 2 вірус № 1 вірус №2 1 10++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ 2 10++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ 3 10++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ 4 10++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ 5 10+--++-++++ ++-+ ++++ ++++ 6 10------++----++++ ++++ 7 10---- - -------+++++-8 10------------+-----9 10------------------3 Титр, lg ТДЦ 50/см 4,66 5,0 6,0 5,33 7,5 7,0 Індекс нейтралізації 2,84 2,0 1,5 1,67 5 10 15 Примітка: "+" - прояв цитопатичної дії вірусу хвороби Ауєскі в моношарі клітин лунки пластикового планшета; "-" - відсутність цитопатичної дії вірусу хвороби Ауєскі; ІН - індекс нейтралізації. Особливістю вірусу хвороби Ауєскі є здатність викликати цитопатичну дію (ЦПД) в культурі клітин. Реакцію нейтралізації оцінюють за явищем наявності або відсутності прояву цитопатичної дії вірусу. Відсутність ЦПД в культурі клітин розцінюється як ознака нейтралізації його біологічної активності і вказує на наявність специфічних антитіл, а наявність ЦПД свідчить про відсутність антитіл в досліджуваних сироватках. Спочатку вираховують титри штамів вірусу в присутності специфічної та негативної сироваток. Число, яке показує у скільки разів специфічна сироватка знижує титр вірусу порівняно з контрольною, називається індексом нейтралізації. Формула визначення індексу нейтралізації (1): , (1) 20 де ІН - індекс нейтралізації; Т1 - титр вірусу в присутності нормальної сироватки; Т2 - титр вірусу в присутності специфічної сироватки. ІН розраховують для кожного вірусу. Для визначення ступеню спорідненості розраховують показники r1 та r2, (2), (3): , (2) 25 де r1 - відношення індексу нейтралізації вірусу № 2 сироваткою № 1 до індексу нейтралізації вірусу № 1 сироваткою № 1. 4 UA 77294 U , (3) 5 де r2 - відношення індексу нейтралізації вірусу № 2 сироваткою № 2 до індексу нейтралізації вірусу № 1 сироваткою № 2. Для визначення антигенної спорідненості використовують формули Архетті (4): , (4) 10 15 20 де R - антигенна спорідненість, що виражена у відсотках; r1 - відношення індексу нейтралізації вірусу № 2 сироваткою № 1 до індексу нейтралізації вірусу № 1 сироваткою № 1; r2 - відношення індексу нейтралізації вірусу № 2 сироваткою № 2; 100 - коефіцієнт. Домінантність вірусів розраховується за формулою Мореа (5): , (5) де Д - домінантність, що виражена у відсотках; r1 - відношення індексу нейтралізації вірусу № 2 сироваткою № 1 до індексу нейтралізації вірусу № 1 сироваткою № 1; r2 - відношення індексу нейтралізації вірусу № 2 сироваткою № 2; 100 - коефіцієнт. Якщо показник домінантності вищий за 100, то один штам домінуватиме над іншим, якщо нижчий - показник домінантності від'ємний і при показнику 100 - штами рівні, домінування немає. Домінантність означає, що даний вірус може забезпечити захист тварин від зараження іншим вірусом збудника хвороби Ауєскі. Відмінності між двома штамами вірусів (6): , (6) 25 30 35 40 де р - визначення відмінності між досліджуваними вірусами; У наведеному прикладі (див. таблицю): r1=0,7 r2=0,89 R=79 % (антигенна спорідненість між досліджуваними вірусами становить 79 %) Д = 89 % (домінантність дорівнює 89 %, тобто домінування штаму № 1 над № 2 не має) р = 30 % (відмінність між штамами становить 30 %) Джерела інформації: 1. Прискока В.А. Методические рекомендации по определению антигенного родства, различий и доминантности вирусов в серологических реакциях / Прискока В.А., Собко А.И., Манзий К.В. - К., 1987.-20 с. 2. Инфекционная патология животных / под ред. А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьева, Е.А. Непоклонова, Е.С. Воронина. - М.: ИКЦ "Акдемкнига", 2006. - Т. 1.-910 с. 3. Болезнь Ауески // Вирусные болезни животных / Сюрин В. Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. - М.: ВНИТИБП, 1998. - С. 603-630. 5 UA 77294 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 15 20 25 Спосіб визначення антигенної спорідненості вірусу хвороби Ауєскі модифікованим мікрометодом реакції нейтралізації, який включає висів суспензії клітин чутливої культури та культивуванням її в термостаті 24-48 годин при температурі 37 °C, розташовування досліджуваних вірусів (ізоляти, клони, штами) десятикратними розведеннями та внесення специфічної (специфічних) сироватки(ок) крові в постійній дозі методом перехресту, експозицію компонентів для контакту протягом 1 години при 37 °C в термостаті, перенесення компонентів на культуру клітин та інкубацію протягом 5-7 діб в термостаті при 37 °C та облік результатів дослідження під світловим мікроскопом за відсутності чи наявності цитопатичної дії вірусу (ЦПД) з визначенням показників - індексу нейтралізації, антигенної спорідненості, домінантності та відмінності між досліджуваними вірусами, який відрізняється тим, що використовується з метою ідентифікації ізолятів, штамів, клонів вірусу хвороби Ауєскі, висів суспензії клітин чутливої культури здійснюється в 96-лункові пластикові планшети з плоским дном, культивування культури клітин з усіма етапами постановки реакції проводиться в умовах СО 2 інкубатора з концентрацією вуглекислоти 5 %, всі маніпуляції (внесення, перенесення, титрування компонентів, промивання лунок планшет) проводяться за допомогою автоматичної восьмиканальної автопіпетки із змінними наконечниками, розташовування досліджуваних штамів вірусу хвороби Ауєскі проводиться в 96-лункових пластикових планшетах з круглим дном, з метою уникнення токсичної дії досліджуваних сироваток на клітини включено додатковий етап - видалення компонентів реакції попередньо внесених в культуру клітин шляхом промивання (2-3 рази) лунок планшета з подальшим внесенням підтримуючого середовища, а результати досліджень враховуються під інвертованим світловим мікроскопом з визначенням показників - індексу нейтралізації, антигенної спорідненості, домінантності та відмінності, що характеризують досліджувані ізоляти, клони або штами вірусу хвороби Ауєскі. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6