Спосіб виявлення специфічних гуморальних антитіл проти вірусу хвороби ауєскі мікрометодом реакції нейтралізації

Реферат: UA 77293 U UA 77293 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ветеринарної вірусології, зокрема для виявлення специфічних гуморальних антитіл проти вірусу хвороби Ауєскі в сироватках крові, молозива, молока тварин шляхом постановки мікрометоду реакції нейтралізації. В лабораторних умовах для визначення специфічних гуморальних антитіл проти вірусу хвороби Ауєскі використовуються наступні методи: реакція нейтралізації (РН), реакція дифузної преципітації (РДП), реакція непрямої гемаглютинації (РНГА), імуноферментний аналіз (ІФА). На сьогодні Міжнародне епізоотичне бюро (МЕБ) рекомендує для діагностики хвороби Ауєскі використовувати два методи: ELISA (імуноферментний аналіз) та РН (реакція нейтралізації). Реакція нейтралізації (РН). Постановку класичної реакції нейтралізації проводять згідно з методикою - "Реакция серонейтрализации", описаної в книзі "Диагностика вирусных болезней животных" З. Лярски, 1980. - С. 121-127. На відміну від твердофазного ІФА реакцію нейтралізації проводять з використанням чутливих до вірусів біологічних моделей - перещеплювані та первинно-трипсинізовані культури клітин, що вирощені на скляних матрацах і пробірках. Реакція нейтралізації базується на явищі нейтралізації інфекційної активності вірусу специфічними антитілами, які знаходяться в сироватці крові, молозива, молока. Для цього беруть рівні об'єми сироватки та суспензії вірусу і після контакту та інкубації зараженого чутливого тест-об'єкта (культури клітин) визначають чи нейтралізувався активний вірус специфічними антитілами сироватки за ознакою наявності або відсутності цитопатичної дії (ЦПД) вірусу. Відсутність прояву цитопатичної дії вірусу в культурі клітин розцінюється як ознака нейтралізації його біологічної активності і вказує на наявність специфічних антитіл в досліджуваній сироватці. Реакція нейтралізації проводиться двома способами: з постійною дозою вірусу при зменшуваних кількостях сироватки, або з постійною дозою сироватки при зменшуваних концентраціях вірусу. Реакція нейтралізації з постійною дозою вірусу дозволяє виявляти специфічні гуморальні антитіла проти різних вірусів з визначенням їх рівнів (титрів) та потребує знати інфекційний титр вірусу (вірусів). Реакція нейтралізації з постійною дозою сироватки дозволяє проводити ідентифікацію виділених ізолятів вірусів та потребує знати титр сироватки (сироваток). Суть постановки реакції нейтралізації з постійною дозою вірусу полягає в наступному. Проводять висів клітин чутливої культури з скляних матраців на пробірки та культивують при температурі 37 °C в умовах звичайного термостату. Стан моношару клітин оцінюють шляхом перегляду в бінокулярному світловому мікроскопі. Моношар клітин, придатний для постановки реакції утворюється, як правило, через 24-48 годин. 3 Для реакції готують робоче розведення вірусу 100 або 1000 ТЦД50/см . В пробірки для приготування дослідних проб мірною скляною піпеткою з грушою вносять по 1 мл живильного середовища. На кожне розведення досліджуваної сироватки готують по 4 пробірки. В перший ряд пробірок додають по 1 мл сироватки, піпетують 3 рази для змішування і 1 мл суміші переносять в наступну. Аналогічно, послідовним переносом сумішей, отримують двократні розведення сироваток. При кожному перенесенні замінюють піпетки. До отриманих розведень в пробірки додають рівний об'єм (1 мл) робочого розведення вірусу, струшують та ставлять в термостат на 1 годину для контакту вірусу з антитілами сироваток. Одночасно ставлять контролі. 1. Контроль культури клітин. В 4 пробірки вносять тільки живильне середовище, для виявлення неспецифічної дегенерації клітин. 2. Контроль токсичності сироватки. В 4 пробірки вносять сироватку в найменшому розведенні, яке використовували в реакції. 3. Контроль позитивної сироватки. Робоче розведення вірусу змішують з дворазовими розведеннями специфічної сироватки. 4. Контроль негативної сироватки. Робоче розведення вірусу змішують з дворазовими розведеннями негативної сироватки. 5. Контроль робочого розведення вірусу. З робочого розведення вірусу готують 4 ряди десятикратних розведень, так щоб у пробірках було по 1000, 100, 10, 1 і 0,1 доз вірусу. Потім суміші переносять в пробірки з вирощеним моношаром клітин, з яких попередньо видаляють ростове середовище, підписують і ставлять в інкубатор. Облік результатів реакції нейтралізації з контролями проводять 5-7 діб щодня, шляхом перегляду в бінокулярному світловому мікроскопі. Реакцію нейтралізації враховують по відсутності ЦПД в пробірках з контролем позитивної сироватки та при наявності ЦПД у контролях вірусу, негативної сироватки, токсичності сироватки, а також при відсутності слідів дегенерації в контролі культури клітин. Титром антитіл 1 UA 77293 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 в сироватці вважають останнє її розведення в якому відсутня цитопатична дія вірусу на культуру клітин. Традиційний метод постановки реакції нейтралізації в пробірках з культурою клітин потребує значних витрат посуду, реактивів, живильних середовищ, досліджуваної сироватки і діагностичного вірусного антигену, тому, в останні роки дослідники широко стали застосовувати мікромодифікацію (мікрометод) реакції нейтралізації. Зокрема виділення вірусу і його ідентифікацію мікрометодом запропоновано використовувати для ентеровірусного та трансмісивного гастроентериту свиней, хвороби Тешена. Мікрометод реакції нейтралізації для діагностики хвороби Ауєскі в Україні пропонується вперше. Даний аналог взято, як найближчий прототип. В основу корисної моделі поставлена задача модифікувати та технічно удосконалити реакцію нейтралізації для виявлення специфічних гуморальних антитіл проти вірусу хвороби Ауєскі, шляхом розробки мікрометоду. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб виявлення специфічних гуморальних антитіл проти вірусу хвороби Ауєскі мікрометодом реакції нейтралізації включає: підготовку біологічного матеріалу (сироватки крові, молозива, молока); висів клітин чутливої культури на 96-лункові пластикові мікропланшети з плоским дном; розтитровування сироваток крові - контрольних (позитивної та негативної) та дослідних в 96-лункових пластикових мікропланшетах з круглим дном; внесення робочого розведення вірусу хвороби Ауєскі (штами: "Петриківський-2006", "Арський", "18 в" тощо); експозицію на контакті протягом 1 години; перенесення вмісту лунок планшета з круглим дном в плоскодонний планшет; інкубацію протягом 5-7 діб в умовах СО2 інкубатора з концентрацією вуглекислоти 5 % та облік результатів дослідження під інвертованим світловим мікроскопом. Процес постановки мікрометоду реакції нейтралізації для виявлення специфічних гуморальних антитіл проти вірусу хвороби Ауєскі полягає в наступному. Компоненти необхідні для реакції. Специфічні сироватки крові отримують шляхом багаторазової гіперімунізації здорових та попередньо досліджених на предмет відсутності специфічних антитіл проти вірусу хвороби Ауєскі тварин. Як біологічна модель для гіперімунізації можуть служити кролі, мурчаки, щурі, кози, свині, велика рогата худоба, коні. Збудник хвороби Ауєскі пантропний і здатний викликати захворювання у різних видів сільськогосподарських та диких тварин. Перед імунізацією готують вірусну сировину, в якій попередньо очищають, концентрують та піддають інактивації вірус хвороби Ауєскі (ізоляти, клони, штами). З метою одержання більш високих титрів специфічних антитіл до вірусної сировини додають ад'ювант Монтанід, котрий використовується в 25-75 % концентрації в залежності від виду тварин. Перед кожною реімунізацією проводять відбір крові та дослідження сироватки на предмет наявності специфічних антитіл. Об'єм та доза введеної вірусної сировини визначається дослідником в кожному окремому випадку. Негативна сироватка крові. Негативну (контрольну) сироватку крові одержують також від здорових не імунізованих тварин того ж виду (частіше за все перед початком циклу імунізацій). Крім того негативна сироватка крові не повинна містити антитіл проти вірусу хвороби Ауєскі. Вірус хвороби Ауєскі. Використовують депоновані діагностичні штами вірусу хвороби Ауєскі "Петриківський-2006", "Арський", "18 в" тощо. Попередньо визначають інфекційну активність (титр). Зберігають віруси в ліофільновисушеному вигляді або в нативному (вірусутримуюча культуральна рідина). Найкращі умови зберігання t-196 °C, або при t-80 °C. Вірус нестійкий при t-20 °C. Заморожування та розморожування вірусутримуючої рідини сприяє зниженню інфекційної активності вірусу. Тому при постановці реакції для впевненості в точності розрахунку робочого розведення вірусу слід постійно визначати його інфекційну активність шляхом титрування в чутливій культурі клітин. Культури клітин. В дослідженнях використовують чутливі культури клітин - СНЕВ, ВНК-21, ПТП, РК-15, НСГК та ін. З метою об'єктивної оцінки одержаних результатів досліди пов'язані з титруванням вірусів, визначенням їх інфекційної активності, антигенну спорідненість необхідно проводити в тій культурі клітин, в якій культивувавсявірус. У разі використання іншої культуральної моделі обов'язково проводиться пасаж (пасажі) вірусу на вибраній культурі з визначенням їх інфекційної активності. Перед постановкою реакції досліджувані сироватки крові обов'язково прогрівають у водяній бані при 56 °C 30 хвилин для інактивації неспецифічних інгібіторів (класичний спосіб). Висушені 3 вірус і контрольні сироватки (позитивну і негативну) розчиняють в 1 см живильного середовища. Живильні середовища (ГЛА. ДМЕМ, 199 тощо) підігрівають до температури 37 °C. 2 UA 77293 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Постановку реакції проводять двома варіантами: із внесенням дослідних проб на сформований моношар клітин або з одночасним внесенням в лунки дослідних проб та суспензії культури клітин. 1. Постановка реакції із внесенням дослідних проб на сформований моношар клітин. 3 Суспензію клітин чутливої культури з концентрацією 250-270 тис. клітин на 1 см висівають з допомогою автоматичної восьмиканальної піпетки на 96-лунковий планшет з плоским дном. В кожну лунку вносять по 200 мкл суспензії і культивують при температурі 37 °C в СО2 інкубаторі з концентрацією вуглекислоти 5 %. Стан моношару оцінюють шляхом перегляду в бінокулярному інвертованому мікроскопі. Моношар, придатний для постановки реакції, утворюється, як правило, через 24-48 годин. 3 Для реакції готують робоче розведення вірусу 100 або 1000 ТЦД50/см . В лунки планшета вносять по 100 мкл живильного середовища. На кожну сироватку (досліджувані, позитивну та негативну) використовують по чотири лунки в кожному розведенні. В перший ряд лунок додають по 100 мкл сироватки, піпетують 3 рази для змішування і 100 мкл суміші переносять в наступний ряд. Таким послідовним перенесенням сироваток отримують двократні розведення. До отриманих розведень в лунки додають по 100 мкл робочого розведення вірусу, і змішують коловими рухами планшета. Одночасно ставлять контролі. 1. Контроль культури клітин. В 4 лунки вносять тільки живильне середовище, для виявлення неспецифічної дегенерації клітин. 2. Контроль токсичності сироватки. В 4 лунки вносять сироватку в найменшому розведенні, яке використовували в реакції. 3. Контроль позитивної сироватки. Робоче розведення вірусу змішують з дворазовими розведеннями специфічної сироватки. 4. Контроль негативної сироватки. Робоче розведення вірусу змішують з дворазовими розведеннями негативної сироватки. 5. Контроль робочого розведення вірусу. З робочого розведення вірусу готують 4 ряди десятикратних розведень, так щоб у лунках було по 1000, 100, 10, 1 і 0,1 доз вірусу. Планшет з компонентами ставлять на 1 годину в СО 2 інкубатор для контакту вірусу з сироватками. Потім вміст переносять в плоскодонний планшет з вирощеним моношаром клітин, з якого попередньо видаляють ростове середовище та ставлять в СО 2 інкубатор. Облік результатів реакції нейтралізації з контролями проводять 5-7 діб щодня, шляхом перегляду в бінокулярному інвертованому мікроскопі. Реакцію нейтралізації враховують по відсутності ЦПД в лунках з контролем позитивної сироватки та при наявності ЦПД у контролях вірусу, негативної сироватки, токсичності сироватки, а також при відсутності слідів дегенерації в контролі культури клітин. 2. Постановка реакції з одночасним внесенням усіх компонентів. 3 Для реакції також беруть робоче розведення вірусу в дозі 100 або 1000 ТЦД 50/см . Розведення сироваток і контролі роблять аналогічно як при першому способі постановки реакції, але об'єми беруть вдвоє менші (50 мкл). Планшет з сумішами ставлять на 1 годину в СО2 інкубатор для контакту вірусу з сироватками. Потім в кожну лунку додають по 100 мкл підготовленої суспензії клітин культури з 3 концентрацією 500-540 тис. клітин на 1 см і ставлять для культивування в СО2 інкубатор. Облік результатів реакції нейтралізації з контролями проводять 5 діб щодня шляхом перегляду в бінокулярному інвертованому мікроскопі. Через 18-24 години, клітини, як правило, починають утворювати суцільний моношар, а дія вірусу починає проявлятися через 24 години. При нейтралізації вірусу, також в контролях культури клітин і позитивної сироватки утворюється суцільний моношар, а в лунках, де діє вірус суцільний моношар не утворюється, або утворюється з явищами ЦПД. Реакцію нейтралізації з одночасним внесенням усіх компонентів враховують аналогічно до першого способу. Обидва варіанти постановки реакції подібні між собою. При внесенні дослідних проб на сформований моношар клітин є можливість оцінити його стан перед постановкою реакції (найбільш поширений). При одночасному внесенні усіх компонентів реакції тривалість досліду скорочується з 7 до 5 діб, оскільки не потрібно чекати формування моношару клітин, а розведення сироваток і їх змішування з робочою дозою вірусу проводиться одночасно в планшеті для культивування клітин, не використовуючи планшет для приготування дослідних проб. Джерела інформації: 1. Болезнь Ауески // Вирусные болезни животных / Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. - М.: ВНИТИБП, 1998. - С. 603-630. 3 UA 77293 U 2. МЕБ. Кодекс здоровья наземных животных. Т. 1. Общие положения / МЕБ. 19-е изд. 2010. - 471 с. 3. Лярски 3. Диагностика вирусных болезней животных / Лярски 3.; пер. Т.Г. Орловой, Я.С. Ляндесберга; под ред. и с предисл. В.Н. Сюрина. - М.: Колос, 1980. - 400 с. 5 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 20 25 Спосіб виявлення специфічних гуморальних антитіл проти вірусу хвороби Ауєскі мікрометодом реакції нейтралізації, який включає підготовку біологічного матеріалу (сироватки крові, молозива, молока), висів клітин чутливої культури, розтитровування сироваток - контрольних (позитивної і негативної) та дослідних шляхом двократних розведень, внесенням робочого розведення вірусу, експозицію внесених компонентів для контакту протягом 1 години в термостаті при температурі 37 °C, перенесенням компонентів в культуру клітин, інкубацію культури клітин протягом 5-7 діб при температурі 37 °C та облік результатів дослідження під світловим мікроскопом за відсутності чи наявності цитопатичної дії вірусу (ЦПД) з визначенням титрів специфічних антитіл, який відрізняється тим, що використовується з метою серологічної діагностики хвороби Ауєскі домашніх та диких тварин, висів суспензії клітин чутливої культури (СНЕВ, ПТП, ВНК-21, РК-15, НСГК) здійснюється в 96-лункові пластикові планшети з плоским дном, культивування культури клітин з усіма етапами постановки реакції проводиться в умовах СО2 інкубатора з концентрацією вуглекислоти 5 %, всі маніпуляції (внесення, перенесення, титрування компонентів, промивання лунок планшет) проводяться за допомогою автоматичної восьмиканальної автопіпетки із змінними наконечниками, розтитровування дослідних та контрольних (позитивна та негативна) сироваток проводиться за допомогою автоматичної восьмиканальної автопіпетки із змінними наконечниками в 96-лункових пластикових планшетах з круглим дном, як антиген для робочого розведення використовуються депоновані діагностичні штами вірусу хвороби Ауєскі ("Петриківський-2006", "Арський", "18 в" та ін.), а облік результатів досліджень проводиться під інвертованим світловим мікроскопом з визначенням титрів специфічних антитіл проти даного вірусу. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4