Спосіб активації та індукції “раннього” інтерферону

Реферат: Спосіб активації фагоцитів та індукції ″раннього″ інтерферону, що може бути застосований у біотехнології, у медичній та ветеринарній практиці з можливістю динамічного контролю 8 показників імунореактивності організму. Тваринам вводять оптимальну дозу (5×10 кл./мишу) мікробіологічного препарату на основі В. subtilis IMB В-7393 чотириразово, щодоби, що супроводжується пролонгованою індукцією ІФН, активацією клітин-ефекторів (фагоцити та природні клітини кілери). UA 77772 U (12) UA 77772 U UA 77772 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології, а саме до способу активації фагоцитів та індукції «раннього» інтерферону, що може бути застосований у біотехнології, медичній і ветеринарній практиці. Використовується штам, що знаходиться в колекції живих культур Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАНУ як перспективний штам для створення лікувальнопрофілактичних препаратів медичного та ветеринарного призначення, а також отримання харчових добавок. Штам В. subtilis IMB В-7393 IMB було селектовано як мутант, який пригнічував ріст В. subtitis (susB47) [1]. Мутантні алелі В. subtilis (sup-44) були отримані S. Zahler з використанням штамів 1 В. subtilis CU48 и В. subtilis CU1965 [ ]. Пізніше показано, що біологічна активність штаму В. subtilis 44-р пов'язана з наявністю дефективного трансдукуючого фагу, що викликає супресію 44 2 гена бактеріальної хромосоми В. subtilis (sup-44 Suppressor, leucyl-tRNA) [ ] та супроводжується втратою здатності штаму функції репарації, що обумовлює біологічну стабільність цього штаму та його біотехнологічну цінність. Необхідне детальне дослідження імуномодулювальних властивостей цього штаму, оскільки пошук сучасних надійних і не надто дорогих методів захисту організму здатних підтримувати неспецифічну резистентність організму на фізіологічному рівні є актуальним завданням ветеринарної та медичної практики. Актуальність дослідження способу активації фагоцитів та індукції «раннього» інтерферону і корисних властивостей штаму В. subtilis IMB В-7393 обумовлено також положенням про безпечне використання бактерій виду В. subtilis (результати досліджень фахівців всесвітніх організацій у галузі харчування - SCAN, FAO/WHO). Аеробні споророутворюючі мікроорганізми включено до переліку перспективних кандидатів для створення пробіотичних препаратів, оскільки вони здійснюють поліфункціональний вплив на організм та є продуцентами біологічно 3 4 5 активних речовин [ ; .; .]. На сьогодні в світовій практиці створено велику кількість препаратів на основі спороутворюючих мікроорганізмів, які відносять до покоління антагоністів, здатних самостійно елімінуватись із організму. Найбільш відомими є бактисубтил, ("Marion Merrell" /Франция/) та його аналог флонівін БС ("Galenika" /Югославия/), що містять B.cereus IP 5832 з коллекції Інституту Пастера (Париж), споробактерин, Росія (В. subtilis 534), біоспорин, Україна (В. subtilis УКМ В-5007; В. licheniformis УКМ В-5514), ентерогермін, що містить чотири штами B.clausii Т, N/K, О/С та SIN, ("Sanofi Winthrop" Італія), цереобіген ("Xing Лап", Китай), діюча 6 7 8 9 10 11 речовина якого - штам B.cereus DM-42S.) [ , , , , , ]. Використання препаратів на основі аеробних бацил при різноманітних захворюваннях людини та тварин свідчило про їх вагомий профілактичний та терапевтичний ефект, який 12 обумовлено комплексною метаболічною та антимікробною активністю [ ]. Проте використання даного штаму може бути більш широким оскільки Bacillus subtilis IMB В7393 має значну імуномодулювальну активність, що може бути використано для імунокорекції організму в медичній і ветеринарній практиці. Потреба в надійних засобах імунокорекції організму обумовлює пошук нових перспективних штамів аеробних спороутворюючих мікроорганізмів, які здатні зменшити витрати на створення і використання специфічних імунних методів захисту, знизити ризик розвитку стійкості до антибіотичних препаратів та зменшити їх побічні ефекти. Слід зауважити вузькій спектр пробіотичних культур на основі аеробних бацил, що використовують у сучасних медичних препаратах на Україні. Так, потреби населення задовольняються переважно за рахунок штамів, що входять до складу Біоспорин (В. subtilis 13 УКМ В-5007; В. licheniformis УКМ В-5514), штами В. subtilis 2335 та В. Hcheniformis 2336 [ ], що містить біоспорин (Росія), надано українськими вченими Співаком М.Я., Резником СР., Смірновим В.В., тобто ці штами Ідентичні В. subtilis УКМ В-5007 та Bacillus licheniformis УКМ В5514. Найближчим аналогом корисної моделі, що заявляється, виходячи з біологічної активності культури В.subtilis IMB В-7393, є спосіб, в якому "Біоспорин" "Біофарма" використовується для 14 профілактики і лікування гострих кишкових інфекцій та дисбактеріозів різної етіології [ ]. Виробництво "Біоспорин" більш економічно затратне, оскільки для отримання еубіотика "Біоспорин" необхідно змішувати мікробні біомаси штамів двох культур, що були накопичені окремо, шляхом глибинного культивування на живильному середовищі з різним вмістом амінного азоту. Так, для В. subtilis ВКПМ В-2335 вмістом амінного азоту від 0,27 до 0,31, а для 15 Bacillus licheniformis ВКПМ В-2336 від 0,37 до 0,41 г/дм3. [ ]. В той же час імунобіотик, що містить лише В. subtilis IMB В-7393, значно економічний, оскільки містить лише одну культуру, та має вагомий активуючий вплив на природну резистентність організму. Даний штам має суттєві переваги не тільки з препаратом Біоспорин, але за імуномодулюючою активність 1 UA 77772 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 наближається до відомого монопрепарату "Субалин", що містить культуру В. subtilis 2335, яка трансформована плазмідою рВМВ 105, що кодує синтез секреторного а-2 інтерферону. Крім цього, імунобіотик на основі В. subtilis IMB В-7393 більш економічний порівняно з іншим препаратом "Субалін-форте", що містить мікробний консорціум трансформованих культур В. subtilis 2335/pBMB 105; Bacillus licheniformis 2336/рВМВ 105, оскільки вказані культури також накопичують окремо, шляхом глибинного культивування на живильному середовищі з різним вмістом амінного азоту та достатніми умовами аерації. Слід зауважити, що препарат "Субалін" є продуцентом рекомбінантного -2 інтерферону, продукція якого залежить від наявності кисню, при культивуванні штаму в умовах низької аерації спостерігається значне зниження синтезу -2 16 ІФН [ ]. Відомо, що в умовах травного тракту спостерігається низький рівень аерації, що суттєво знижує ефективність синтезу -2 ІФН. В той же час, в умовах недостатку кисню при проходженні через травну систему спори В. subtilis IMB В-7393 активно утворюють вегетативні клітини, збільшуючи чисельність популяції, що супроводжується індукцією ендогенного інтерферону. Суть "ендогенної інтерферонізації", зводиться до включення в організмі власної системи продукції ІФН під дією перорального застосування культури В. subtilis IMB В-7393 і, таким чином, позбавлення необхідності введення екзогенного ІФН. Крім цього, слід зауважити, що терапевтична дія рекомбінантного інтерферону, завжди продукту одного гена, значно слабша, порівняно з Інтерферонами природного походження, оскільки він не містить додаткових біологічно-активних компонентів. Рекомбінантні препарати інтерферону найбільш ефективні тільки при внутрішньом'язовому введенні великих доз препарату (мегадоз). Слід зауважити, що індуковані В. subtilis IMB В-7393 власні інтерферони не викликають сенсибілізації організму та алергічних проявів при довготривалому використанні індукторів ІФН 17 [ ]. В основу корисної моделі поставлено задачу пошуку нового способу активації фагоцитів та пошук нового індуктора "раннього" / та  - ІФН, з високим рівнем здатності до активації фагоцитів та природних клітин кілерів серед аеробних спороутворюючих мікроорганізмів з високою антагоністичною активністю та розширенню спектра перспективних пробіотичних культур. 1. Культурально-морфологічні та фізіолого-біохімічні особливості штаму. Грампозитивні, спорутворючі аеробні палички, із закругленими кінцями. Штам вирощується при 38±1 °C протягом 24-48 год. на поживному середовищі Гаузе, МПА, сусло агарі. В мазках з колоній, що виросли на МПА через 18 год. можна побачити прямі палочковидні клітини розміром 0,8×2,7 мкм, які розташовані поодиноко, зрідка ланцюгом. Клітини рухливі, утворюють спори овальної форми, при спороутворенні не роздуваються. На середовище Гаузе при температурі 37 °C на 24-48 годину культивування утворюють складчасті, матові колонії розово-білуватого кольору. Зберігає життєздатність на середовищах у присутності жовчі, холестерину, шлункового соку, ферментів травлення. Штам не росте в анаеробних умовах і при 10 % NACL, не гідролізує сечовину, не продукує аргієінгідролазу, росте у присутності 7 % NACL, гідролізує крохмаль на казеїн, розріджує желатину. Ферментує глюкозу, арабінозу ксилозу, маніт з утворенням кислоти без газу. Редукує нітрати, не має коагулазної та лецитиназної активностей. Культура добре засвоює широко коло вуглеводних субстратів: маніт, глюкоза, сахароза, фукоза, маноза, рафіноза, арабіноза, ксилоза, картопляний крохмаль, соєве борошно, розчинний крохмаль, лактоза. Відношення до азотного живлення: культура добре засвоює нітратний азот. Штам нетоксичний, авірулентний. Відношення до кисню: облігатний аероб. Відношення до температури: мезофіл, оптимальна температура для росту 37-42 °C. 2. Штам є непатогенним. Проводили первинну санітарно-гігієнічну оцінку даного штаму, а саме досліджували у гострих дослідах один із показників патогенності - вірулентність активних життєздатних клітин 18 19 20 21 на моделі білих мишей [ ; ; ; ] Встановлено, штам бактерій В. subtilis IMB В-7393 згідно з отриманими результатами у гострих дослідах на безпородних білих мишах та відповідних нормативних матеріалів належить 9 до групи авірулентних мікроорганізмів, так доза 14,0×10 клітин/мишу при пероральному або внутрішньочеревному введені не викликала змін у поведінці тварин, всі тварини були активними, добре поїдали корм, фізіологічні відправлення у них не порушувались, клінічних ознак токсикозу не відмічено. 2 UA 77772 U 5 10 15 20 3. Штам довготривало зберігається (2 роки і більше) в сублімованому стані в запаяних ампулах. Захисне середовище під час ліофільного висушування: сахароза 10 %, желатин 1 %, рН 7,0±0,2. 4. Активність штаму 4.1. Вивчення біологічних властивостей штаму Оптимальні дози та дозозалежний вплив В. subtilis IMB В-7393на продукцію інтерферону та показники природної резистентності досліджували на безпородних мишах вагою 14-16 р. Тварини, підібрані за принципом аналогів, були розділені на 9 груп по 20 голів у кожній. Мишам першої, другої і третьої груп протягом 4 днів з інтервалом в 24 години вводили per os по 0,5 мл 9 8 6 добової суспензії В. subtilis IMB В-7393 в дозах відповідно групам (1×10 , 5×10 , 1×10 кл / мишу). У четвертій і п'ятій групах вивчали інтерфероногенну активність В. subtilis IMB В-7393 і 8 6 9 препарату "Біоспорин" при одноразовому введенні в дозі 5×10 , 1×10 , 1×10 кл / мишу. Мишам шостої, сьомої та восьмої дослідних груп вводили перорально "Біоспорин" (контрольний 8 9 6 пробіотічний препарат "Біофарма" Україна) в дозі відповідно (5×10 , 1×10 , 1×10 кл/мишу) протягом 4 днів. Мишам дев'ятої контрольної групи вводили по 0,5 мл 0,15 М NaCl. Продукцію ІФН визначали у інтактних і дослідних мишей через 6 та 12 год. і кожні наступні 48 годин протягом 9 діб після початку введення препаратів. Для цього по кілька мишей з кожної групи забивали методом 22 цервікальної дислокації і отримували сироватку крові тварин [ ], макрофаги перитонеального 23 ексудату (МФПЕ) [ ]. Таблиця 1 Дозозалежний вплив В. subtilis B-7393 та препарату "Біоспорин" на продукцію інтерферону in vivo Кількість Група тварин, мишей що отримали штук Шлях Схема введення застосування Доза мл Доза, КУО Рівень ІФН Log2 Од/мл, період спостереження, доба діб 1 3 6 9 Дослід: І - група В. subtilis B7393 ІІ - група В. subtilis B7393 ПІ-група В. subtilis B7393 IV - група В. subtilis B7393 V - група "Біоспорин» VI - група «Біоспорин» VII - група «Біоспорин» VIII - група «Біоспорин» 9 20 0,5 1,0×10 per os 20 0,5 5х10 20 0,5 20 0,5 5х10 20 5х10 20 5х10 4 6,0±0,01 6,0±0,01 6,0±0,01 4,3 8 per os 4 6,2±0,01 6,2±0,01 6,0+0,01 4,3 6 per os 4 5,4±0,01 5,2±0,01 5,0+0,01 4,3 8 per os 1 6,2±0,01 5,2±0,01 4,3 4,3 8 per os 1 5,8±0,01 5,0 4,3 4,3 8 per os 4 5,8 5,6 5,4 1,0×10 per os 4 1·10 9 20 6 1·10 20 per os 4 5,8±0,01 5,8±0,01 5,6±0,01 5,2 5,1 4,8 4,3 4,3 Контроль: IX-група 0,15 М NaCL 20 0,5 0 per os 4 4,30±0,06 4,30±0,06 4,30±0,06 4,30±0,06 *Примітка: per os - введення в шлунок за допомогою зонда. 3 UA 77772 U 5 10 15 20 25 Як свідчать результати, наведені у таблиці 1, при введенні в організм культури В. subtilis B7393 та препарату Біоспорин за двома схемами застосування одноразово та протягом 4 діб відмічається вагома інтерфероногенна активність (див… При іншій схемі культуру В, subtilis B-7393 вводили per o$ щоденно чотириразово (5 × 10 кл/ мишу), така схема застосування, виявилась більш ефективною та дозволяла підтримувати досягнутий рівень ІФН до (6,2±0,01 log2 Од/мл; Р