Спосіб класифікації індукторів інтерферону за кількісними показниками експресії генів інтерферону

Реферат: Спосіб класифікації індукторів інтерферону за кількісними показниками експресії генів інтерферону методом зворотної транскрипції - полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), причому розраховується співвідношення кількісних показників експресії генів інтерферону, пртеїнкінази, UA 72028 U (12) UA 72028 U РНКази L, і 2-5-олігосинтетази під впливом препаратів, які вже використовуються в медичній практиці або знаходяться на стадії доклінічних досліджень. UA 72028 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до молекулярної біології, вірусології і медицини, зокрема, стосується класифікації індукторів інтерферону (ІФН) природного і хімічного походження за їх здатністю активувати гени-мішені ІФН і можливості кількісної оцінки їх активуючої дії. Інтерферони належать до родин білків і глікопротеїнів невеликої молекулярної маси від 15 до 27 кДа, які продукуються клітинами, головним чином, у відповідь на вірусну інфекцію, але також у відповідь на синтетичні та природні індуктори [1]. За своїми структурними та функціональними властивостями інтерферони розділяють на дві групи. До ІФН І типу належать ІФН альфа, бета, омега та тау. До ІФН II типу - ІФН гамма. Всі ІФН І типу мають багато спільного в нуклеотидних послідовностях генів і амінокислотних послідовностях білків [2]. В природних умовах численні віруси індукують синтез переважно ІФН альфа, а мікроорганізми - переважно ІФН гамма [3]. Серед природних і синтетичних індукторів інтерферону і його мішеней чільне місце посідають сам інтерферон і дволанцюгові РНК PolyI:PolyC. Молекули інтерферону I і II типу активують експресію генів-мішеней опосередковано, вони взаємодіють з відповідними рецепторами на поверхні клітини подібно до білкових гормонів, факторів росту та інших медіаторів міжклітинної взаємодії. Після зв'язування з рецепторами ініціюється ланцюг складної внутрішньоклітинної передачі сигналу, яка розпочинається від внутрішньоклітинної частини рецептора і закінчується в ядрі активацією/інактивацією транскрипції генів - мішеней інтерферону. Транскрипція відповідних генів та синтез білкових продуктів призводить до спрацьовування ефекторних внутрішньоклітинних механізмів, що є специфічними для дії інтерферону. В кінцевому рахунку спостерігаються численні ефекти дії інтерферону як на клітинному рівні, так і на рівні організму в цілому, що в разі вірусної інфекції призводить до інгібування реплікації вірусу. Такий ефект відбувається через здатність інтерферону активувати гени-мішені, серед яких ген 2-5-олігоаденілатсинтетази (2-5 ОАС) та РНКази L, яка розщеплює РНК переважно вірусного походження, ген еукаріотичного фактору ініціації трансляції 2α (eIF2), який гальмує трансляцію мРНК і, відповідно, утворення білків. В теперішній час існує декілька характеристик індукторів інтерферону - інтерфероніндукуюча активність in vitro та in vivo, тип індукованого інтерферону і динаміка його індукції. Але така характеристика індукторів не дає ніякого уявлення щодо механізму дії цих індукторів, їх здатності активувати/інгібувати експресію генів, які є мішенями ендогенного інтерферону. Найближчим до використаної моделі можна вважати спосіб визначення цитокінового статусу людини на генетичному рівні [4], який полягає в тому, що оцінюють на транскрипційному рівні активність генів інтерферону, інтерферонзалежних та проліферативних цитокінів. Використання даного способу в клінічних дослідженнях дає необхідну інформацію про існуючі взаємозв'язки в зоні ІФН-залежних та цитокінових реакцій клітин в нормі та при різних патологічних станах. Суть корисної моделі полягає у визначенні активності індукторів інтерферону методом зворотної транскрипції - полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) і класифікації індукторів інтерферону за співвідношенням кількісних показників експресії генів інтерферону, протеїнкінази, РНКази L і 2-5-олігоаденілатсинтетази. Задача вирішується шляхом кількісного визначення експресії генів системи інтерферону протеїнкінази R (ПКР), 2'-5'-олігоаденілатсинтетази 1a (2'-5'-ОАС) та РНКази L методом ПЛР під впливом препаратів, які вже використовуються в медичній практиці і які ще знаходяться на стадії доклінічних досліджень. В дослідженні використовуються відомі молекулярно-біологічні методи визначення вмісту мРНК ІФНу в тотальній РНК, які мають високу специфічність, чутливість та наочність. Приклад 1 Як модель для випробування були використані щури, яким вводили препарати природного і хімічного походження і визначали вміст мРНК, які кодують інтерферон альфа, протеїнкіназу R, РНКазу L і 2'-5'-олігоаденілатсинтетазу, в тотальній РНК із печінки [5]. Спосіб дозволяє визначити кількісний вміст мРНК ІФН-регульованих генів, що експресуються в печінці щура під впливом різних індукторів. Дію індукторів природного і хімічного походження порівнювали з дією інтерферону альфа і класичного ендогенного індуктора - дволанцюгової PolyI:PolyC. Зразки брали у інтактних тварин, а також через 24 год. після введення внутрішньочеревно по 0,5 мл препаратів у концентраціях, які вказані в табл. 1. 1 UA 72028 U Таблиця 1 Характеристика використаних препаратів № п/п Назва препарату 1 2 Heberon 6 Амізон 7 Мімікрин -392 8 Трилумін 9 Протефлазид 10 20 Альтабор 5 15 PolyI:PolyC 4 10 Рамназин С 3 5 Рамназин П Лектин хурми Складові частини Концентрація природний, 7,3'-диметилкверцетин, виділений з 0,96 мкг/мл Протефлазиду синтетичний - триметил-кверцетин і тетраметил0,096 мкг/мл кверцетин Еталонний індуктор ІФНу- полінозин - поліцитидин) 100 мкг/мл фірми "Calbiochem" Субстанція - сумарний комплекс поліфенолів суцвіт вільхи сірої і клейкої, яка містить не менш 60 % 1 мг/мл елаготанінів моно- та олігомірної природи, близько 10 % полімеру, 100 мкл/мл Рекомбінантний альфа-2 інтерферон, 100 000 МО Субстанція препарату амізон-4-(N-бензил) 1 мг/мл амінокарбоніл-1-метилпіридиній йодид вуглеводвмісний біополімер з культурального 25 мкг/мл середовища Staphylococcus aureus штам 392 Включає в себе екстракт спеціально обробленої культури грампозитивної спороутворюючої аеробної розведення ґрунтової бактерії Bac. subtilis та спеціально оброблену 1:100 кров великої рогатої худоби, натрій хлорид та воду для ін'єкцій - в розведенні Містить флавоноїдні глікозиди, виділені з диких злаків Deschampsia caespitosa L. (щучка дерниста), Calamagrostis epigeios L. (війник наземний), 3,2 мкг/мл флавоноїдів в перерахунку на рутин не менш 0,32 мг/мл Ізольований з хурми сіалоспецифічний глікопротеїн 1 мг/мл Тотальну РНК виділяли реагентом Тризол; кДНК синтезували за допомогою зворотної транскриптази M-MuLV (Fermentas, Литва) та випадкових гексамерних праймерів (Амплісенс, Росія). Специфічні фрагменти кДНК ІФН, ПКР, РНКаза L, 2-5 ОАС напрацьовано методом ПЛР із використанням специфічних праймерів (Синтол, Росія). Послідовності відповідних кДНК взято з бази даних NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Праймери та умови ампліфікації специфічних фрагментів підібрано в програмі Vector NTI suite, а їхню специфічність перевіряли у програмі Blastn. Для кількісної полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі (кПЛР-РЧ) використовували спеціальний набір реактивів з флюоресцентним барвником SYBR Green І та пасивним референтним барвником RОX (Синтол, Росія). Визначення кількості специфічної мРНК ІФНу у тотальній РНК проводили за калібрувальною кривою, для побудови якої використовували розчини очищеного (для кДНК 2-5 ОАС та РНКази L) або клонованого (для кДНК ІФН альфа та ПКР) ПЛР-продукту відомої концентрації. Після розрахунків результати кПЛР-РЧ наводили в кількості копій індивідуальних РНК в одному мкг тотальної РНК та розраховували співвідношення кількості мРНК досліджуваних генів при введенні препаратів до кількості відповідних мРНК в нормі. Дані з кількісної експресії генів інтерферону, ПКР, РНКази L і 2-5 ОАС надані в табл. 2 у відносних одиницях в порівнянні з вмістом мРНК, яка кодує інтерферон. 2 UA 72028 U Таблиця 2 Відносний вміст індивідуальних РНК в тотальній РНК Препарати Рамназин природний Рамназин синтетичний Альтабор Амізон Мімікрин Трилумін Протефлазид Лектин хурми PolyI:PolyC Heberon Співвідношення кількості копій мРНК Нормалізація даних по кількості копій дослід/контроль ІФН мРНК * ІФН ПКР РНКаза L 2-5 ОАС ІФН ПКР РНКаза L 2-5 ОАС 3,1 7,3 14,5 1,2 1 2,35 4,7 0,38 3,6 16,5 20,3 3,6 1 4,58 5,6 1 4,1 3,7 3,3 5,7 3,6 2,8 5,0 4,1 17,4 15,5 18,4 18,2 22,6 13,8 17,0 18,3 34,6 51,1 46,7 46,7 24,4 19,1 20,2 37,4 10,1 12,3 9,1 10,9 11,7 14,1 15,2 12,4 1 1 1 1 1 1 1 1 4,24 4,18 5,57 3,19 6,27 4,9 3,4 4,46 8,4 13,8 14,15 8,19 6,7 6,7 4,04 9,12 4,1 3,32 2,75 1,91 3,25 5,0 3,04 3,02 * Нормалізовані дані - це співвідношення кількості копій мРНК дослід/контроль для кожного з досліджуваних генів, поділене на співвідношення кількості копій ІФН мРНК дослід /контроль. В результаті визначено співвідношення експресії генів ІФНу при введенні екзогенного інтерферону та стандартного індуктора інтерферону PolyI:PolyC: 5 екзогенний інтерферон: PolyI:PolуC: 10 15 20 25 30 35 мРНК ІФН: ПРК: 1,0: 4,5: 1,0: 3,5: РНКаза L: 2-5 ОАС 9,0: 3,0 4,0: 3,0 Серед використаних препаратів-індукторів інтерферону повної збіжності кількісної експресії генів ІФНу з екзогенним ІФНом та стандартним індуктором ІФНу PolyI: PolyС - немає. Подібності з екзогенним ІФНом із збільшенням експресії гена 2-5 ОАС притаманні для альтабору, із кількісним збільшенням мРНКРНКази L для амізону і ПРК та РНКази L - мімікрину бактерійному. При порівнянні кількісної експресії генів ІФНу, індукованих PolyI:PolyС та досліджуваних індукторів показано, що рівень експресії гена ПРК та РНКази L вище для Рамназину синтетичного, амізону, мімікрину, протефлазиду; генів ПКР, РНКази L, 2-5 ОАС - для альтабору та лектину хурми. Рамназини природний та синтетичний відрізняються значним зменшенням експресії гена 2-5 ОАС. Результати досліджень свідчать про те, що індуктори інтерферону природного та хімічного походження з однаковим рівнем біологічної активності і майже однаковим рівнем експресії ІФНу мають різні кількісні співвідношення мРНК ПРК, РНКази L, 2-5 ОАС. Серед досліджених препаратів встановлені індуктори ІФНу, які стимулюють експресію генів ІФНу, ПКР, РНКази L та 2-5 ОАС відповідно до екзогенного ІФНу, що дуже важливо при заміні екзогенного ІФНу його індуктором. Препарати альтабор та лектин хурми є більш ефективні в індукції експресії генів ПКР, РНКази L, 2-5 ОАС, а препарати протефлазид, амізон, мімікрин більш ефективні в експресії генів ПКР, РНКази L, ніж стандартний індуктор інтерферону PolyI:PolyC. Джерела інформації:: 1. Isaacs A., Lindenmann J. Virus interference. I. The interferon // Proc. R. Soc. Lond. Biol.-1957.147. - P. 258-267. 2. Stewart H.J., McCann S.H.E., Flint A.P.F. Structure of interferon α2 gene expressed in the bovine conceptus early in gestation// J. Mol. Endocrinol.-1990.-4. - P. 275-282. 3. Marcus, P.I. The interferon inducer moiety of viruses: a single molecule of dsRNA. // Tex. Rep. Biol. Med. 1981.-41. - P. 70-75. 4. Соколова Т.М., Урываев Л.В. Способ определения цитокинового статуса человека на генетическом уровне. Патент 2181773 от 27.04.2002. 3 UA 72028 U 5. Слончак A.M. Сазонова Л.Я., Губар О.С. та ін. Експресія генів, які кодують альфаінтерферон, його рецептор, протеїнкіназу R та рибонуклеазу L в інтактній та регенеруючій печінці щурів// Наукові записки НаУКМА. Біологія та екологія.-2005. - Т. 43. - С. 25. 5 10 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб класифікації індукторів інтерферону за кількісними показниками експресії генів інтерферону методом зворотної транскрипції - полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), який відрізняється тим, що розраховується співвідношення кількісних показників експресії генів інтерферону, протеїнкінази, РНКази L, і 2-5-олігосинтетази під впливом препаратів, які вже використовуються в медичній практиці або знаходяться на стадії доклінічних досліджень. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4