Спосіб кількісного визначення левотироксину натрію

Реферат: Спосіб кількісного визначення левотироксину натрію передбачає приготування проби для аналізу, взаємодію її з розчинами хлориду лантаніду і органічного реагенту-сенсибілізатора. Як реагент-сенсибілізатор використовують розчин 1-етил-4-гідроксі-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3карбонової кислоти-(4-метил-пірідин-2-іл)-аміду, як хлорид лантаніду використовують хлорид тербію при заданому рН, опромінювання утвореної системи УФ-світлом та вимірювання інтенсивності люмінесценції реакційного розчину, за величиною якої визначають концентрацію левотироксину натрію. UA 78423 U (12) UA 78423 U UA 78423 U Корисна модель належить до аналізу матеріалів, а саме до флуоресцентного визначення тиреоїдного гормону щитовидної залози - О-(4-Гідрокси-3,5-дийодфеніл)-3,5-дийод-L-тирозину натрію (левотироксину натрію; L-тир) (див. Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Новая волна, 2006, с. 548). I HO I O NH2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 I I COONa . L-тир Тиреоїдний гормон щитовидної залози - йодоване похідне амінокислоти тирозину левотироксин натрію, необхідна складова всіх живих організмів, відіграє важливу роль у регулюванні процесів метаболізму, тому актуальна задача підвищення чутливості визначення Lтир завдяки застосуванню люмінесцентних зондів (органічних барвників, комплексів металів), люмінесценція котрих значно змінюється при взаємодії з L-тир (збільшується або гаситься). Лантанідні комплекси широко вживають як люмінесцентні зонди для визначення органічних сполук (зокрема лікарських препаратів), нуклеїнових кислот та в імунофлуоресцентному аналізі. Люмінесценція у цих комплексах є результатом ефективної внутрішньомолекулярної передачі енергії від органічної частини молекули до іона лантаніду. Ефективність застосування таких комплексів як аналітичних форм в біоаналітичній хімії обумовлена їх вузькими емісійними смугами, можливістю усунення впливу біологічної матриці на аналітичний сигнал. Відомий спосіб, який полягає у гасінні інтенсивності люмінесценції (І люм) органічного барвника - 7-гідроксикумарину при додаванні L-тир (див. Elmas Gök, Canan Oztiirk, Nuriye Akbay. Interaction of Thyroxine with 7 Hydroxycoumarin: A Fluorescence Quenching Study // J. Fluorescence. - 2008. -V. 18, № 5. - P. 781-785). Спосіб передбачає додавання компонентів у -7 наступній послідовності: розчини 7-гідроксикумарину (5 × 10 моль/л); L-тир (0,4-3,0) моль/л, -6 катіонного детергенту цетилтриметиламонію броміду (1 × 10 моль/л) та буферного розчину (рН = 7,4). Далі цю суміш залишають на 20 хвилин і потім реєструють І люм при збудж=334 нм та -8 еміс=464 нм, межа виявлення 3,42 × 10 моль/л. Недоліками даного способу є: залежність люмінесцентного сигналу від часу реагування компонентів системи, у зв'язку з чим визначення І люм необхідно вести при фіксованому часі (20 хвилин), а також використання додаткового компоненту - поверхнево-активної речовини, що ускладнює аналіз. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб люмінесцентного визначення L-тир (див. Elmas Gök, Serdar Ates. Fluorimetric Determination of Thyroxine Hormone with Eu(III)(Pyridine-2,6-Dicarboxylate) Tris Complex // J. Fluorescence.-2003. - V. 13, №3. - P. 221-225), в -5 якому до розчину хлориду європію (1,0 × 10 моль/л) додають розчин дипіколінової кислоти 5 (ДПК) (1,9 × 10' моль/л), розчин L-тир (15,5-551,6 мкг/мл), піперазиновий буферний розчин рН=6,5, перемішують, залишають на 10 хвилин, записують люмінесценцію при збудж = 282 нм та еміс = 615 нм. Інтенсивність люмінесценції комплексу європію з ДПК зменьшується у 3,5 рази в присутності 300 мкг/мл L-тир (це максимальна концентрація з інтервалу лінійності). Межа кількісного визначення L-тир в цьому способі становить 15,5 мкг/мл. Цей спосіб визначення L-тир застосовує гасіння люмінесценції зонду (комплексу європію з ДПК). Даний спосіб обрано найближчим аналогом. Найближчий аналог та спосіб, що заявляється, мають такі спільні ознаки: приготування проби; взаємодія левотироксину натрію з розчином комплексу лантаніду з відповідним органічним реагентом при заданому рН водного середовища; опромінювання утвореної потрійної системи УФ світлом. вимірювання інтенсивності люмінесценції розчину у видимій області спектра. Але спосіб за найближчим аналогом забезпечує межу кількісного визначення L-тир, яка дорівнює 15,5 мкг/мл. У способі за найближчим аналогом вживають сенсибілізовану люмінесценцію комплексу європію з ДПК. Молярний коефіцієнт поглинання дипіколінової 3 -1 -1 кислоти при =270 нм невеликий: =3,11·10 л·моль ·см , у зв'язку з чим відсутнє ефективне поглинання енергії збудження, наслідком чого є низька інтенсивність люмінесценції комплексу. Відомо, що для створення методик визначення по гасінню люмінесценції зонду необхідно використовувати комплексні сполуки з високим квантовим виходом. 1 UA 78423 U 5 10 15 20 25 30 35 В основу корисної моделі поставлена задача розробки способу кількісного визначення левотироксину натрію за ефектом гасіння люмінесценції комплексної сполуки лантаніду, в якому за рахунок заміни реагентів (іону лантаніду та реагенту-сенсибілізатора), а також інших умов проведення реакції та режимів опромінювання і вимірювання люмінесценції тербію, забезпечується більш висока люмінесценцію зонду, що призводить до підвищення чутливості визначення левотироксина натріу (гасника). Поставлена задача вирішена в способі визначення левотироксину натрію, що передбачає приготування проби для аналізу, взаємодію її з розчинами хлориду лантаніду і органічного реагента-сенсибілізатора при заданому рН, опромінювання утвореної системи УФ-світлом та вимірювання інтенсивності люмінесценції реакційного розчину за величиною якої визначають концентрацію левотироксину натрію, згідно з корисною моделлю, як органічний реагентсенсибілізатор використовують розчин 1-етил-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонової кислоти-(4-метил-піридин-2-іл)-аміду, як хлорид лантаніду використовують хлорид тербію, їх взаємодію здійснюють при рН 7,0-8,0, опромінювання проводять УФ-світлом при збудж = 317 нм, а вимірювання інтенсивності люмінесценції реакційного розчину здійснюють при еміс = 545 нм. Новим у корисній моделі, що заявляється, є наявність наступних ознак: як лантанід використовують тербій (III); як органічний реагент використовують 1-етил-4-гідроксі-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3карбонової кислоти-(4-метил-піридин-2-іл)-амід; опромінювання утворенної системи Тb(III)-L-L-тир УФ-світлом з збудж = 317 НМ. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю суттєвих ознак, що заявляються, і технічним результатом, що досягається, полягає в наступному: молярний коефіцієнт поглинання L приблизно в 15 разів більше, ніж у дипіколінової кислоти, що приводить до більш ефективного поглинання енергії збудження, наслідком чого є висока інтенсивність люмінесценції водного розчину комплексної сполуки тербію з наведеним органічним реагентом; інтенсивність люмінесценції комплексу тербію з L зменшується у 8,5 разів в присутності 300 мкг/мл L-тир; використання цього люмінесцентного зонда дозволяє знизити межу кількісного визначення L-тир у 3 рази. Визначення стало можливим завдяки використанню нового люмінесцентного зонда комплексу тербію з реагентом 1-етил-4-гідроксі-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонової кислоти(4-метил-піридин-2-іл)-амідом (див. І.В. Українець, С.А. Ель Каяль, О.В. Горохова, Л.В. Сидоренко. Синтез та протитуберкульозна активність метилзаміщених піридил-2-амідів 1-R-2оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонових кислот // Фарм. журн.-2004. - № 4. - С. 47-53). Це можна пояснити наступним. Органічний реагент належить до похідних 2-оксо-4-гідроксихінолінкарбонової кислоти і має таку структурну формулу: CH3 OH O N H N N O C2H5 40 45 L. Обробка стандартного розчину солі тербію водним розчином реагенту L також, як і у випадку найближчого аналога, сенсибілізує люмінесценцію тербію. Цей реагент має в ультрафіолетовій області спектру смуги поглинання з високими молярними коефіцієнтами екстинкції (313 = 49000 -1 -1 л·моль см ), що обумовлює ефективне поглинання енергії збудження. Ця енергія передається -1 5 -1 з триплетного рівня ліганду (Ет = 22220 см ) на енергетичний рівень Тb(ІІІ) (E D4=20500см ), що призводить до значного зростання Ілюм тербію. Взаємодія L-тир з люмінесцентним зондом - комплексом Tb(III)-L відбувається при рН 4,010,0, максимум люмінесценції спостерігається при рН 7,0-8,0 (див. Фіг. 1, де наведено залежність інтенсивності люмінесценції (відн. од.) системи Tb-L-L-тир від рН розчину (CTb(III) = -6 CL=110 моль/л; СL-тир = 100 мкг/мл)). У запропонованому способі для утворення оптимального рН середовища використовується 40 % уротропіновий розчин (рН=7.5). 2 UA 78423 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Максимальний ефект гасіння спостерігається при співвідношенні Tb: L=1:1, оптимальна 3+ -5 концентрація іонів Tb та реагенту становить 110 моль/л. Необхідний час для реагування компонентів системи Тb(ІІІ)-L-L-тир та досягнення оптимального аналітичного сигналу становить 5 хвилин. Далі інтенсивність люмінесценції залишається постійною протягом 3 годин (див. Фіг. 2, де наведено залежність інтенсивності люмінесценції (відн. од.) системи Тb(III)-b-b-тир від часу -5 реагування компонентів (СTb = CL=1 10 моль/л; CL-тиp=100 мкг/мл)). Гасіння Ілюм тербію в комплексі Тb(IIІ)-L-L-тир спостерігається при опромінюванні утвореного комплексу УФ-світлом з збудж = 317 нм (див. Фіг. 3, де наведено спектри люмінесценції комплексу Tb(III)-L в присутності -5 різних концентрацій L-тир (СTb = CL=1 10 моль/л; CL.тиp=5,0-300,0 мкг/мл)). Інтенсивність люмінесценції тербію в системах Тb(III)-L-L-тир пропорційна концентрації L-тир в інтервалі - 5,0300,0 мкг/мл (див. Фіг. 4, а, де наведено градуювальний графік у координатах Штерна-5 Фольмера для визначення L-тир (СTb=CL=1 10 моль/л)). Залежність Іо/І від CL-тир (градуювальний графік у координатах Штерна-Фольмера) у широкому інтервалі описується 2 поліноміальним рівнянням другого порядку І0/І = А + B1CL-тир+B2CL-тир , де А, В1 і В2 - емпіричні коефіцієнти. Для визначення можливо використовувати також модифіковану форму рівняння Штерна-Фольмера у координатах log(I0/I) від концентрації L-тир (мкг/мл), яке являє лінійним (див. Фіг. 4, б, де наведено градуювальний графік у модифікованих координатах Штерна-5 Фольмера для визначення L-тир (СTb = CL-1 10 моль/л). Також встановлено, що при додаванні різних концентрацій L-тир час життя збудженого стану іонів тербію не змінюється (=1200 мкс). Для прикладу наведені криві затухання люмінесценції комплексу Tb(III)-L у присутності різних концентрацій L-тир (див. Фіг. 5, де наведено криві -5 затухання люмінесценції комплексу Tb(III)-L (СTb = CL=1х 10 моль/л) у присутності різних концентрацій L-тир (мкг/мл): 1-0; 2-10,0; 3-30,0; 4-50,0; 5-100,0; 6-200,0). Висунуто припущення щодо змішаного механізму гасіння: статичного, пов'язаного з утворенням системи Tb(III)-L-L-тир, та динамічного, обумовленого зіткненням молекул зонду та гасників у збудженому стані. При цьому спостерігається характерна в таких випадках особливість графіку Штерна-Фольмера - відхилення вгору та вгнутість по відношенню до осі ординат (див. Lakowicz J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, New York:Plenum, 1986). Приклад. Визначення проводили на модельних розчинах шляхом введення відомої кількості L-тир (30,0 мкг/мл, 100,0 мкг/мл та 200,0 мкг/мл) в присутності хлоридів калію, натрію, кальцію, глюкози та L-аланіну. Кількісне визначення L-тир проводили за градуювальним графіком. Градуювальник, графік будують наступним чином: у мірні колби місткістю 10 мл вносять по 0,05; 0,10; 0,30; 0,50; 0,60; 0,70; 1,00; 1,50; 2,00; 3,00 мл робочого розчину L-тир (1000 мкг/мл) (5 -4 паралельних вимірів). В кожну колбу додають по 1,0 мл 110 моль/л розчину хлориду тербію, -4 1,0 мл 1  10 моль/л розчину L, 0,4 мл 40 %-ного розчину уротропіну. Доводять водою до 10,0 мл та перемішують. Паралельно готують розчин контрольної проби, який містить усі компоненти, крім L-тир. Через 5 хв вимірюють інтенсивність люмінесценції за еміс = 545 нм (збудж = 317 нм) у кожній точці (І) та інтенсивність люмінесценції контрольної проби (І 0). За допомогою одержаних результатів будують градуювальний графік залежності І 0/І від концентрації L-тир (мкг/мл) у координатах Штерна-Фольмера (див. Фіг. 4, а) в інтервалі концентрацій L-тир 5,0-300,0 мкг/мл. Методика. У мірні колби місткістю 10 мл вносять по 1,0 мл робочих розчинів хлоридів калію, натрію, -1 -4 кальцію та глюкози (1 × 10 моль/л); по 0,5 мл робочого розчину L- аланіну (1 × 10 моль/л), додають по 0,3; 1,0; 2,0 мл робочого розчину L-тир (1000 мкг/мл) (5 паралельних вимірів). Далі додають усі реактиви та проводять вимірювання, як у випадку градуювального графіка. Таблиця Сторонні речовини + Na , аланін 50 n+ + K, 2+ Са , -5 глюкоза, Введено мкг/мл 30,0 L100,0 200,0 L-тир, -5 Знайдено мкг/мл 30,2±1,6 99,4±2,8 202,1±3,8 -6 L-тир, sr 0,042 0,023 0,015 СMе =1 × 10 моль/л; СГлюкоза = 1 × 10 моль/л; СL-Аланін = 5 × 10 моль/л. Результати визначення L-тир в модельних розчинах представлено в таблиці. Точність і правильність визначення L-тир у розчинах перевірені методом "введено - знайдено". При n=5; 3 UA 78423 U Р=0,95 відносне стандартне відхилення (sr) складає 0,015-0,042. Таким чином, спосіб дозволяє підвищити чутливість визначення L-тир в 3 рази. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб кількісного визначення левотироксину натрію, що передбачає приготування проби для аналізу, взаємодію її з розчинами хлориду лантаніду і органічного реагенту-сенсибілізатора при заданому рН, опромінювання утвореної системи УФ-світлом та вимірювання інтенсивності люмінесценції реакційного розчину, за величиною якої визначають концентрацію левотироксину натрію, який відрізняється тим, що як органічний реагент-сенсибілізатор використовують розчин 1-етил-4-гідроксі-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонової кислоти-(4-метил-піридин-2-іл)аміду, як хлорид лантаніду використовують хлорид тербію, їх взаємодію здійснюють при рН 7,08,0, опромінювання проводять УФ-світлом при збудж = 317 нм, а вимірювання інтенсивності люмінесценції реакційного розчину здійснюють при еміс = 545 нм. 4 UA 78423 U 5 UA 78423 U Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6