Застосування рослини або екстракту з рослини для приготування композиції, призначеної для попередження, полегшення та/або лікування захворювань кісток або для підтримання здоров’я кісток у людини або хатніх тварин

1. Застосування рослини або екстракту однієї або більше рослин, що містить фітохімічні сполуки, здатні стимулювати кістковий морфогенний білок та/або інгібувати резорбцію кісток, де рослину вибрано з групи, яка включає: надземні частини Lindera benzoin, надземні частини Artemisia vulgaris, кореневища (різома) Acorus calamus, на 2 (19) 1 C2 (54) ЗАСТОСУВАННЯ РОСЛИНИ АБО ЕКСТРАКТУ З РОСЛИНИ ДЛЯ ПРИГОТУВАННЯ КОМПОЗИЦІЇ , ПРИЗНАЧЕНОЇ ДЛЯ ПОП ЕРЕДЖЕННЯ, ПОЛЕГШЕННЯ ТА/АБО ЛІКУВАННЯ ЗАХВОРЮВАНЬ КІСТОК АБО ДЛЯ ПІДТРИМАННЯ ЗДОРОВ'Я КІСТОК У ЛЮДИНИ АБО ХАТНІХ ТВАРИН 3 84123 4 хатніх тварин, дієтичної добавки, або фармацевтварин, який включає стадію згодовування індивітичної композиції. дуумові композиції за будь-яким з пп. 1-3. 4. Спосіб лікування, полегшення стану або запобі7. Спосіб лікування або запобігання остеопорозу, гання захворюванням кісток або підтримання здоякий включає введення ефективної кількості комров’я кісток, який включає введення ефективної позиції за будь-яким з пп. 1-3. кількості композиції за будь-яким з пп. 1-3. 8. Спосіб стимулювання регенерації кісток при 5. Спосіб посилення кісткоутворення, підвищення лікуванні переломів, який включає стадію згодовумінеральної густини кісток на стадії росту та оптивання індивідуумові композиції за будь-яким з пп. мізації пікової маси кісток у людини або хатніх тва1-3. рин, який включає стадію згодовування індивідуу9. Спосіб зниження розрідження кісток, зокрема, мові композиції за будь-яким з пп. 1-3. розрідження кісток, обумовленого віком, у людини 6. Спосіб лікування, полегшення стану та/або або хатніх тварин, який включає стадію згодовупрофілактики остеоартриту у людини або хатніх вання індивідуумові композиції за будь-яким з пп. 1-3. Даний, винахід стосується композиції для підтримання здоров'я кісток або запобігання, полегшення стану та/або лікування захворювань кісток. Він також стосується застосування композиції у виробництві живильного продукту, добавки або лікарського засобу та способу стимулювання росту кісток або підтримання здоров'я кісток, який передбачає прийом усередину ефективної кількості композиції. Здорові кістки мають потребу в ефективному перебудовуванні, яке включає рівновагу між кісткоутворенням і резорбцією кісток. Причиною більшості захворювань кісток є підвищена резорбція кісток, що робить її інгібування основною терапевтичною метою, тому більшість фармацевтичних препаратів, розроблених до теперішнього часу, є протирезорбційними. Наприклад, естрогени блокують утворення цитокінів, які сприяють генерації та диференціації остеокластів. Розробляються SERM (селективні модулятори естрогенової реакції), які мають корисний вплив на здоров'я кісток при зниженні ризику шкідливої гормональної дії на тканини молочної залози або ендометрію. Передбачається, що механізм їхньої дії аналогічний механізму дії естрогенів у кістках. Бісфосфонати (такі як алендронат, ризедронат та ін.) концентруються у кістках і є на сьогоднішній день найефективнішими інгібіторами резорбції кісток. Вони інгібують критичний ферментативний механізм, необхідний для активності та виживання остеокластів. Кальцитонін - це поліпептидний гормон, що інгібує резорбцію кісток за рахунок блокування активності остеокластів. Нові розробки спрямовані на блокування членів сімейства рецепторів/лігандів фактора некрозу пухлин (TNF) та їхні х сигнальних шляхів, зокрема, RANK/RANKL, на інгібування кісткоспецифічних металопротеаз, таких як катепсин K, або інгібування специфічних кіназ. Створення лікувальних засобів, що стимулюють кісткоутворення, дещо відстало від розробки інгібіторів резорбції. Відомі деякі хімічні або фармацевтичні агенти, які сприяють росту кісток у людини. Наприклад, у [WO 9619246] описаний спосіб стимулювання росту кісток у хворих людей за рахунок періодичного введення їм паратиреоїдного гормону (PTH), РТН-спорідненого білка або агоніста протягом, щонайменше, одного місяця. В [WO 9619501] фактор, що походить з підшлункової за лози, інгібує резорбцію кісток і стимулює проліферацію кісткових клітин та посилює кісткоутворення. Головним відкриттям останніх років стала демонстрація ролі кісткового морфогенного білка 2 (ВМР-2) як ключового фактора стимулювання кісткоутворення, а також того, що статини (ефективні засоби для зниження рівня холестерину шляхом інгібування синтезу холестерину) поліпшують кісткоутворення, частково опосередковане за рахунок індукції ВМР-2. Показано, що введення рекомбінантного ВМР-2 індукує кісткоутворення та формування хрящів. В [US 6150328] описується спосіб індукування кісткоутворення та формування хрящів, який передбачає введення очищеного кісткового морфогенного білка, одержаного культивуванням клітини, трансформованої ДНК, що кодує BMP. [WO 9711095] також стосується застосування композицій кісткового морфогенного білка для лікування пухлин нервової системи та хвороб росту кісток і для загоєння ран. На додаток до BMP, вивчаються такі фактори росту (GF), як інсуліноподібний фактор росту (IGF-1), трансформуючий фактор росту GF-b (TGF-b), фактори росту фібробластів (FGF), що можуть використовуватися як локальна терапія при лікуванні переломів і дефектів кісток. Однак їхнє систематичне введення досить проблематичне через метаболізм у кишечнику, а також внаслідок можливого впливу на інші тканини. Як одне з можливих рішень пропонується генотерапія. Альтернативою може служити цілеспрямоване регулювання утворення остеобластів за допомогою харчових або фармацевтичних регуляторів експресії генів або білка остеобластів. Хоча зазначені хімічні й фармацевтичні сполуки підтвердили свою ефективність для лікування захворювань кісток, проте, великий інтерес представляє безпечний та ефективний харчовий шлях стимуляції росту кісток і запобігання, полегшення або лікування кісткових/суглобних за хворювань у ссавців. Відповідно до першого аспекту, даний винахід стосується композиції, призначеної для запобігання, полегшення стану та /або лікування захворювань кісток або для підтримання здоров'я кісток у ссавців, що містить як активний інгредієнт ефективну кількість, щонайменше, однієї рослини або екстракту рослини, спеціально підібраної за її здатністю індукувати експресію кісткового морфогенного білка. 5 84123 6 Цікаво, що деякі рослини або екстракти з них, явили стимуляцію ВМР-2 у 3,2 й 2,8 рази, відповіяк було встановлено, мають здатність стимулювадно, порівняно з контролем. Достовірність цієї мети ріст кісток за рахунок регулювання ендогенних тодики експерименту підтверджують з факторів росту в кістковій або хрящовій тканинах. використанням ловастатину (0,5мкг/мл) як позитиВони мають здатність індукувати експресію кістковного контролю, який виявляє 2,5-кратну індукцію вого морфогенного білка in vivo та у локальному ВМР-2. оточенні кістки, що має позитивний ефект на кістФіг.2. Порівняння вимірюваних показників інгікоутворення й відновлення кісток, на підтримання бування в тесті на черепному склепінні (Calvaria здоров'я кісток або запобігання, полегшення стану Assay) (A) і ямковому тесті (Pit Assay) (B) при вита/або лікування захворювань кісток. користанні екстрактів Осітит gratissimum (738), Композиція відповідно до винаходу може виAmelanchier alnifolia (734), Glycine max (768), користовуватися у виробництві живильного продуCyperus rotundus (205), Carthamus tinctorius (746). кту, добавки, страви або лікарського засобу, приВідповідно до першої мети даного винаходу, значеного для людини або хатніх тварин. рослина або екстракт рослини відповідно до винаВведення індивідуумові харчової композиції за ходу містить фітохімічні сполуки, що мають анабоданим винаходом приводить до поліпшення регелічний потенціал завдяки їхній здатності індукуванерації кісток при лікуванні переломів. Дана комти експресію кісткового морфогенного білка й, крім позиція, крім того, допомагає інгібувати резорбцію того, можуть служити протирезорбційними агентакісток. Вона допомагає збільшува ти кісткоутворенми. ня й мінеральну густину кісток на стадії росту й В кращому варіанті втілення, під рослиною або оптимізувати пікову масу кісток. Крім того, зазнаекстрактом рослини розуміють будь-яку частину чена харчова композиція допомагає знизити ризик рослини, наприклад, листя, бульби, плоди, насінрозрідження кісток, зокрема, розрідження кісток, ня, корінь, зерна, зародки або клітинні культури. обумовленого віком, у ссавців. Таким чином, вона Рослина або екстракт рослини може бути сухим сприяє підтриманню маси кісток з віком і знижує ліофілізованим екстрактом з листя, коренів та/або небезпеку остеопорозу. плодів залежно від виду використовуваної рослиКрім цього, вона сприяє формуванню хрящів у ни, або свіжозібраною рослиною, або збагаченою ссавців, запобіганню остеоартриту у хатніх тварин фракцією, одержаною відомим у даній області або людини, що забезпечує підвищену активність методом екстракції неорганічним або органічним або рухливість індивідуума. розчинником. Відповідно до іншого аспекту, даний винахід Рослину або екстракт рослини відбирають за стосується застосування рослини або екстракту їхньою здатністю інгібувати резорбцію кісток рослини, відібраних за їхньою здатністю стимулюта/або індукувати кісткоутворення, зокрема, вона вати кісткові морфогенні білки та/або інгібувати може бути обрана з групи, що включає Lindera, резорбцію кісток, для виготовлення композиції, Artemisia, Acorns, Carihamus, Carum, Cnidium, призначеної для підтримання здоров'я кісток у Amelanchier, Curcuma, Taraxacum, Cyperus, ссавців і запобігання, полегшення стану та/або Juniperus, Prunus, Iris, Cichorium, Dodonaea, лікування захворювань кісток. Epimedium, Eriogonum, Soya, Mentha, Ocimum, На додаток до цього, винахід забезпечує споThymus, Tanacetum, Plantago, Spearmint, Віха, сіб запобігання, полегшення стану та/або лікуванVitis, Rosmarinus, Rhus та Anethum. Вона може ня захворювання кісток або підтримання здоров'я бути також їстівним грибом. кісток, який передбачає введення ефективної кільУ найкращому варіанті це можуть бути, наприкості композиції, описаної вище. клад, надземні частини Lindera benzoin, надземна Винахід також забезпечує спосіб посилення кічастина Artemisia vulgaris, кореневище (ризом) сткоутворення, мінеральної густини кістки на стадії Acorus calamus, насіння або квіти Carthamus росту та оптимізації пікової маси кісток, лікування tinctorius, плоди Amelanchier ovalis, плоди або запобігання остеопорозу, стимулювання регеAmelanchier alnifolia, корінь Cichorium intybus, конерації кісток при лікуванні переломів, який передреневище Curcuma longa, надземна частина бачає введення ефективної кількості композиції, як Epimedium brevicomum, надземна частина описано вище. Eriogonum giganteum, листя або корінь Taraxacum Крім того, він стосується способу лікування, officinalis, кореневище Cyperus rotondus, листя полегшення стану та/або профілактики остеоартDodoneae viscosa, клітинні культури Iris pallida, риту у хатніх тварин або людини, який включає кореневище Iris germanica, pallida або pseudacorus, стадію згодовування індивідуумові композиції, як плоди Juniperus communis, насіння Prunus persica, описано вище. клітинні культури сої, надземні частини Mentha Він також забезпечує спосіб зниження ризику spicata, надземні частини Ocimum gratissimum, розрідження кісток, зокрема, розрідження кісток, надземні частини Thymus sp., надземні частини обумовленого віком, у людини або хатніх тварин, Rhus glabra, анісу, Віха, ягоди Vitis vinifera, надзеякий включає стадію згодовування індивідуумові мні частини Rosmarinus officinalis, надземні частикомпозиції, як описано вище. ни Tanacetum vulgare, Carum carvi, Plantago major, Фіг.1. Вимірювання ендогенної експресії мРНК надземні частини Oxydendron arboreum. ВМР-2 у клітинах hPOB-tert за допомогою полімеФітохімічні сполуки можуть бути геністеїном, разної ланцюгової реакції із зворотною транскрипдаїдзеїном, лактуцином, лактукопікрином, 3тазою (RT-PCR) після обробки екстрактами з дезоксилактуцином, гераніолом або карвоном. Lindera benzoin (P.E. 740, 50мкг/мл) або Cyperus Рослина або екстракт рослини відповідно до rotundus (P.E. 205, 10мкг/мл) протягом 48год., вивинаходу може використовуватися для виготов 7 84123 8 лення харчової композиції. Зазначена композиція моно- і дигліцериди. Так само можуть бути вклюможе мати вигляд збалансованого по живильних чені придатні солі та стабілізатори. Вітаміни та речовинах харчового продукту або корму для хатмінеральні речовини також можуть комбінуватися ніх тварин або живильної добавки, страви чи фарз екстрактом рослини. мацевтичної композиції. Живильний склад краще призначений для енРослина або екстракт рослини може використерального введення, наприклад, у вигляді пороштовуватися як окремо, так й у комбінації з іншими ку, таблетки, капсули, рідкого концентрату, тверрослинами, такими як, наприклад, цикорій, чай, дого продукту або го тового до вживання напою. какао, або з іншими біоактивними молекулами, Якщо потрібно приготувати сухий, порошкоподібтакими як антиоксиданти, жирні кислоти, пребіотиний живильний склад, то гомогенізовану суміш чні волокна, глюкозамін, хондроїтинсульфат. пропускають через відповідну сушарку, наприклад, В одному з варіантів втілення виготовляється розпилювальну сушарку або сублімаційну сушархарчова композиція для споживання людиною. ку, з одержанням порошку. Зазначена композиція може бути повністю збаланВ іншому варіанті втілення живильна композисованою по живильних речовинах сумішшю, молоція включає молочно-зерновий продукт у суміші із чним продуктом, охолодженим напоєм або напоєм пребіотичним складом. Молочно-зерновий продукт з тривалим терміном зберігання, супом, харчовою краще є продуктом дитячого харчування, що слудобавкою, замінником їжі в рамках повсякденного жить носієм для пребіотичного складу. раціону та висококалорійним батончиком або конВідповідно до наступного варіанта втілення, дитерським виробом. звичайний харчовий продукт може бути збагачеКрім екстракту рослини відповідно до винахоний, щонайменше, однією рослиною або екстракду, живильний склад може містити джерело білка. том рослини за даним винаходом, наприклад, кисЯк джерело білка краще використовуються харчові ломолочний продукт, йогурт, свіжий сир, молочний білки. Вони можуть бути будь-якими придатними зсідок сичугового згортання, кондитерський виріб, для даної мети харчовими білками, наприклад, солодкий або підсолоджений напій, кондитерський тваринними білками (такими як білки молока, м'я сбатончик, зернові пластівці або зернові батончики ний білок та яєчний білок), рослинними білками до сніданку, напої, сухе молоко, продукти на соєвій (соєвий білок, пшеничний білок, рисовий білок і основі, немолочні ферментовані продукти або жибілок гороху), сумішами вільних амінокислот або вильні добавки для клінічного харчування. їхніми комбінаціями. Особливо кращими видами Кількість рослини або екстракту рослини в білків є, зокрема, білки молока (казеїн, білки молокомпозиції може змінюватися залежно від виду чної сироватки) і соєвий білок. Композиція може рослини й використовуваної частини рослини. У містити також джерело вуглеводів і джерело жиру. кращому варіанті втілення ефективна добова доза Якщо живильний склад містить джерело жиру, дорівнює щонайменше приблизно 1мг, ще краще то це джерело жиру краще забезпечує приблизно від 1мг до 200мг активних молекул. від 5% до 55% енергетичної цінності живильного В одному з втілень може бути виго товлена складу, наприклад, від 20% до 50%. Ліпіди як джефармацевтична композиція, яка містить, щонайрело жиру можуть бути будь-яким придатним для менше, екстракт або фітохімічну сполуку, як заданої мети жиром або сумішшю жирів. Найбільш значено вище, у кількості, достатній для досягненпридатними є рослинні жири, наприклад, соєва ня необхідного ефекту у індивідуума. Ця олія, пальмова олія, кокосова олія, сафлорова композиція може мати вигляд таблетки, рідини, олія, соняшникова олія, кукурудзяна олія, олія какапсул, м'яких капсул, пасти або пастилок, гумі або ноли, лецитини і т.п. При необхідності можна допридатних для питва розчинів або емульсій, сухої давати також тваринні жири, наприклад, молочний добавки для орального вживання, вологої добавки жир. для орального вживання. Фармацевтична компоДо живильного складу можна додати джерело зиція буде містити також носії й наповнювачі, привуглеводів. Воно краще забезпечує приблизно від датні для транспортування відповідних активних 40% до 80% енергетичної цінності живильного молекул різної природи до тканини-мішені. Вид складу. Може використовуватися будь-який приданосія/наповнювача та його кількість будуть залетний для даної мети вуглевод, наприклад, сахарожати від природи речовини й передбачуваного за, лактоза, глюкоза, фруктоза, суха кукур удзяна способу доставки та/або введення ліків. Зрозуміпатока й мальтодекстрини, а також їхні суміші. При ло, що фа хівці в даній області можуть вибрати необхідності можна додати також харчові волокна. відповідні компоненти й галенові форми, опираюУ випадку додавання харчових волокон, вони крачись на свій досвід і знання. ще становлять приблизно до 5% енергетичної цінРослина або екстракт рослини відповідно до ності живильного складу. Харчові волокна можуть винаходу може використовуватися для виготовбути будь-якого придатного походження, включалення композиції корму для хатніх тварин. Зазнаючи, наприклад, сою, горох, овес, пектин, гуарову чена композиція може згодовуватися ха тній тварикамедь, гуміарабік і фруктоолігосахариди. До жині як добавка до звичайного раціону або як вильного складу можуть бути включені відповідні компонент збалансованого по живильних речовивітаміни й мінеральні речовини в кількості, що віднах корму для хатніх тварин або, ще краще, низьповідає нормативним показникам. кокалорійного корму для хатніх тварин. Вона може При необхідності в живильний склад може бубути також фармацевтичною композицією. ти введений один або кілька емульгаторів харчоРослина або екстракт рослини може викорисвої якості, наприклад, діацетилові складні ефіри товуватися як окремо, так і в комбінації з іншими винної кислоти та моно- і дигліцеридів, лецитин та рослинами, такими як, наприклад, цикорій, чай, 9 84123 10 какао, або з іншими біоактивними молекулами, 5г висушених рослин на 1кг маси тіла тварини, такими як антиоксиданти, жирні кислоти, пребіотизвичайно буде адекватною для собак і кішок. чні волокна, глюкозамін, хондроїтинсульфат. Введення людині або хатній тварині харчової Краще, композиція корму для хатніх тварин мікомпозиції або композиції корму, як описано вище, стить приблизно від 0,01 до 0,5г висушених рослин приводить до поліпшення регенерації кісток при на один грам сухо го корму для собак з масою тіла лікуванні переломів. Вона здатна стимулювати 15кг і від 0,001 до 0,1г висушених рослин на один кісткоутворення, підвищувати мінеральну густину грам вологого корму для собак з масою тіла 15кг. кістки на стадії росту та оптимізувати пікову масу Збалансована по живильних речовинах компокісток. Зокрема, вона може забезпечити оптимазиція корму для хатніх тварин відповідно до винальний ріст кісток у дитячому віці. Зазначена харчоходу може бути приготовлена в порошкоподібнова композиція допомагає запобігти розрідженню му, сухому виді, у вигляді страви або вологого, кісток, зокрема, розрідженню кісток, обумовленому охолодженого чи стійкого при зберіганні продукту віком, у ссавців, або розрідженню кісток, пов'язадля хатніх тварин. Вона може бути о холодженим ному із тривалою госпіталізацією. Вона знижує продуктом або продуктом тривалого зберігання. небезпеку остеопорозу й поліпшує відновлення Зазначені продукти для хатніх тварин можна вигопісля перелому. Крім того, вона сприяє формувантовляти будь-яким відомим способом. ню хрящів у ссавців, запобігає остеоартриту у люКомпозиція корму для хатніх тварин може, при дини й хатніх тварин, що приводить до підвищення необхідності, містити також пребіотик, пробіотичні активності або рухливості індивідуума. мікроорганізми або інший активний агент, наприНаведені нижче приклади даються лише з меклад, довголанцюгову жирну кислоту. Кількість тою ілюстрації даного винаходу, однак їх не слід пребіотика в композиції корму для хатніх тварин, інтерпретувати як такі, що обмежують об'єкт даної краще, складає менш ніж 10%мас. Наприклад, заявки. Процентна кількість скрізь зазначена в пребіотик може складати приблизно від 0,1% до %мас, якщо немає посилання на іншу розмірність. 5%мас. від маси корму. Якщо корм містить цикорій Прикладам передує стислий опис фігур. як джерело пребіотика, то цикорій може додаватиПриклади ся таким чином, щоб його кількість у кормовій суПриклад 1: Тести на кісткоутворення й резорміші становила приблизно від 0,5% до 10%мас, бцію кісток краще - приблизно від 1% до 5%мас. 1. Кісткоутворення Якщо використовується пробіотичний мікроор91 екстракт піддавали скринінгу на кісткоутвоганізм, то 1 грам корму для хатніх тварин у кращорення шляхом аналізу експресії репортерного гена му варіанті містить приблизно від 104 до 1010 клідля ВМР-2 (кістковий морфогенный білок) і на ретин, краще - приблизно від 106 до 108 клітин зобцию кістки за допомогою тесту на черепному пробіотичного мікроорганізму. Корм для хатніх склепінні (Calvaria Assay). Зазначені 91 екстракти тварин може містити приблизно від 0,5% до були одержані з 30 різних рослин. 20%мас. суміші пробіотичних мікроорганізмів, Матеріали й методи краще - приблизно від 1% до 6%мас, наприклад, - Приготування екстрактів для скринінгприблизно від 3% до 6%мас. анализу: При необхідності в корм для хатніх тварин доПодрібнену рослинну сировину знежирюють дають мінеральні речовини й вітаміни так, щоб він гексаном, потім екстрагують сумішшю спирту з був повністю збалансований по живильних речоводою з різним процентним вмістом води - від 10 винах. Крім того, у корм для хатніх тварин можна до 90%, краще, 50%. Як спирт можна використати вводити, при необхідності, інші інгредієнти, наприметиловий або етиловий спирти, одержуючи екстклад, цукор, сіль, спеції, пряності, ароматизатори і ракт 1а. т.п. Відбирають аликвотну кількість залишку заВідповідно до іншого варіанта втілення можна значеного першого екстракту й проводять його приготувати живильні добавки, які поліпшують ферментативний гідроліз із використанням a- і bякість кормів для хатніх тварин. Ці живильні добаглюкозидаз. Замість ферментного гідролізу можна вки можуть бути поміщені у капсулу або виготовпроводити кислотний гідроліз. Зазначений процес лені у вигляді порошку й упаковані разом або можна проводити у м'яких умовах (при кімнатній окремо від основного корму, незалежно від того, температурі) або в умовах зворотного холодильвологий він або сухий. Як приклад, порошок, що ника при різній концентрації кислоти. Водну гідромістить екстракти відповідно до винаходу, може лізну фазу екстрагують незмішуваним розчиннибути упакований в саше у вигляді порошку або ком, краще, етилацетатом, з одержанням введений до гелю чи ліпіду або іншого придатного екстракту 2а: носія. Ці окремо розфасовані добавки можна потім Екстракт можна висушити розпиленням або надавати разом з основним кормом або у багатосублімацією або одержати в рідкому виді. секційних упаковках для наступного використання У деяких випадках можливе видалення поліразом з основним кормом або стравою, відповідно фенолів шляхом обробки полівінілполіпіролідоном до інструкції для користувача. (PVPP) для уникнення артефакту при скринінгКількість корму, що має бути спожита хатньою аналізі. твариною для досягнення необхідного ефекту, Після одержання екстрактів кожний екстракт буде залежати від розмірів, виду й віку хатньої зважують, повторно розчиняють у диметилсультварини. Однак, кількість корму для хатніх тварин, фоксиді (DMSO) до кінцевої концентрації 20мг/мл і що забезпечує добову дозу приблизно від 0,5 до зберігають у вигляді аліквот при -20°С. Ці розчини використовують як маточні розчини, згодом розба 11 84123 12 вляючи їх у середовища х для кожного аналізу. У випробовують при початковому розведенні ході аналізів випробовували широкий спектр доз. 100мкг/мл з наступними двократними розведення- Тест на кісткоутворення ми до 0,2мкг/мл. Активність промотору ВМР-2 виВМР-2-люциферазний тест: активність екстразначають шляхом вимірювання активності люциктів визначають з використанням клітин 2Т3, які ферази в клітинних екстрактах. містять промотор ВМР-2, функціонально зв'язаний 13 рослин показали високий позитивний рез геном люциферази. Підвищення активності люзультат у стимулюванні експресії ВМР-2 (Таблиця циферази в клітинних лізатах відібражає збіль1). шення активності промотору ВМР-2. Екстракти Таблиця 1 Переклад англійської Використовувана частина Концентрація Активний екстназви рослини мкг/мл ракт/№ Acorus calamus Аїрний корінь (лепеха) Кореневище 5 МеОН/вода/731 Amelanchier ovalis Ірга круглолиста Плоди 10 МеОН/вода/219 Полінь звичайArtemisia vulgaris Надземні частини 10 Етилацетат/225 на/чорнобиль Cyperus rotundus Смикавець круглий Кореневище 10 Етилацетат/205 Taraxacum officinalis Кульбаба звичайна Листя 50 Етилацетат/750 Ліндера (сімейство Lindera benzoin Надземні частини 50 Етилацетат/740 лаврові) Prunus persica Персик Насіння 25 Етилацетат/772 Glycine max Соя Клітинні культури 50 Етилацетат/768 Iris pallida Ірис садовий Бульби 100 МеОН/вода/239 Rosmarinus МеОН/вода/2004 Розмарин звичайний Листя 50 officinalis Етилацетат/2005 Carvi Кмин Насіння 25 Етилацетат/2074 Thyme Чебрець Листя 25 Етилацетат/2067 Mentha spicata М'ята Листя 100 Етилацетат/2072 Vitis vinifera Виноград Ягоди 100 Етилацетат/2069 Латинська назва Прикладами нових препаратів тих же рослин та їхніх субфракций, що стимулюють ВМР-2, є: Lindera benzoin, активний екстракт/№ етилацетат/740/2059; активна субфракція/№2060; Taraxacum officinalis, активний екстракт/№ етилацетат/750/2034; активна субфракція/№2035; Cyperus rotundus, активний екстракт/№ етилацетат/205/2011; активна субфракція/№ 2012, 2013; Ins pallida, активний екстракт/№ МеОН/вода/239; активна субфракція/№760/762/2021,2022. Субфракції одержують фракціонуванням на оберненофазових картриджах із силікагелем при Рослина Glycine max Rosmarinus officinalis Rosmarinus officinalis Cyperus rotundus Ins pallida Чебрець Кмин елююванні розчинниками різної полярності. Чисті ізофлавони сої - геністеїн та даїдзеїн (10-6M) стимулюють ВМР-2, а естрадіол - ні. Очевидно, індукція ВМР-2 не обмежується естрогеноподібною активністю, оскільки вона стимулюється фітоестрогеном, але не самим естрогеном. Це означає, що активність фітоестрогена (такого як геністеїн або даїдзеїн) може опосередковуватися через неестрогенний механізм. Активність промотору ВМР-2 не стимулюється естрадіолом, тому даний експеримент не потребує естрогенної активності рослинних сполук. Активний екстракт/№ Етилацетат/2001 МеОН/вода/2004 Етилацетат/2005 Субфракція/2012 Субфракція/2022 Етилацетат/2067 Етилацетат/2074 Приклад кісткоутворення в органній культурі черепного склепіння. Використаний метод описаний у [Science 286: 1946-1949 (1999)]. Екстракти оцінюють на 4 день в експериментах in vitro на черепному склепінні новонароджених мишей. Кістки інкубують з екстрактами протягом повних 4 днів. Кісткоутворенняі оцінюють гістологічним методом. Концентрація (мкг/мл) 10,50 10,50 10 10,50 10 10 10 2. Резорбція кісток, тест на черепному склепінні Здатність екстрактів, приготовлених відповідно до Приклада 1, інгібувати стимульовану IL-1 (10-10) резорбцію кісток оцінюють за допомогою тесту на резорбцію кісток у новонароджених мишей. Кожний екстракт оцінюють за його здатністю інгібувати 10мкг/мл. 13 резорбцію 84123 кісток у концентрації 14 Екстракти з рослин, що показали позитивний результат, наведені у Таблиці 2. Таблиця 2 Латинська назва Amelanchier alnifolia Осітит gratissimum Осітит gratissimum Carthamus tinctorius Cyperus rotundus Glycine max Переклад англійської назви Ірга вільхолиста Різновид василька Різновид василька Сафлор фарбувальний Смикавець круглий Соя Перелічені рослини виявили активність у тесті на резорбцію кісток: Amelanchier alnifolia, Осimum gratissimum, Carthamus tinctorius та Glycine max. C yperus rotundus інгібував резорбцію кісток та індукував ВМР-2. Приклад 2: Вплив екстрактів рослин на ендогенну експресію ВМР-2 у остеобластах людини Рослини, що показали позитивні результати індукування ВМР-2 у Прикладі 1, випробовувалися додатково на лінії клітин періосту/прерстеобластів людини (hPOB-tert) йа їхню здатність індукувати ендогенну експресію ВМР-2. Даний тест на клітинах остеобластів підтвердив результати, одержані в Прикладі 1 Наприклад, обробка клітин hPOB-tert екстрактами Lindera benzoin (екстракт 740, 50мкг/мл) і Cyperus rotundus (екстракт 205, 10мкг/мл) протягом 48год. стимулювала експресію ВМР-2 у 3,8 та 2,8 рази, відповідно, у порівнянні з контролем (див. Фіг.1). Перевірку результатів тесту проводили з використанням ловастатину (0,5мкг/мл) як позитивного контролю, що показав індукцію ВМР2 у 2,5 рази. Після досягнення стадії злиття клітини інкубують з 0,05 мкг/мл ловастатину або з екстрактами рослин. Загальну PHK екстрагують реагентом TRIzol (від фірми Gibco). 10мкг PHK піддають зворотній транскрипції, використовуючи набір 1st Stand cDNA Synthesis Kit (від фірми Boehringer). Послідовності кДНК ВМР-2 ампліфікують у 35 циклах при температурі відпалу 55°C за допомогою специфічних олігонуклеотидних праймерів (5': TTGCGGCTGCTC AGC ATGTT; 3': CATCTTGCATCTGTTCTCGGAA). Продукти полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) розділяють методом електрофорезу в агарозному гелі й проявляють шляхом фарбування бромистим етидієм. їхню кількісну оцінку проводять за допомогою програмного забезпечення NIH Image, а результати нормують з використанням актину як гена «домашнього господарства». Результати представлені на Фіг.1. Резорбція кісток Екстракти рослин, що показали позитивні результати в тесті на черепному склепінні, оцінювали повторно в другому тесті на резорбцію кісток, а саме, ямковому тесті (pit assay), з використанням змішаних кісткових клітин кролів, культивованих на зрізах кісток великої рогатої худоби [Tezuka K., et al., 1992, Biochem. Biophys. Використовувана частина рослини Плоди Листя Листя Насіння Кореневище Клітинні культури Активний екстракт/№ Етилацетат/734 МеОН/вода/737 Етилацетат/738 Етилацетат/746 Етилацетат/205 768 Res. Commun. 186 (2): 911-917, та Lorget F., et аl., 2000, Biochem. Biophys. Res. Commun. 268(3): 899-903]. Резорбційні лунки візуалізують шляхом фарбування на TRAP (тартратрезистентна кисла фосфа таза). Позитивні клітини підраховують. Порівняльна оцінка активності екстрактів у концентрації 10мкг/мл у двох тест-системах представлена на Фіг.2. Приклад 3: Сухий корм для хатніх тварин Кормова суміш складається з приблизно 58%мас. кукурудзи, приблизно 5,5%мас. кукурудзяної клейковини, приблизно 22%мас. кормового борошна з відходів переробки птаха, 2,5% сухого цикорію, близько 10% екстракту з бульб Cyperus rotondus, решта - солі, вітаміни й мінеральні речовини. Кормову суміш подають в апарат для попереднього кондиціонування та зволожують. Вологий корм піддають екструзійному варінню та желатинуванню. Вихідну з екструдера желатиновану матрицю видавлюють через голівку екструдера. Екструдат нарізають на шматочки, зручні для згодовування собакам, висушують при приблизно 110°C протягом приблизно 20 хвилин і охолоджують, одержуючи гранули. Одержаний сухий корм для собак мав позитивний вплив на здоров'я кісток і хрящів та збільшував їхню р ухливість. Приклад 4: Вологий консервований корм для хатніх тварин с добавкою Готують суміш з 73% тушок птаха, свинячих легенів та яловичої печінки (подрібненої), 16% пшеничного борошна, 2% барвників, вітамінів і неорганічних солей. Одержану суміш емульгують при 12°C та екструдують у вигляді пудингу, який потім піддають варінню при температурі 90°C. Продукт охолоджують до 30°С и розрізають на шматки. 45% одержаних шматків змішують з 55% соусу, приготовленого з 98% води, 1% барвника та 1% гуарової камеді. Розфасовують в бляшані консервні банки і стерилізують при 125°C протягом 40хв. Додаткова упаковка (наприклад, саше), містить 25г порошку з надземної частини Cyperus rotundus як добавку, призначену для додавання в щоденний раціон хатньої тварини. Відповідна кількість її для хатньої тварини становить, приблизно, 25г/добу; і вона може надаватися як додаток (наприклад, на кришці) до консервної банки. 15 Комп’ютерна в ерстка О. Гапоненко 84123 Підписне 16 Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601