Спосіб виявлення мікроміцетів у воді

1. Спосіб виявлення мікроміцетів у воді, що передбачає культивування мікроскопічних грибів на живильному середовищі з подальшим підрахунком колоній, який відрізняється тим, що середовище додатково містить дихлоран (2,6-дихлор-4нітроанілін) у кількості (1÷4) мг/дм3. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що додатково вводять антибіотик бактерицидної чи бактеріостатичної дії. UA (21) a200900259 (22) 14.01.2009 (24) 27.09.2010 (46) 27.09.2010, Бюл.№ 18, 2010 р. (72) ГОНЧАРУК ВЛАДИСЛАВ ВОЛОДИМИРОВИЧ, РУДЕНКО АДА ВІКТОРІВНА, САВЛУК ОЛЬГА СЕМЕНІВНА, САПРИКІНА МАРІЯ МИКОЛАЇВНА, ПОТАПЧЕНКО НЕЛЛІ ГРИГОРІВНА, КОСІНОВА ВАЛЕНТИНА МИКОЛАЇВНА (73) ІНСТИТУТ КОЛОЇДНОЇ ХІМІЇ ТА ХІМІЇ ВОДИ ІМ. А.В. ДУМАНСЬКОГО НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ (56) Goncalves А.В., Russel R., Paterson M., Lima N. Survey and significance of filamentous fungi from tap water // Int. J. Hyg. Environ. Health. - 2006. - 209, №3.- P. 257-264. Kanzler D., Buzina W., Paulitsch A., Haas D., Platzer S., Marth E. and Mascher F. Occurrence and hygienic relevance of fungi in drinking water // Mycoses - 2008. - 51, №2 - P. 165-169 (abstract). MD a20030243, 10.13.03 (abstract). MD A20020090, 11.03.02 (abstract). RU 2157849 C1, 20.10.2000. MD A20030243, 13.10.03 (abstract). C2 2 (19) 1 3 92088 Відомий спосіб виявлення грибів у воді з використанням живильних середовищ Сабуро та агару екстракту солоду (Kanzler D., Buzina W., Paulitsch A., Haas D., Platzer S., Marth E. and Mascher F. Occurrence and hygienic relevance of fungi in drinking water // Mycoses - 2008. - 51, №2 - P. 165-169) [2]. Спосіб [2] реалізується з використанням двох різних методів: методу прямого посіву і методу мембранних фільтрів. При реалізації вказаних методів як живильне середовище було використано агар Сабуро та агар екстракту солоду, кожне з яких містило гентаміцин (40 мг/дм3) і 3 хлорамфенікол (100 мг/дм ), для пригнічення росту бактерій. Досліджувана вода містила представників швидкоростучих грибів, наприклад Aspergillus sp., та представників повільноростучих грибів, наприклад Cladosporium sp. У методі прямого посіву аналізовану воду, об'ємом 0,5 см3, поміщали на чашку Петрі з живильним середовищем. Чашки витримували в термостаті при 22 °С протягом трьох - семи днів. При використанні методу мембранних фільтрів досліджувану воду, об'ємом 100 см3, пропускали через ацетатцелюлозні фільтри, з діаметром пор 0,45 мкм (Millipore). У чашки Петрі поміщали живильне середовище, на поверхні якого розміщали ацетатцелюлозні фільтри після фільтрації. Чашки витримували в термостаті при 22 °С протягом трьох - семи днів. З отриманих авторами даних видно, що методи прямого посіву та мембранних фільтрів можуть бути використані для виявлення мікроміцетів у воді. При цьому відзначають більшу селективність живильного середовища Сабуро ніж екстракту солоду по відношенню до мікроміцетів. Проте кількість ідентифікованих грибів у процентному співвідношенні до не ідентифікованих становила 44,6 %. Таким чином основним недоліком відомого способу [2] є значне ускладнення процесу виявлення грибів з води та їх ідентифікації при наявності у пробі грибів, що мають розгалужений міцелій, який заважає росту грибів з помірним міцелієм. 4 Найбільш близьким аналогом до винаходу за технічною суттю та результатом, що досягається, є спосіб виявлення мікроскопічних грибів з використанням агаризованого живильного середовища Сабуро (Справочник по санитарной микробиологии / Под ред. Л.В. Григорьевой. - Кишенев: Картя Молдовеняскэ, 1981. - 206с.) [3]. Для отримання зразків мікроскопічних грибів та їх подальшого підрахунку використовували метод мембранних фільтрів (І) [3, С. 51] та метод прямого посіву (II) [3, С. 59]. У методі (І) досліджувану воду, об'ємом 100 см3, пропускали через ацетатцелюлозні фільтри, з діаметром пор 0,45 мкм (Millipore), з подальшим їх розміщенням на агаризованому середовищі. Згідно з методом (II) 1 см3 досліджуваної води висівали у середовище. Як середовище використовували агаризоване живильне середовище Сабуро наступного складу: дріжджі 20 г/дм3, пептон 10 г/дм3, агар 20 г/дм3, глюкоза 40 г/дм3, дистильована вода решта [3, С. 185]. У способі [3] не представлені кількісні результати по виявленню мікроміцетів, тому для визначення ефективності відомого способу [3] нами був приготовлений модельний розчин на стерильній дистильованій воді, який містив представників швидкоростучих (Aspergillus niger) та повільноростучих мікроскопічних грибів (Cladosporium cladosporioides, Penicillium multicolor). Відповідно до методу (І) 100 см3 досліджуваної води пропускали через ацетатцелюлозні фільтри з діаметром пор 0,45 мкм (Мilliроrе), з подальшим їх розміщенням на агаризованому середовищі Сабуро вищезгаданого складу. При використанні методу (II) 1 см3 досліджуваної води висівали у середовище Сабуро. Чашки витримували в термостаті при 27±2 °С протягом семи днів, з щоденним підрахунком кількості колоній. Дані по вихідній кількості мікроміцетів у модельному розчині, а також кількості виявлених грибів та розміру їх колоній представлені в таблиці 1. Таблиця 1 Час спостереження, доба Окремі види грибів A. niger C. cladosporioides Діаметр, Діаметр, КУО КУО мм мм 1 3 5 7 СВ, % 85* 40 ** ** 47 3 5 7 СВ, % 5* 3 ** ** 60 2 6 125* 90 83 75 72 7 3 4 6 8 3 6* 2 3 3 50 3 4 5 Суміш грибів P. multicolor A. niger С. cladosporioides Діаметр, Діаметр, КУО КУО Діаметр, мм КУО мм мм Метод прямого посіву Приклади за способом [3] 3 4 5 116* 40* 58* 87 4 15 5 8 2 70 7 ** ** 64 8 ** ** 75 37,5 13,7 Метод мембранних фільтрів Приклади за за способом [3] 9 10 11 5* 5* 3* 3 3 2 2 1 1 3 6 ** ** 3 7 ** ** 60 40 33,3 * - вихідна кількість мікроскопічних грибів, КУО/см3** - чашка повністю встелена міцелієм гриба. P. multicolor Діаметр, мм КУО 6 55* 6 ** ** 11 2 12 4* 1 ** ** 25 1 ** 5 З таблиці 1, приклади 1 - 3, та 7 - 9 слідує, що ступінь виявлення (СВ) монокультури кожного мікроскопічного гриба відбувається лише на 47-75 %. Так, у випадку з повільноростучим видом гриба, наприклад Cladosporium та Реnісіllium, підрахунок ускладнюється внаслідок збільшення діаметру колоній гриба, що призводить до об'єднання кількох колоній мікроскопічного гриба в одну. В свою чергу швидкоростучий вид гриба, наприклад Aspergillus має розгалужений, повітряний міцелій, який швидко вкриває поверхню чашки, що робить неможливим подальші кількісні підрахунки колоній. При наявності у аналізованій пробі води представників швидкоростучих (Aspergillus) та повільноростучих (Cladosporium та Реnісіllium) видів грибів ступінь їх виявлення становить 1137,5 %. Це є результатом як наявності повзучого міцелію Aspergillus niger, так і значного діаметру колоній Cladosporium cladosporioides та Реnісіllіum multicolor (таблиця 1, приклади 4 - 6 та 10 - 12). Як витікає з даних отриманих за методом прямого посіву та методом мембранних фільтрів основним недоліком відомого способу [3] є низький ступінь виявлення мікроміцетів, як у випадку наявності в аналізованій пробі води монокультури повільноростучого чи швидкоростучого виду гриба, так і при їх сумісній присутності, за рахунок розгалуженого міцелію та значного діаметру колоній. Задачею винаходу є розробка способу виявлення мікроскопічних грибів, в якому використання живильного середовища, яке додатково містить реагент, що уповільнює швидкість росту мікроміцетів, забезпечило б підвищення ступеня виявлення мікроскопічних грибів з різною швидкістю росту та покращення якості їх підрахунків, за рахунок зменшення діаметру колоній, а також проведення ідентифікації. При виявленні мікроскопічних грибів у водах, що містять гетеротрофні мікроорганізми для пригнічення росту останніх вводили антибіотики бактеристатичної чи бактерицидної дії, це дало можливість попередити їх вплив на виявлення та кількісний підрахунок мікроскопічних грибів. Для вирішення поставленої задачі запропоновано спосіб виявлення мікроскопічних грибів у воді, що передбачає культивування мікроміцетів на живильному середовищі з подальшим підрахунком колоній, в якому, згідно з винаходом, середовище додатково містить дихлоран (2,6дихлор-4-нітроанілін), у кількості 1÷4 мг/дм3, при цьому в середовище додатково вводять антибіотик бактеріоцидної чи бактеріостатичної дії. Нами показано, що використання живильного середовища, наприклад Сабуро, або Чапека, яке містить дихлоран (2,6-дихлор-4-нітроанілін), що пригнічує ріст мікроскопічних грибів та зменшує діаметр колоній мікроміцетів, дає можливість виявити і провести більш повний кількісний підрахунок та ідентифікацію швидкоростучих і повільноростучих видів грибів, як у випадку їх сумісної присутності, так і при виявленні мікроскопічних грибів у монокультурі, що робить проведений аналіз зразка більш інформативним. 92088 6 Таким чином, сукупність суттєвих ознак способу виявлення мікроскопічних грибів у воді, що заявляється, є необхідною і достатньою для досягнення технічного результату, який забезпечується винаходом - підвищення ступеню виявлення як швидкоростучих так і повільноростучих грибів, як у монокультурі, так і при їх сумісній присутності, з їх подальшим кількісним підрахунком та ідентифікацією. Високий ступінь виявлення грибів дає можливість, при використанні відповідних методів знезараження води, отримувати безпечну для споживання воду. Спосіб реалізується наступним чином. Досліди проводили з використанням мікроскопічних грибах Aspergillus niger v Tiegh (швидкоростучий вид) та Cladosporium cladosporioides (Fres.) De Vries, Penicillium multicolor Grigorieva-Manoilova et Paradielova (повільноростучі види). Всі види грибів було виділено з водопровідної води в інституті колоїдної хімії та хімії води імені А.В. Думанського НАН України, та ідентифіковано відповідно до опису (Лугаускас А.Ю, Микульскене А.Н., Шляужене Д.Ю. Каталог микромицетов - биодеструкторов полимерних материалов. - Москва: Наука, 1987. – С. 113-114) [4]. Виділену культуру переносили з допомогою мікробіологічної петлі на косяк з живильним середовищем, наприклад агаризованим середовищем Сабуро, та витримували в термостаті 4-5 днів при температурі 27 °С. Отримані колонії гриба змивали 3 двічі п'ятьма см стерильної дистильованої води, попередньо приготованої у автоклаві ВК - 75, при одній атмосфері (121 °С) п'ятнадцять хвилин. Таким чином густина суспензії складала 1·105 - 1·107 КУО/см3 (колоній утворюючі одиниці/см3). Для приготування модельного розчину необхідний об'єм вихідної суспензії вносили у приготовану стерильну дистильовану воду. Ступінь зараження води складав 3-125 КУО/см3. Суспензію гетеротрофних мікроорганізмів виділили з води річки Дніпро. Річкову воду об'ємом 1 см3 висівали у чашку Петрі з поживним агаром та поміщали в термостат, витримували 4 дня при температурі 22 °С. Отримані колонії мікроорганізмів змивали стерильною дистильованою водою. Густина суспензії становила 1·10 КУО/см3. У модельний розчин стерильної дистильованої води, що містив мікроскопічні гриби, вносили необхідний об'єм вихідної суспензії гетеротрофів, таким чином ступінь зараження води складав 2,2·102 КУО/см3. Спосіб реалізували з використанням двох різних методів: методу прямого посіву і методу мембранних фільтрів. У методі прямого посіву аналізовану воду, об'ємом 1 см3, поміщали у чашку Петрі з живильним середовищем. При використанні методу мембранних фільтрів досліджувану воду, об'ємом 100 см3, пропускали через ацетатцелюлозні фільтри, з діаметром пор 0,45 мкм (Millipore). Після фільтрації фільтри розміщали на поверхню живильного середовища. Як живильне середовище використовували: середовище Сабуро, що містить дріжджі 20 г/дм3, пептон 10 г/дм3, агар 20 г/дм3, глюкоза 40 г/дм3, 7 дистильована вода решта [3, С. 185], та середовище Чапека складу: хлорид калію 0,5 г, сульфат магнію 0,5 г, фосфат калію однозаміщений 1 г, сульфат заліза 0,01 г, нітрат натрію 3 г, сахароза 30 г, агар-агар 20 г [3, С. 186]. До зазначених середовищ додавали необхідну аліквоту розчину дихлорану для отримання середовищ з заявленими концентраціями дихлорану (1÷4 мг/см3), та стерилізували при 111 °20 хв. Робочий розчин дихлорану готували наступним чином: наважку продажного дихлорану (2,6дихлор-4-нітроанілін) 100 мг розчиняли в 50 см3 етанолу. Концентрація робочого розчину складала 2 г/дм3. Як антибіотик бактеріостатичної дії використовували гентаміцин, робочої концентрації 40 мг/дм3, а як антибіотик бактерицидної дії використовували хлортетрациклін, робочої концентрації 100 мг/дм3. Приготування робочих розчинів гентаміцину та хлортетрацикліну здійснювали відповідно до (ГОСТ 10444.12-88). Антибіотики вносили у живильне середовище Сабуро після його стерилізації. Чашки з середовищем та мікроскопічними грибами витримували в термостаті при 27±2 °С протягом семи днів, з щоденним спостереженням. Після інкубації було підраховано кількість колоній у кожній чашці. У випадку методу прямого висіву, чашку розміщували вверх дном на темному фоні, та здійснювали підрахунок усіх колоній, що виросли як на поверхні чашки так і в глибині. Підрахунок кількості колоній, отриманих методом мембранних фільтрів здійснювали, використовуючи лупу. Виявлені обома методами мікроміцети були ідентифіковані з допомогою електричного мікроскопу. Ступінь виявлення культури мікроскопічного гриба у воді розраховували за співвідношенням: CB = (Nt/N0)·100 % (І) де: СВ - ступінь виявлення культури з води, %; N0 - вихідна кількість колонійутворюючих одиниць, КУО/см3; Nt - максимальна кількість колонійутворюючих одиниц, що виросли на поверхні живильного середовища протягом часу спостереження, КУО/см3. Для здійснення способу використовують: сухий екстрат харчових дріжджів, ТУ 42-14-5676; пептон сухий ферментативний, ГОСТ 1380576; агар поживний сухий, ГОСТ 16280-88; глюкоза, ч., ГОСТ 6038-79; 2,6-дихлор-4-нітроанілін (дихлоран) ТУ 6-1415-113-88; гентаміцин, хлортетрациклін ГОСТ 10444.1288; спирт етиловий технічний, ГОСТ 17299-78; вода дистильована, ГОСТ 6709-72; чашки біологічні (Петрі), ГОСТ 25336-82; автоклав вертикальний, ГОСТ 28694-90; лупа вимірювальна, ГОСТ 25706-83; універсальний дослідний біологічний мікроскоп, МБІ-6. Приклади виконання за винаходом Приклад 1. Метод прямого висіву. 92088 8 У колбу, що містить 100 см3 стерильної дистильованої води вносили по 1 см3 суспензії кожного виду гриба, а саме Aspergillus niger v Tiegh (A. niger) (швидкоростучий вид) та Cladosporium cladosporioides (Fres.) De Vries (C. cladosporioides), Penicillium multicolor Grigorieva-Manoilova et Paradielova (P. multicolor) (повільноростучі види). Вихідна кількість КУО у 1 см3 стерильної дистильованої води складала: A. niger - 85, С. cladosporioides - 125 та P. multicolor - 116. Отриманий модельний розчин аналізованої води, об'ємом 1 см3, поміщали у чашку Петрі з живильним середовищем Сабуро з дихлораном у концентрації 2 мг/дм3. Останній вносили у живильне середовище перед автоклавуванням, тобто з робочого розчину дихлорану концентрації 2 г/дм3, приготованого на етанолі, вносили 1 см3 у 1 дм3 приготованого середовища Сабуро. Підрахунок колоній та вимірювання їх діаметру здійснювали, беручи до уваги колонії, що виросли як на поверхні чашки так і в глибині. Ступінь виявлення культури кожного мікроскопічного гриба розраховували за співвідношенням (І). Для мікроскопічного гриба A. niger CB становить: СВ=(36/38)·100 %=94,7 % (таблиця. 2, приклад 4); Для мікроскопічного гриба С cladosporioides CB: СВ=(56/60)·100 %=93,3 % (таблиця 2, приклад 5); Для мікроскопічного гриба P. multicolor CB: СВ=(45/50)·100 %=90 % (таблиця 2, приклад 6). В таблиці 2 також приведені дані по виявленню грибів у монокультурі цим же методом, дослідження та розрахунки проведені аналогічним чином. Для повільноростучих грибів, С. cladosporioides та P. multicolor, запропонований спосіб забезпечує 100 % ступінь виявлення (таблиця 2, приклади 2, 3), при цьому навіть для швидкоростучих видів грибів, таких як A. niger, досягається значний ступінь виявлення на рівні 94% (таблиця 2, приклад 1). Приклад 2. Метод мембранних фільтрів. У колбу, що містить 100 см3 стерильної дистильованої води вносили по 0,1 см3 суспензії кожного виду гриба, а саме A. niger (швидкоростучий вид) та С. cladosporioides, P. multicolor (повільноростучі види). Вихідна кількість КУО у 100 см3 стерильної дистильованої води складала: A. niger - 5, С. cladosporioides - 5 та P. multicolor - 4. Отриманий модельний розчин аналізованої води, об'ємом 100 см3, пропускали через ацетатцелюлозні фільтри, з діаметром пор 0,45 мкм (Millipore). Після фільтрації фільтри розміщали на поверхню живильного середовища Сабуро з дихлораном. Останній вносили у живильне середовище перед автоклавуванням у концентрації 2 мг/дм3, тобто з вихідного розчину дихлорану, концентрацією 2 г/дм3, приготованого на етанолі, вносили 1 см3 у 1 дм3 приготованого середовища Сабуро. Підрахунок кількості колоній на поверхні фільтру та вимірювання їх діаметру здійснювали використовуючи лупу. 9 92088 Ступінь виявлення культури кожного мікроскопічного гриба розраховували за співвідношенням (І). Для мікроскопічного гриба A. niger CB становить: СВ=(4/5)·100 %=80 % (таблиця 2, приклад 10); Для мікроскопічного гриба С. cladosporioides CB: СВ=(4/5)·100 %=80 % (таблиця 2, приклад 11); 10 Для мікроскопічного гриба P. multicolor CB: СВ=(3/4)·100 %=75 % (таблиця 2, приклад 12). В таблиці 2 також приведені дані по виявленню грибів у монокультурі цим же методом, дослідження та розрахунки проведені аналогічним чином. Для всіх видів грибів (повільноростучих та швидкоростучих) відзначається однаково високий ступінь виявлення на рівні 80-83,3 % (таблиця 2, приклади 7, 8, 9). Таблиця 2 Час спостереження, доба 3 5 7 СВ, % 3 5 7 СВ, % Окремі види грибів Суміш грибів С. cladospoA. niger P. multicolor A. niger C. cladporioides rioides Діаметр, Діаметр, Діаметр, Діаметр, Діаметр, КУО КУО КУО КУО КУО мм мм мм мм мм Метод прямого посіву Приклади за винаходом 1 2 3 4 5 85* 125* 116* 38* 60* 80 2,5 18 1,8 54 2 18 1 1 1 74 5,8 46 2 110 3 24 1,8 38 1,5 60 6,5 125 2,5 116 5,5 36 3 56 2 94 100 100 94,7 93,3 Метод мембранних фільтрів Приклади за винаходом 7 8 9 10 11 5* 6* 5* 5* 5* 4 2 3 2 1 2 4 1 1 2 3 6 3 2 3 3 4 3 2 2 3 6,8 5 3 4 3 3 3,5 4 2,5 80 83,3 80 80 80 P. multicolor КУО Діаметр, мм 6 50* 22 34 45 90 1 2 3 12 4* 1 2 3 75 1 2 3 3 * - вихідна кількість мікроскопічних грибів, КУО/см . Приклад 3. Метод мембранних фільтрів. Модельний розчин містить гетеротрофні мікрорганізми. У колбу, що містить 100 см3 стерильної дистильованої води вносили по 0,1 см3 розведення суспензії кожного виду гриба, а саме A. niger (швидкоростучий вид), С. cladosporioides та P. multicolor (повільноростучі види). При цьому вихідна кількість КУО кожного гриба у 100 см3 модельного розчину складала 4, 5, 4 КУО/100 см3, відповідно. Далі в модельну воду, що містила мікроміцети вносили 0,1 см3 суспензії гетеротрофних мікроорганізмів, таким чином їх вихідна кількість становила 2,2·102 КУО/100 см3. Приготований модельний розчин аналізованої води, об'ємом 100 см3, пропускали через ацетатцелюлозні фільтри, з діаметром пор 0,45 мкм (Millipore). Після фільтрації фільтри розміщали на поверхню живильного середовища Сабуро з дихлораном (2 мг/дм3), яке додатково містило антибіотик, наприклад, гентаміцин у концентрації 40 мг/дм3 середовища. Підрахунок кількості колоній на поверхні фільтру та вимірювання їх діаметру здійснювали, використовуючи лупу. Ступінь виявлення культури кожного мікроскопічного гриба розраховували за співвідношенням (І). Для мікроскопічного гриба A. niger СВ становить: СВ-(3/4)·100 %=75 % (таблиця 3, приклад 4); Для мікроскопічного гриба С. cladosporioides CB: СВ=(4/5)·100 %=80 % (таблиця 3, приклад 5); Для мікроскопічного гриба P. multicolor CB: СВ=(3/4)·100 %=75 % (таблиця 3, приклад 6). В таблиці 3 також приведені дані по виявленню грибів у монокультурі цим же методом, дослідження та розрахунки проведені аналогічним чином. Ступінь виявлення мікроскопічних грибів, як повільноростучих, так і швидкоростучих становить 75-83,3 % (таблиця 3, приклади 1, 2, 3). Порівняльний аналіз даних таблиці 2 приклади 7 12, та таблиці 3 прикладів 1 - 6 показує, що присутність гетеротрофних мікроорганізмів не впливає на ступінь виявлення швидкоростучих і повільноростучих мікроміцетів, як у випадку їх виявлення у монокультурі, так і при сумісній присутності. Приклад 4. Метод прямого посіву. Агаризоване середовище Чапека. У колбу, що містить 100 см3 стерильної дистильованої води вносили по 1 см3 розведення суспензії кожного виду гриба, а саме A. niger (швидкоростучий вид) та С cladosporioides, P. multicolor (повільноростучі види). Вихідна кількість КУО у 1 см3 стерильної дистильованої води складала: A. niger 40, С. cladosporioides 40 та P. multicolor 60. 11 92088 Отриманий модельний розчин аналізованої води, об'ємом 1 см3, поміщали у чашку Петрі з живильним середовищем Чапека з дихлораном у концентрації 2 мг/дм3. Підрахунок колоній та вимірювання їх діаметру здійснювали, беручи до уваги колонії які виросли на поверхні чашки так і на глибині. Ступінь виявлення культури кожного мікроскопічного гриба розраховували за співвідношенням (І). Для мікроскопічного гриба A. niger CB становить: СВ=(36/40)·100 %=90 % (таблиця 4, приклад 4); Для мікроскопічного гриба С. cladosporioides CB: СВ=(35/40)·100 %=87,5 % (таблиця 4, приклад 5); 12 Для мікроскопічного гриба/5, multicolor CB: СВ=(48/60·%=80 % (таблиця 4, приклад 6). В таблиці 4 приведені дані по виявленню грибів у монокультурі цим же методом; дослідження та розрахунки проведені аналогічним чином. Для повільноростучих грибів, С. cladosporioides та P. multicolor, ступінь виявлення становить 95 та 88,4 %, відповідно (таблиця 4, приклади 2, 3), а для швидкоростучих видів грибів, таких як A. niger досягається ступінь виявлення рівний 92,9 % (таблиця 4, приклад 1). Як випливає з даних представлених у таблицях 2 приклади 1 - 6, та 4 приклади 1 - 6, використання живильних середовищ, що відрізняються за кількісним та якісним складом компонентів, забезпечує практично однаково високий ступінь виявлення мікроміцетів. Таблиця 3 Окремі види грибів Час спостереження, доба 3 5 7 СВ, % Суміш грибів P.multicolor КУО/100 Діаметр, КУО/100 Діаметр, КУО/100 Діаметр, КУО/100 Діаметр, КУО/100 Діаметр, КУО/100 Діаметр, 3 3 3 3 3 3 см мм см мм см мм см мм см мм см мм Метод мембранних фільтрів Приклади зa винаходом 1 2 3 4 5 5 4* 6* 5* 4* 5* 4* 2 1,5 3 1,5 1 2 3 1 1 1,5 1 1 3 5,5 3 2 3 2,5 3 2,6 2 2 2 2 3 6,1 5 2,5 4 3 3 3,1 4 2,5 3 2,8 75 83,3 80 75 80 75 A. niger С cladosporioides P.multicolor A. niger С cladosporioides 3 * - вихідна кількість мікроскопічних грибів, КУО/см . Таблиця 4 Час спостереження, доба 3 5 7 СВ, % Окремі види грибів Суміш грибів A. niger С.cladosporioides P. multicolor A. niger С.cladosporioides P.multicolor 3 Діаметр, 3 Діаметр, 3 Діаметр, 3 Діаметр, 3 Діаметр, 3 Діаметр, КУО/см КУО/см КУО/см КУО/см КУО/см КУО/см мм мм мм мм мм мм Метод прямого посіву Приклади за винаходом 1 2 3 4 5 6 70* 100* 86* 40* 40* 60* 60 2,3 15 1,1 44 2,3 28 0,7 5 1 28 1 65 5,5 56 2 60 3,5 30 1,4 18 1,5 34 2,4 60 6,8 95 3 76 5,4 36 3,2 35 2,3 48 3 92,9 95 88,4 90 87,5 80 3 * - вихідна кількість мікроскопічних грибів, КУО/см . Встановлено, що використання живильного середовища, наприклад Сабуро або Чапека, яке містить дихлоран (2,6-дихлор-4-нітроанілін), у концентрації (1÷4 мг/дм3), дає можливість виявити та провести більш повний кількісний підрахунок як монокультури швидкоростучих і повільноростучих видів грибів, так і їх суміші, як методом прямого посіву, так і методом мембранних фільтрів, що робить проведений аналіз зразка більш інформативним (таблиці 2, 3, 4). 13 92088 14 Таблиця 5 Час спостереження, доба СВ, % 3 5 7 СВ, % 3 5 7 СВ, % Окремі види грибів Суміш грибів A. niger C.cladosporioides P. multicolor A. niger C.cladosporioides P.multicolor 3 Діаметр, 3 Діаметр, 3 Діаметр, 3 Діаметр, 3 Діаметр, 3 Діаметр, КУО/см КУО/см КУО/см КУО/см КУО/см КУО/см мм мм мм мм мм мм Приклади за винаходом 1 2 3 4 5 6 94 100 100 94,7 93,3 90 Позамежні значення 3 Концентрація дихлорану 0,5 мг/дм Приклади 7 8 9 10 11 12 70* 80* 60* 35* 45* 27* 33 5,5 65 2,8 45 3,8 13 5,1 5 2,5 4 2 ** 61 3,6 40 5,5 ** ** ** ** 52 5,8 35 8 ** ** ** 47,1 81,3 75 37,1 11,1 14,8 3 Концентрація дихлорану 4,5 мг/дм Приклади 13 14 15 16 17 18 60* 95* 70* 48* 50* 65* 25 0,3 2 0,5 2 0,5 15 0,5 4 0,5 8 0,5 30 0,7 15 1 16 1 18 1 10 0,8 11 0,7 35 1 30 1 20 1 23 1,1 12 1 15 1 58,3 31,6 28,6 47,9 24 23 3 * - вихідна кількість мікроскопічних грибів, КУО/см . Реалізація способу з використанням середовища Сабуро, методом прямого посіву, при позамежному зменшенні концентрації дихлорану у середовищі, наприклад 0,5 мг/дм3, призводить, у випадку монокультури мікроскопічних грибів, до зменшення ступеню виявлення (СВ) мікроміцетів (СВ=47,1-81,3 %), що відповідає рівню у відомому способі [3] (СВ=47-75 %) (дивись таблиця 5, приклади 7-9 та таблиця 1, приклади 1-3, відповідно). Слід відмітити, що при наявності суміші грибів недостатня кількість дихлорану також призводить до різкого зниження ступеню виявлення (СВ=11,137,1 %), який наближається до ступеня виявлення у способі [3] (СВ=11-37,5 %) (дивись таблиця 5, приклади 10-12 та таблиця 1, приклади 4-6, відповідно). Це свідчить про недостатню концентрацію дихлорану для пригнічення росту колоній і повзучого міцелію грибів, що призводить до злиття кількох колоній в одну, а це в свою чергу впливає на підрахунки колоній грибів. Верхнє граничне значення кількості дихлорану у живильному середовищі обмежено тим, що при позамежному збільшенні дихлорану у середовищі, наприклад, до 4,5 мг/дм3, відбувається надмірне пригнічення росту грибів, як у випадку монокультури, так і у випадку суміші мікроміцетів. Так, наприклад ступень виявлення монокультури мікроміцетів, методом прямого посіву, для A. niger складає 58,3 %, для C. cladosporioides 31,6 %, а для P. multicolor 28,6 % (таблиця 5 приклади 13, 14, 15). У випадку суміші швидкоростучих грибів та повільноростучих грибів СВ для A. niger складає 47,9 %, для C. cladosporioides 24 %, а для P. multi color 23 % (таблиця 5 приклади 16, 17, 18). Це свідчить про надмірну дію дихлорану на структуру клітини гриба, що призводить до надмірного пригнічення росту мікроміцетів. Переваги запропонованого способу виявлення мікроміцетів у воді з допомогою живильного середовища, яке містить дихлоран в порівнянні з відомим способом [3], полягають в наступному: реалізація запропонованого способу дозволяє підвищити ступінь виявлення мікроміцетів, як швидкоростучих так і повільноростучих видів, за рахунок покращення якості їх підрахунків, так наприклад, у випадку монокультур ступінь виявлення A. niger з 47 % до 94 %; C. cladosporioides з 72 % до 100 %, P. multicolor з 75 % до 100 %, тобто на 25-47 %; так і при їх сумісній присутності для A. niger з 37,5 % до 94,7 %; C.cladosporioides з 13,7 до 93,3 %, P.multicolor з 11 % до 90 %, тобто на 57,2-79,6 %; результативність та інформативність досягається і при виявленні мікроміцетів у поверхневих водоймах, які містять гетеротрофні мікроорганізми, за рахунок внесення антибіотика, так наприклад, ступінь виявлення P. multicolor становить 80 %, як і у випадку відсутності гетеротрофів; - достоїнством запропонованого способу є можливість використання його для аналізу проб з різних джерел навколишнього середовища, а внесення дихлорану можна здійснювати у різні продажні живильні середовища, що призначені для виявлення мікроміцетів та дріжджеподібних грибів. 15 Комп’ютерна верстка Д. Шеверун 92088 Підписне 16 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601