Антитіло, яке специфічно зв’язує рецептор інтерлейкіну-6 людини (hil-6r)

Реферат: Винахід належить до антитіла або його антигензв'язувального фрагменту, яке зв'язує hIL-6R, та його застосування для лікування захворювань, опосередкованих IL-6. UA 97645 C2 (12) UA 97645 C2 UA 97645 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Інтерлейкін-6 (IL-6) є плейотропним цитокіном, продукованим імунними і неімунними клітинами, який відіграє вирішальну роль у регуляції імунної реакції, реакцій гострої фази і гемопоезу. Він зв'язується з розчинним і зв'язаним із клітинною мембраною IL-6R (α-ланцюгом) з утворенням бінарного комплексу, і цей комплекс здатний взаємодіяти зі зв'язаним із клітинною мембраною gp130 (β-ланцюгом), індукує утворення комплексу передачі сигналу, який містить по два кожного з IL-6, IL-6R і gp130. Антитіла до WL-6R описані в патентах US 5670373, 5795965, 5817790, 6410691 і ЕР 409607В1. Терапевтичні способи описані в патентах US 5888510 і 6723319. У першому аспекті, даний винахід забезпечує антитіла людини, переважно рекомбінантні антитіла людини, які специфічно зв'язують рецептор інтерлейкіну-6 людини (hIL-6R). Ці антитіла характеризуються зв'язуванням з hIL-6R з високою афінністю і повільною кінетикою дисоціації і здатністю нейтралізувати активність IL-6. Ці антитіла можуть бути повнорозмірними (наприклад, антитіло IgG1 або IgG2) або можуть містити тільки антигензв'язувальну частину (наприклад, фрагмент Fab, F(ab')2 або scFv) і можуть бути модифіковані для впливу на функціональність, наприклад, для елімінації залишкових ефекторних функцій (Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925-1933). У переважному варіанті здійснення, цей винахід забезпечує антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що зв'язує IL-6-рецептор людини (SEQ ID NO: 1) з KD близько 500 пМ або менше, як виміряно резонансом поверхневих плазмонів. У більш конкретному варіанті здійснення, це антитіло або антигензв'язувальний фрагмент має K D менше 300 пМ або менше 200 пМ, або навіть менше 100 пМ. У різних варіантах здійснення, це антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент блокує активність hIL-6 з ІС50 250 пМ або менше, як виміряно біоаналізом з використанням люциферази. У більш конкретних варіантах здійснення, антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент виявляє ІС50 150 пМ або менше. У родинних аспектах, це антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за даним винаходом зв'язує ML-6R з афінністю щонайменше в 2 рази більш високою, ніж афінність, з якою він зв'язує IL-6R мавпи. У більш переважних варіантах здійснення, це антитіло або антигензв'язу вальний фрагмент зв'язує білок hIL-6R (SEQ ID NO: 1) з афінністю, яка є приблизно в 3 рази більш високою відносно його афінності зв'язування з IL-6R мавпи (позаклітинний домен Масаса fascicularis показаний у SEQ ID NO: 251). В одному варіанті здійснення, антитіло або антигензв'язувальна частина антитіла за даним винаходом містить варіабельну область важкого ланцюга (HCVR), вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 3, 227, 19, 231, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 239, 241, 163, 179, 235, 195 і 211 або їх по суті подібної послідовності. У більш конкретному варіанті здійснення, це антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент додатково містить варіабельну область легкого ланцюга (LCVR), вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 11, 229, 27, 233, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 237, 203 і 219 або їх по суті подібної послідовності. У конкретних варіантах здійснення, це антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент містить пари HCVR/LCVR, вибрані з групи, яка складається з SEQ ID NO: 3/11; 227/229; 19/27; 231/233; 35/43; 51/59; 67/75; 83/91; 99/107; 115/123; 131/139; 147/155; 239/155; 241/155; 163/171, 179/187; 235/237; 195/203 і 211/219 або їх по суті подібної послідовності. В другому аспекті, цей винахід забезпечує виділені молекули нуклеїнових кислот, які кодують антитіло або антигензв'язувальний фрагмент антитіла цього винаходу. В одному варіанті здійснення, молекула нуклеїнової кислоти за даним винаходом кодує антитіло або його фрагмент, що містять HCVR, описану вище. У конкретних варіантах здійснення, молекула нуклеїнової кислоти, що кодує HCVR, вибрана з групи, яка складається з SEQ ID NO. 2, 226, 18, 230, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 238, 240, 162, 178, 234, 194 і 210 або їх по суті ідентичної послідовності. У родинному аспекті, цей винахід забезпечує виділену молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує LCVR, описану вище. У конкретних варіантах здійснення, ця молекула нуклеїнової кислоти, що кодує LCVR, є нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 10, 228, 26, 232, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 236, 202 і 218 або їх по суті ідентичної послідовності. У третьому аспекті, цей винахід описує антитіло або антигензв'язувальний фрагмент, які містять домен ділянки 3 (CDR3), що визначає комплементарність, важкого ланцюга і домен CDR3 легкого ланцюга, де 1 2 3 4 домен CDR3 важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність формули X - X - X - X 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 1 X - X - X - X - X - X - X - X - X - X -X - X - X - X - X (SEQ ID NO: 247), де Х =Аlа, 2 3 4 5 6 7 8 9 10 X =Lys, X =Gly, X =Arg, X =Asp, X =Ser або Ala, X =Phe, X =Asp; X =Ile, X =Pro або відсутній, 11 12 13 14 15 X =Phe або відсутній, X =Val або відсутній, Х =Туr або відсутній, Х =Туr або відсутній, Х =Туr 16 17 18 19 або відсутній, X =Gly або відсутній, X =Met або відсутній, X =Asp або відсутній і X =Val або відсутній; і 1 UA 97645 C2 1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2 3 4 домен CDR3 легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність формули X - X - X - X 6 7 8 9 1 2 3 4 5 X - X - X - X - X (SEQ ID NO: 250), де X =Gln, X =Gln або His, Х =Аlа, X =Asn або Туr, X =Ser, 6 7 8 9 X =Phe, X =Pro, X =Pro і X =Thr. У більш конкретному варіанті здійснення, це антитіло або антигензв'язувальний фрагмент додатково містить: 1 2 домен CDR1 важкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність формули X - X 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 X - X - X - X - X - X (SEQ ID NO: 245), де X =Gly або Arg, X =Phe, X =Thr, X =Phe, X =Asp, 6 7 8 X =Asp, X =Tyr і X =Ala; 1 2 домен CDR2 важкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність формули X - X 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 X - X - X - X - X - X (SEQ ID NO: 246), де X =llе або Val, X =Ser, X =Trp, X =Asn, X =Ser, 6 7 8 X =Gly, X =Ser і Х =Іlе; 1 2 3 домен CDR1 легкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність формули X - X - X 4 5 6 1 2 3 4 5 6 - X - X - X (SEQ ID NO: 248), де X =Gln, X -Gly, X =Ile, X =Ser, X =Ser і Х =Тrр; і 1 2 3 домен CDR2 легкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність формули X - X - X 1 2 3 (SEQ ID NO: 249), де X =Gly або Ala, Х =Аlа і X =Ser. У четвертому аспекті, цей винахід описує антитіло або антигензв'язувальний фрагмент, які містять: домен CDR3 важкого ланцюга, вибраний із групи, яка складається з SEQ ID NO: 25, 153, 9, 185, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 169, 201 і 217, і домен CDR3 легкого ланцюга, вибраний із групи, яка складається з SEQ ID NO: 33, 161, 17, 193, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 177, 209 і 225. У більш конкретному варіанті здійснення, антитіло або антигензв'язувальний фрагмент додатково містить: домен CDR1 важкого ланцюга, вибраний із групи, яка складається з SEQ ID NO: 21, 149, 5, 181, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 165, 197 i 213; домен CDR2 важкого ланцюга, вибраний із групи, яка складається з SEQ ID NO:23, 151,7, 183,39,55,71,87, 103, 119, 135, 167, 199 і 215; домен CDR1 легкого ланцюга, вибраний із групи, яка складається з SEQ ID NO: 29, 157, 13, 189, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 173, 205 і 221, і домен CDR2 легкого ланцюга, вибраний із групи, яка складається з SEQ ID NO: 31, 159, 15, 191, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 175, 207 і 223.** У конкретних варіантах здійснення, це антитіло або антигензв'язувальний фрагмент містить послідовності CDR важкого ланцюга SEQ ID NO: 21, 23, 25 і послідовності CDR легкого ланцюга SEQ ID NO: 29, 31, 33; послідовності CDR важкого ланцюга SEQ ID NO: 149, 151, 153 і послідовності CDR легкого ланцюга SEQ ID NO: 157, 159, 161; послідовності CDR важкого ланцюга SEQ ID NO: 5, 7, 9 і послідовності CDR легкого ланцюга SEQ ID NO: 13, 15, 17; і послідовності CDR важкого ланцюга SEQ ID NO: 181, 183, 185 і послідовності CDR легкого ланцюга SEQIDNO: 189, 191, 193. У п'ятому аспекті, цей винахід описує виділені молекули нуклеїнових кислот, які кодують антитіло або антигензв'язувальні фрагменти цього винаходу, де це антитіло або його фрагмент містить: домен CDR3 важкого ланцюга, кодований нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 24, 152, 8, 184, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 168, 200 і 216; і домен CDR3 легкого ланцюга, кодований нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO 32, 160, 16, 192, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 176, 208 і 224; а також їх по суті ідентичні послідовності нуклеїнових кислот. У більш конкретному варіанті здійснення, забезпечені виділені молекули нуклеїнових кислот, які кодують антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за даним винаходом, де це антитіло або його фрагмент містить: домен CDR1 важкого ланцюга, кодований нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 20, 148, 4, 180, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 164, 196 і 212; домен CDR2 важкого ланцюга, кодований нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 22, 150, 6, 182, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 166, 198 і 214; домен CDR1 легкого ланцюга, кодований нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 28, 156, 12, 188, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 172, 204 і 220; і домен CDR2 легкого ланцюга, кодований нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 30, 158, 14, 190, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 174, 206 і 222; а також їх по суті ідентичні послідовності нуклеїнових кислот. Даний винахід включає анти-hlL-6R-антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, які мають модифікований патерн (розподіл) глікозилування. У деяких застосуваннях, можуть бути 5 2 UA 97645 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 застосовні модифікація для видалення небажаних сайтів глікозилування або антитіло, позбавлене фукозної частини молекули на олігосахаридному ланцюгу, наприклад, для збільшення антитілозалежної клітинної цитотоксичності (ADCC) (див. Shield et al. (2002) JBC 277:26733). В інших застосуваннях, може бути зроблена модифікація галактозилування для модифікації комплементзалежної цитотоксичності (CDC). В інших аспектах, даний винахід забезпечує рекомбінантні експресуючі вектори, що несуть молекули нуклеїнових кислот цього винаходу, і клітини-хазяїни, у які були введені такі вектори, а також способи одержання антитіл або антигензв'язувальних фрагментів цього винаходу, одержаних культивуванням клітин-хазяїнів цього винаходу. Ця клітина-хазяїн може бути прокаріотичною або еукаріотичною клітиною, переважно цією клітиною-хазяїном є клітина Е. соlі або клітина ссавця, наприклад, клітина СНО. У наступному аспекті, даний винахід описує фармацевтичну композицію, яка містить антитіло людини або антигензв'язувальний фрагмент антитіла, що специфічно зв'язується з hIL6R, і фармацевтично прийнятний носій. У наступних аспектах, даний винахід описує способи інгібування активності IL-6 людини з використанням антитіла або його антигензв'язувальної частини даного винаходу. В одному варіанті здійснення, це антитіло включає терапевтичний спосіб, який передбачає введення антитіла цього винаходу, або його фрагмента, суб'єкту-людині, що страждає від порушення, яке лікується або послабляється інгібуванням активності IL-6. Цим порушенням може бути, наприклад, артрит, у тому числі хронічний ревматоїдний артрит; запальні захворювання кишечнику, у тому числі хвороба Крона і виразковий коліт; системний червоний вовчак і запальні захворювання. В інших аспектах, даний винахід забезпечує застосування антитіла або антигензв'язувального фрагмента антитіла, визначених вище, у приготуванні лікарського засобу для застосування в ослабленні або інгібуванні IL-6-опосередкованого захворювання або порушення у людини. У родинному аспекті, цей винахід забезпечує антитіло або антигензв'язувальний фрагмент антитіла, визначені вище, для застосування в ослабленні або інгібуванні IL-6-опосередкованого захворювання або порушення у людини. Інші цілі і переваги стануть очевидними при розгляді наступного докладного опису. Перед описом способів даного винаходу, повинно бути зрозуміло, що цей винахід не обмежується описаними конкретними способами й експериментальними умовами, оскільки такі способи й умови можуть варіюватися. Повинно бути також зрозуміло, що використовувана в даному описі термінологія призначена тільки для цілі опису конкретних варіантів здійснення і не призначена для обмеження, об'єм даного винаходу буде обмежуватися тільки прикладеною формулою винаходу. Якщо немає іншої вказівки, усі технічні і наукові терміни, використовувані в дійсному винаході, мають таке ж значення, що і значення, яке розуміється фахівцем зі звичайною кваліфікацією в галузі, до якої належить цей винахід. Хоча в практиці або тестуванні даного винаходу можуть бути використані будь-які способи і матеріали, подібні або еквівалентні способам і матеріалам, описаним у даному описі, тепер будуть описані переважні способи і матеріали. Термін "IL6R людини" (hIL-6R) належить, у даному контексті, до рецептора цитокіну людини, який специфічно зв'язує інтерлейкін-6 (IL-6). Позаклітинний домен hIL-6R показаний у SEQ ID NO: 1. Термін "антитіло" належить, у даному контексті, до молекул імуноглобуліну, які містять чотири поліпептидні ланцюги, два важких (Н) ланцюги і два легких (L) ланцюги, взаємозв'язані дисульфідними зв'язками. Кожен важкий ланцюг містить варіабельну область важкого ланцюга (скорочувану в даному описі як HCVR або VH) і константну область важкого ланцюга. Константна область важкого ланцюга містить три домени, СНІ, СН2 і СН3. Кожен легкий ланцюг містить варіабельну область легкого ланцюга (скорочувану як LCVR або VL) і константну область легкого ланцюга. Константна область легкого ланцюга складається з одного домену (CL1). VH- і VL-області можуть бути додатково підрозділені на гіперваріабельні області, називані районами (областями) (CDR), що визначають комплементарність, зі вставленими районами, які є більш консервативними, називаними каркасними областями (FR). Кожна з VH і VL складається з трьох CDR і чотирьох FR, розташованих від амінокінця до карбоксикінця в наступному порядку: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Термін "антигензв'язувальна частина" антитіла (або просто "частина антитіла" або "фрагмент антитіла") належить, у даному контексті, до одного або декількох фрагментів антитіла, що зберігають здатність специфічно зв'язуватися з антитілом (наприклад, hIL-6R) Було показано, що антигензв'язувальна функція антитіла може виконуватися фрагментами 3 UA 97645 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 повнорозмірного антитіла. Приклади зв'язувальних фрагментів, охоплюваних терміном "антигензв'язувальна частина" антитіла, включають (і) Fab-фрагмент, одновалентне антитіло, яке складається з доменів VL, VH, CLl і СНІ; (іі) F(аb') 2-фрагмент, двовалентний фрагмент, який містить два Fab-фрагменти, зв'язаних дисульфідним містком при шарнірній області; (ііі) Fdфрагмент, який складається з VL- і VH-доменів єдиного плеча антитіл; (ν) dAb-фрагмент (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), який складається з VH-домену; i (vi) виділений район (CDR), що визначє комплементарність. Крім того, хоча два домени Fv-фрагмента, VL і VH, кодуються різними генами, вони можуть бути з'єднані з використанням рекомбінантних способів, за допомогою синтетичного лінкера, який дозволяє їм утворити єдиний суміжний ланцюг, в якому ці VL- і VH-області спарюються з утворенням одновалентних молекул, відомих як одноланцюгові Fv (scFv), див., наприклад, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; і Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Передбачається, що такі одноланцюгові антитіла включені також у термін "антигензв'язувальна частина" антитіла. Інші форми одноланцюгових антитіл, такі як діатіла, також включені в цей термін (див., наприклад, Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448). "Нейтралізуюче" або "блокуюче" антитіло, у даному контексті, належить до антитіла, зв'язування якого з hIL-6R приводить до інгібування біологічної активності hIL-6. Це інгібування біологічної активності hIL-6 може оцінюватися вимірюванням одного або декількох індикаторів біологічної активності hIL-6, відомих у даній галузі, таких як hIL-6-індукована клітинна активність і зв'язування hIL-6 з hIL-6R (див. приклади нижче). "CDR" або ділянкою, що визначає комплементарність, є ділянка гіперваріабельності, вставлена з інтервалами в областях, що є більш консервативними, називаними "каркасними областями" (FR). У різних варіантах здійснення aнти-hIL-6R-aнтитіла або фрагмента за даним винаходом, ці FR можуть бути ідентичними послідовностям зародкової лінії людини або можуть бути природно або штучно модифікованими. Група CDR може бути визначена як амінокислотна консенсусна послідовність, наприклад, в одному варіанті здійснення, анти-hIL-6R-aнтитілo або антигензв'язувальний фрагмент за даним винаходом можуть бути описані як такі, що містять 1 2 3 домен CDR3 важкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність формули X – X - X 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 X - X – X - X -X - X - X - X - X - X - X - X - X - X - X - X (SEQ ID NO: 247), де 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 X =Ala, X =Lys, X =Gly, X =Arg, X =Asp, X =Ser або Ala, X =Phe, X =Asp; X =He, X =Pro або 11 12 13 14 відсутній, X =Phe або відсутній, X =Val або відсутній, Х =Туr або відсутній, Х =Туr або 15 16 17 18 відсутній, Х =Туr або відсутній, X =Gly або відсутній, X =Met або відсутній, X =Asp або 19 відсутній і X =Val або відсутній; і домен CDR3 легкого ланцюга, який містить амінокислотну 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 послідовність формули X – X - X - X - X - X - X - X - X (SEQ ID NO: 250), де X =Gln, X =Gln 3 4 5 6 7 8 9 або His, Х =Аlа, X =Asn або Туr, X =Ser, X =Phe, X =Pro, X =Pro і X =Thr. Термін "резонанс поверхневих плазмонів", у даному контексті, належить до оптичного явища, яке робить можливим аналіз взаємодій реального часу детектуванням змін концентрацій білка в біосенсорному матриксі, наприклад, з використанням системи BIAcore™ (Pharmacia Biosensor AB). Термін "епітоп" означає антигенну детермінанту, яка взаємодіє зі специфічним антигензв'язу вальним сайтом у варіабельній області молекули антитіла, відомим як паратоп. Окремий антиген може мати більше ніж один епітоп. Епітопи можуть бути або конформаційними, або лінійними. Конформаційний епітоп утворюється просторово розташованими поруч амінокислотами з різних сегментів лінійного поліпептидного ланцюга. Лінійний епітоп утворюється суміжними амінокислотними залишками в поліпептидному ланцюзі. У деяких обставинах, епітоп може включати сахаридні частини, фосфорильні групи або сульфонільні групи цього антигену. Термін "суттєва ідентичність" або "по суті ідентичні", коли він належить до нуклеїнової кислоти або її фрагмента, вказує на те, що при оптимальному зіставленні з придатними нуклеотидними інсерціями або делеціями з іншою молекулою нуклеїнової кислоти (або її комплементарним ланцюгом) є ідентичність нуклеотидної послідовності щонайменше приблизно 95% або більш переважно щонайменше приблизно 96%, 97%, 98% або 99% нуклеотидних основ, як виміряно будь-яким добре відомим алгоритмом ідентичності послідовності, таким як FASTA, BLAST або Gap, обговорюваними нижче. Застосовно до поліпептидів, термін "суттєва ідентичність" або "по суті ідентичні" означає, що дві пептидні послідовності, при оптимальному зіставленні, такому як програми GAP або BESTFIT, які використовують маси гепів за замовчуванням, мають щонайменше 95% ідентичність послідовності, навіть більш переважно щонайменше 98% або 99% ідентичність послідовності. Переважно, положення залишків, які не є ідентичними, розрізняються консервативними амінокислотними замінами. "Консервативна амінокислотна заміна" є заміною, 4 UA 97645 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 в якій амінокислотний залишок замінений іншим амінокислотним залишком, який має бічний ланцюг (R-групу) з подібними хімічними властивостями (наприклад, зарядом або гідрофобністю). Звичайно, консервативна амінокислотна заміна не буде суттєво змінювати функціональні властивості білка. У випадках, коли дві або більше амінокислотні послідовності відрізняються одна від одної консервативними замінами, процентна ідентичність або ступінь подібності послідовності може коректуватися в напрямку корекції консервативної природи цієї заміни. Див., наприклад, Pearson (1994) Methods Моl. Biol. 24: 307-331. Приклади груп амінокислот, які мають бічні ланцюги з подібними хімічними властивостями, включають 1) аліфатичні бічні ланцюги: гліцин, аланін, валін, лейцин і ізолейцин; 2) аліфатичні-гідроксильні бічні ланцюги: серин і треонін, 3) амідовмісні бічні ланцюги: аспарагін і глутамін, 4) ароматичні бічні ланцюги: фенілаланін, тирозин і триптофан; 5) основні бічні ланцюги: лізин, аргінін і гістидин; 6) кислотні бічні ланцюги: аспартат і глутамат; і 7) сірковмісні бічні ланцюги: цистеїн і метіонін. Переважними групами консервативних замін є: валін-лейцин-ізолейцин, фенілаланінтирозин, лізин-аргінін, аланін-валін, глутамат-аспартат і аспарагін-глутамін. Альтернативно, консервативною заміною є будь-яка зміна, що має позитивну величину в матриці log-імовірності РАМ250, описаній в Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-45. А "помірно консервативною" заміною є будь-яка зміна, що має ненегативну величину в матриці log-імовірності РАМ250. Подібність послідовності для поліпептидів, яку також називають ідентичністю послідовності, вимірюють звичайно з використанням програмного забезпечення аналізу послідовностей. Програмне забезпечення аналізу білків зіставляє подібні послідовності з використанням вимірювань подібності, приписаних різним замінам, делеціям і іншим модифікаціям, у тому числі амінокислотним замінам. Наприклад, програмне забезпечення GCG містить програми, такі як Gap і Bestfit, які можуть бути використані з параметрами за замовчуванням для визначення гомології послідовностей або ідентичності послідовностей між близькородинними поліпептидами, такими як гомологічні поліпептиди з різних видів організмів або між білком дикого типу і його мутеїном. Див., наприклад, GCG Version 6.1. Поліпептидні послідовності можуть також порівнюватися за допомогою FASTA з використанням параметрів за замовчуванням або рекомендованих параметрів, програма в GCG Version 6.1. FASTA (наприклад, FASTA2 і FASTA3) забезпечує зіставлення і процентну ідентичність послідовності районів найкращого збігу між запитуваними послідовностями і послідовностями пошуку (Pearson (2000) supra). Іншим переважним алгоритмом при порівнянні послідовності цього винаходу з базою даних, яка містить велику кількість послідовностей з різних організмів, є комп'ютерна програма BLAST, особливо blastp або tblastn, які використовують параметри за замовчуванням. Див., наприклад, Altschul et al. (1990) J. Моl. Biol. 215: 403-410 і Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 402. Одержання антитіл людини Способи генерування антитіл людини включають, наприклад, технологію Velocimmune™ (Regeneron Pharmaceuticals), XenoMouse™ (Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21; Abgenix), підхід "мінілокусу" і фаговий дисплей (див., наприклад, патент US 5545807. патент US 6787637) Технологія Velocimmune™ (патент US 6596541) включає спосіб генерування високоспецифічного повнорозмірного антитіла людини до вибраного антигену. Ця технологія включає генерування трансгенної миші, яка має геном, що містить варіабельні області важкого і легкого ланцюга людини, функціонально зв'язані з ендогенними локусами константної області миші, так що ця миша продукує антитіло, яке містить варіабельну область людини і константну область миші у відповідь на антигенну стимуляцію. ДНК, які кодують варіабельні області важкого і легкого ланцюгів цього антитіла, виділяють і функціонально зв'язують із ДНК, яка кодує константні області важкого і легкого ланцюга людини. Потім цю ДНК експресують у клітині, здатній експресувати повністю людське антитіло. У конкретних варіанті здійснення, цією клітиною є клітина СНО. Антитіла можуть бути терапевтично застосовні в блокуванні взаємодії ліганд-рецептор або інгібуванні взаємодії рецепторного компонента, а не за допомогою убивання клітин через фіксацію комплемента (комплементзалежної цитотоксичності) (CDC) і через участь в антитілозалежній клітинноопосередкованій цитотоксичності (ADCC). Константна область антитіла є важливою в здатності антитіла фіксувати комплемент і опосередковувати клітиннозалежну цитотоксичність Таким чином, ізотип антитіла може бути вибраний на основі того, чи є бажаним, щоб це антитіло опосередкувало цитотоксичність. Імуноглобуліни людини можуть існувати в двох формах, які асоційовані з гетерогенністю шарнірної області. В одній формі, молекула імуноглобуліну містить стабільну чотириланцюгову конструкцію приблизно 150-160 кДа, у якій димери утримуються разом взаємодією дисульфідного зв'язку важкого ланцюга. В другій формі, ці димери не зв'язані разом 5 UA 97645 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 міжланцюговими дисульфідними зв'язками, і утворена молекула приблизно 75-80 кДа, складена з ковалентно зв'язаних легкого ланцюга і важкого ланцюга (напівантитіло). Розділити ці форми було украй важко, навіть після афінного очищення. Частота зустрічальності другої форми в різних інтактних ізотипах IgG обумовлена, але не обмежується ними, структурними відмінностями, асоційованими з ізотипом шарнірної області цього антитіла. Дійсно, заміна єдиної амінокислоти в шарнірній області шарніра IgG4 людини може значимо зменшувати появу другої форми (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) до рівнів, звичайно спостережуваних з використанням шарніра IgG1 людини. Даний винахід включає антитіла, які мають одну або кілька мутацій у шарнірній області, в області СН2 або СН3, які можуть бути бажаними, наприклад, у виробництві, для поліпшення виходу бажаної форми антитіла. Антитіла за даним винаходом одержують переважно з використанням технології Velocimmune™. Трансгенну мишу, в якій ендогенні варіабельні області важкого і легкого ланцюгів імуноглобуліну замінені відповідними варіабельними областями людини, стимулюють антигеном, який представляє інтерес, і витягають лімфатичні клітини (такі як В-клітини) з цих мишей, що експресують антитіла. Ці лімфатичні клітини можуть бути злиті з мієломною клітинною лінією для одержання імморталізованих гібридомних клітинних ліній, і такі гібридомні клітинні лінії піддають скринінгу і відбирають для ідентифікації гібридомних клітинних ліній, які продукують антитіла, специфічні відносно антигену, що представляє інтерес. ДЕК, яка кодує варіабельні області важкого ланцюга і легкого ланцюга, може бути виділена і зв'язана з бажаними ізотипічними константними областями важкого ланцюга і легкого ланцюга. Такий білок антитіла може бути одержаний у клітині, такій як клітина СНО. Альтернативно, ДНК, яка кодує антигенспецифічні химерні антитіла або варіабельні домени легкого і важкого ланцюгів, може бути виділена безпосередньо з антигенспецифічних лімфоцитів. В одному варіанті здійснення, ця трансгенна миша містить до 18 функціональних генів варіабельних областей важкого ланцюга людини і 12 функціональних генів варіабельних областей легкого ланцюга каппа людини. В іншому варіанті здійснення, ця трансгенна миша містить до 39 генів варіабельних областей важкого ланцюга людини і 30 генів варіабельних областей легкого ланцюга каппа людини. Ще в одному варіанті здійснення ця трансгенна миша містить до 80 генів варіабельних областей важкого ланцюга людини і 40 генів варіабельних областей легкого ланцюга каппа людини. Звичайно, антитіла за даним винаходом мають дуже високі афінності, звичайно маючи KD 9 -12 приблизно 10 - приблизно 10 Μ при вимірюванні зі зв'язування з антигеном або у виді іммобілізованих на твердій фазі, або у фазі розчину антитіл. Спочатку виділяють химерні антитіла високої афінності, які мають варіабельну область людини і константну область миші Як описано нижче, ці антитіла характеризують і відбирають на бажані характеристики, що включають зв'язувальну афінність відносно hIL-6R, здатність блокувати hIL-6 і/або селективність відносно білка людини. Константні області миші заміняють бажаною константною областю людини для генерування повністю людського антитіла цього винаходу, наприклад, IgG4 або IgG1 дикого типу або модифіковані (наприклад, SEQ ID NO: 242, 243, 244). Хоча вибрана константна область може варіюватися відповідно до конкретного застосування, характеристики зв'язування антигену з високою афінністю і специфічності відносно мішені локалізовані у варіабельній області. Картування епітопів і пов'язані з ним технології Для скринінгу на антитіла, які зв'язуються з конкретним епітопом, може виконуватися рутинний перехресно блокуючий аналіз, такий як аналіз, описаний у Antibodies A Laboratory Manual 1988 Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow and Lane, eds. Інші способи включають аланінскануючі мутанти, пептидні блоти (Reineke (2004) Methods Моl. Biol. 248:443-63) або аналізи пептидного розщеплення, описані в прикладах нижче. Крім того, можуть бути використані такі способи, як вирізання епітопів, екстракція епітопів і хімічна модифікація антигенів (Tomer (2000) Protein Science: 9:487-496). Аналіз з використанням модифікацій (МАР), також відомий як аналіз антитіл на основі структури антигену (ASAP), є способом, який класифікує великі кількості моноклональних антитіл (mAbs). спрямованих проти одного і того самого антигену, згідно з подібностями профілю зв'язування кожного антитіла з поверхнями хімічно або ферментативно модифікованих антигенів (Публікація патенту US 2004/0101920). Кожна категорія може відображати унікальний епітоп, який або явно відрізняється від епітопа, представленого іншою категорією, або частково співпадає з епітопом, представленим іншою категорією. Ця технологія робить можливою швидку фільтрацію генетично ідентичних антитіл, так що характеристика може бути сфокусована на генетично відмінних антитілах. При використанні скринінгу гібридом, МАР може полегшувати ідентифікацію рідких гібридомних клонів з бажаними характеристиками. МАР може 6 UA 97645 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 бути використаний для сортингу hІL-6R-антитіл цього винаходу на групи антитіл, які зв'язують різні епітопи. Агенти, застосовні для зміни структури іммобілізованого антигену, є ферментами, такими як, наприклад, протеолітичні ферменти, і хімічними агентами. Антигенний білок може бути іммобілізований або на поверхнях біосенсорного чипа, або на полістиролових гранулах. Останні можуть бути оброблені з використанням, наприклад, такого аналізу, як мультиплексний аналіз детектування з використанням Luminex™ (Luminex Corp., TX). Оскільки здатність Luminex™ виконувати мультиплексний аналіз з такою кількістю, як до 100 різних типів гранул, Luminex™ забезпечує майже необмежені антигенні поверхні з різними модифікаціями, що приводить до поліпшеного розрізнення аналізу епітопів антитіл у порівнянні з біосенсорним аналізом. Терапевтичне введення і готові форми Введення терапевтичних речовин відповідно до даного винаходу буде виконуватися з придатними носіями, ексципієнтами й іншими агентами, які включають у готові форми для забезпечення поліпшеного перенесення, доставки, переносимості і т. п. Множина придатних готових форм може бути знайдена у фармакологічному довіднику, відомому усім фармацевтичним хімікам. Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1975), зокрема, частині 87, написаній Blaug, Seymour, у цьому довіднику Ці готові форми включають, наприклад, порошки, пасти, мазі, желе, воски, олії, ліпіди, ліпід (катіонний або аніонний), що містить пузирчики (такий як Ліпофектин™), ДНК-кон'югати, безводні абсорбційні пасти, емульсії типу масло-у-воді і вода-у-маслі, емульсії карбоваксу (поліетиленгліколів різних молекулярних мас), напівтверді гелі і напівтверді суміші, що містять карбовакс. Кожна з попередніх сумішей може бути придатною в обробках і терапіях відповідно до даного винаходу, за умови, що активний інгредієнт у цій готовій формі не інактивується цією готовою формою, і ця готова форма є фізіологічно сумісною і переносимою для конкретного способу введення. Див. також Powell et al. PDA (1998) J Pharm Sci Technol. 52-238-311 і посилання, цитовані в цій роботі, щоджо додаткової інформації, яка належить до ексципієнтів і носіїв, добре відомих фармацевтичним хімікам. ПРИКЛАДИ Наступні приклади пропонуються для забезпечення фахівців із звичайною кваліфікацією в даній галузі повним розкриттям і описом, яким чином виконувати і використовувати способи і композиції даного винаходу, і не призначені для обмеження об'єму матеріалу, розглянутого авторами як їхнього винаходу. Були здійснені спроби забезпечення точності відносно використовуваних чисел (наприклад, кількостей, температури і т. д.), але деякі експериментальні помилки і відхилення повинні враховуватися. Якщо немає інших вказівок, частини є масовими частинами, молекулярна маса є середньою молекулярною масою, температура є температурою в градусах за стоградусною шкалою Цельсія і тиск є атмосферним або майже атмосферним тиском. Приклад 1. Генерування антитіл людини до IL-6-рецептора людини Імунізація гризунів може виконуватися будь-якими способами, відомими в даній галузі (див., наприклад, Harlow and Lane (1988) supra; Malik and Lillehoj, Antibody techniques: Academic Press, 1994, CA). В одному переважному варіанті здійснення, антиген hIL-6R вводять безпосередньо мишам, які містять локуси ДНК, що кодують як варіабельну область важкого ланцюга IgG, так і варіабельну область легкого ланцюга каппа людини (Velocimmune™, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.; US 6596541), з ад'ювантом для стимуляції імунної реакції. Такий ад'ювант включає повний і неповний ад'ювант Фрейнда, систему ад'ювантів MPL+TDM (Sigma) або RIBI (мурамілдипептиди) (див. O'Hagan, Vaccine Adjuvant, by Human Press, 2000, NJ). Такий ад'ювант може попереджувати швидке розсіювання поліпептидів секвестрацією антигену в локальному депо і може містити фактори, які можуть стимулювати імунну реакцію хазяїна. В одному варіанті здійснення, hIL-6R вводять безпосередньо у вигляді ДНК-плазміди, яка містить ген hIL-6R і експресує hIL-6R з використанням апарату експресії клітинних білків хазяїна з утворенням антигенного поліпептиду in vivo. В обох підходах, схема імунізації вимагає декількох введень, з інтервалами порядку декількох тижнів. Імунну реакцію у вигляді антитіл піддають моніторингу з використанням стандартного антигенспецифічного імуноаналізу. При досягненні тваринами їх максимальної імунної реакції, експресуючі антитіло В-клітини збирали і зливали з мишачими мієломними клітинами для збереження їх життєздатності, з одержанням гібридомних клітин. Для відбору функціонально бажаних моноклональних антитіл, кондиціоновані середовища цих гібридомних клітин або трансфекованих клітин піддавали скринінгу на специфічність, антигензв'язувальну афінність і ефективність блокування зв'язування hIL-6 з hIL-6R (описано нижче). 60 7 UA 97645 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Приклад 2. Анти-hlL-6R-антитіла, генеровані за допомогою прямого виділення спленоцитів ДНК, яка кодує домени VH і VL, може бути виділена безпосередньо з позитивної відносно єдиного антигену В-клітини. Коротко, імунізовану hIL-6Ra трансгенну мишу евтонізували і збирали спленоцити Еритроцити видаляли лізисом з наступним осадженням зібраних спленоцитів. Ресуспендовані спленоцити спочатку інкубували з коктейлем (сумішшю) IgG людини, FITC-анти-mFc і біотин-ІL6-Rα протягом 1 години. Забарвлені клітини промивали двічі ЗФР, потім офарблювали коктейлем IgG людини і миші, АРС-анти-mIgM і SA-PE протягом однієї години. Ці забарвлені клітини промивали один раз ЗФР і аналізували проточною цитометрією на MoFlo (Cytomation). Кожну IgG-позитивну, IgM-негативну й антигенпозитивну В-клітину піддавали сортингу і висівали в окрему ямку на 96-ямковому планшеті. ЗТ-ПЛР генів антитіл з цих В-клітин виконували згідно зі способом, описаним Wang et al. (2000) (J Immunol Methods 244:217-225). Коротко, кДНК для кожної окремої В-клітини синтезували за допомогою ЗТ-ПЛР. Потім кожен одержаний ЗТ-продукт відщепляли і переносили в дві відповідні ямки на двох 96ямкових планшетах. Один набір одержаних ЗТ-продуктів спочатку ампліфікували за допомогою і ПЛР із використанням 5 -виродженого праймера, специфічного відносно лідерної послідовності варіабельної області важкого ланцюга IgG, і 3'-праймера, специфічного відносно константної області важкого ланцюга миші, для утворення амплікона. Потім цей амплікон ампліфікували знову за допомогою ПЛР із використанням набору 5'-вироджених праймерів, специфічних відносно каркаса 1 варіабельної області важкого ланцюга IgG людини, і вмонтованого 3'праймера, специфічного відносно константної області важкого ланцюга миші. Інший набір одержаних ЗТ-продуктів спочатку ампліфікували за допомогою ПЛР із використанням 5'виродженого праймера, специфічного відносно лідерної послідовності варіабельної області легкого ланцюга каппа людини, і 3'-праймера, специфічного відносно константної області легкого ланцюга каппа миші, з утворенням амплікона. Потім цей амплікон ампліфікували знову за допомогою ПЛР із використанням набору 5'-вироджених праймерів, специфічних відносно каркаса 1 варіабельної області легкого ланцюга каппа людини, і вмонтованого 3'-праймера, специфічного відносно константної області легкого ланцюга каппа миші. Ці ПЛР-продукти важкого ланцюга і легкого ланцюга клонували в Sap І-лінеаризовані вектори антитіл, які містять константну область важкого ланцюга IgG1 і варіабельну область легкого ланцюга каппа, відповідно. Плазміда важкого ланцюга має сайт lох2272 і сайт lох511, фланкуючі касети експресії важкого ланцюга. Крім того, безпосередньо праворуч від lох2272 у цій плазміді важкого ланцюга є ген стійкості до гігроміцину, який позбавлений промотору й ініціюючого ATG. Ген стійкості до гігроміцину зв'язаний також транскрипційно з геном eGFP, що знаходиться праворуч, через послідовність IRES. Плазміда легкого ланцюга має сайт ΙοxΡ і сайт lох2272, фланкуючі касету експресії легкого ланцюга. Крім того, ця плазміда легкого ланцюга має промотор SV40 безпосередньо перед ATG у сайті lох2272, так що після інтеграції в придатну клітину-хазяїна цей lох2272-проксимальний промотор SV40 і ініціюючий ATG із плазміди легкого ланцюга стають суміжними з геном стійкості до гігроміцину в плазміді важкого ланцюга в правильній рамці зчитування, що дозволяє транскрипцію і трансляцію генів стійкості до гігроміцину і eGFP. Потім очищені рекомбінантні плазміди, які мають послідовність варіабельної області важкого ланцюга, і плазміди, які мають послідовність варіабельної області легкого ланцюга, з однієї і тієї ж В-клітини об'єднували і трансфекували, разом із плазмідою, яка експресує рекомбіназу Сrе, у модифіковану лінію клітин-хазяїнів СНО. Ця модифікована лінія клітин-хазяїнів СНО містить, від 5' до 3', сайт ΙοxΡ, eCFP, сайт lох2272, DsRed і сайт lох511 у транскрипційно активному локусі. Потім, ця клітина-хазяїн СНО може бути виділена проточною цитометрією у вигляді позитивної відносно синього забарвлення, позитивної відносно червоного - забарвлення і негативної відносно зеленого забарвлення клітини. При трансфекції рекомбінантних плазмід, експресуючих гени важкого ланцюга і легкого ланцюга, разом із плазмідою, експресуючою рекомбіназу Сrе, сайтспецифічна рекомбінація, опосередкована рекомбіназою Сrе, приводить до інтеграції цих плазмід антитіл у хромосомному локусі, що містить сайти Іох, і заміщення генів eCFP і DsRed. Потім рекомбінанти можуть бути виділені у вигляді негативних відносно синього забарвлення, негативних відносно червоного забарвлення і позитивних відносно зеленого забарвлення клітин проточною цитометрією. Таким чином, клітини СНО, трансфековані рекомбінантними плазмідами, які мають послідовність варіабельної області важкого ланцюга, і плазмідами, які мають послідовність варіабельної області легкого ланцюга, з однієї і тієї ж В-клітини піддавали сортингу проточною цитометрією і правильні рекомбінанти, що виявляють негативний відносно синього забарвлення, негативний відносно червоного забарвлення і позитивний відносно зеленого забарвлення фенотип, виділяли і встановлювали стабільні експресуючі рекомбінантне антитіло лінії клітин СНО з виділених клонів. 8 UA 97645 C2 5 10 15 20 25 30 Приклад 3. Визначення антигензв'язувальної афінності KD зв'язування антигену з відібраними антитілами, описаними вище, визначали аналізом поверхневої кінетики на біосенсорі реального часу резонансу поверхневих плазмонів (ВІАсоrе™). Більш конкретно, афінність цих антитіл відносно IL-6R людини вимірювали з використанням ВІАсоrе® 2000 або ВІАсоrе® 3000 Це антитіло уловлювали на поверхні анти-IgG миші-антитіла і піддавали дії різних концентрацій рекомбінантного білка hIL-6R у мономерній або димерній формі. Виконували кінетичний аналіз з використанням програмного забезпечення BIAevaluation™ для одержання констант швидкості асоціації і дисоціації. Афінності зв'язування цих антитіл з hIL-6R також вимірювали або відносно гібридомакондиціонованих середовищ, або відносно очищених білків конкурентним імуноаналізом на основі планшетів Білки антитіл очищали з використанням Білок G-афінної хроматографії з кондиціонуючого гібридомні клітини середовища, яке було виснажена відносно бичачого IgG (Invitrogen). Для конкурентного ELISA, коротко, постійні кількості антитіла при різних рівнях попередньо змішували із серійними розведеннями антигенного білка, hIL-6R-hFc, у діапазоні 010 мкг/мл і інкубували протягом двох годин при кімнатній температурі до досягнення рівноваги псевдозв'язування між цим антитілом і антигеном. Потім ці розчини переносили в 96-ямкові попередньо покриті hIL-6R-hFc планшети, щоб дозволити вільному антитілу в цих сумішах зв'язуватися з нанесеним на планшет hIL-6R-hFc. Ці планшети звичайно покривали 1-2 мкг/мл білка hIL-6R-hFc у розчині ЗФР протягом ночі при 4°С з наступним неспецифічним БСАблокуванням. Після вимивання надлишку антитіла в розчині, зв'язані з планшетом антитіла детектували реагентом HRP-кон'югованого козячого поліклонального антитіла проти мишачого IgG або IgA і проявляли з використанням або колориметричного, або хемілюмінесцентного субстратів. Залежність сигналів від концентрацій антигену в розчині аналізували з використанням 4-параметричного аналізу графічної репрезентації з використанням програмного забезпечення Prism™ (Graph Pad) і повідомляли у вигляді ІС50. Проводили також конкурентний імуноаналіз з використанням приладу Kіnеха™ з фазою розчину як стаціонарною фазою (Sapidyne Inc.). Результати показані в таблиці 1 (контроль: гуманізоване моноклональне антитіло до IL-6R людини(Патент US 5817790 SEQ ID NO: 69 і 71). Антитіло (амінокислотні послідовності HCVR і LCVR): VQ8A9-6 (3, 11); VQ8F11-21 (19, 27); VV7G4-1 (35, 43); VV7G4-10 (51, 59) VV6C10-1 (67, 75); VV6C10-3 (83, 91); VV6C10-4 (99, 107); VV6F12-11 (115, 123); VVA6-11 (131, 139); VV6A9-5 (147, 155), VV3D8-4 (163, 171); VV1G4-7 (179, 187); 248982-13-1-Е5 (195, 203); 248982-13-2-А9 (211, 219). KD мономера і димеру визначали за допомогою BIAcore™; KD у розчині - за допомогою Kіnеха™; ІС50 - за допомогою аналізів ELISA (n.d.=нe визначали). 35 Таблиця 1 Антигензв'язувальна афінність Антитіло VQ8A9-6 VQ8F11-21 VV3D8-4 VV6A9-5 VV1G4-7 VV6C10-1 VV6F12-11 VV7G4-10 VV9A6-11 VV6C10-3 248982-13-1-E5 248982-13-2-A9 Контроль 40 KD, Мономер (нМ) KD, Димер (нМ) 0,222 0,067 2,410 0,097 0,225 0,267 n.d. n.d. n.d. n.d. 0,987 2,870 1,790 0,101 0,023 0,172 0,146 0,070 0,032 n.d. n.d. n.d. n.d. 0,785 n.d. n.d. KD, у розчині, Мономер (нМ) 0,120 0,009 1,910 0,032 0,197 2,050 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 1,960 ІС50 ELISA, Димер (нМ) 0,004 0,008 0,013 0,005 0,041 0,010 0,033 1,980 0,347 0,009 0,360 0,054 n.d. Приклад 4. Нейтралізація активності hIL-6 Блокуючі hIL-6 активності анти-hlL-6R-антитіл даного винаходу піддавали скринінгу з використанням імуноаналізів блокування hIL-6, біоаналізів in vitro hlL-6-залежного росту клітин і резонансу поверхневих плазмонів (ВІАсоrе™). Імуноаналіз використовували для скринінгу на здатність тестованого антитіла блокувати зв'язування hIL-6 з hIL-6R, а біоаналіз in vitro 9 UA 97645 C2 5 10 15 20 25 використовували для визначення ефективності цих антитіл у нейтралізації hlL-6Rопосередкованої передачі клітинного сигналу. Для імуноаналізу рекомбінантний білок hIL-6 наносили на 96-ямковий планшет у ЗФРбуфері протягом ночі при 4°С. Цей планшет використовували для захоплення вільного hIL-6RhFc з розчинів проб антитіл і кількість захопленого hIL-6R-hFc визначали згідно зі стандартною кривою. Розчини проб складалися з постійної кількості рекомбінантного білка hIL-6R-hFc (100 пМ) і кількостей антитіла, які варіюються, або в неочищеному гібридома-кондиціонованому середовищі, або у вигляді очищеного білка антитіла, у діапазоні 0 - приблизно 50 нм у вигляді серійних розведень. Цю суміші антитіло-антиген інкубували при кімнатній температурі протягом ~2 годин, щоб дозволити зв'язуванню антитіло-антиген досягти рівноваги. Потім ці зрівноважені розчини проб переносили в покриті hIL-6 планшети для вимірювання вільного hIL-6R-hFc. Після 1-годинного зв'язування планшет промивали і зв'язаний hIL-6R-hFc детектували з використанням HRP-кон'югованих козячих поліклональних анти-hFс-антитіл (Jackson lmmuno Research) і проявляли з використанням субстрату ТМВ (BD Pharmigen). IC 50 визначали у вигляді кількості антитіла, необхідного для зменшення на 50% hIL-6R-hFc, детектованого відносно зв'язаного з планшетом ліганду hIL-6. Результати показані в першому стовпці таблиці 2. Додатково, здатність тест-антитіла блокувати зв'язування hIL-6 з рецептором hIL-6R визначали з використанням резонансу поверхневих плазмонів. Молекули очищеного антигену hIL-6R-hFc захоплювалися козячими поліклональними антитілами проти IgG людини, іммобілізованими на поверхні СМ-5 через амінозв'язування, до густини 250 R.U. Розчин hIL-6 (0,25 мл, 50 нМ) інжектували на поверхню рецептора і зв'язаний hIL-6 реєстрували (перша інжекція IL-6). Потім зв'язаний hIL-6 видаляли імпульсом 3 Μ MgCl2 з наступним додаванням кондиціонуючого буфера. Анти-hlL-6R-антитіло в гібридома-кондиціонованому середовищі інжектували на поверхню захопленого рецептора з наступною другою інжекцією hIL-6. Процентне зменшення зв'язування hIL-6, що походить з попередньо утвореного комплексу антитіло-рецептор, використовували як оцінку для визначення hIL-6-блокаторів серед неблокаторів (другий стовпець, таблиця 2). Таблиця 2 Нейтралізація зв'язування hIL-6 Антитіло VQ8A9-6 -fVQ8F11-21 W3D8-4 W6A9-5 W1G4-7 W6C10-1 W6F12-11 W7G4-10 W9A6-11 W6C10-3 Контроль 30 35 40 Інгібування зв'язування hlL6RML-6, ІС50 (нМ) Інгібування зв'язування hIL6R/hIL-6, (%) 0,39 0,12 0,61 0,35 1,10 4,60 2,20 13,00 0,50 0,06 2,20 68 98 93 100 34 61 n.d. n.d. n.d. n.d. 91 Інгібування проліферації клітин XG-1, ІС50 (нМ) 0,40 0,62 >100 1,10 1,80 >6,90 n.d. n.d. n.d. n.d. 1,50 Активність люциферази HepG2/Stat3, ІС50 (нМ) 0,097 0,135 n.d. 0,188 0,578 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 0,854 Здатність hIL-6R-aнтитіл блокувати активність hIL-6 in vitro вимірювали в hIL-6-залежній мієломній лінії XG-1. Клітини XG-1, підтримувані в hIL-6-вмісному середовищі, промивали двічі середовищем, що не містить hIL-6, і культивували протягом ~24 годин у середовищі, що не містить hIL-6, для виснаження hIL-6, що залишився. Потім клітини, що голодували, відкручували 5 і ресуспендували в середовищі при 4×10 клітин на мл і висівали 20000 клітин на ямку в 96ямковому планшеті для культури тканини. Очищені білки антитіл серійно розводили в середовищі і додавали до висіяних клітин при концентраціях у діапазоні від 0 до 50 нМ. Потім у ямки додавали рекомбінантний hIL-6 до кінцевої концентрації 8 пМ. Клітинам давали рости протягом ~72 годин при 37°С у зволоженому 5% СО 2-термостаті. Наприкінці періоду росту живі клітини вимірювали з використанням набору ССK-8 (Dojindo, Japan). IC50 визначали, як описано вище, і вони наведені в третьому стовпці таблиці 2. 10 UA 97645 C2 5 10 15 20 25 30 Здатність антитіл hIL-6R блокувати активність hIL-6 також вимірювали in vitro у hIL-6чутливій лінії клітин гепатоми людини, HepG2. Клітини HepG2 трансфекували репортеркою плазмідою, що містить чутливий до STAT3 (переносник сигналу й активатор транскрипції 3) елемент, зв'язаний з геном люциферази. Трансфековані клітини трипсинізували, відкручували і 5 ресуспендували в середовищі при приблизно 2,5×10 клітин на мл і висівали 20000 клітин на ямку в 96-ямковому планшеті для культури тканини. Очищені білки антитіл серійно розводили в середовищі і додавали до висіяних клітин при концентраціях у діапазоні від 0 до 100 нМ. Потім у ямки додавали рекомбінантний hIL-6 до кінцевої концентрації 50 пМ. Реакцію вимірювали після інкубування цих клітин протягом 6 годин при 37°С у зволоженому 5% СО 2-термостаті. Люциферазну активність вимірювали системою для аналізу люциферази Steady-Glo™ (Promega). IC50 визначали, як описано вище, і вони наведені в четвертому стовпці таблиці 2. Приклад 5. Різноманітність епітопів зв'язування Конкурентний імуноаналіз зв'язування антитіл виконували з використанням як контролю гуманізованого антитіла до IL-6R людини. Коротко, 96-ямковий імуносорбентний (твердофазний) планшет покривали 20 нг на ямку рекомбінантного білка hIL-6R протягом ночі при 4°С. Після блокування неспецифічного зв'язування БСА, сайти зв'язування hIL-6R на одній половині цього планшета насичували зв'язуванням контрольного антитіла додаванням 500 нг цього контролю на ямку, а до іншої половини цього планшета додавали тільки буфер для зв'язування. Після трьох годин зв'язування при кімнатній температурі, очищені антитіла додавали при кінцевій концентрації 50 нг/мл із передіснуючим контрольним антитілом в ямці або без передіснуючого контролю в ямці. Після однієї години додаткового зв'язування вільне антитіло вимивали і зв'язане з планшетом антитіло детектували HRP-кон'югованим поліклональним козячим антитілом проти мишачого IgG або IgA і планшет проявляли з використанням хроматичних HRP-субстратів і реєстрували оптичну густину при 450 нм. Виведені проценти зв'язування анти-hIL-6R-aнтитіл по присутності контрольного антитіла наведені в переліку в таблиці 3 нижче. Проводили подібний експеримент із - використанням технології резонансу поверхневих плазмонів (таблиця 3). Обидва способи давали узгоджувані результати. Антитіла VQ8F11, VV3D8, VV6A9, VV6C10-1 зв'язували епітопи, які збігаються з контрольним антитілом; у той час як антитіла VQ8A9, VV1G4, W6F12, VV7G4, VV9A6 і VV6C103, очевидно, зв'язуються з відмінними епітопами, оскільки зв'язування антигену не блокувалося цим контрольним антигеном. Часткова конкуренція може походити зі стеричної перешкоди з боку першого зв'язаного антитіла, навіть у тому випадку, коли епітопи можуть не бути співпадаючими. Таблиця 3 Конкуренція за зв'язування антигену з контрольним антитілом Антитіло VQ8A9-6 VQ8F11-21 W3D8-4 W6A9-5 W1G4-7 W6C10-1 W6F12-11 W7G4-10 W9A6-11 W6C10-3 BIAcore™ (%-не зменшення) 26 96 97 96 12 90 n.d. n.d. n.d. n.d. Імуноаналіз (%-не зменшення) 3 79 84 84 3 80 3 26 18 1 35 40 45 Приклад 6. Перехресна здатність зв'язування між видами Чотири антитіла тестували на перехресну реактивність з рекомбінантним білком hIL-6R мавпи з використанням технології BIAcore™. Коротко, біосенсорний чип, на якому було іммобілізоване козяче поліклональне анти-Fc-миші-антитіло, використовували для презентації моноклональних анти-hIL-6R-антитіл до густини приблизно 75 RU. На поверхню цього антитіла інжектували рекомбінантний мономерний білок IL-6R (позаклітинний домен, SEQ ID NO: 251, Масаса fasciculahs) у діапазоні концентрацій 1,25-40 нМ. Зв'язування цього рецептора з цим антитілом і дисоціацію зв'язаного комплексу піддавали моніторингу в реальному часі. Одержували як константу швидкості асоціації (kа), так і константу швидкості дисоціації (kd) і розраховували KD (таблиця 4). 11 UA 97645 C2 Таблиця 4 Порівняння афінності зв'язування з IL-6R людини і мавпи Антитіло Контроль VQ8F11-21 VV1G4-7 VV6A9-5 VQ8A9-6 5 10 15 Антиген IL6R людини IL6R мавпи IL6R людини IL6R мавпи IL6R людини IL6R мавпи IL6R людини IL6R мавпи IL6R людини IL6R мавпи -1 -1 -1 kа (М с ) 1,74Е+05 1,44Е+05 8,51Е+05 3,39Е+05 2,57Е+05 немає зв'язування 5,18Е+05 5,00Е+05 7,32Е+05 7,31Е+05 kс (с ) 1,67Е-04 1,68Е-04 4,38Е-05 4,86Е-05 6,18Е-05 KD (нM) 0,963 1,170 0,051 0,143 0,240 8,41Е-05 7,70Е-05 2,76Е-04 4,16Е-04 0,162 0,154 0,377 0,569 Серед чотирьох тестованих антитіл, VQ8F11, VV6A9 і VQ8A9 сильно реагували з рецептором мавпи з величинами KD, які відрізняються приблизно в 1,5 - приблизно в 3 рази більшим зв'язуванням з рецептором, відповідно. VV1G4, що не блокується контрольним антитілом (таблиця 3), не виявляло зв'язування з рецептором мавпи, незважаючи на сильне зв'язування з рецептором людини з KD 241 пМ. Приклад 7. Дія константної області на афінність зв'язування Афінність зв'язування з мономерним hIL-6R чотирьох антитіл, які мають мишачий IgG, IgG1 або IgG4 людини (дикого типу або модифікований), визначали за допомогою ВІАсоrе™, як описано вище, за винятком випадку, коли використовували поверхню козячого поліклонального анти-Рс-людини-антитіла для захоплення hIgG-антитіл. Мономерний hIL-6R інжектували в концентраціях 12,5, 6,25, 3,12 і 1,56 нМ. Здатність цих антитіл нейтралізувати hIL-6-залежну трансдукцію сигналу HepG2/STAT3 також визначали в люциферазному аналізі (ІС 50). ІС50 для різних ізотипів IgG були подібними, що передбачає відсутність дії ізотипу на афінність антитіла відносно антигену. Таблиця 5 Порівняння ізотипів IeG Антитіло VQ8F11-21 VQ8A9-6 W6A9-5 VQ1G4-21 IgG hlgG1 hlgG4 mlgG2a modhlgG4 hlgG1 hlgG4 mlgG1 hlgG1 hlgG4 mlgG2a hlgG1 hlgG4 mlgG2a -1 -1 ka (M c ) 6,22E+05 7,17Е+05 7,86E+05 8,81E+05 1,09E+06 1,17E+06 9,95E+05 7,12Е+05 5,67E+05 7,72E+05 3,34E+05 2,73E+05 3,41E+05 12 -1 kd (c ) 4,54E-05 5,22E-05 5,27E-05 4,705-05 2,60E-04 2,35E-04 2,21E-04 8,87E-05 7,64E-05 7,52E-05 7,92E-05 9,18Е-05 7,66E-05 KD (нM) 0,073 0,073 0,067 0,053 0,238 0,201 0,222 0,125 0,135 0,097 0,237 0,336 0,225 IC50 (нМ) 0,150 0,228 0,135 0,249 0,130 0,185 0,097 0,204 0,343 0,188 0,767 0,528 0,578 UA 97645 C2 13 UA 97645 C2 14 UA 97645 C2 15 UA 97645 C2 16 UA 97645 C2 17 UA 97645 C2 18 UA 97645 C2 19 UA 97645 C2 20 UA 97645 C2 21 UA 97645 C2 22 UA 97645 C2 23 UA 97645 C2 24 UA 97645 C2 25 UA 97645 C2 26 UA 97645 C2 27 UA 97645 C2 28