Антитіло, що зв’язується з рецептором notch1, і його застосування

Реферат: Винахід стосується виділеного антитіла, яке специфічно зв'язується з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини та містить: (a) CDR1 важкого ланцюга, що включає RGYWIE (SEQ ID NO:15), CDR2 важкого ланцюга, що включає QILPGTGRTNYNEKFKG (SEQ ID NO:16), і CDR3 важкого ланцюга, що включає FDGNYGYYAMDY (SEQ ID NO:17); та (b) CDR1 легкого ланцюга, що включає RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:18), CDR2 легкого ланцюга, що включає GTNNRAP (SEQ ID NO:19), і CDR3 легкого ланцюга, що включає ALWYSNHWVFGGGTKL (SEQ ID NO:20). UA 101672 C2 (12) UA 101672 C2 UA 101672 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки, до якої відноситься винахід Даний винахід відноситься до композицій, що включають агент, який зв'язується з рецептором Notch людини, і до способів застосування вказаних композицій для дослідження, діагностики і лікування рака і інших захворювань. Зокрема, даний винахід відноситься до антитіл, які специфічно зв'язуються з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини і інгібують зростання пухлини. Даний винахід далі відноситься до способів лікування рака, що включають введення терапевтично ефективної кількості антитіла, яке специфічно зв'язується з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини і інгібує зростання пухлини. Рівень техніки Рак є однією з головних причин смертності в розвинених країнах, від якого в США вмирає більше 500000 осіб на рік. Щороку в США рак діагностується більш ніж в одного мільйона осіб, при цьому встановлено, що більш ніж у 1 людини з 3 впродовж всього життя розвивається яканебудь форма рака. Не дивлячись на те, що існує більше 200 різних типів рака, на чотири з них, а саме рак молочної залози, рак легень, колоректальний рак і рак передміхурової залози, припадає більше половини всіх нових випадків захворювання раком (Jemal et al., 2003, Cancer J. Clin. 53:5-26). Рак виникає унаслідок збою у функціонуванні механізмів, регулюючих нормальний розвиток і збереження тканин, при цьому вважається, що головну роль в даному процесі грає збільшення числа стволових клітин (Beachy et al., 2004, Nature 432:324). В процесі нормального розвитку тварини клітини більшості або всіх тканин утворюються з нормальних попередників, що іменуються стволовими клітинами (Morrison et al., 1997, Cell, 88:287-98; Morrison et al., 1997, Curr. Opin. Immunol., 9:216-21; Morrison et al., 1995, Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 11:35-71). Стволові клітини є такими клітинами, які володіють: (1) високим проліферативним потенціалом; (2) здатністю асиметричного поділу клітини з утворенням одного або декількох типів потомства з нижчим проліферативним та/або диференційованим потенціалом; і (3) здатністю симетричного поділу клітини для самовідновлення або самозбереження. Найбільш відомим прикладом відновлення зрілих клітин шляхом диференціювання стволових клітин є гемопоетична система, в якій диференційовано незрілі попередники (гемопоетичні стволові клітини і клітинипопередники) реагують на молекулярні сигнали утворенням різних типів клітин крові і лімфоцитів. Інші клітини, включаючи клітини кишечнику, системи проток молочної залози і шкіри, постійно заповнюються з невеликої популяції стволових клітин в кожній тканині, і недавно виконані дослідження дозволяють передбачити, що більшість інших зрілих тканин, включаючи головний мозок, також містять стволові клітини. Солідні пухлини складаються з популяцій гетерогенних клітин. Наприклад, рак молочної залози являє собою суміш ракових клітин і нормальних клітин, що включають мезенхімні (стромальні) клітини, клітини запального інфільтрату і ендотеліальні клітини. Класичні моделі раку передбачають, що всі фенотипічно різні популяції ракових клітин володіють здатністю проліферувати і утворювати нову пухлину. У класичній моделі гетерогенність пухлинних клітин виникає під впливом навколишніх чинників, а також в результаті мутацій, що відбуваються в ракових клітинах, унаслідок чого виникає інша популяція онкогенних клітин. Дана модель побудована на припущенні, що всі популяції пухлинних клітин володіють деякою мірою онкогенного потенціалу. (Pandis et al., 1998, Genes, Chromosomes & Cancer 12:122-129; Kuukasjrvi et al., 1997, Cancer Res. 57:1597-1604; Bonsing et al., 1993, Cancer 71:382-391; Bonsing et al., 2000, Genes Chromosomes & Cancer 82: 173-183; Beerman H et al., 1991, Cytometry 12:14754; Aubele M & Werner M, 1999, Analyt. Cell. Path. 19:53; Shen L et al., 2000, Cancer Res. 60:3884). Альтернативна модель спостережуваної гетерогенності клітин солідної пухлини передбачає, що солідні пухлини утворюються з "стволової клітини солідної пухлини" (або "ракової стволової клітини" солідної пухлини), яка потім хаотично розвивається в результаті циклів симетричного і асиметричного поділу клітини. У даній моделі на основі стволових клітин солідні пухлини складаються з субпопуляції клітин, що відрізняється і обмеженої (можливо, навіть рідкої), які володіють властивостями нормальних "стволових клітин", що виражаються в тому, що вони інтенсивно проліферують і ефективно утворюють додаткові стволові клітини солідної пухлини (самооновлюються), і більшості пухлинних клітин солідної пухлини, в яких відсутній онкогенний потенціал. Дійсно, мутації в довгоживучій популяції стволових клітин можуть ініціювати утворення ракових стволових клітин, які забезпечують зростання і збереження пухлин і наявність яких робить неефективними сучасні методи лікування. Стволові клітини раку вперше були виявлені в раку крові, гострому мієлолейкозі (AML) (Lapidot et al., 1994, Nature 267:645-8). Згодом було продемонстровано, що злоякісні пухлини молочної залози людини також містять невелику відмінну популяцію ракових стволових клітин, 1 UA 101672 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 володіючих здатністю утворювати пухлини у мишей з імунодефіцитом. Було встановлено, що популяція ESA+, CD44+, CD24-/low, Lin- клітин містить в 50 разів більше онкогенних клітин в порівнянні з нефракціонованими пухлинними клітинами (Al-Hajj et al., 2003, PNAS 100:3983-8). Можливість виділення онкогенних ракових клітин дозволила досліджувати біологічні шляхи, що лежать в основі онкогенності вказаних клітин і, таким чином, створити кращі діагностичні аналізи і методи лікування хворих раком. Даний винахід переслідує саме таку мету. Нормальні стволові клітини і ракові стволові клітини володіють здатністю проліферувати і самовідновлюватися, тому недивно, що цілий ряд генів, регулюючих розвиток нормальних стволових клітин, бере участь в онкогенезі (див. огляд в публікаціях Reya et al., 2001, Nature 414:105-111 і Taipale & Beachy, 2001, Nature 411:349-354). У даному винаході ідентифікований рецептор Notch, наприклад, Notch1, як маркер ракових стволових клітин, що використовує сигнальний шлях Notch для збереження ракових стволових клітин, і як мішень для лікування рака шляхом знищення вказаних онкогенних клітин. Сигнальний шлях Notch є одним з декількох важливих регулюторів утворення ембріонального патерну, постембріонального збереження тканин і біології стволових клітин. Зокрема, передача сигналу рецептора Notch визначає процес латерального інгібування суміжних клітин і грає важливу роль у визначенні долі клітин в процесі асиметричного поділу клітин. Нерегульована передача сигналу рецептора Notch асоційована з багатьма типами рака людини, в яких вказаний сигнал може змінювати розвиток пухлинних клітин і зберігати їх в недиференційованому і проліферативному стані (Brennan and Brown, 2003, Breast Cancer Res. 5:69). Таким чином, онкогенезу може передувати захват гомеостатичних механізмів, регулюючих нормальний розвиток і репарацію тканин популяціями стволових клітин (Beachy et al., 2004, Nature 432:324). Рецептор Notch вперше був ідентифікований в мутантах дрозофіли з гаплонедостатністю, що викликає надрізи по краю крила, при цьому втрата даної функції викликає утворення ембріонального летального "нейрогенного" фенотипу, в якому клітини епідермісу викликають загибель нервової тканини (Moohr, 1919, Genet. 4:252; Poulson, 1937, PNAS 23:133; Poulson, 1940, J. Exp. Zool. 83:271). Рецептор Notch є однопрохідним трансмембранним рецептором, що містить багаточисельні парні повтори, подібні до епідермального чинника зростання (EGF), і три повтори Notch/LIN-12 (LNR) з великим вмістом цистеїну у великому позаклітинному домені (Wharton et al., 1985, Cell 43:567; Kidd et al., 1986, Mol. Cell Biol. 6:3094; огляд в публікації Artavanis et al., 1999, Science 284:770). LNR-повтори і додаткова С-кінцева ділянка, що складається приблизно з 103 амінокислот позаклітинного домену, визначені в даному описі винаходу як "проксимальна ділянка мембрани". Вказана ділянка відома також як негативна регуляторна ділянка рецептора Notch (NRR). Рецептори Notch ссавців розщеплюються з утворенням зрілого рецептора і подальшим зв'язуванням ліганду, що активує передачу сигналу в нижній ділянці. Фурінподібна протеаза розщеплює попередники рецептора Notch в процесі дозрівання з утворенням розташованих поряд з мембраною гетеродимерів, які включають нековалентне зв'язану позаклітинну субодиницю і трансмембранну субодиницю, що утримуються разом в аутоінгібуючому стані. Зв'язування ліганду порушує таке інгібування і викликає розщеплювання рецептора Notch металлопротеазою типу ADAM і гамма-секретазою, причому гамма-секретаза вивільняє внутріклітинний домен (ICD) в цитоплазму, завдяки чому він переміщається в ядро і активує транскрипцію гена. Розщеплювання під дією ADAM відбувається в нелігандзв'язуючому розщеплюваному домені в негативній регуляторній ділянці (NRR), розташованій поряд з мембраною (див. фиг.1А). У рецепторі Notch1 вказана ділянка охоплює ділянку приблизно від амінокислоти 1427 до амінокислоти 1732. У ссавців ідентифіковано чотири білка Notch (Notch1, Notch2, Notch3 і Notch4), і мутації у вказаних рецепторах неминуче викликають аномалії розвитку і патології, що включають виникнення декількох типів рака, детально описаних нижче (Gridley, 1997, Mol. Cell Neurosci. 9:103; Joutel & Tournier-Lasserve, 1998, Semin. Cell Dev. Biol. 9:619-25). Рецептор Notch активується однопрохідними трансмембранними лігандами сімейства Delta, Serrated, Lag-2 (DSL). У ссавців відомо п'ять лігандів Notch: Delta-подібний 1 (DLL1), Deltaподібний 3 (DLL3), Delta-подібний 4 (DLL4), Jagged 1 і Jagged 2, які характеризуються наявністю домену DSL і парних EGF-подібних повторів в позаклітинному домені. Позаклітинний домен рецептора Notch взаємодіє з таким же доменом його лігандів, зазвичай на суміжних клітинах, внаслідок чого відбуваються два протеолітичних розщеплювання Notch; одне позаклітинне розщеплювання, опосередковуване протеазою ADAМ (дезинтегрин А і металопептидаза), і одне розщеплювання в трансмембранному домені, опосередковуване гамма-секретазою. Останнє розщеплювання викликає утворення внутріклітинного домену Notch (ICD), який потім проникає в 2 UA 101672 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ядро і активує сімейство чинників транскрипції CBF1, Supressor of Hairless [Su(H)], Lag-2 (CSL), які є основними ефекторами нижньої ділянки, що збільшують транскрипцію основних ядерних чинників транскрипції спіраль-петля-спіраль сімейства Hairy і Enhancer of Split [E(spl)] (Artavanis et al., 1999, Science 284:770; Brennan and Brown, 2003, Breast Cancer Res. 5:69; Iso et al., 2003, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 23:543). У ссавців також можуть бути альтернативні внутріклітинні шляхи, визначувані цитоплазматичним білком Deltex, ідентифікованим в дрозофіли (Martinez et al., 2002, Curr. Opin. Genet. Dev. 12:524-33), і вказаний Deltex-залежний шлях може пригнічувати експресію генів-мішеней Wnt (Brennan et al., 1999, Curr. Biol. 9:707-710; Lawrence et al., 2001, Curr. Biol. 11:375-85). Гемопоетичні стволові клітини (HSC) є найбільш вивченими стволовими клітинами в організмі, і передача сигналу Notch визначає їх нормальне існування і лейкозну трансформацію (Kopper & Hajdu, 2004, Pathol. Oncol. Res. 10:69-73). HSC являє собою рідку популяцію клітин, що знаходиться в стромальній ніші зрілого кісткового мозку. Вказані клітини характеризуються унікальним профілем експресії генів, а також здатністю постійно утворювати більш диференційовані клітини-попередники для відновлення всієї гемопоетичної системи. Конститутивна активація передачі сигналу Notch в HSC і клітинах-попередниках викликає утворення іморталізованних ліній клітин, які створюють лімфоїдні і мієлоїдні клітини in vitro і при виконанні тривалих аналізів по відновленню (Varnum-Finney et al., 2000, Nat. Med. 6:1276-81), і наявність Jagged1 збільшує приєднання популяцій клітин кісткового мозку людини з високим вмістом HSC (Karanu et al., 2000, J. Exp. Med. 192:1365-72). Нещодавно передача сигналу Notch була продемонстрована в HSC in vivo, при цьому було показано, що вказаний сигнал бере участь в інгібуванні диференціювання HSC. Крім того, передача сигналу Notch, мабуть, необхідна для Wnt-опосередковуваного самовідновлення HSC (Duncan et al., 2005, Nat. Immunol. 6:314). Сигнальний шлях Notch також грає важливу роль в збереженні нервових стволових клітин і визначає як нормальний стан, так і виникнення рака головного мозку (Kopper & Hajdu, 2004, Pathol. Oncol. Res. 10:69-73; Purow et al., 2005, Cancer Res. 65:2353-63; Hallahan et al., 2004, Cancer Res. 64:7794-800). Нервові стволові клітини викликають утворення всіх нейронів і гліальних клітин в нервовій системі ссавця в процесі її формування, і нещодавно були ідентифіковані в зрілому головному мозку (Gagе, 2000, Science 287:1433-8). У мишей з відсутністю рецептора Notch1, генів-мішеней Notch Hes1, 3 і 5 і регулятора передачі сигналу Notch презеніліну 1 (PS1) спостерігається нижчий вміст ембріональних нервових стволових клітин. Крім того, в головному мозку гетерозиготних мишей PS1 знаходиться менше зрілих нервових стволових клітин (Nakamura et al., 2000, J. Neurosci. 20:283-93; Hitoshi et al., 2002, Genes Dev. 16:846-58) Зменшення кількості нервових стволових клітин, мабуть, викликане їх недостиглим диференціюванням в нейрони (Hatakeyama et al., 2004, Dev. 131:5539-50), з чого виходить, що передача сигналу Notch регулює диференціювання і самовідновлення нервових стволових клітин. Аберантна передача сигналу Notch має місце в цілому ряду раків людини. Ген Notch1 був вперше ідентифікований у людини в субпопуляції Т-клітинного гострого лімфобластного лейкозу у вигляді переміщеного локуса, що викликає активацію сигнального шляху Notch (Ellisen et al., 1991, Cell 66:649-61). Конститутивна активація передачі сигналу Notch1 в Т-клітинах мишачих моделей аналогічним чином викликає Т-клітинні лімфоми, що вказує на її спонукальну роль (Robey et al., 1996, Cell 87:483-92; Pear et al., 1996, J. Exp. Med. 183:2283-91; Yan et al., 2001, Blood 98:3793-9; Bellavia et al., 2000, EMBO J. 19:3337-48). Нещодавно було виявлено, що в Т-клітинному гострому лімфобластному лейкозі/лімфомі як у дітей, так і у дорослих часто присутні точкові мутації, інсерції і делеції Notch1, що викликають аберантну передачу сигналу Notch1 (Pear & Aster, 2004, Curr. Opin. Hematol. 11:416-33). Часте введення мишачого вірусу пухлини молочної залози як в локус Notch1 і Notch4 пухлин молочної залози, так і в отримані активовані фрагменти білка Notch спочатку дозволило виявити передачу сигналу Notch в раку молочної залози (Gallahan & Callahan, 1987, J. Virol. 61:66-74; Brennan & Brown, 2003, Breast Cancer Res. 5:69; Politi et al., 2004, Semin. Cancer Biol. 14:341-7). Подальші дослідження з використанням трансгенних мишей підтвердили роль рецептора Notch в розгалуженні проток в процесі нормального розвитку молочної залози і те, що конститутивно активна форма Notch4 в епітеліальних клітинах молочної залози інгібує диференціювання епітелію і викликає онкогенез (Jhappan et al., 1992, Genes & Dev. 6:345-5; Gallahan et al., 1996, Cancer Res. 56:1775-85; Smith et al., 1995, Cell Growth Differ. 6:563-77; Soriano et al., 2000, Int. J. Cancer 86:652-9; Uyttendaele et al., 1998, Dev. Biol. 1967:204-17; Politi et al., 2004, Semin. Cancer Biol. 14:341-7). В даний час відомості про роль рецептора Notch в раку молочної залози людини обмежені експресією рецепторів Notch в карциномах молочної залози і 3 UA 101672 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 їх кореляцією з результатами клінічних досліджень (Weijzen et al.,2002, Nat. Med. 8:979-86; Parr et al., 2004, Int. J. Mol. Med. 14:779-86). Крім того, надекспресія сигнального шляху Notch була виявлена в раку шийки матки (Zagouras et al., 1995, PNAS 92:6414-8), раку нирки (Rae et al., 2000, Int. J. Cancer 88:726-32), плоскоклітинному раку голови і шиї (Leethanakul et al., 2000, Oncogene 19:3220-4), ендометріальному раку (Suzuki et al., 2000, Int. J. Oncol. 17:1131-9) і нейробластомі (van Limpt et al., 2000, Med. Pediatr. Oncol. 35:554-8), що вказує на можливу роль рецептора Notch в розвитку цілого ряду пухлин. Цікаво відзначити, що передача сигналу рецептора Notch може грати певну роль в збереженні недиференційованого стану Арсмутантних пухлинних клітин ободової кишки (van Es & Clevers, 2005, Trends in Mol. Med. 11:496502). Сигнальний шлях Notch також має відношення до багатьох аспектів розвитку судин, включаючи проліферацію, міграцію, диференціювання гладком'язових клітин, утворення кровоносних судин і артеріально-венозне диференціювання (Iso et al., 2003, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 23:543). Наприклад, гомозиготні нульові мутації в Notch1/4 і Jagged1, а також гетерозиготна втрата DLL4 викликають серйозні, хоча і різні дефекти розвитку артерій і васкуляризації жовткового мішка. Крім того, в ембріонах мишей з відсутністю DLL1 і гіпоморфним рецептором Notch-2 відбувається крововилив, який, мабуть, виникає в результаті поганого розвитку судинних структур (Gale et al., 2004, PNAS, 101:15949-54; Krebs et al., 2000, Genes Dev. 14:1343-52; Xue et al.,1999, Hum. Mel. Genet. 8:723-30; Hrabe de Angelis et al., 1997, Nature 386:717-21; McCright et al., 2001, Dev. 128:491-502). У людини мутації Jagged1 асоційовані з синдромом Алагілле, порушенням розвитку, яке включає дефекти судин, і мутації Notch3 відповідають за спадкову васкулярную деменцію (Cadasil), причиною якої є дефекти гомеостазу судин (Joutel et al., 1996, Nature 383:707-10). Ідентифікація Notch1, Notch4, DLL1 і DLL4 як генів, експресованих в ракових стволових клітинах, в порівнянні з нормальним епітелієм молочної залози, дозволяє передбачити, що направлена дія на сигнальний шлях Notch може сприяти знищенню не лише більшості неонкогенних ракових клітин, але також онкогенних клітин, відповідальних за утворення і вторинне виникнення солідних пухлин. Крім того, у зв'язку з важливою роллю розвитку кровоносних судин в процесі утворення і збереження пухлини, направлена дія на сигнальний шлях Notch може також ефективно інгібувати даний процес, позбавляючи ракову пухлину живильних речовин і сприяючи її знищенню. У науковій літературі описані антитіла проти рецептора Notch і їх можливе використання як протиракової терапії. Див., наприклад, публікації заявок на патент США №№ 2008/0131434 і 2009/0081238, які повністю включені в даний опис винаходу як посилання. Див. також міжнародні публікації №№ WO 2008/057144, WO 2008/076960 і WO 2008/50525. Суть винаходу Даний винахід відноситься до агентів, які зв'язуються з нелігандзв'язуючою проксимальною областю мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1, і композицій, таких як фармацевтичні композиції, включаючі вказані агенти. Даний винахід далі відноситься до способів направленої дії вказаними агентами на ракові стволові клітини. У деяких варіантах здійснення винаходу вказані способи включають зменшення частоти зустрічальності ракових стволових клітин в пухлині, зменшення числа ракових стволових клітин в пухлині, зменшення онкогенності пухлини та/або зменшення онкогенності пухлини шляхом зменшення числа або частоти зустрічальності ракових стволових клітин в пухлині. Даний винахід відноситься також до способів вживання вказаних агентів для лікування рака та/або інгібування зростання пухлини. Одним об'єктом даного винаходу є антитіло, яке специфічно зв'язується з нелігандзв'язуючою проксимальною областю мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 (наприклад, рецептора Notch1 людини). У деяких варіантах здійснення винаходу нелігандзв'язуюча проксимальна область мембрани рецептора Notch1 включає ділянку приблизно від амінокислоти 1427 до амінокислоти 1732 рецептора Notch1 людини. У деяких варіантах здійснення винаходу проксимальна область мембрани рецептора Notch1 включає SEQ ID NO:2. У певних варіантах здійснення винаходу антитіло специфічно зв'язується з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену щонайменше одного додаткового члена сімейства рецепторів Notch. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло є антагоністом Notch1. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло інгібує передачу сигналу рецептором Notch1 або активацію рецептора Notch1. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло інгібує активність Notch1. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло інгібує розщеплювання в проксимальній ділянці мембрани. У певних варіантах здійснення винаходу антитіло інгібує розщеплювання рецептора Notch1 (наприклад, розщеплювання металопротеазою на сайті S2) та/або інгібує активацію 4 UA 101672 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рецептора Notch1 в результаті зв'язування ліганду. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло інгібує вивільнення або утворення внутріклітинного домену (ICD) рецептора Notch1. У певних варіантах здійснення винаходу антитіло інгібує зростання пухлини. Певні варіанти здійснення винаходу відносяться до антитіла, яке зв'язується з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини і містить (а) CDR1 важкого ланцюга, що включає RGYWIE (SEQ ID NO:15), CDR2 важкого ланцюга, що включає QILPGTGRTNYNEKFKG (SEQ ID NO:16), та/або CDR3 важкого ланцюга, що включає FDGNYGYYAMDY (SEQ ID NO:17); та/або (b) CDR1 легкого ланцюга, що включає RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:18), CDR2 легкого ланцюга, що включає GTNNRAP (SEQ ID NO:19), та/або CDR3 легкого ланцюга, що включає ALWYSNHWVFGGGTKL (SEQ ID NO:20). У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло має варіабельну ділянку важкого ланцюга, що включає: (а) CDR1 важкого ланцюга, що включає RGYWIE (SEQ ID NO:15), або його варіант, що включає заміни 1, 2, 3 або 4 амінокислот; (b) CDR2 важкого ланцюга, що включає QILPGTGRTNYNEKFKG (SEQ ID NO:16), або його варіант, що включає заміни 1, 2, 3 або 4 амінокислот; та/або (с) CDR3 важкого ланцюга, що включає FDGNYGYYAMDY (SEQ ID NO:17), або його варіант, що включає заміни 1, 2, 3 або 4 амінокислот. У інших певних варіантах здійснення винаходу антитіло має (або додатково має) варіабельну ділянку легкого ланцюга, що включає: (а) CDR1 легкого ланцюга, що включає RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:18), або його варіант, що включає заміни 1, 2, 3 або 4 амінокислот; (b) CDR2 легкого ланцюга, що включає GTNNRAP (SEQ ID NO:19), або його варіант, що включає заміни 1, 2, 3 або 4 амінокислот; та/або (с) CDR3 легкого ланцюга, що включає ALWYSNHWVFGGGTKL (SEQ ID NO:20), або його варіант, що включає заміни 1, 2, 3 або 4 амінокислот. У деяких варіантах здійснення винаходу заміни амінокислот є консервативними замінами амінокислот. Деякі варіанти здійснення винаходу відносяться до антитіла 52М51, продукованому лінією клітин гібридоми, депонованої в Американську колекцію типових культур (АТСС), за адресою: 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USA, згідно з положеннями Будапештського договору 7 серпня 2008 р. під номером РТА-9405. Деякі варіанти здійснення винаходу відносяться до гуманізованого варіанту антитіла 52М51, 52М51Н4L3, кодованому ДНК, депонованої в АТСС згідно з положеннями Будапештського договору 15 жовтня 2008 р. під номером РТА-9549. Деякі варіанти здійснення винаходу відносяться до антитіла, яке зв'язується з тим же епітопом, з яким зв'язується антитіло 52М51. Іншим об'єктом даного винаходу є антитіло, яке зв'язується з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини, причому вказане антитіло включає, складається або по суті складається з антитіла "52R43", кодованого ДНК, депонованої в АТСС згідно з положеннями Будапештського договору 15 жовтня 2008 р. під номером РТА-9548. Деякі варіанти здійснення винаходу відносяться до антитіла, яке конкурує з антитілом 52R43 за специфічне зв'язування з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену Notch1 людини. Даний винахід відноситься також до фармацевтичних композицій, що включає антитіло 52R43, і до способів лікування рака, які включають введення терапевтично ефективної кількості антитіла 52R43. Певні варіанти здійснення винаходу відносяться до антитіла, яке конкурує з будь-якими антитілами, розглянутими в приведених вище варіантах здійснення винаходу та/або об'єктах, а також в інших об'єктах/варіантах здійснення винаходу, представлених в даному описі винаходу, за специфічне зв'язування з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини (наприклад, при виконанні конкурентнозв'язуючого аналізу). Даний винахід відноситься також до фармацевтичних композицій, що включають описані антитіла, і до способів лікування рака, які включають введення терапевтично ефективної кількості вказаних антитіл. У певних вищезгаданих об'єктах і варіантах здійснення винаходу, а також в інших об'єктах і варіантах здійснення винаходу, представлених в даному описі винаходу, антитіло є рекомбінантним антитілом. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло є моноклональним антитілом, химерним антитілом, гуманізованим антитілом або людським антитілом. У певних варіантах здійснення винаходу антитіло є фрагментом антитіла. У певних варіантах здійснення винаходу антитіло або фрагмент антитіла є моновалентним, моноспецифічним, двовалентним, біспецифічним або мультиспецифічним. У певних варіантах здійснення винаходу антитіло кон'юговано з цитотоксичною частиною. У певних варіантах здійснення винаходу антитіло є виділеним антитілом. У інших варіантах здійснення винаходу антитіло є по суті чистим антитілом. Даний винахід відноситься також до фармацевтичних композицій, що включають антитіла по даному винаходу, і до способів лікування рака, які включають введення терапевтично 5 UA 101672 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ефективної кількості антитіл по даному винаходи. У певних варіантах здійснення винаходу фармацевтичні композиції далі включають фармацевтично прийнятний носій. Іншим об'єктом даного винаходу є поліпептид. У деяких варіантах здійснення винаходу поліпептид є антитілом (наприклад, антитілом, яке специфічно зв'язується з рецептором Notch1), важким ланцюгом або легким ланцюгом антитіла та/або фрагментом антитіла. У деяких варіантах здійснення винаходу поліпептид є виділеним поліпептидом. У певних варіантах здійснення винаходу поліпептид є по суті чистим поліпептидом. У деяких варіантах здійснення винаходу поліпептид включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28 або SEQ ID NO:32. У деяких варіантах здійснення винаходу поліпептид включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:14 або SEQ ID NO:24 і амінокислотну послідовність SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:28 або SEQ ID NO:32. У деяких варіантах здійснення винаходу поліпептид включає щонайменше частину амінокислотної послідовності SEQ ID NO:14 або SEQ ID NO:24 та/або щонайменше частину амінокислотної послідовності SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:28 або SEQ ID NO:32. Даний винахід відноситься також до фармацевтичних композицій, що включають поліпептид і фармацевтично прийнятний носій, а також до ліній клітин, що продукують вказаний поліпептид. У деяких варіантах здійснення винаходу поліпептид включає: (а) поліпептид, що має послідовність, яка щонайменше приблизно на 80 % ідентична SEQ ID NO:14 або SEQ ID NO:24; і (b) поліпептид, що має послідовність, яка щонайменше приблизно на 80 % ідентична SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:28 або SEQ ID NO:32. У певних варіантах здійснення винаходу поліпептид є антитілом (наприклад, антитілом, яке специфічно зв'язується з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини). У певних варіантах здійснення винаходу поліпептид є поліпептидом, що має послідовність, яка щонайменше приблизно на 85 %, щонайменше приблизно на 90 %, щонайменше приблизно на 95 %, щонайменше приблизно на 98 % або приблизно на 100 % ідентична SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:28 або SEQ ID NO:32. У певних варіантах здійснення винаходу поліпептид включає варіабельну ділянку важкого ланцюга і варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла 52М51. У деяких варіантах здійснення винаходу поліпептид включає варіабельну ділянку важкого ланцюга та/або варіабельну ділянку легкого ланцюга гуманізованого антитіла 52М51. У деяких варіантах здійснення винаходу поліпептид включає варіабельну ділянку важкого ланцюга та/або варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла 52R43. Іншим об'єктом даного винаходу є молекула полінуклеотиду, що кодує будь-які антитіла та/або поліпептиди по вищезгаданих об'єктах винаходу, а також інших об'єктах/варіантах здійснення винаходу, представлених в даному описі винаходу. У деяких варіантах здійснення винаходу експресуючий вектор включає молекулу полінуклеотиду. У інших варіантах здійснення винаходу клітина-хазяїн включає експресуючий вектор. У деяких варіантах здійснення винаходу клітина-хазяїн включає молекулу полінуклеотиду. У деяких варіантах здійснення винаходу клітина-хазяїн є лінією клітин або лінією клітин гібридоми. У певних варіантах здійснення винаходу лінія клітин гібридоми продукує антитіло 52М51 або гуманізоване антитіло 52М51. Іншим об'єктом даного винаходу є спосіб інгібування активності рецептора Notch1 в клітині, який включає контактування вказаної клітини з ефективною кількістю будь-якого з антитіл або поліпептидів, описаних в розглянутих вище об'єктах і варіантах здійснення винаходу, а також в інших об'єктах/варіантах здійснення винаходу, представлених в даному описі винаходу. У певних варіантах здійснення винаходу клітина є пухлинною клітиною. Ще одним об'єктом даного винаходу є спосіб інгібування зростання пухлини у суб'єкта, який включає введення вказаному суб'єктові терапевтично ефективної кількості будь-якої з антитіл або поліпептидів, описаних в розглянутих вище об'єктах і варіантах здійснення винаходу, а також в інших об'єктах/варіантах здійснення винаходу, представлених в даному описі винаходу. У деяких варіантах здійснення винаходу пухлина включає ракові стволові клітини. У деяких варіантах здійснення винаходу вказані способи включають направлену дію антитілами на ракові стволові клітини. У певних варіантах здійснення винаходу вказані способи включають зменшення частоти зустрічальності ракових стволових клітин в пухлині, зменшення числа ракових стволових клітин в пухлині, зменшення онкогенності пухлини та/або зменшення онкогенності пухлини шляхом зменшення числа або частоти зустрічальності ракових стволових клітин в пухлині. У деяких варіантах здійснення винаходу способи включають інгібування активності рецептора Notch1 та/або інгібування зростання пухлини. У певних варіантах здійснення винаходу пухлину вибирають з групи, що складається з пухлини молочної залози, колоректальної пухлини, пухлини печінки, пухлини нирки, пухлини легень, пухлини підшлункової залози, пухлини яєчника, пухлини передміхурової залози і пухлини голови і шиї. 6 UA 101672 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Іншим об'єктом даного винаходу є способи лікування рака у суб'єкта. У деяких варіантах здійснення винаходу вказаний спосіб включає введення суб'єктові терапевтично ефективної кількості будь-якої з антитіл або поліпептидів, описаних в розглянутих вище об'єктах та/або варіантах здійснення винаходу, а також в інших об'єктах/варіантах здійснення винаходу, представлених в даному описі винаходу. У деяких варіантах здійснення винаходу рак, що підлягає лікуванню є раком молочної залози, колоректальним раком, печінковим раком, раком нирки, раком печінки, раком легень, раком підшлункової залози, шлунково-кишковим раком, меланомою, раком яєчника, раком передміхурової залози, раком шийки матки, раком сечового міхура, гліобластомою і раком голови і шиї. У певних вищезгаданих об'єктах або варіантах здійснення винаходу, а також інших об'єктах та/або варіантах здійснення винаходу, представлених в даному описі винаходу, спосіб лікування рака включає інгібування зростання пухлини. Додатковим об'єктом даного винаходу є спосіб інгібування зростання пухлини у суб'єкта, який включає введення вказаному суб'єктові терапевтично ефективної кількості антитіла, яке специфічно зв'язується з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини і таким чином інгібує активність Notch1. Іншим об'єктом даного винаходу є спосіб зменшення онкогенності пухлини, що включає ракові стволові клітини, шляхом зменшення частоти зустрічальності або числа ракових стволових клітин в пухлині, який включає контакт пухлини з ефективною кількістю антитіла, що інгібує активність рецептора Notch1. У певних вищезгаданих об'єктах та/або варіантах здійснення винаходу, а також інших об'єктах або варіантах здійснення винаходу, представлених в даному описі винаходу, вказані способи далі включають введення суб'єктові щонайменше одного додаткового протиракового та/або терапевтичного агента. У певних вищезгаданих об'єктах та/або варіантах здійснення винаходу, а також інших об'єктах або варіантах здійснення винаходу, представлених в даному описі винаходу, антитіло або поліпептид вводять суб'єктові в комбінації з додатковим лікуванням рака. У певних варіантах здійснення винаходудодаткове лікування рака включає променеву терапію, хіміотерапію та/або додаткову терапію антитілами. У певних варіантах здійснення винаходу хіміотерапія включає таксол, іринотекан, гемцитабін та/або оксаліплатин. У певних варіантах здійснення винаходу додаткова терапія антитілами включає використання антитіла, яке специфічно зв'язується з другим рецептором Notch людини (наприклад, Notch2) або з лігандом рецептора Notch людини (наприклад, DLL4 або JAG1). У певних варіантах здійснення винаходу додаткова терапія антитілами включає використання антитіла, яке специфічно зв'язується з VEGF. У певних варіантах здійснення винаходу суб'єкт, що піддається лікуванню, є людиною. Даний винахід далі відноситься до способу лікування у людини рака, що включає ракові стволові клітини, в якому ракові стволові клітини не характеризується надекспресією одного або декількох рецепторів Notch, при цьому вказаний спосіб включає введення людині терапевтично ефективної кількості антитіла, яке зв'язується з проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 і блокує активацію лігандом рецептора Notch1. Даний винахід далі відноситься до способу лікування рака у людини, яка включає введення вказаній людині терапевтично ефективної кількості (а) першого антитіла, яке зв'язується з рецептором Notch1 і інгібує зростання ракових стволових клітин, надекспресуючих рецептори Notch; і (b) другого антитіла, яке зв'язується з рецептором Notch і блокує активацію лігандом рецептора Notch. Даний винахід відноситься також до іншого способу лікування рака, вибираного з групи, що складається з рака молочної залози, ободової кишки, підшлункової залози, передміхурової залози, легень, ректального і колоректального рака, який включає введення терапевтично ефективної кількості антитіла, яке блокує активацію лігандом рецептора Notch1. Даний винахід додатково відноситься до гуманізованого антитіла, яке зв'язується з Notch1 і блокує активацію лігандом рецептора Notch1; до композиції, що включає гуманізоване антитіло і фармацевтично прийнятний носій; і до імунокон'югату, що включає гуманізоване антитіло, кон'юговане з цитотоксичним агентом. Крім того, даний винахід відноситься до виділеного полінуклеотиду, що кодує гуманізоване антитіло; до вектора, що включає нуклеїнову кислоту; до клітини-хазяїна, що включає нуклеїнову кислоту або вектор; а також до способу отримання гуманізованого антитіла, який включає культивування клітини-хазяїна, що включає вказану нуклеїнову кислоту, з досягненням експресії нуклеїнової кислоти, і необов'язкове подальше виділення гуманізованого антитіла з культури клітин-хазяїв (наприклад, з культурального середовища клітин-хазяїв). 7 UA 101672 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід далі відноситься до імунокон'югату, що включає антитіло, що зв'язується з рецептором Notch, яке кон'юговане з однією або декількома молекулами каліхеаміцину, і до вживання таких кон'югатів для лікування рака, експресуючого рецептори Notch, наприклад, рака, в якому ракові стволові клітини надекспресують рецептори Notch. Приклади солідних пухлин, які можна лікувати, використовуючи терапевтичну композицію по даному винаходу, наприклад, антитіло, яке зв'язується з проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1, включають, не обмежуючись ними, саркоми і карциноми, такі як фібросаркома, міксосаркома, ліпосаркома, хондросаркома, остеогенна саркома, хордома, ангіосаркома, ендотеліосаркома, лімфангіосаркома, лімфангіоендотеліосаркома, синовіома, мезотеліома, пухлина Юінга, лейоміосаркома, рабдоміосаркома, карцинома ободової кишки, рак підшлункової залози, рак молочної залози, рак яєчника, рак передміхурової залози, плоскоклітинний рак, базально-клітинний рак, аденокарцинома, карцинома потової залози, карцинома сальної залози, папілярна карцинома, папілярна аденокарцинома, цистаденокарцинома, медулярна карцинома, бронхогенний рак, нирково-клітинний рак, гепатома, рак жовчної протоки, хоріокарцинома, семінома, ембріональний рак, пухлина Вільмса, рак шийки матки, рак яєчка, рак легень, дрібноклітинний рак легень, рак сечового міхура, епітеліальний рак, гліома, астроцитома, медулобластома, краніофарингіома, епендимома, пінеалома, гемангіобластома, невринома слухового нерва, олігодендрогліома, менінгіома, меланома, нейробластома і ретинобластома. У тих випадках, коли об'єкти і варіанти здійснення винаходу описані у вигляді групи Маркуша або іншої групи альтернатив, в об'єм даного винаходу входить не лише вся група, але також кожен член вказаної групи і всі можливі підгрупи основної групи, а також основна група за відсутності одного або декількох членів групи. Даним винаходом також передбачено чітко виражене виключення одного або декількох будь-яких членів групи в заявленому винаході. Короткий опис креслень Фігура 1. Ідентифікація антитіл, спрямовано діючих на проксимальну ділянку мембрани рецептора Notch, які інгібують передачу сигналу Notch. (А) Схематичне зображення рецептора Notch і ділянки антигена 52М. Антиген 52М включає ділянку рецептора Notch1, розщеплювану фурином в процесі дозрівання рецептора і протеазами ADAM (дезинтегрин А і металопротеазу) після зв'язування ліганду. Подальший процесинг гамма-секретазою викликає вивільнення внутріклітинного домену (ICD) Notch, який активує транскрипцію гена в ядрі. (В) Рівні люциферази (ось у), виділеної з клітин Notch1-Hela, культивованих у присутності розчинного ліганду Notch (hDLL4-fc) і антитіл проти рецептора Notch1. Результати, отримані для нетрансфецированих (NT) клітин, культивованих в присутності і відсутності hDLL4-Fc, показані зліва на осі х. Антитіла проти антигена 52М рецептора Notch1 показані на осі х порівняно з DBZ, інгібітором гамма-секретази Notch (GSI) і 21М18, антитілом проти DLL4. Всі антитіла 52М51, 52М63, 52М74 і 52М80 проти рецептора Notch1 істотно інгібували передачу сигналу Notch, про що свідчить зниження активності люциферази. (С) Рівні люциферази (ось у), виділеної з клітин Notch1-Hela, культивованих у присутності розчинного ліганду Notch (hDLL4-fc) і антитіл проти рецептора Notch1. Результати, отримані для нетрансфікованих (NT) клітин, культивованих в присутності і відсутності hDLL4-Fc, показані зліва на осі х. Антитіло 52М51, отримане з гібридоми миші, і гуманізований варіант 52М51-Н4/L3, показані на осі х в різних вказаних концентраціях. Як вихідне мишаче антитіло 52М51, так і гуманізований варіант істотно інгібували передачу сигналу Notch, про що свідчить зниження активності люциферази. (D) Аналіз методом вестерн-блотингу утворення ICD після опосередкованої лігандом стимуляції клітин Hеlа, експресуючих Notch1. Мінімальна кількість ICD була продукована за відсутністю ліганду DLL4 (-DLL4), але присутність DLL4 стимулювала утворення ICD. Антитіла 52М51, 52М63, 52М74 і 52М80 зменшують утворення ICD до фонових рівнів, не дивлячись на присутність DLL4. Фігура 2. Антитіло 52М52 проти рецептора Notch1 інгібує утворення пухлини in vivo. (А) Мишам NOD/SCID, яким були ін'єктовані клітини пухлини ободової кишки С8, вводили контрольне антитіло (квадрати) або антитіло 51М51 проти Notch1 (трикутники) і вимірювали 3 об'єм пухлини (ось у, мм ) протягом певного періоду часу (ось х, дні). Введення антитіл 52М51 істотно (р=0,0006) інгібувало зростання пухлини в порівнянні з контрольним антитілом. (В) Об'єм пухлини у тварин по пункту (А) вимірювали на 48-й і 55-й день і порівнювали результати, отримані для контрольних мишей (зліва) і мишей, яким вводили антитіло 52М51 (справа). Лінією відокремлено середнє значення для кожної піддослідної групи. (С) Мишам NOD/SCID, яким були ін'єктовані клітини пухлини молочної залози Ре13, вводили контрольне антитіло (чорні квадрати) або антитіла проти Notch1, які не інгібують передачу сигналу Notch, показані на фігурі 3 1В: 52М1 (чорні трикутники) і 52М2 (сірі кружки). Об'єм пухлини (ось у, мм ) вимірювали 8 UA 101672 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 протягом певного періоду часу (ось х, дні). Введення антитіл 52М1 і 52М2 не впливало на зростання пухлини в порівнянні з тваринами, яким вводили контрольне антитіло. (D) Мишам NOD/SCID, яким були ін'єктовані клітини пухлини молочної залози Ре13, вводили контрольне антитіло (квадрати) або антитіло 52М8 проти Notch1 (трикутники), яке не інгібує передачу 3 сигналу Notch, показане на фігурі 1В. Об'єм пухлини (ось у, мм ) вимірювали протягом визначеного періоду часу (ось х, дні). Введення антитіла 52М8 не впливало на зростання пухлини в порівнянні з тваринами, яким вводили контрольне антитіло. Фігура 3. Антитіло 52R43 проти рецептора Notch1 інгібує зростання пухлини in vivo. (А) Мишам NOD/SCID, яким були ін'єктовані клітини меланоми М2, вводили контрольне антитіло (квадрати) або антитіло 52R43 проти Notch1 (кружки) і вимірювали об'єм пухлини (ось 3 у, мм ) протягом певного періоду часу (ось х, дні). (В) Мишам NOD/SCID, яким були ін'єктовані клітини пухлини легень Lu24, вводили контрольне антитіло (квадрати) або антитіло 52R43 проти 3 Notch1 (кухлі) і вимірювали об'єм пухлини (ось у, мм ) протягом певного періоду часу (ось х, дні). (С) Мишам NOD/SCID, яким були ін'єктовані клітини пухлини підшлункової залози PN8, вводили контрольне антитіло (квадрати) або антитіло 52R43 проти Notch1 (кружки) і вимірювали 3 об'єм пухлини (ось у, мм ) протягом певного періоду часу (ось х, дні). (D) Мишам NOD/SCID, яким були ін'єктовані клітини пухлини молочної залози Т1, вводили контрольне антитіло (квадрати), антитіло 52R43 проти Notch1 (кружки), таксол (трикутники) або антитіло 52R43 і 3 таксол (окружності) і вимірювали об'єм пухлини (ось у, мм ) протягом певного періоду часу (ось х, дні). Детальний опис винаходу Даний винахід відноситься до нових агентів, які включають, не обмежуючись ними, поліпептиди, такі як антитіла, які зв'язуються з одним або декількома рецепторами Notch людини. Агенти, що зв'язуються з Notch, включають антагоністи рецепторів Notch людини. Даний винахід відноситься також до родинних поліпептидів і полінуклеотидів, композицій, що включають агенти, що зв'язуються з Notch, і способів одержання агентів, що зв'язуються з Notch. Даний винахід далі відноситься до способів використання нових агентів, що зв'язуються з Notch, таким як способи інгібування зростання пухлини та/або лікування рака. Даний винахід далі відноситься до молекул (наприклад, антитілам), які специфічно зв'язуються з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини і інгібують зростання пухлини in vivo. Лігандзв'язуюча ділянка рецептора Notch, яка необхідна і достатня для зв'язування ліганду, була ідентифікована у вигляді повторів EGF 11 і 12, з чого виходить, що дана ділянка рецептора Notch має важливе значення для передачі сигналу Notch і онкогенезу (Rebay et al., 1991, Cell 67:687; Lei et al., 2003, Dev. 130:6411; Hambleton et al., 2004, Structure 12:2173). Вельми несподівано було встановлено, що антитіла, які зв'язуються за межами лігандзв'язуючої ділянки позаклітинного домену рецептора Notch людини, інгібують зростання пухлинних клітин in vivo (див. публікацію патенту США № 2008/0131434, яка повністю включена в даний опис винаходу як посилання). Таким чином, антитіла, які зв'язуються за межами лігандзв'язуючої ділянки позаклітинного домену одного або декількох рецепторів Notch людини, а саме Notch1, Notch2, Notch3 і Notch4, можуть бути корисні як можливі засоби для лікування рака. В даний час ідентифіковані моноклональні антитіла, які специфічно зв'язуються з проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену Notch1, включаючи моноклональне антитіло 52М51 (приклад 1). Також створені гуманізовані антитіла 52М51 (приклад 2). Декілька антитіл, у тому числі антитіло 52М51 і гуманізований варіант антитіла 52М51, інгібують індуковану лігандом передачу сигналу Notch1 (приклад 3 і фігура 1В і С), не дивлячись на зв'язування з рецептором Notch1 в ділянці за межами лігандзв'язуючої ділянки. В даний час також продемонстрована здатність декількох антитіл інгібувати утворення внутріклітинного домену (ICD) рецептора Notch (приклад 3 і фігура 1D). Було встановлено, що антитіло 52М51 інгібує зростання пухлинних клітин in vivo в моделі ксенотрансплантату (приклад 5 і фігура 2А і В). Крім того, було виявлено, що інше антитіло 52R43 інгібує зростання пухлинних клітин in vivo в декількох моделях ксенотрансплантатів (приклад 7 і фігура 3А-D). Визначення термінів "Антагоніст" рецептора Notch у використаному тут значенні є терміном, що означає будь-яку молекулу, яка частково або повністю блокує, інгібує або нейтралізує біологічну активність сигнального шляху Notch. Прийнятні молекули антагоністів включають антитіла або фрагменти антитіл. Термін "антагоніст" у використаному тут значенні означає будь-яку молекулу, яка частково або повністю блокує, інгібує або нейтралізує експресію рецептора Notch. Термін "антитіло" означає молекулу імуноглобуліну, яка розпізнає і специфічно зв'язується з мішенню, такою як білок, поліпептид, пептид, вуглевод, полінуклеотид, ліпід або комбінація 9 UA 101672 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 вищезгаданих мішеней і т.д., за допомогою щонайменше одного сайту розпізнавання антигена у варіабельній ділянці молекули імуноглобуліну. У визначення даного терміну входять інтактні поліклональні антитіла, інтактні моноклональні антитіла, фрагменти антитіл (такі як Fab, Fab', F(ab')2 і Fv-фрагменти), одноланцюгові мутанти Fv (scFv), мультиспецифічні антитіла, такі як біспецифічні антитіла, створені щонайменше з двох інтактних антитіл, моновалентні або моноспецифічні антитіла, химерні антитіла, гуманізовані антитіла, людські антитіла, злиті білки, що включають антигеновизначальну частину антитіла, і будь-які інші модифіковані молекули імуноглобуліну, що включають сайт розпізнавання антигена, якщо вказані антитіла володіють необхідною біологічною активністю. Антитіло може відноситися до будь-якого з п'яти основних класів імуноглобулінів: IGA, IGD, IGE, IGG і IGM або їх підкласам (ізотипам) (наприклад, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 і IgA2) на основі ідентичності їх константних ділянок важкого ланцюга, визначуваних відповідно як альфа, дельта, епсилон, гамма і мю. Імуноглобуліни різних класів мають різні і добре відомі структури субодиниць і тривимірні конфігурації. Антитіла можуть бути голими або кон'югованими з іншими молекулами, такими як токсини, радіоізотопи і т. д. У використаному тут значенні термін "фрагмент антитіла" означає частину інтактного антитіла і служить для визначення антигенвизначальних варіабельних ділянок інтактного антитіла. Приклади фрагментів антитіл включають, не обмежуючись ними, Fab, Fab', F(ab')2 і Fv-фрагменти, лінійні антитіла, одноланцюгові антитіла і мультиспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл. Термін "Fv-антитіло" означає мінімальний фрагмент антитіла, який містить повний сайт розпізнавання антигена і антигензв'язуючий сайт або у вигляді двох ланцюгів, в яких варіабельний домен одного важкого і одного легкого ланцюга утворює нековалентно зв'язаний димер, або у вигляді одного ланцюга (scFv), в якому варіабельний домен одного важкого і одного легкого ланцюга ковалентно зв'язаний гнучким пептидним лінкером, завдяки чому два ланцюги утворюють подібну димерну структуру. У даній конфігурації ділянки, що визначають комплементарність, (CDR) кожного варіабельного домену взаємодіють, визначаючи антигензв'язуючу специфічність Fv-димера. Альтернативно для розпізнавання і зв'язування антигена може бути використаний один варіабельний домен (або половина Fv), хоча зазвичай з нижчою афінністю. Термін "моноклональне антитіло" у використаному тут значенні означає популяцію гомогенних антитіл, що беруть участь у високоспецифічному розпізнаванні і зв'язуванні однієї антигенної детермінанти або епітопа. Цим моноклональні антитіла відрізняються від поліклональних антитіл, які зазвичай включають різні антитіла, направлені проти різних антигенних детермінант. У визначення терміну "моноклональне антитіло" входять як інтактні і непроцесовані моноклональні антитіла, так і фрагменти антитіл (наприклад, Fab, Fab", F(ab")2, Fv), одноланцюгові мутанти (scFv), злиті білки, що включають частину антитіла, і будь-які інші модифіковані молекули імуноглобуліну, що включають сайт розпізнавання антигена. Крім того, термін "моноклональне антитіло" означає антитіла, створені будь-якими методами, які включають, не обмежуючись ними, метод гібридом, фаговий відбір, експресію рекомбінантів і трансгенних тварин. У використаному тут значенні термін "гуманізоване антитіло" означає форми антитіл, відмінних від людських, (наприклад, мишачих), які є специфічними ланцюгами імуноглобулінів, химерними імуноглобулінами або їх фрагментами, що містять мінімальні послідовності, відмінні від людських. Гуманізовані антитіла зазвичай є імуноглобулінами людини, в яких залишки з ділянок, що визначають комплементарність, (CDR), замінені залишками з CDR видів, відмінних від людини (наприклад, миші, щура, кролика, хом'яка і т. д.), які володіють необхідною специфічністю, афінністю та/або потенціалом. В деяких випадках залишки остовної Fv-ділянки (FR) імуноглобуліну людини замінені відповідними залишками в антитілі з видів, відмінних від людини, які володіють необхідною специфічністю, афінністю та/або потенціалом. Гуманізоване антитіло може бути далі модифіковане шляхом введення додаткових залишків в остовну Fvділянку та/або в замінені залишки, відмінні від людських, для поліпшення і оптимізації специфічності, афінності та/або потенціалу антитіла. Як правило, гуманізоване антитіло включає по суті все, зокрема, щонайменше один або зазвичай два або три варіабельних домену, що містять всі або по суті всі CDR-ділянки, які відповідають імуноглобуліну, відмінному від людського, де всі або по суті всі остовні ділянки (FR) є ділянками консенсусної послідовності імуноглобуліну людини. Гуманізоване антитіло може також включати щонайменше частину константної ділянки або домену (Fc) імуноглобуліну, який зазвичай є імуноглобуліном людини. Приклади методів, використовуваних для створення гуманізованих антитіл, наведені в патенті США № 5225539, який включений в даний опис винаходу як посилання. 10 UA 101672 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "варіабельна ділянка" антитіла означає варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла або варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла, окремо або в комбінації. Варіабельні ділянки важкого і легкого ланцюга складаються з чотирьох остовних ділянок (FR), з'єднаних трьома ділянками, що визначають комплементарність (CDR), відомими також як гіперваріабельні ділянки. CDR-ділянки в кожному ланцюзі стримуються в безпосередній близькості одна від одної остовними ділянками, при цьому CDR-ділянки з іншого ланцюга сприяють утворенню антигензв'язуючого сайту антитіл. Існують щонайменше два методи визначення CDR-ділянок: (1) метод, заснований на варіабельності послідовностей в різних видах (наприклад, публікація Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.); і (2) метод, заснований на кристалографічних дослідженнях комплексів антиген-антитіло (Al-lazikani et al., 1977, J. Molec. Biol. 273:927-948). Крім того, для визначення CDR-ділянок в даній галузі інколи використовують комбінації двох вказаних методів. Термін "людське антитіло" у використаному тут значенні означає антитіло, продуковане людиною, або антитіло, що має амінокислотну послідовність, відповідну антитілу, продукованому людиною, яке було отримано будь-якими методами, відомими в даній галузі. У вказане визначення людського антитіла входять інтактні або непроцесовані антитіла, їх фрагменти та/або антитіла, що включають щонайменше один поліпептид важкого та/або легкого ланцюга людини, такі як, наприклад, антитіло, що включає поліпептиди легкого ланцюга миші і важкого ланцюга людини. Термін "химерні антитіла" означає антитіла, в яких амінокислотна послідовність молекули імуноглобуліну виділена з двох або більшого числа видів. Варіабельна ділянка легкого і важкого ланцюгів зазвичай відповідає варіабельній ділянці антитіл, отриманих з одного виду ссавців (наприклад, миші, щура, кролика і т.д.), які володіють необхідною специфічністю, афінністю та/або потенціалом, тоді як константні ділянки гомологічні послідовностям в антитілах, отриманих з іншого виду (зазвичай людини), щоб уникнути імунної відповіді на вказаний вид. У визначення терміну "химерне антитіло" входять моновалентні, двовалентні і полівалентні антитіла. Терміни "епітоп" або "антигенна детермінанта" мають взаємозамінні значення і означають частину антигену, яка може бути розпізнана і специфічно зв'язана певним антитілом. У антигені, що є поліпептидом, епітопи можуть бути утворені з суміжних амінокислот і несуміжних амінокислот, зв'язаних шляхом третинного укладання білка. Епітопи, утворені з суміжних амінокислот (визначувані також як лінійні епітопи), зазвичай зберігаються в процесі денатурації білка, тоді як епітопи, утворені шляхом третинного укладання (визначувані також як конформаційні епітопи), зазвичай втрачаються в процесі денатурації білка. Епітоп зазвичай включає щонайменше 3 або частіше щонайменше 5 або 8-10 амінокислот, створюючих унікальну просторову конформацію. Те, що антитіло "вибірково зв'язується" або "специфічно зв'язується" з епітопом або рецептором, означає, що антитіло взаємодіє або зв'язується з епітопом або рецептором частіше, швидше, триваліше, з більшою афінністю або у вигляді комбінації вказаних дій, чим з іншими речовинами, включаючи неродинні білки. Термін "вибірково зв'язується" або "специфічно зв'язується" означає, наприклад, що антитіло зв'язується з білком при значенні КD, рівному приблизно 0,1 мМ або менше, інколи приблизно 1 мкМ або менше, інколи приблизно 0,1 мкМ або менше і інколи приблизно 0,01 мкМ або менше. Завдяки ідентичності послідовностей в гомологічних білках в різних видах термін "специфічне зв'язування" може відноситися до антитіла, яке розпізнає рецептор Notch в більш ніж одному вигляді. Очевидно, що в певних варіантах здійснення винаходу антитіло або частина, що зв'язується, яка специфічно зв'язується з першою мішенню, може або не може специфічно зв'язуватися з другою мішенню. Таким чином, "специфічне зв'язування" не обов'язково вимагає (хоча може включати) виняткового зв'язування, тобто зв'язування з однією мішенню. Як правило, але не обов'язково, зв'язування означає специфічне зв'язування. Конкуренцію між антитілами визначають за допомогою аналізу, при виконанні якого досліджуваний імуноглобулін інгібує специфічне зв'язування еталонного антитіла із загальним антигеном. Відомо багато типів конкурентно-зв'язуючих аналізів, наприклад: твердофазний радіоімуноаналіз (RIA) прямого або непрямого зв'язування, твердофазний імуноферментний аналіз (EIA) прямого або непрямого зв'язування, конкурентно-зв'язуючий сендвіч-аналіз (див. публікацію Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253 (1983)); твердофазний імуноферментний аналіз прямого зв'язування на основі біотина-авідина (див. публікацію Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619 (1986)); твердофазний аналіз прямого зв'язування з міченням, твердофазний сендвіч-аналіз прямого зв'язування з міченням (див. публікацію Harlow 11 UA 101672 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press (1988)); твердофазний 125 радіоімуноаналіз прямого зв'язування з міченням при використанні мітки I (див. публікацію Morel et al., Molec. Immunol. 25(1):7-15 (1988)); твердофазний імуноферментний аналіз прямого зв'язування на основі біотина-авідина (Cheung et al., Virology 176:546-552 (1990)); і радіоімуноаналіз прямого зв'язування з міченням (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:7782 (1990)). Такий аналіз зазвичай включає використання очищеного антигена, зв'язаного з твердою поверхнею або клітинами, що несуть немічений випробовуваний імуноглобулін і мічений еталонний імуноглобулін. Конкурентне інгібування вимірюють, визначаючи кількість мітки, зв'язаної з твердою поверхнею або клітинами у присутності випробовуваного імуноглобуліну. Випробовуваний імуноглобулін зазвичай присутній в надлишку. Антитіла, ідентифіковані за допомогою конкурентного аналізу (конкуруючі антитіла), включають антитіла, що зв'язуються з тим же епітопом, що і еталонне антитіло, і антитіла, що зв'язуються з суміжним епітопом, розташованим досить близько до епітопа, зв'язаного еталонним антитілом, для утворення стеричної перешкоди. Конкуруюче антитіло, присутнє в надлишку, зазвичай інгібує специфічне зв'язування еталонного антитіла із загальним антигеном щонайменше на 50 % або 75 %. Терміни "виділений" або "очищений" служать для визначення речовини, яка в основному або по суті не містить компонентів, які зазвичай супроводять їй в нативному стані. Чистоту і гомогенність зазвичай визначають методами аналітичної хімії, такими як електрофорез в поліакриламідному гелі або високоефективна рідинна хроматографія. Білок (наприклад, антитіло) або нуклеїнова кислота, яка переважає в препараті, є по суті очищеною. Зокрема, в деяких варіантах здійснення винаходу виділена нуклеїнова кислота, що включає ген, відокремлена від відкритих рамок зчитування, які в природних умовах фланкують ген і кодують білки, відмінні від білка, кодованого даним геном. Виділене антитіло відокремлюють від інших білків, що не є імуноглобулінами, і від інших білків імуноглобуліну, що володіють іншими антигензв'язуючими специфічностями. Даний термін може також означати, що нуклеїнова кислота або білок є чистим щонайменше на 85 %, щонайменше на 95 % і в деяких варіантах здійснення винаходу є чистим щонайменше на 99 %. У використаному тут значенні терміни "рак" і "раковий" служать для визначення або описують фізіологічний стан у ссавців, при якому популяція клітин характеризується нерегульованим зростанням клітин. Приклади рака включають, не обмежуючись ними, карциному, лімфому, бластому, саркому і лейкоз. Конкретніші приклади таких типів рака включають, не обмежуючись ними, плоскоклітинний рак, дрібноклітинний рак легень, недрібноклітинний рак легень, аденокарциному легень, епідермоїдний рак легень, рак очеревини, печінково-клітинний рак, шлунково-кишковий рак, рак підшлункової залози, гліобластому, рак шийки матки, рак яєчника, рак печінки, рак сечового міхура, гепатому, рак молочної залози, рак ободової кишки, колоректальний рак, ендометріальну карциному або рак матки, рак слинної залози, рак нирки, рак печінки, рак передміхурової залози, рак жіночих зовнішніх статевих органів, рак щитовидної залози, карциному печінки і різні типа рака голови і шиї. Терміни "пухлина" і "новоутворення" у використаному тут значенні означають будь-яку масу тканини, що утворюється в результаті надлишкового зростання або проліферації клітин, доброякісну (неракову) або злоякісну (ракову), включаючи передпухлинні стани. Терміни "проліферативне порушення" і "проліферативне захворювання" означають порушення, що асоціюються з анормальною проліферацією клітин, такої як рак. Термін "метастази" у використаному тут значенні означає процес поширення або перенесення рака з місця виникнення в інші частини тіла з утворенням аналогічної ракової поразки в новому місці. "Метастатична" або "метастазуюча" клітина є такою клітиною, яка втрачає зчеплення з сусідніми клітинами і мігрує по кровотоку або лімфі з первинного місця поразки в сусідні структури тіла. Терміни "ракова стволова клітина", "пухлинна стволова клітина" або "стволова клітина солідної пухлини" мають взаємозамінні значення і означають популяцію клітин солідної пухлини, яка володіє: (1) надмірним проліферативним потенціалом; (2) здатністю асиметричного поділу клітин з утворенням одного або декількох типів диференційованого потомства із зниженим проліферативним або диференційованим потенціалом; і (3) здатністю симетричного поділу клітин для самовідновлення або самозбереження. Вказані властивості "ракових стволових клітин", "пухлинних стволових клітин" або "стволових клітин солідної пухлини" повідомляють вказаним раковим стволовим клітинам здатність утворювати пальповані пухлини при трансплантації мишам з порушеною імунологічною реактивністю в порівнянні з більшістю пухлинних клітин, не здатних утворювати пухлини. Ракові стволові клітини 12 UA 101672 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 самооновлюються на відміну від хаотичного диференціювання з утворенням пухлин, що містять клітини анормальних типів, які з часом можуть змінюватися при виникненні мутацій. Терміни "ракова клітина" або "пухлинна клітина" означають загальну популяцію клітин, виділену з пухлини, що включає як неонкогенні клітини, які складають основну частину популяції пухлинних клітин, так і онкогенні стволові клітини (ракові стволові клітини). У використаному тут значенні термін "онкогенний" служить для визначення функціональних ознак стволової клітини солідної пухлини, що включають властивості самооновлення (виникнення додаткових онкогенних ракових стволових клітин) і проліферації з утворенням всіх інших пухлинних клітин (виникнення диференційованих і, отже, неонкогенних пухлинних клітин), що дозволяє стволовим клітинам солідної пухлини утворювати пухлину. У використаному тут значенні термін "онкогенність" пухлини означає здатність довільного зразка клітин, отриманого з пухлини, утворювати пальповані пухлини при трансплантації мишам з порушеною імунологічною реактивністю. У використаному тут значенні терміни "раковий маркер стволових клітин", "маркер ракових стволових клітин", "маркер пухлинних стволових клітин" або "маркер стволових клітин солідної пухлини" означають ген або гени, білок, поліпептид або пептид, експресований геном або генами, рівень експресії якого окремо або в комбінації з іншими генами корельований з присутністю онкогенних ракових клітин в порівнянні з неонкогенними клітинами. Кореляція може відноситися до підвищеної або зниженої експресії гена (наприклад, підвищені або знижені рівні мРНК або пептиду, кодованого даним геном). Терміни "сигнатура гена ракової стволової клітини", "сигнатура гена пухлинної стволової клітини" або "сигнатура ракової стволової клітини" мають взаємозамінні значення і означають сигнатури генів, що включають гени, диференційовано експресовані в ракових стволових клітинах в порівнянні з іншими клітинами або популяцією клітин, наприклад, нормальної епітеліальної тканини молочної залози. У деяких варіантах здійснення винаходу сигнатури генів ракових стволових клітин включають гени, диференційовано експресовані в ракових стволових клітинах на відміну від нормального епітелію молочної залози, при кратній зміні, наприклад, 2кратному зменшенні та/або збільшенні експресії, і подальшому обмеженні за допомогою статистичного аналізу, наприклад, з використанням значення Р t-критерію для декількох зразків. У іншому варіанті здійснення винаходу гени, диференційовано експресовані в ракових стволових клітинах, розділені на сигнатури генів ракових стволових клітин на основі кореляції їх експресії з вибраним геном у поєднанні з кратною або процентною зміною експресії. Сигнатури ракових стволових клітин служать для ретроспективного і перспективного прогнозування клінічних змін, які включають, не обмежуючись ними, метастази і смерть. Термін "генетичний тест" у використаному тут значенні означає аналіз генетичної структури суб'єкта або зразка пухлини суб'єкта. Вказаний аналіз може включати виявлення ДНК, РНК, хромосом, білків або метаболітів з метою виявлення для клінічних цілей спадкових або соматичних генотипів або каріотипів, що мають відношення до захворювання. У використаному тут значенні терміни "біопсія" або “ біопсійна тканина ” означають зразок тканини або рідини, яку беруть у суб'єкта з метою визначення вмісту в зразку ракової тканини. У деяких варіантах здійснення винаходу біопсійну тканину або рідину отримують у суб'єкта з підозрінням на рак. Біопсійну тканину або рідину потім досліджують на наявність або відсутність рака. У використаному тут значенні термін "суб'єкт" означає будь-яка тварина (наприклад, ссавець), яка включає, не обмежуючись ними, людину, приматів окрім людини, гризунів і тому подібних, і може бути реципієнтом конкретного лікування. Терміни "суб'єкт" і "пацієнт" мають взаємозамінні значення і означають суб'єкта, що є людиною. Термін "фармацевтично прийнятний" служить для визначення речовини, затвердженої або затверджуваної керуючим агентством федерального уряду або уряду штату або вказаного у фармакопеї США або іншої загальновизнаної фармакопеї для використання при лікуванні тварин, включаючи людину. Термін "фармацевтично прийнятний наповнювач, носій або ад'ювант" або "прийнятний фармацевтичний носій" означає наповнювач, носій або ад'ювант, який може бути введений суб'єктові разом щонайменше з одним антитілом по даному винаходу і який не порушує фармакологічну активність вказаного антитіла і не є токсичним при введенні в дозах, достатніх для доставки терапевтичної кількості антитіла. Крім того, "фармацевтично прийнятний носій" не викликає імунної реакції у суб'єкта, що є реципієнтом. Приклади носіїв включають, не обмежуючись ними, будь-які стандартні фармацевтичні носії, такі як фізіологічний розчин з фосфатним буфером, вода і різні масляні/водні емульсії. Деякі розчинники для аерозолю або 13 UA 101672 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 парентерального введення включають фізіологічний розчин з фосфатним буфером або нормальний (0,9 %) фізіологічний розчин. Термін "фармацевтично прийнятний носій" означає розчинник, ад'ювант, наповнювач або носій, разом з яким вводять щонайменше одне антитіло по даному винаходу. Термін "ефективна кількість", "терапевтично ефективна кількість" або "терапевтичний ефект" означає кількість антитіла, поліпептиду, полінуклеотиду, дрібної органічної молекули або іншого лікарського засобу, яке надає ефективну дію при "лікуванні" захворювання або порушення у суб'єкта або ссавця. В разі рака терапевтично ефективна кількість лікарського засобу викликає терапевтичний ефект і, отже, може зменшити число ракових клітин; зменшити онкогенність, частоту зустрічальності онкогенних клітин або онкогенний потенціал; зменшити число або частоту зустрічальності ракових стволових клітин; зменшити об'єм пухлини; інгібувати або припинити інфільтрацію ракових клітин в периферичні органи, включаючи, наприклад, поширення рака в м'які тканини і кістки; інгібувати і припинити метастазування пухлини; інгібувати і припинити зростання пухлини; ослабити в деякій мірі один або декілька симптомів, обумовлених раком; скоротити захворюваність і смертність; поліпшити якість життя або забезпечити комбінацію таких ефектів. Залежно від міри запобігання зростанню та/або знищенню існуючих ракових клітин, агент, наприклад, антитіло, може бути визначений як цитостатичний та/або цитотоксичний. Такі терміни як "лікування", "лікувати", "полегшення" або "полегшувати" означають 1) терапевтичні заходи, які дозволяють вилікувати, уповільнити розвиток, ослабити симптоми та/або припинити розвиток діагностованого патологічного стану або порушення, і 2) профілактичні або превентивні заходи, які дозволяють запобігти виникненню або уповільнити розвиток патологічного стану або порушення. Таким чином, суб'єктами, що потребують лікування, є суб'єкти, що вже мають порушення; суб'єкти, схильні до виникнення порушення, і суб'єкти, в яких необхідно запобігти виникненню порушення. Вважається, що "лікування" суб'єкта способами по даному винаходу є успішним, якщо у даного суб'єкта виявлений один або декілька наступних ознак: зменшення числа або повна відсутність ракових клітин; зменшення об'єму пухлини; інгібування або відсутність інфільтрації ракових клітин в периферичні органи, включаючи поширення рака в м'які тканини і кістки; інгібування або відсутність метастазів пухлини; інгібування або відсутність зростання пухлини; ослабіння одного або декількох симптомів, що асоціюються з конкретним раком; скорочення захворюваності і смертності; поліпшення якості життя; зменшення онкогенності; скорочення числа або частоти зустрічальності ракових стволових клітин або має місце комбінація вказаних ефектів. У використаному тут значенні терміни "полінуклеотид" або "нуклеїнова кислота" означають полімер, що складається з безлічі нуклеотидних ланок (рибонуклеотид або дезоксирибонуклеотид або споріднені структурні варіанти), зв'язаних фосфодіефірними зв'язками, який включає, не обмежуючись ними, ДНК або РНК. У визначення даного терміну входять послідовності, що включають будь-які відомі аналоги основ ДНК і РНК. Термін "ген" означає послідовність нуклеїнової кислоти (наприклад, ДНК), яка включає кодуючі послідовності, необхідні для продукування поліпептиду, попередника або РНК (наприклад, рРНК, тРНК). Поліпептид може бути кодований непроцесованою кодуючою послідовністю або будь-якою частиною кодуючої послідовності при збереженні необхідної активності або функціональних властивостей (наприклад, ферментативної активності, зв'язування ліганду, сигнальної трансдукції, імуногенності і т.д.) непроцесованого поліпептиду або фрагмента. У визначення даного терміну входить також кодуюча область структурного гена і послідовності, розташовані поряд з кодуючою ділянкою з обох 5'- і 3’-кінців на відстані близько 1 т.п.о. або більше від будь-якого кінця, завдяки чому ген відповідає довжині непроцесованої мРНК. У визначення терміну "ген" входять як кДНК, так і геномні форми гена. Термін "рекомбінантний", використовуваний стосовно клітини, нуклеїнової кислоти, білка або вектора, означає, що дана клітина, нуклеїнова кислота, білок або вектор модифікований шляхом введення гетерологичной нуклеїнової кислоти або білка, зміни нативної нуклеїнової кислоти або білка або що дана клітина отримана з модифікованої таким чином клітини. Таким чином, наприклад, рекомбінантні клітини експресують гени, які не зустрічаються в нативній (нерекомбінантній) формі клітини, або експресують нативні гени, які надекспресовані або анормально експресовані яким-небудь іншим чином, наприклад, експресовані у вигляді неприродних фрагментів або сплайсованих варіантів. Термін "рекомбінантна нуклеїнова кислота" означає нуклеїнову кислоту, спочатку отриману in vitro, зазвичай в результаті маніпулювання нуклеїновою кислотою з використанням полімераза і эндонуклеаза, у формі, що не зустрічається в природі. Таким чином досягається функціональне зв'язування різних послідовностей. Так, нуклеїнова кислота, виділена в лінійній формі, або експресуючий вектор, 14 UA 101672 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 отриманий in vitro шляхом лігування молекул ДНК, які зазвичай не з'єднується, вважаються рекомбінантними відповідно до мети даного винаходу. Очевидно, що після того, як рекомбінантна нуклеїнова кислота отримана і введена в клітину-хазяїна або організм, вона буде реплікувати нерекомбінантно, тобто з використанням in vivo клітинного механізму клітинихазяїна, а не маніпуляцій in vitro; проте, такі нуклеїнові кислоти, спочатку отримані рекомбінантними методами, хоча потім і реплікують нерекомбінантно, все ж вважаються рекомбінантними відповідно до мети даного винаходу. Аналогічним чином термін "рекомбінантний білок" означає білок, отриманий рекомбінантними методами, тобто в результаті експресії рекомбінантної нуклеїнової кислоти, описаної вище. У використаному тут значенні термін "вектор" означає молекули нуклеїнової кислоти, що переносять сегменти ДНК з однієї клітини в іншу. Вектори часто отримують з плазмід, бактеріофагів, рослинних або тваринних вірусів. У використаному тут значенні термін "експресія гена" означає процес перетворення генетичної інформації, кодованої геном, в РНК (наприклад, мРНК, рРНК, тРНК або мяРНК) в результаті "транскрипції" гена (наприклад, шляхом ферментативної дії РНК-полімерази), а для генів, кодуючих білок, в білок в результаті "трансляції" мРНК. Експресія гена може регулюватися на багатьох стадіях даного процесу. Термін "посилення" або "активація" означає регуляцію, яка збільшує продукування продуктів експресії гена (наприклад, РНК або білка), тоді як термін "ослаблення" або "репресія" означає регуляцію, яка зменшує продукування. Молекули (наприклад, чинники транскрипції), які беруть участь в посиленні або ослабленні, часто іменуються відповідно "активаторами" або "репресорами". Терміни "поліпептид", "пептид", "білок" або "фрагмент білка" мають взаємозамінні значення в даному описі винаходу і означають полімер, що складається з амінокислотних залишків. Вказані терміни служать для визначення амінокислотних полімерів, в яких один або декілька амінокислотних залишків є штучними хімічними імітаторами відповідної природної амінокислоти, а також природних амінокислотних полімерів і неприродних амінокислотних полімерів. Термін "амінокислота" означає природні і синтетичні амінокислоти, а також аналоги і імітатори амінокислот, які функціонують аналогічно природним амінокислотам. Природними амінокислотами є амінокислоти, кодовані генетичним кодом, а також амінокислоти, які пізніше були модифіковані, наприклад, гідроксипролін, гамма-карбоксиглутамат і о-фосфосерин. Термін "аналоги амінокислот" означає сполуки, що мають таку ж основну хімічну структуру, що і природна амінокислота, наприклад, альфа-атом вуглецю, зв'язаний з атомом водню, карбоксильною групою, аміногрупою і R-групою, наприклад, гомосерин, норлейцин, метіонінсульфоксид, метіонінметилсульфоній. Такі аналоги можуть мати модифіковані R-групи (наприклад, норлейцин) або модифіковані пептидні остови, але зберігають основну хімічну структуру, властиву природній амінокислоті. Термін "імітатори амінокислот" означає хімічні сполуки, що мають структуру, яка відрізняється від звичайної хімічної структури амінокислоти, але функціонує аналогічно природній амінокислоті. Термін "консервативно модифіковані варіанти" відноситься як до амінокислотних послідовностей, так і до послідовностей нуклеїнових кислот. Термін "варіанти амінокислот" відноситься до амінокислотних послідовностей. Що стосується конкретних послідовностей нуклеїнових кислот, то консервативно модифіковані варіанти означають нуклеїнові кислоти, кодуючі ідентичні або по суті ідентичні амінокислотні послідовності, або в тих випадках, коли нуклеїнова кислота не кодує амінокислотну послідовність, означають по суті ідентичні або асоційовані (наприклад, природно суміжні) послідовності. Через виродженість генетичного коду більшість білків кодовано великим числом функціонально ідентичних нуклеїнових кислот. Наприклад, всі кодони GCA, GCC, GCG і GCU кодують амінокислоту аланін. Таким чином, в будь-якому положенні, в якому аланін визначається кодоном, такий кодон може бути замінений іншими відповідними кодонами без зміни кодованого поліпептиду. Такі варіанти нуклеїнових кислот є ” мовчазними варіантами", що являють собою один різновид консервативно модифікованих варіантів. Кожна послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, також описує мовчазні варіанти нуклеїнової кислоти. Відомо, що в певному контексті кожен кодон нуклеїнової кислоти (за винятком AUG, який зазвичай є єдиним кодоном для метіоніну, і TGG, який зазвичай є єдиним кодоном для триптофану) може бути модифікований з утворенням функціонально ідентичної молекули. Таким чином, мовчазні варіанти нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, маються на увазі в описаній послідовності відносно продукту експресії, але не відносно фактичних послідовностей зонда. Що стосується амінокислотних послідовностей, то відомо, що окремі заміни, делеції або додавання в послідовності нуклеїнової кислоти, пептиду, поліпептиду або білка, які змінюють, 15 UA 101672 C2 5 10 додають або видаляють одну амінокислоту або невеликий відсоток амінокислот в кодованій послідовності, утворюють "консервативно модифікований варіант", включаючи варіант, в якому зміна являє собою заміну амінокислоти хімічно подібною амінокислотою. У даній галузі добре відомі таблиці консервативних замін, що включають функціонально подібні амінокислоти. (Див., наприклад, таблицю 1). З керівництвом по заміні амінокислот, які, мабуть, є фенотипично мовчазними, можна ознайомитися в публікації Bowie et al., 1990, Science 247:1306-1310. Такі консервативно модифіковані варіанти доповнюють і не виключають поліморфні варіанти, гомологи і алелі по даному винаходу. Консервативні заміни зазвичай включають: 1) аланін (А), гліцин (G); 2) аспарагінову кислоту (D), глутамінову кислоту (Е); 3) аспарагін (N), глутамін (Q); 4) аргінін (R), лізин (К); 5) ізолейцин (I), лейцин (L), метіонін (М), валін (V); 6) фенілаланін (F), тірозин (Y), триптофан (W); 7) серин (S), треонін (Т) і 8) цистеїн (С), метіонін (М) (див., наприклад, публікацію Creighton, Proteins (1984)). Як вказано, зміни зазвичай мають незначний характер, зокрема, консервативні заміни амінокислот, які істотно не впливають на укладання або активність білка. 15 Таблиця 1 Консервативні заміни амінокислот Первинна амінокислота Аланін Аргінін Аспарагін Аспарагінова кислота Цистеїн Глутамін Глутамінова кислота Гліцин Гістидин Ізолейцин Лейцин Лізин Метіонін Фенілаланін Пролін Серин Треонін Триптофан Тирозин Валін 20 25 Типові консервативні заміни Валін, ізолейцин, лейцин, гліцин, серин Лізин, гістидин, глутамін, аспарагін Глутамін, гістидин, лізин, аргінін Глутамінова кислота, аспарагін Серин, аланін, метіонін Аспарагін Аспарагінова кислота, глутамін Пролін, аланін Аспарагін, глутамін, лізин, аргінін Лейцин, валін, метіонін, аланін, фенілаланін, норлейцин Норлейцин, ізолейцин, валін, метіонін, аланін, фенілаланін Аргінін, глутамін, аспарагін, гістидин Лейцин, фенілаланін, ізолейцин, валін, цистеїн Лейцин, валін, ізолейцин, аланін, тірозин Аланін, гліцин Треонін Серин Тирозин, фенілаланін Триптофан, фенілаланін, треонин, серин Ізолейцин, метіонін, лейцин, фенілаланін, аланін, норлейцин Використані в даному описі винаходу і формулі винаходу форми однини включають форми множини з виключенням тих випадків, коли з контексту ясно виходить зворотне. Слід зазначити, що варіанти здійснення винаходу, при описі яких використаний термін "що включає", відповідають варіантам здійснення винаходу, аналогічним у всіх інших відносинах, при описі яких використані терміни "що складається з" та/або "по суті, що складається з". Певні варіанти здійснення даного винаходу Даний винахід відноситься до композицій і способам їх застосування для дослідження, діагностики, характеристики і лікування рака. Зокрема, певні варіанти здійснення даного винаходу відносяться до агентів, що включають антагоністи, які зв'язуються з рецепторами Notch, і до способів застосування вказаних агентів або антагоністів для інгібування зростання пухлини і лікування рака або інших захворювань у людей. У певних варіантах здійснення винаходу антагоністи є антитілами, які специфічно зв'язуються з нелігандзв'язуючою ділянкою позаклітинного домену рецептора Notch людини. 16 UA 101672 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Одним об'єктом даного винаходу є антитіло, яке специфічно зв'язується з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло зв'язується з ділянкою Notch1 людини, що охоплює ділянку приблизно від амінокислоти 1427 до амінокислоти 1732. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло зв'язується з ділянкою, що включає SEQ ID NO:2. У певних варіантах здійснення винаходу антитіло специфічно зв'язується з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену щонайменше одного додаткового рецептора Notch. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло є антагоністом рецептора Notch1 людини. У певних варіантах здійснення винаходу антитіло інгібує індуковану лігандом передачу сигналу по сигнальному шляху Notch1. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло інгібує активність рецептора Notch1. У інших варіантах здійснення винаходу антитіло інгібує розщеплювання рецептора Notch1. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло інгібує розщеплювання рецептора Notch1 на сайті в проксимальній ділянці мембрани позаклітинного домену. У певних варіантах здійснення винаходу антитіло інгібує вивільнення або утворення внутріклітинного домену (ICD) рецептора Notch1. У інших варіантах здійснення винаходу антитіло зменшує онкогенність пухлини, що містить ракові стволові клітини. У певних варіантах здійснення винаходу антитіло інгібує зростання пухлини, що містить ракові стволові клітини. У певних варіантах здійснення винаходу антитіло інгібує зростання пухлини. У певних варіантах здійснення винаходу антитіло, яке специфічно зв'язується з проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини і інгібує зростання пухлини, є моноклональним антитілом. У певних варіантах здійснення винаходу антитіло, яке специфічно зв'язується з проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини, є химерним антитілом, гуманізованим антитілом, людським антитілом, фрагментом антитіла або біспецифічним антитілом. Певні варіанти здійснення винаходу відносяться до гібридоми, що продукує антитіло, яке специфічно зв'язується з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини і інгібує зростання пухлини. Іншим об'єктом винаходу є спосіб інгібування зростання пухлини у суб'єкта, який включає введення вказаному суб'єктові терапевтично ефективної кількості антитіла, яке специфічно зв'язується з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену білка рецептора Notch1 людини. У деяких варіантах здійснення винаходу пухлина містить ракові стволові клітини. У деяких варіантах здійснення винаходу вказані способи включають направлену дію антитілами на ракові стволові клітини. У певних варіантах здійснення винаходу спосіб інгібування зростання пухлини включає введення терапевтично ефективної кількості моноклонального антитіла. У певних варіантах здійснення винаходу спосіб інгібування зростання пухлини включає введення терапевтично ефективної кількості химерного антитіла. У певних варіантах здійснення винаходу спосіб інгібування зростання пухлини включає введення терапевтично ефективної кількості гуманізованого антитіла. У певних варіантах здійснення винаходу спосіб інгібування зростання пухлини включає введення терапевтично ефективної кількості людського антитіла. У певних варіантах здійснення винаходу спосіб інгібування зростання пухлини включає зменшення частоти зустрічальності ракових стволових клітин в пухлині, зменшення числа ракових стволових клітин в пухлині, зменшення онкогенності пухлини та/або зменшення онкогенності пухлини в результаті зменшення числа або частоти зустрічальності ракових стволових клітин в пухлині. У деяких варіантах здійснення винаходу спосіб інгібування зростання пухлини включає інгібування активності рецептора Notch1. У певних варіантах здійснення винаходу пухлина включає, не обмежуючись ними, пухлину молочної залози, колоректальну пухлину, пухлину печінки, пухлину нирки, пухлину легень, пухлину підшлункової залози, пухлину яєчника, пухлину передміхурової залози і пухлину голови і шиї. Іншим об'єктом даного винаходу є спосіб лікування рака у суб'єкта, що потребує такого лікування, який включає введення суб'єктові терапевтично ефективної кількості антитіла, яке специфічно зв'язується з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену білка рецептора Notch1 людини і інгібує зростання пухлини у суб'єкта. У певних варіантах здійснення винаходу спосіб лікування рака включає введення терапевтично ефективної кількості моноклонального антитіла. У певних варіантах здійснення винаходу спосіб лікування рака включає введення терапевтично ефективної кількості химерного антитіла. У певних варіантах здійснення винаходу спосіб лікування рака включає введення терапевтично ефективної кількості гуманізованого антитіла. У певних варіантах здійснення винаходу спосіб лікування рака включає введення терапевтично ефективної кількості людського антитіла. 17 UA 101672 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У певних варіантах здійснення винаходу спосіб лікування рака включає введення терапевтично ефективної кількості антитіла, кон'югованого з цитотоксичною частиною, яке специфічно зв'язується з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини і інгібує зростання пухлини. У певних варіантах здійснення винаходу спосіб лікування рака включає введення терапевтично ефективної кількості антитіла по будь-яких об'єктах та/або варіантах здійснення винаходу, а також по інших об'єктах та/або варіантах здійснення винаходу, розглянутих в даному описі винаходу, в комбінації з променевою терапією. У певних варіантах здійснення винаходу спосіб лікування рака включає введення терапевтично ефективної кількості антитіла по будь-яких об'єктах та/або варіантах здійснення винаходу, а також по інших об'єктах і варіантах здійснення винаходу, розглянутих в даному описі винаходу, в комбінації з хіміотерапією. У певних варіантах здійснення винаходу спосіб лікування рака включає введення терапевтично ефективної кількості антитіла, яке специфічно зв'язується з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини і інгібує зростання пухлини, вибираної з пухлин, які включають, не обмежуючись ними, пухлину молочної залози, колоректальну пухлину, пухлину легень, пухлину підшлункової залози, пухлину передміхурової залози або пухлину голови і шиї. У певних варіантах здійснення винаходу спосіб лікування рака включає виявлення суб'єктів, що потребують такого лікування, за допомогою генетичного тесту з використанням антитіла, яке специфічно зв'язується з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини, і введення таким суб'єктам терапевтично ефективної кількості антитіла. У певних варіантах здійснення винаходу спосіб лікування рака включає виявлення суб'єктів, що потребують такого лікування, за допомогою антитіла, яке специфічно зв'язується з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини, при виконанні генетичного тесту, що дозволяє виявити сигнатуру ракових стволових клітин, і введення терапевтично ефективної кількості антитіла, яке специфічно зв'язується з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини і інгібує зростання пухлини. Іншим об'єктом даного винаходу є спосіб ідентифікації молекули, яка зв'язується з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини і інгібує зростання пухлини, що включає: i) інкубацію молекули з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини; ii) визначення здатності молекули зв'язуватися з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notсh1 людини; та iii) визначення здатності молекули інгібувати зростання пухлини. Певні варіанти здійснення винаходу відносяться до способу ідентифікації молекули, яка зв'язується з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини і інгібує зростання пухлини, що включає: i) інкубацію молекули з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notсh1 людини, що включає SEQ ID NO:2; ii) визначення здатності молекули зв'язуватися з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини, що включає SEQ ID NO:2; та iii) визначення здатності молекули інгібувати зростання пухлини. Певні варіанти здійснення даного винаходу відносяться до фармацевтичної композиції, що включає антитіло, яке специфічно зв'язується з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини і інгібує зростання пухлини. Певні варіанти здійснення даного винаходу відносяться до способу одержання антитіла, яке специфічно зв'язується з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини і інгібує зростання пухлини. Певні варіанти здійснення даного винаходу відносяться до виділеної нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло, яке специфічно зв'язується з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини і інгібує зростання пухлини. У певних варіантах здійснення винаходу антагоністи рецептора Notch, такого як Notch1, діють позаклітинно, інгібуючи або впливаючи на функцію рецептора Notch. У певних варіантах здійснення винаходу антагоніст рецептора Notch є білковим антагоністом. У деяких варіантах здійснення винаходу білкові антагоністи рецептора Notch1 є антитілами, які специфічно зв'язуються з позаклітинним епітопом рецептора Notch1. Позаклітинне зв'язування антагоніста рецептора Notch1 може інгібувати передачу сигналу рецептора Notch шляхом інгібування активації (наприклад, активації кіназою) рецептора Notch1 та/або шляхом стеричного інгібування взаємодії рецептора Notch з одним з його лігандів. Крім того, позаклітинне зв'язування антагоніста рецептора Notch може ослабляти експресію рецептора Notch на 18 UA 101672 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 поверхні клітини, наприклад, в результаті інтерналізації рецептора Notch, та/або зменшувати переміщення рецептора Notch по поверхні клітини. Позаклітинне зв'язування антагоніста з рецептором Notсh може інгібувати розщеплювання рецептора Notch і зменшувати вивільнення ICD рецептора Notch. У деяких варіантах здійснення винаходу антагоністи рецептора Notch зв'язуються з рецептором Notch і надають одну або декілька наступних дій: інгібують проліферацію пухлинних клітин, запускають процес загибелі клітини безпосередньо в пухлинних клітинах або запобігають метастазуванню пухлинних клітин. У певних варіантах здійснення винаходу антагоністи рецептора Notch запускають процес загибелі клітини за допомогою кон'югованого токсину, хіміотерапевтичного засобу, радіоізотопу або іншого подібного агента. Наприклад, антитіло проти рецептора Notch може бути кон'юговано з токсином, який активується в пухлинних клітинах, експресуючих рецептор Notch, в результаті інтерналізації білка. У інших варіантах здійснення винаходу антагоністи рецептора Notch опосередкують загибель клітини, експресуючої рецептор Notch, за допомогою антитілозалежної клітинно-опосередкованої цитотоксичності (ADCC). ADCC викликає лізис клітин ефекторними клітинами, які розпізнають Fc-частину антитіла. Багато лімфоцитів, моноцитів, тканинних макрофагів, гранулоцитів і еозинофілів, наприклад, мають Fc-рецептори і можуть опосередкувати цитоліз (Dillman, 1994, J. Clin. Oncol. 12:1497). У деяких варіантах здійснення винаходу антагоніст рецептора Notch є антитілом, яке запускає процес загибелі клітини, експресуючої рецептор Notch, шляхом активації комплементзалежної цитотоксичності (CDC). Сdc викликає зв'язування сироваткового комплементу з Fc-частиною антитіла і подальшу активацію білкового каскаду комплементу, що приводить до руйнування клітинної мембрани і зрештою до загибелі клітини. Відомо, що біологічна активність антитіл визначається в значній мірі константними доменами або Fcділянкою молекули антитіла (Uananue and Benacerraf, Textbook of Immunology, 2nd Edition, William & Wilkins, р. 218 (1984)). Антитіла різних класів і підкласів відрізняються в цьому відношенні так само, як антитіла одного і того ж підкласу, але з різних видів. З людських антитіл IgM є найбільш ефективним класом антитіл, зв'язуючих комплемент, а після нього IgG1, IgG3 та IgG2, при цьому IgG4, мабуть, володіє недостатньою активністю для активації шляху активації комплементу (Dillman, 1994, J. Clin. Oncol. 12:1497; Jefferis et al., 1998, Immunol. Rev. 163:59-76). Відповідно до даного винаходу отримують антитіла вказаних класів, що володіють необхідною біологічною активністю. Можна досліджувати здатність будь-якого конкретного антитіла проти рецептора Notch опосередкувати лізис клітини-мішені шляхом активації комплементу та/або ADCC. Клітини, що представляють інтерес, вирощують і мітять in vitro; антитіло додають до культури клітин в комбінації з сироватковим комплементом або імунокомпетентними клітинами, які можуть бути активовані комплексами антиген-антитіло. Цитоліз клітин-мішеней визначають, наприклад, по вивільненню мітки з лізованих клітин. Фактично антитіла можна досліджувати, використовуючи власну сироватку суб'єкта як джерело комплементу та/або імунокомпетентних клітин. Антитіло, здатне активувати комплемент або опосередкувати ADCC при дослідженні in vitro, може бути використане в терапевтичних цілях для лікування конкретного суб'єкта. У певних варіантах здійснення винаходу агент або антагоніст, що зв'язується з рецептором Notch, є антитілом, яке не володіє однією або декількома ефекторними функціями. Наприклад, в деяких варіантах здійснення винаходу антитіло не володіє антитілозалежною клітинноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC) та/або комплементзалежною цитотоксичністю (CDC). У певних варіантах здійснення винаходу антитіло не зв'язується з Fc-рецептором та/або чинниками комплементу. У певних варіантах здійснення винаходу антитіло не володіє ефекторною функцією. У інших варіантах здійснення винаходу антагоністи рецептора Notch можуть побічно запускати процес загибелі клітини, інгібуючи розвиток кровоносних судин. Розвиток кровоносних судин являє собою процес утворення нових кровоносних судин з раніше існуючих судин і є основним процесом, необхідним для нормального зростання, наприклад, під час розвитку ембріона, загоєння ран і у відповідь на овуляцію. Зростання солідної пухлини більш ніж на 1-2 2 мм також вимагає розвитку кровоносних судин для доставки живильних речовин і кисню, без яких пухлинні клітини гинуть. Таким чином, в певних варіантах здійснення винаходу антагоніст рецептора Notch спрямовано впливає на клітини судин, експресуючі рецептор Notch, які включають, наприклад, ендотеліальні клітини, гладком'язові клітини або компоненти позаклітинного матриксу, необхідні для утворення судин. У інших варіантах здійснення винаходу антагоніст рецептора Notch інгібує передачу сигналу чинника зростання, необхідну для рекрутинга, збирання, збереження або виживання клітин судин. 19 UA 101672 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід відноситься до різних поліпептидів, які включають, не обмежуючись ними, антитіла і фрагменти антитіл. У певних варіантах здійснення винаходу поліпептид є виділеним поліпептидом. У певних альтернативних варіантах здійснення винаходу поліпептид є по суті чистим. У певних варіантах здійснення винаходу поліпептиди по даному винаходу можуть бути рекомбінантними поліпептидами, природними поліпептидами або синтетичними поліпептидами, що включають послідовність SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28 або SEQ ID NO:32 (за наявності або відсутності вказаних сигнальних послідовностей). Даний винахід відноситься до поліпептиду, що включає важкий ланцюг та/або легкий ланцюг відповідно в SEQ ID NO:10 і SEQ ID NO:4 (за наявності або відсутності вказаних передбачуваних сигнальних послідовностей). У певних варіантах здійснення винаходу поліпептид є антитілом. У певних варіантах здійснення винаходу поліпептид специфічно зв'язується з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини. Даний винахід далі відноситься до поліпептиду, що включає SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:28 або SEQ ID NO:32 та/або SEQ ID NO:14 або SEQ ID NO:24. У певних варіантах здійснення винаходу поліпептид включає послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає SEQ ID NO:8, і послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, що включає SEQ ID NO:14. У певних варіантах здійснення винаходу поліпептид включає послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає SEQ ID NO:28, і послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, що включає SEQ ID NO:24. У певних варіантах здійснення винаходу поліпептид включає послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає SEQ ID NO:32, і послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, що включає SEQ ID NO:24. У певних варіантах здійснення винаходу поліпептид є антитілом. У певних варіантах здійснення винаходу поліпептид специфічно зв'язується з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини. У даній галузі відомо, що деякі амінокислотні послідовності по даному винаходу можуть бути змінені без істотного впливу на структуру або функцію білка. При внесенні таких змін в послідовності слід пам'ятати, що в білку є важливі ділянки, що визначають активність. Таким чином, в об'єм даного винаходу далі входять варіанти поліпептидів, що володіють значною активністю. Такі мутанти включають делеції, інсерції, інверсії, повтори і заміни. Ознайомитися із замінами амінокислот, які, мабуть, є фенотипічно мовчазними, можна в публікації Bowie, J.U., et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions.” Sience 1990, 247:1306-1310. Таким чином, фрагменти, похідні або аналоги поліпептидів по даному винаходу можуть бути такими фрагментами, похідними або аналогами, в яких: (i) один або декілька амінокислотних залишків замінено консервативними або неконсервативними амінокислотними залишками (часто консервативним амінокислотним залишком), і такий замінений амінокислотний залишок може бути або не бути залишком, кодованим генетичним кодом; або (ii) один або декілька амінокислотних залишків включають замінну групу; або (iii) зрілий поліпептид гібридизований з іншою сполукою, такою як сполука, що збільшує час напівжиття поліпептиду (наприклад, поліетиленгліколь); або (iv) додаткові амінокислоти гібридизовані із зрілим поліпептидом, наприклад, з лідерною або секреторною послідовністю або послідовністю, використовуваною для очищення зрілого поліпептиду або пробілковою послідовністю. Вважається, що такі фрагменти, похідні і аналоги входять в об'єм даного винаходу. Особливий інтерес представляють заміни заряджених амінокислот іншою зарядженою амінокислотою і нейтральними або негативно зарядженими амінокислотами. Останні амінокислоти дозволяють отримати білки з меншим позитивним зарядом. Вельми бажано запобігти агрегації білків. Агрегація білків не лише викликає втрату активності, але також створює проблеми при одержанні фармацевтичних препаратів, оскільки такі агрегати можуть бути імуногенними. (Pinckard et al., Clin. Exp. Immunol. 1967, 2:331-340; Robbins et al., Diabetes 1987, 36:838-845; Cleland et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 1993, 10:307-377). Число виконаних замін амінокислот, звичайно, залежить від багатьох чинників, включаючи чинники, вказані в даному описі винаходу. У певних варіантах здійснення винаходу число замін для будь-якого даного поліпептиду не повинне перевищувати 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10 або 3. Поліпептиди по даному винаходу включають поліпептиди SEQ ID NO:14, а також поліпептиди, які щонайменше на 90 % подібні (у певних випадках послідовності ідентичні щонайменше на 90 %) до поліпептидів SEQ ID NO:14 і щонайменше на 95 % подібні (у певних випадках послідовності ідентичні щонайменше на 95 %) до поліпептидів SEQ ID NO:14, і в інших варіантах здійснення винаходу поліпептиди, які щонайменше на 96 %, 97 %, 98 % або 99 % 20 UA 101672 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 подібні (у певних випадках послідовності ідентичні на 96 %, 97 %, 98 % або 99 %) до поліпептидів SEQ ID NO:14. Поліпептиди по даному винаходу включають поліпептиди SEQ ID NO:8, а також поліпептиди, які щонайменше на 90 % подібні (у певних випадках послідовності ідентичні щонайменше на 90 %) до поліпептидів SEQ ID NO:8 і щонайменше на 95 % подібні (у певних випадках послідовності ідентичні щонайменше на 95 %) до поліпептидів SEQ ID NO:8, і в інших варіантах здійснення винаходу поліпептиди, які щонайменше на 96 %, 97 %, 98 % або 99 % подібні (у певних випадках послідовності ідентичні на 96 %, 97 %, 98 % або 99 %) до поліпептидів SEQ ID NO:8. Як відомо у даній галузі, "подібність" двох поліпептидів визначають, порівнюючи амінокислотну послідовність і консервативні заміни амінокислот одного поліпептиду з послідовністю другого поліпептиду. Фрагменти або частини поліпептидів по даному винаходу можуть бути використані для отримання відповідного непроцесованого поліпептиду методом синтезу пептидів; тому фрагменти можуть бути використані як проміжні продукти для одержання непроцесованих поліпептидів. Фрагменти або частини полінуклеотидів по даному винаходу можуть бути використані для синтезу непроцесованих полінуклеотидів по даному винаходу. У певних варіантах здійснення винаходу фрагмент білків по даному винаходу є частиною або всім білком, здатним зв'язуватися з білком рецептора Notch1. Вказаний фрагмент володіє високою афінністю до рецептора Notch або ліганду рецептора Notch1. Певні фрагменти злитих білків є фрагментами білків, що включають щонайменше частину зв'язуючого домену Notch поліпептидного агента або антагоніста, гібридизованого щонайменше з частиною константної 11 12 ділянки імуноглобуліну. Афінність зазвичай знаходиться в межах від близько 10- до 10- М, хоча значення афінності може значно змінюватися при використанні фрагментів різної величини 7 13 в межах від 10- до 10- М. В деяких варіантах здійснення винаходу фрагмент складається приблизно з 10-110 амінокислот і включає зв'язуючий домен Notch поліпептидного агента або антагоніста, зв'язаного щонайменше з частиною константної ділянки імуноглобуліну. Поліпептиди і аналоги можуть бути далі модифіковані шляхом введення додаткових хімічних частин, які зазвичай не є частиною білка. Похідні частини можуть покращувати розчинність, біологічний час напівжиття та/або абсорбцію білка. Вказані частини можуть також зменшувати або усувати будь-які небажані побічні ефекти білка і тому подібні. З оглядом хімічних частин можна ознайомитися в публікації Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000). Виділені поліпептиди, розглянуті в даному описі винаходу, можуть бути отримані будь-яким прийнятним методом, відомим в даній галузі. Такими методами є будь-які методи від прямого синтезу білків до створення послідовності ДНК, що кодує виділені поліпептидні послідовності, і експресії таких послідовностей в прийнятному трансформованому хазяїні. Деякі варіанти здійснення винаходу відносяться до методу рекомбінантних ДНК, відповідно до якого послідовність ДНК отримують, виділяючи або синтезуючи послідовність ДНК, кодуючої білок дикого типу, що становить інтерес. Така послідовність може бути необов'язково піддана сайт-специфічному мутагенезу з утворенням її функціональних аналогів. Див., наприклад, публікацію Zoeller et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1984, 81:5662-5066 і патент США № 4588585. Іншим методом створення послідовності ДНК, кодуючої поліпептид, що становить інтерес, є хімічний синтез в синтезаторі олігонуклеотидів. Такі олігонуклеотиди можуть бути створені на основі амінокислотної послідовності необхідного поліпептиду з вибором тих кодонів, які личать для клітини-хазяїна, в якій буде продукований рекомбінантний поліпептид, що становить інтерес. Стандартні методи можуть бути використані для синтезу виділеної полінуклеотидної послідовності, кодуючої виділений поліпептид, що становить інтерес. Наприклад, повна амінокислотна послідовність може бути використана для створення гена, трансльованого у зворотному напрямі. Крім того, може бути синтезований олігомер ДНК, що містить нуклеотидну послідовність, кодуючу конкретний виділений поліпептид. Наприклад, можна синтезувати і потім лігувати декілька дрібних олігонуклеотидів, кодуючих частини необхідного поліпептиду. Окремі олігонуклеотиди зазвичай містять 5'- або 3'-кінцеві сегменти, що перекриваються, для комплементарного збирання. Зібрані (шляхом синтезу, сайтнаправленого мутагенезу або іншим методом) мутанті послідовності ДНК, кодуючі певний виділений поліпептид, що становить інтерес, вводять в експресуючий вектор і функціонально зв'язують з регулюючою експресію послідовністю, придатною для експресії білка в бажаному хазяїні. Правильність збирання можна підтвердити шляхом секвенування нуклеїнової кислоти, рестрикційного картування і експресії біологічно активного поліпептиду в прийнятному хазяїні. Як добре відомо в даній галузі, для отримання високих рівнів експресії трансфікованого гена в хазяїні вказаний ген функціонально зв'язують з 21 UA 101672 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 транскрипційними і трансляційними послідовностями, що регулюють експресію, які є функціонально активними у вибраному експресуючому хазяїні. Даний винахід відноситься до виділених антитіл проти нелігандзв'язуючої проксимальної ділянки мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1. Антитіло або фрагмент антитіла може бути будь-яким моноклональним або поліклональним антитілом, яке специфічно розпізнає проксимальну ділянку мембрани позаклітинного домену Notch1. Деякі варіанти здійснення винаходу відносяться до моноклональних антитіл або їх фрагментів, які специфічно зв'язуються з проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини по даному винаходу. У деяких варіантах здійснення винаходу моноклональні антитіла або їх фрагменти є химерними або гуманізованими антитілами, які специфічно зв'язуються з проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини по даному винаходу. У інших варіантах здійснення винаходу моноклональні антитіла або їх фрагменти є людськими антитілами, які специфічно зв'язуються з проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини по даному винаходу. Антитіла проти проксимальної ділянки мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 знаходять застосування в експериментальних, діагностичних і терапевтичних методах, розглянутих в даному описі винаходу. У певних варіантах здійснення винаходу антитіла по даному винаходу використовують для виявлення експресії рецептора Notch1 в біологічних зразках, таких як, наприклад, біопсійна тканина суб'єкта, плевральний випіт або проба крові. З біопсійної тканини можуть бути отримані гістологічні зрізи, використовувані для виявлення білка за допомогою імунофлуоресценції або імуногістохімії. Альтернативно із зразка можуть бути виділені окремі клітини і використані для виявлення експресії білка на фіксованих або живих клітинах за допомогою аналізу FACS. Крім того, антитіла можуть бути використані на білкових матрицях для виявлення експресії рецептора Notch1, наприклад, на пухлинних клітинах, в клітинних лізатах або в інших зразках білка. У інших варіантах здійснення винаходу антитіла по даному винаходу використовують для інгібування зростання пухлинних клітин, здійснюючи контактування антитіл з пухлинними клітинами при виконанні клітинних аналізів in vitro або в тваринних моделях in vivo. У інших варіантах здійснення винаходу антитіла використовують для лікування рака у людини шляхом введення терапевтично ефективної кількості антитіла проти проксимальної ділянки мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1. Поліклональні антитіла можуть бути отримані будь-яким відомим методом. Поліклональні антитіла утворюються в результаті імунізації тварини (наприклад, кролика, щура, миші, кози, осла і т.д.) шляхом декількох підшкірних або внутрішньоочеревинних ін'єкцій спорідненного антигена (очищеного пептидного фрагмента, непроцесованного рекомбінантного білка, злитого білка і т.д.), необов'язково кон'югованого з гемоціанином лімфи равлика (KLН), сироватковим альбуміном і т.д., розведеного в стерильному фізіологічному розчині і об'єднаного з ад'ювантом (наприклад, з повним або неповним ад'ювантом Фрейнда) з утворенням стійкої емульсії. Поліклональне антитіло потім виділяють з крові, асцитичної рідини і подібних рідин імунізованої тварини. Отриману кров коагулюють, сироватку декантують, очищають центрифугуванням і аналізують відносно титру антитіл. Поліклональні антитіла можуть бути очищені від сироватки або асцитичної рідини стандартними методами, відомими в даній галузі, які включають афінну хроматографію, іонообмінну хроматографію, гель-електрофорез, діаліз і т.д. Моноклональні антитіла можуть бути отримані методами гібридом, описаними в публікації Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497. При використанні методу гібридом мишу, хом'яка або інше прийнятне тварину-хазяїна імунізують вищеописаним методом для продукування лімфоцитами антитіл, які специфічно зв'язуються з імунізуючим антигеном. Альтернативно лімфоцити можуть бути імунізовані in vitro. Після імунізації лімфоцити виділяють і гібридизують з прийнятною лінією мієломних клітин, використовуючи, наприклад, поліетиленгліколь, для утворення клітин гібридоми, які потім можуть бути відокремлені від негібридизованих лімфоцитів і мієломних клітин. Гібридоми, що продукують моноклональні антитіла, специфічно направлені проти вибраного антигену, при визначенні методом імунопреципітації, імуноблотингу або конкурентно-зв'язуючого аналізу in vitro, такого як радіоімуноаналіз (RIA) або твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA), потім можуть бути розмножені стандартними методами культивування in vitro (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986) або in vivo у вигляді асцитичних пухлин у тварини. Моноклональні антитіла потім можуть бути очищені від культурального середовища або асцитичної рідини методами, описаними вище для поліклональних антитіл. У деяких варіантах здійснення даного винаходу антитіло є антитілом, яке специфічно зв'язується з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло включає 22 UA 101672 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіабельну ділянку важкого ланцюга, послідовність якого щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO:14; та/або варіабельну ділянку легкого ланцюга, послідовність якого щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO:8. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло включає варіабельну ділянку важкого ланцюга, послідовність якого щонайменше на 95 % ідентична SEQ ID NO:14; та/або варіабельну ділянку легкого ланцюга, послідовність якого щонайменше на 95 % ідентична SEQ ID NO:8. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло є моноклональним антитілом або фрагментом антитіла. Певні варіанти здійснення винаходу відносяться до антитіла, яке зв'язується з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини і містить CDR1 важкого ланцюга, що включає RGYWIE (SEQ ID NO:15), CDR2 важкого ланцюга, що включає QILPGTGRTNYNEKFKG (SEQ ID NO:16), та/або CDR3 важкого ланцюга, що включає FDGNYGYYAMDY (SEQ ID NO:17). У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло далі містить CDR1 легкого ланцюга, що включає RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:18), CDR2 легкого ланцюга, що включає GTNNRAP (SEQ ID NO:19), та/або CDR3 легкого ланцюга, що включає ALWYSNHWVFGGGTKL (SEQ ID NO:20). У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло містить CDR1 важкого ланцюга, що включає RGYWIE (SEQ ID NO:15), CDR2 важкого ланцюга, що включає QILPGTGRTNYNEKFKG (SEQ ID NO:16), та/або CDR3 важкого ланцюга, що включає FDGNYGYYAMDY (SEQ ID NO:17); і CDR1 легкого ланцюга, що включає RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:18), CDR2 легкого ланцюга, що включає GTNNRAP (SEQ ID NO:19), та/або CDR3 легкого ланцюга, що включає ALWYSNHWVFGGGTKL (SEQ ID NO:20). У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що включає: (а) CDR1 важкого ланцюга, що включає RGYWIE (SEQ ID NO:15), або його варіант, що включає заміни 1, 2, 3 або 4 амінокислот; (b) CDR2 важкого ланцюга, що включає QILPGTGRTNYNEKFKG (SEQ ID NO:16), або його варіант, що включає заміни 1, 2, 3 або 4 амінокислот; та/або (с) CDR3 важкого ланцюга, що включає FDGNYGYYAMDY (SEQ ID NO:17), або його варіант, що включає заміни 1, 2, 3 або 4 амінокислот. У інших варіантах здійснення винаходу антитіло містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що включає: (а) CDR1 легкого ланцюга, що включає RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:18), або його варіант, що включає заміни 1, 2, 3 або 4 амінокислот; (b) CDR2 легкого ланцюга, що включає GTNNRAP (SEQ ID NO:19), або його варіант, що включає заміни 1, 2, 3 або 4 амінокислот; та/або (с) CDR3 легкого ланцюга, що включає ALWYSNHWVFGGGTKL (SEQ ID NO:20), або його варіант, що включає заміни 1, 2, 3 або 4 амінокислот. У деяких варіантах здійснення винаходу заміни амінокислот є консервативними замінами амінокислот. Деякі варіанти здійснення винаходу відносяться до антитіла 52М51, продукованому лінією клітин гібридоми, депонованої в АТСС згідно з положеннями Будапештського договору 7 серпня 2008 р. під номером РТА-9405. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло є гуманізованим варіантом антитіла 52М51. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло є гуманізованим варіантом антитіла 52М51 "52M51H4L3", кодованим ДНК, депонованою в АТСС згідно з положеннями Будапештського договору 15 жовтня 2008 р. під номером РТА-9549. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло є гуманізованим варіантом антитіла 52М51 "52M51H4L4". Деякі варіанти здійснення винаходу відносяться до антитіла, яке зв'язується з тим же епітопом, з яким зв'язується антитіло 52М51. Інші варіанти здійснення винаходу відносяться до антитіла, яке конкурує з будь-якими антитілами, описаними в розглянутих вище варіантах здійснення винаходу та/або об'єктах, а також в інших об'єктах/варіантах здійснення винаходу, представлених в даному описі винаходу, за специфічне зв'язування з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини. Даний винахід відноситься також до фармацевтичних композицій, що містять антитіла по даному винаходу, і до способів лікування рака, які включають введення терапевтично ефективної кількості вказаних антитіл. Деякі варіанти здійснення винаходу відносяться до антитіла 52R43, кодованому ДНК, депонованою в АТСС згідно з положеннями Будапештського договору 15 жовтня 2008 р. під номером РТА-9548. Деякі варіанти здійснення винаходу відносяться до антитіла, яке зв'язується з тим же епітопом, з яким зв'язується антитіло 52R43. Деякі варіанти здійснення винаходу відносяться до антитіла, яке включає одну, дві, три, чотири, п'ять та/або шість CDR-ділянок антитіла 52R43. Інші варіанти здійснення винаходу відносяться до антитіла, яке конкурує з антитілом 52R43. Даний винахід відноситься також до фармацевтичних композицій, що містять антитіла по даному винаходу, і до способів лікування рака, які включають введення терапевтично ефективної кількості вказаних антитіл. Альтернативно моноклональні антитіла можуть бути також отримані методами рекомбінантних ДНК, описаними в патенті США № 4816567. Полінуклеотиди, кодуючі 23 UA 101672 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 моноклональне антитіло, виділяють із зрілих в-клітин або клітин гібридоми за допомогою ПЦР із зворотною транскрипцією (RT-ПЦР), використовуючи олігонуклеотидні затравки, які специфічно ампліфікують гени, кодуючі важкий і легкий ланцюги антитіла, при визначенні їх послідовності стандартними методами. Виділені полінуклеотиди, кодуючі важкий і легкий ланцюги, потім клонують в прийнятні експресуючі вектори, які трансфікують в клітини-хазяїні, такі як клітини E. coli, клітини COS мавп, клітини яєчника китайського хом'яка (СНО) або мієломні клітини, які інакше не продукують білок імуноглобуліну. Клітини-хазяї досліджують відносно продукування моноклонального антитіла і відбирають антитіла з необхідною специфічністю. Крім того, рекомбінантні моноклональні антитіла або їх фрагменти необхідного вигляду можуть бути виділені з бібліотек відображення на фагі, описаних в науковій літературі (McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al., 1991, Naturе, 352:624-628; and Мarks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597). Полінуклеотиди, кодуючі моноклональне антитіло, можуть бути далі модифіковані різними методами рекомбінантних ДНК з метою створення альтернативних антитіл. У деяких варіантах здійснення винаходу константні домени легкого і важкого ланцюгів, наприклад, мишачого моноклонального антитіла можуть бути замінені 1) такими ж ділянками людського антитіла з утворенням химерного антитіла або 2) поліпептидом, що не є імуноглобуліном, з утворенням гібридного антитіла. У інших варіантах здійснення винаходу константні ділянки усікають або видаляють з утворенням необхідного фрагмента моноклонального антитіла. Крім того, для оптимізації специфічності, афінності і т.д. моноклонального антитіла може бути використаний сайтнаправлений або високощільний мутагенез варіабельної ділянки. Як правило, модифіковані антитіла, придатні для використання в даному винаході, можуть бути отримані або виділені з будь-якого антитіла. Вихідне антитіло або антитіло-попередник або його фрагмент, використовуваний для створення модифікованих антитіл, може бути мишачим, людським, химерним, гуманізованим антитілом, антитілом примату окрім людини або приматизованим антитілом. У інших варіантах здійснення винаходу модифіковані антитіла по даному винаходу можуть включати конструкції одноланцюгових антитіл (описані в патенті США № 5892019, який включений в даний опис винаходу як посилання), що містять змінені константні домени, розглянуті в даному описі винаходу. У об'єм даного винаходу входять будьякі з вказаних типів антитіл, модифікованих відповідно до даного опису винаходу. Відповідно до даного винаходу методи можуть бути адаптовані для продукування одноланцюгових антитіл, специфічних до поліпептиду по даному винаходу (див. патент США № 4946778). Крім того, методи можуть бути адаптовані для створення Fab-експресуючих бібліотек (Huse et al., 1989, Science, 246:1275-1281), що забезпечують швидку і ефективну ідентифікацію моноклональних Fab-фрагментів з необхідною специфічністю відносно рецептора Notch або його похідних, фрагментів, аналогів або гомологів. Фрагменти антитіл, що містять ідіотипи для поліпептиду по даному винаходу, можуть бути отримані методами, відомими в даній галузі, і включають, не обмежуючись ними: (в) F(ab') 2-фрагмент, отриманий шляхом розщеплювання молекули антитіла пепсином; (b) Fab-фрагмент, отриманий шляхом відновлення дисульфідних містків F(ab')2-фрагмента, (с) Fab-фрагмент, отриманий шляхом обробки молекули антитіла папаїном і відновником, і (d) Fv-фрагменти. Біспецифічні антитіла також входять в об'єм даного винаходу. Біспецифічні антитіла є моноклональними, переважно людськими або гуманізованими, антитілами, які володіють специфічністю зв'язування щонайменше з двома різними антигенами. У даній галузі відомі методи отримання біспецифічних антитіл. Наприклад, в даному випадку одна із специфічностей зв'язування відноситься до антигенного поліпептиду по даному винаходу (рецептор Notch1 або його фрагмент), тоді як другою мішенню зв'язування є будь-який інший антиген, який переважно є білком на поверхні клітини, рецептором або субодиницею рецептора. Одержання біспецифічних антитіл рекомбінантними методами засноване на коекспресії двох пар важкого ланцюга/легкого ланцюга імуноглобуліну, в яких два важкі ланцюги володіють різними специфічностями (Milstein and Cuello, Nature 1983, 305:537-539). Завдяки довільному вибору важких і легких ланцюгів імуноглобуліну вказані гібридоми (квадроми) продукують потенційну суміш десяти різних молекул антитіла, з яких лише одна має правильну біспецифічну структуру. Правильну молекулу зазвичай очищають за допомогою афінної хроматографії. Варіабельні домени антитіла з потрібними специфічностями зв'язування можуть бути гібридизовані з послідовностями константних доменів імуноглобуліну. Гібридизацію виробляють з константним доменом важкого ланцюга імуноглобуліну, що включає щонайменше частину шарнірної ділянки, Сн2 та Сн3 ділянок. Перша константна ділянка (Сн1) важкого ланцюга, що містить сайт, необхідний для зв'язування легкого ланцюга, може бути присутньою щонайменше 24 UA 101672 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 в одному з гібридів. ДНК, кодуючу гібриди важкого ланцюга імуноглобуліну, і за бажання легкий ланцюг імуноглобуліну, вводять в окремі експресуючі вектори і котрансфікують в прийнятний організм-хазяїн. Детальніший опис створення біспецифічних антитіл приведений в публікації Suresh et al., Mеthods ion Enzymology 1986, 121:210. Біспецифічні антитіла можуть бути отримані у вигляді непроцесованих антитіл або фрагментів антитіл. У науковій літературі описані методи одержання біспецифічних антитіл з фрагментів антитіл. Наприклад, біспецифічні антитіла можуть бути отримані шляхом хімічного зв'язування. Крім того, в публікації Brennan et al., Science 1985, 229:81 описаний метод протеолітичного розщеплювання інтактних антитіл з утворенням F(ab") 2-фрагментів. Крім того, Fab'-фрагменти можуть бути безпосередньо виділені з E. coli і хімічно зв'язані з утворенням біспецифічних антитіл (Shalaby et al., J. Exp. Med. 1992, 175:217-225). Вказані методи можуть бути використані для одержання молекули F(ab')2 повністю гуманізованого біспецифічного антитіла. У об'єм даного винаходу також входять антитіла з більш ніж двома валентностями. Наприклад, можуть бути отримані триспецифічні антитіла (Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60). Даний винахід також відноситься до біспецифічних антитіл, які розпізнають проксимальну ділянку мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1. Біспецифічні антитіла є антитілами, здатними специфічно розпізнавати і зв'язуватися щонайменше з двома різними епітопами. Різні епітопи можуть знаходитися в одній молекулі (наприклад, в одному рецепторі Notch1) або в різних молекулах, при цьому, наприклад, антитіла можуть специфічно розпізнавати і зв'язуватися з рецептором Notch1, а також з 1) ефекторною молекулою на лейкоциті, такою як Т-клітинний рецептор (наприклад, CD3) або Fc-рецептор (наприклад, CD64, CD32 або CD16) або 2) цитотоксичним агентом, детально описаним нижче. Біспецифічні антитіла можуть бути інтактними антитілами або фрагментами антитіл. У даній галузі відомі методи одержання біспецифічних антитіл (Millstein et al., 1983, Nature, 305:537-539; Brennan et al., 1985, Science, 229:81; Suresh et al, 1986, Methods in Enzymol, 121:120; Traunecker et al., 1991„,EMBOJ 10:3655-3659; Shalaby et al., 1992,/. Exp. Med., 175:217-225; Kostelny et al., 1992, J. Immunol., 148:1547-1553; Gruberetal., 1994,/. Immunol., 152:5368; і патент США № 5731168). Типові біспецифічні антитіла можуть зв'язуватися з двома різними епітопами, при цьому щонайменше один з епітопів знаходиться в поліпептиді по даному винаходу. Альтернативно антигензв'язуючий домен молекули імуноглобуліну може бути об'єднаний з доменом, що зв'язується із запускаючою молекулою на лейкоциті, такою як молекула Т-клітинного рецептора (наприклад, CD2, CD3, CD28 або В7) або Fc-рецептори для IgG, з тим, щоб сфокусувати механізми захисту клітини на клітині, експресуючої конкретний антиген. Біспецифічні антитіла можуть бути також використані для доставки цитотоксичних агентів до клітин, експресуючих певний антиген. Вказані антитіла містять антигензв'язуючий домен і домен, який зв'язує цитотоксичний агент або хелатор, мічений радіоізотопом, такий як EOTUBE, DPTA, DOTA або TETA. У об'єм даного винаходу входять також гетерокон'югатні антитіла. Гетерокон'югатні антитіла складаються з двох ковалентно зв'язаних антитіл. Такі антитіла, наприклад, було запропоновано використовувати для направленої дії імунокомпетентних клітин на небажані клітини (патент США № 4676980). Такі антитіла можуть бути отримані in vitro відомими методами хімії синтезу білків з використанням перехреснозшивальних агентів. Наприклад, імунотоксини можуть бути створені в результаті виконання реакції дисульфідного обміну або утворення тіоефірного зв'язку. Приклади реагентів, придатних для вказаної мети, включають імінотіолат і метил-4-меркаптобутиримідат. Відповідно до цілей даного винаходу слід зазначити, що модифіковані антитіла можуть включати варіабельну ділянку будь-якого типу, яка забезпечує зв'язування антитіла з проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notсh1. У даному зв'язку варіабельна ділянка може бути отримана у ссавця будь-якого типу, в якого може бути викликана гуморальна відповідь і утворені імуноглобуліни проти необхідного опухолеспецифічного антигену. Варіабельна ділянка модифікованих антитіл може, наприклад, належати людині, миші, примату окрім людини (наприклад, мавпам Cynomolgus, макакам і т.д.), або може бути виділена з люпину. У деяких варіантах здійснення винаходу, як варіабельна ділянка, так і константна ділянка модифікованих імуноглобулінів належить людині. У інших варіантах здійснення винаходу варіабельні ділянки сумісних антитіл (зазвичай отримані з джерела, відмінного від людини) можуть бути створені або специфічно скомбіновані для поліпшення властивостей зв'язування або зменшення імуногенності молекули. У даному зв'язку варіабельні ділянки, придатні для використання в даному винаході, можуть бути гуманізовані або змінені яким-небудь іншим чином шляхом включення перенесених амінокислотних послідовностей. 25 UA 101672 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У деяких варіантах здійснення даного винаходу моноклональне антитіло проти проксимальної ділянки мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 є гуманізованим антитілом. Гуманізовані антитіла є антитілами, що містять у варіабельних ділянках мінімальні послідовності з антитіл, відмінних від людських (наприклад, мишачих антитіл). Такі антитіла використовують в терапевтичних цілях для зменшення антигенності і реакцій НАМА (людського антитіла проти мишачого антитіла) при введенні людині. На практиці гуманізовані антитіла зазвичай є людськими антитілами з мінімальним числом або повною відсутністю послідовностей, відмінних від людських. Людське антитіло є антитілом, продукованим людиною, або антитілом, що має амінокислотну послідовність, відповідну антитілу, продукованому людиною. Гуманізовані антитіла можуть бути отримані різними методами, відомими в даній галузі. Антитіло може бути гуманізоване шляхом заміни CDR людського антитіла такою ж ділянкою антитіла, відмінного від людського (наприклад, миші, щура, кролика, хом'яка і т. д.), що володіє необхідною специфічністю, афінністю та/або потенціалом (Jones et al., 1986, Nature, 321:522535; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536). Гуманізоване антитіло може бути далі модифіковане шляхом введення додаткового залишку в остовну Fv-ділянку та/або в замінені залишки, відмінні від людських, для поліпшення і оптимізації специфічності, афінності та/або потенціалу антитіла. У деяких варіантах здійснення даного винаходу антитіло є гуманізованим антитілом, яке специфічно зв'язується з нелігандзв'язуючою проксимальною ділянкою мембрани позаклітинного домену рецептора Notch1 людини. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло включає варіабельну ділянку важкого ланцюга, послідовність якого щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO:24; та/або варіабельну область легкого ланцюга, послідовність якого щонайменше на 90 % ідентична SEQ ID NO:28 або SEQ ID NO:32. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіло включає варіабельну ділянку важкого ланцюга, послідовність якого щонайменше на 95 % ідентична SEQ ID NO:24, та/або варіабельну ділянку легкого ланцюга, послідовність якого щонайменше на 95 % ідентична SEQ ID NO:28 або SEQ ID NO:32. У деяких варіантах здійснення винаходу гуманізоване антитіло включає варіабельну ділянку важкого ланцюга SEQ ID NO:24 і варіабельну ділянку легкого ланцюга SEQ ID NO:28. У деяких варіантах здійснення винаходу гуманізоване антитіло включає варіабельну ділянку важкого ланцюга SEQ ID NO:24 і варіабельну ділянку легкого ланцюга SEQ ID NO:32. Людські антитіла можуть бути отримані різними методами, відомими в даній галузі. Можуть бути створені іморталізовані В-лімфоцити людини, імунізовані in vitro або виділені у імунізованого суб'єкта, що продукує антитіло проти антигена-мішені (див., наприклад, публікації Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, р. 77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol. 147(1):86-95; і патент США № 5750373). Крім того, людське антитіло може бути вибране з бібліотеки фагів, експресуючої людські антитіла (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581). Гуманізовані антитіла можуть бути також отримані у трансгенних мишей, що містять локуси імуноглобуліну людини, які здатні в результаті імунізації продукувати повний спектр людських антитіл без продукування ендогенного імуноглобуліну. Наприклад, в науковій літературі описано, що гомозиготна делеція гена сполучної ділянки (JH) важкого ланцюга антитіла у химерних і гаметичних мутантних мишей викликає повне інгібування продукування ендогенних антитіл. Перенесення гаметичного гена імуноглобуліну людини гаметичним мутантним мишам викликає продукування людських антитіл при антигенній стимуляції. (Див., наприклад, публікації Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551; Jakobovits et al., 1993, Nature, 362:255-258; Bruggemann et al., 1993, Year in Immuno. 7:33; патенти США №№ 5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425 і 5661016. Альтернативно для продукування людських антитіл і фрагментів антитіл in vitro з набору генів варіабельного (V) домену імуноглобуліну, отриманого у неімунізованих донорів, може бути використаний метод відображення на фагі. Відповідно до даного методу гени V-домену антитіла клонують в рамці в ген мажорного або мінорного білка оболонки нитчастого бактеріофага, такого як М13 або fd, і відображують у вигляді функціональних фрагментів антитіла на поверхні фагової частки. Оскільки нитчаста частка містить копію одноланцюгової ДНК генома фага, вибір на основі функціональних властивостей антитіла дозволяє також вибрати ген, кодуючий антитіло, що володіє вказаними властивостями. Таким чином, фаг імітує деякі властивості Вклітини. Відображення на фагі може бути виконане в різних форматах. Для відображення на фагі можна використовувати декілька джерел сегментів V-гена. Всілякі антитіла проти оксазолона були виділені з невеликої довільної комбінаторної бібліотеки V-генів, отриманих з 26 UA 101672 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 селезінки імунізованих мишей. Можна створити набір V-генів, отриманих у неімунізованих людей-донорів, і виділити антитіла до різних антигенів (включаючи аутоантигени). Як було вказано вище, людські антитіла можуть бути утворені in vitro активованими Вклітинами (див. патенти США №№ 5567610 і 5229275). Слід зазначити, що введення всіх варіабельних доменів, відмінних від людських, в константні ділянки людини дозволяє отримати "класичні" химерні антитіла. У контексті даної заявки термін "химерні антитіла" означає будь-яке антитіло, в якому імунореактивна ділянка або сайт отримані або виділені з першого виду, і константна ділянка (яка може бути інтактною, неповною або модифікованою відповідно до даного винаходу) отримана з другого виду. У деяких варіантах здійснення винаходу антигензв'язуюча ділянка або сайт отримують з джерела, відмінного від людського (наприклад, миші), і константна ділянка належить людині. Хоча на імуногенну специфічність варіабельної ділянки зазвичай не впливає джерело, константна ділянка людини, мабуть, у меншій мірі викликає імунну відповідь людини, чим константна ділянка джерела, відмінного від людського. Варіабельні домени важкого і легкого ланцюгів змінюють шляхом щонайменше часткової заміни однієї або декількох CDR-ділянок і, при необхідності, часткової заміни остовної ділянки і зміни послідовності. Хоча CDR-ділянки можуть бути отримані з антитіла того ж класу або навіть підкласу, що і антитіло, з якого були виділені остовні ділянки, можна передбачити, що CDRділянки будуть виділені з антитіла іншого класу і переважно з антитіла іншого виду. Слід зазначити, що не обов'язково замінювати всі CDR-ділянки повними CDR-ділянками з варіабельної ділянки донора для перенесення антигензв'язуючої здатності одного варіабельного домену в іншій. Швидше потрібно перенести лише ті залишки, які необхідні для збереження активності антигензв'язуючого сайту. З врахуванням пояснень, приведених в патентах США №№ 5585089, 5693761 і 5693762, можна отримати функціональне антитіло із зниженою імуногенністю шляхом звичайного експериментування або методом проб і помилок, відомим в даній галузі. Не дивлячись на зміни варіабельної ділянки, слід зазначити, що модифіковані антитіла по даному винаходу включають антитіла або їх імунореактивні фрагменти, в яких щонайменше частина одного або декількох доменів константної ділянки видалена або змінена яким-небудь іншим чином з досягненням необхідних біохімічних характеристик, таких як краща локалізація пухлини або менший час напівжиття в кров'яному руслі, в порівнянні з антитілом, що володіє приблизно такою ж імуногенністю і що включає нативну або незмінену константну ділянку. У деяких варіантах здійснення винаходу константна ділянка модифікованих антитіл включає константну ділянку людини. Модифікації константної ділянки, сумісні із даним винаходом, включають додавання, делеції або заміни однієї або декількох амінокислот в одному або декількох доменах. Тобто модифіковані антитіла по даному винаходу можуть включати зміни або модифікації одного або декількох з трьох константних доменів важкого ланцюга (СН1, СН2 або СН3) та/або константного домену легкого ланцюга (CL). Деякі варіанти здійснення винаходу відносяться до модифікованих константних ділянок, в яких один або декілька доменів частково або повністю видалені. У інших варіантах здійснення винаходу модифіковані антитіла включають конструкції з видаленими доменами або варіанти, в яких видалений весь СН2 домен (конструкції СН2). У інших варіантах здійснення винаходу видалений домен константної ділянки замінений коротким амінокислотним спейсером (наприклад, з 10 залишків), який забезпечує деяку молекулярну гнучкість, що зазвичай повідомляється відсутньою константною ділянкою. У даній галузі відомо, що, окрім конфігурації, константна ділянка опосередкує декілька ефекторних функцій. Наприклад, зв'язування компонента С1 комплементу з антитілами активує систему комплементу. Активація комплементу має важливе значення для опсонізації і лізису патогенних організмів клітини. Активація комплементу також стимулює запальну реакцію і може опосередкувати аутоімунну гіперчутливість. Крім того, антитіла зв'язуються з клітинами за допомогою Fc-ділянки, при цьому сайт Fc-рецептора в Fc-ділянки антитіла зв'язується з Fcрецептором (FсR) на клітині. Існує ряд Fc-рецепторів, специфічних для різних класів антитіл, включаючи IgG (гамма-рецептори), IgЕ (епсилон-рецептори), IgA (альфа-рецептори) і IgM (мюрецептори). Зв'язування антитіла з Fc-рецепторами на поверхні клітини запускає ряд важливих і всіляких біологічних реакцій, що включають поглинання і руйнування часток, покритих антитілом, кліренс імунних комплексів, лізис клітин-мішеней, покритих антитілом, клітинамикілерами (іменований антителозалежною клітинно-опосередкованою цитотоксичностью або ADCC), вивільнення медіаторів запалення, перенесення через плаценту і регуляцію продукування імуноглобуліну. Хоча в деякій мірі вивчені різні Fc-рецептори і сайти рецепторів, все ще багато що не відомо про їх локалізацію, структуру і функціонування. 27 UA 101672 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Не обмежуючи об'єм даного винаходу, можна передбачити, що антитіла, що включають константні ділянки, модифіковані відповідно до даного винаходу, виконують змінені ефекторні функції, які у свою чергу впливають на біологічний профіль введеного антитіла. Наприклад, делеція або інактивація (за допомогою точкових мутацій або інших засобів) домену константної ділянки може зменшувати зв'язування Fc-рецептором циркулюючого модифікованого антитіла, що збільшує вірогідність локалізації пухлини. У інших випадках модифікації константної ділянки, сумісні із даним винаходом, можуть опосередкувати зв'язування комплементу і, таким чином, скорочувати час напівжиття в кров'яному руслі і неспецифічне зв'язування кон'югованого цитотоксину. Інші модифікації константної ділянки можуть бути використані для усунення дисульфільних зв'язків або олігосахаридних частин, що дозволяє краще локалізувати пухлину завдяки вищій антигенній специфічності або гнучкості антитіла. Аналогічним чином модифікації константної ділянки відповідно до даного винаходу можуть бути легко виконані добре відомими біохімічними методами або методами молекулярної інженерії. Слід зазначити, що можуть бути створені модифіковані антитіла з можливістю гібридизації СН3 домену безпосередньо з шарнірною ділянкою відповідних модифікованих антитіл. У інших конструкціях може бути бажано ввести пептидний спейсер між шарнірною ділянкою і модифікованими СН2 та/або СН3 доменами. Наприклад, можуть бути експресовані сумісні конструкції, в яких СН2 домен видалений і СН3 домен, що залишився, (модифікований або немодифікований) сполучений з шарнірною ділянкою спейсером з 5-20 амінокислот. Такий спейсер може бути доданий, наприклад, для гарантії того, що регуляторні елементи константного домену залишаються вільними і доступними або шарнірна ділянка залишається гнучкою. Проте слід зазначити, що амінокислотні спейсеры в деяких випадках можуть бути імуногенними і викликати небажану імунну реакцію проти даної конструкції. Тому будь-який спейсер, що вводиться в конструкцію, має бути відносно неімуногенним, або навіть може бути взагалі видалений при необхідності збереження необхідних біохімічних властивостей модифікованих антитіл. Окрім делеції всіх доменів константної ділянки, може бути бажано отримати антитіла по даному винаходу шляхом часткової делеції або заміни декількох або навіть однієї амінокислоти. Наприклад, мутація однієї амінокислоти у вибраній ділянці СН2 домену може бути достатньою для істотного зменшення зв'язування Fc і, отже, для поліпшення локалізації пухлини. Аналогічним чином може бути бажано просто видалити ту частину одного або декількох доменів константної ділянки, яка контролює модульовану ефекторну функцію (наприклад, зв'язування комплементу CLQ). Такі часткові делеції константних ділянок можуть покращувати вибрані характеристики антитіла (час напівжиття в кров'яному руслі) при збереженні інших необхідних функцій, що асоціюються з даним інтактним доменом константної ділянки. Крім того, як було вказано вище, константні ділянки розглянутих антитіл можуть бути модифіковані в результаті мутації або заміни однієї або декількох амінокислот, що підсилюють профіль створеної конструкції. У даному відношенні можна усунути активність збереженого сайту зв'язування (наприклад, зв'язування Fc) і при цьому зберегти конфігурацію і імуногенний профіль модифікованого антитіла. Інші варіанти здійснення винаходу можуть включати додавання однієї або декількох амінокислот в константну ділянку для посилення необхідних характеристик, таких як ефекторна функція, або приєднання більшого числа цитотоксинів або вуглеводів. У таких варіантах здійснення винаходу може бути бажано вставити або реплікувати конкретні послідовності, виділені з вибраних доменів константної ділянки. У певних варіантах здійснення винаходу може бути бажано використовувати фрагмент антитіла, а не інтактне антитіло, наприклад, для кращого проникнення в пухлину. Відомі різні методи отримання фрагментів антитіл. Такі фрагменти традиційно отримують в результаті протеолітичного розщеплювання інтактних антитіл (див., наприклад, публікації Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 і Brennan et al., 1985, Science, 229:81). Проте в даний час вказані фрагменти продукують рекомбінантні клітини-хазяї, описані вище. Таким чином, Fab-, Fv- і scFv-фрагменти антитіл можуть бути експресовані і секретовані з E. coli або інших клітин-хазяїв, що дозволяє отримувати вказані фрагменти у великих кількостях. Альтернативно такі фрагменти антитіл можуть бути виділені з вищеописаних бібліотек відображення антитіл на фагі. Фрагменти антитіл можуть бути також лінійними антитілами, описаними, наприклад, в патенті США № 5641870, і можуть бути моноспецифічними або біспецифічними. Фахівцеві в даній галузі мають бути відомі інші методи отримання фрагментів антитіл. Крім того, може бути бажано, особливо в разі фрагментів антитіл, модифікувати антитіло для збільшення часу напівжиття в кров'яному руслі. Дана мета може бути досягнута, наприклад, шляхом введення у фрагмент антитіла збереженого епітопа зв'язування рецептора шляхом 28