Notcн-зв’язуючі агенти й антагоністи та способи їх застосування

Реферат: UA 101671 C2 (12) UA 101671 C2 Винахід стосується виділеного антитіла, яке специфічно зв'язує незв'язуючу ліганд область позаклітинного домену Notch2 і/або Notch3 людини, яке містить: (a) CDR1 важкого ланцюга, що містить SSSGMS (SEQ ID NO:5), CDR2 важкого ланцюга, що містить VIASSGSNTYYADSVKG (SEQ ID NO:6), і CDR3 важкого ланцюга, що містить SIFYTT (SEQ ID NO:51) або GIFFAI (SEQ ID NO:7); та (b) CDR1 легкого ланцюга, що містить RASQSVRSNYLA (SEQ ID NO:8), CDR2 легкого ланцюга, що містить GASSRAT (SEQ ID NO:9), і CDR3 легкого ланцюга, що містить QQYSNFPI (SEQ ID NO:10). UA 101671 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки, до якої належить винахід Даний винахід стосується композицій, що містять агент, який зв'язує Notch-рецептор людини, і способів застосування цих композицій для лікування раку та інших захворювань. Конкретніше, даний винахід забезпечує, наприклад, антитіла, які специфічно зв'язуються з незв'язуючою ліганд областю позаклітинного домену Notch-рецептора людини та інгібує зростання пухлини. Даний винахід забезпечує також способи лікування раку, причому такий спосіб введення терапевтично ефективної кількості антитіла, яке специфічно зв'язується з незв'язуючою ліганд областю позаклітинного домену білка й інгібує зростання пухлини. Рівень техніки Шлях передачі сигналу Notch є одним з декількох критичних регуляторів формування ембріонального патерну, підтримки постембріональної тканини й біології стволових клітин. Конкретніше, передача сигналу Notch бере участь у процесі латерального інгібування між долями сусідніх клітин і грає важливу роль у визначенні доль клітин під час асиметричних ділень клітин. Нерегульована передача сигналу Notch асоційована з множинними типами раку людини, де вона може змінювати долю розвитку пухлинних клітин для підтримки їх у недиференційованому й проліферативному стані (Brennan and Brown, 2003, Breast Cancer Res. 5:69). Таким чином, канцерогенез може відбуватися за допомогою узурпації гомеостатичних механізмів, регулюючих нормальний розвиток і репарацію тканин популяціями стволових клітин (Beachy et al., 2004, Nature 432:324). Notch-рецептор був спочатку ідентифікований у мутантах Drosophila з гаплонедостатністю, що приводить до вирізок (notches) в краю крила, тоді як мутація із втратою функції виробляє ембріональний летальний "нейрогенний" фенотип, у якому клітини епідермісу перемикають шлях до формування нервових клітин (Moohr, 1919, Genet. 4:252; Poulson, 1937, PNAS 23:133; Poulson, 1940, J. Exp. Zool. 83:271). Notch-рецептор є трансмембранним рецептором односпрямованого проходження, що містить багаточисельні тандемні повтори, подібні до епідермального чинника зростання (EGF), і три багатих цистеїном повтори Notch/LIN-12 у великому позаклітинному домені (Wharton et al., 1985, Cell 43:567; Kidd et al., 1986, Mol. Cell Biol. 6:3094; у огляді Artavanis et al., 1999, Science 284:770). Були ідентифіковані чотири білки Notch ссавців (Notch1, Notch2, Notch3 і Notch4), і мутації в цих рецепторах незмінно приводять до аномалій розвитку й патологій у людини, що включають декілька типів раку, як описано детально нижче (Gridley, 1997, Mol. Cell Neurosci 9:103; Joutel & Tournier-Lasserve, 1998, Seminl. 9:619-25). Notch-рецептори активуються трансмембранними лігандами односпрямованого проходження сімейства Delta, Serrated, Lag-2 (DSL). У ссавців є п'ять відомих лігандів Notch: Delta-подібний 1 (DLL1), Delta-подібний 3 (DLL3), Delta-подібний 4 (DLL4), Jagged 1 (JAG1) і Jagged 2 (JAG2), що характеризуються доменом DSL і тандемними EGF-подібними повторами в позаклітинному домені. Позаклітинний домен Notch-рецептора взаємодіє з позаклітинним доменом його лігандів, зазвичай на сусідніх клітинах, приводячи до двох протеолітичних розщеплювань Notch, одного позаклітинного розщеплювання, опосередкованого протеазою ADAM (дезинтегрин і металопротеаза) й одного розщеплювання, опосередкованого гаммасекретазою. Це останнє розщеплювання генерує внутрішньоклітинний домен Notch (ICD), який потім входить у ядро, де він активує CBF1, супресор Hairless [Su(H)], сімейство Lag-2 (CSL) чинників транскрипції як основні наступні ефектори для збільшення транскрипції ядерних основних чинників транскрипції спіраль-петля-спіраль сімейства Hairy and Enhancer of Split [E(sp)] (Artavanis et al., 1999, Science 284:770; Brennan and Brown, 2003, Breast Cancer Res. 5:69; Iso et al., 2003, Arterioscler. Thromb. Vasс. Biol. 23:543). У ссавців можуть існувати також альтернативні внутрішньоклітинні шляхи, що включають цитоплазматичний білок Deltex, ідентифікований у Drosophila (Martinez et al., 2002, Curr. Opin. Genet. Dev. 12:524-33), і цей Deltex-залежний шлях може діяти за допомогою супресії генів-мішеней Wnt (Brennan et al., 1999, Curr. Biol. 9:707-710; Lawrence et al., 2001, Curr. Biol. 11:375-85). Notch-рецептори ссавців піддаються розщеплюванню з утворенням зрілого рецептора, а також подальшим зв'язуванням ліганду для активації подальшої передачі сигналу. Фуринподібна протеаза розщеплює Notch-рецептори під час дозрівання з утворенням навколомембранних гетеродимерів, які містять нековалентно асоційовану позаклітинну субодиницю й трансмембранну субодиницю, що утримуються разом в ауто-інгібованому стані. Зв'язування ліганду полегшує це інгібування й індукує розщеплювання Notch-рецептора металопротеазою типу ADAM і гамма-секретазою, причому остання вивільняє внутрішньоклітинний домен (ICD) у цитоплазму, дозволяючи йому переміщатися в ядро для активації транскрипції генів. Розщеплювання за допомогою ADAM відбувається в домені, що не зв'язує ліганд, у межах проксимальної відносно мембрани негативної регуляторної області. 1 UA 101671 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Гемопоетичні стволові клітини (HSC) є найбільш вивченими стволовими клітинами в організмі, й, мабуть, передача сигналу Notch бере участь в їх нормальній підтримці, а також у лейкозному перетворенні (Kopper & Hajdu, 2004, Pathol. Oncol. Res. 10:69-73). HSC є рідкою популяцією клітин, яка займає стромальну нішу в зрілому кістковому мозку. Ці клітини характеризуються як унікальним профілем експресії генів, так і здатністю виробляти більше диференційованих клітин-попередників для відтворення всієї гемопоетичної системи. Конститутивна активація передачі сигналу Notch в HSC і клітинах-попередниках встановлює іморталізовані клітинні лінії, які генерують як лімфоїдні, так і мієлоїдні клітини in vitro і в довгострокових аналізах відтворення (Varnum-Finney et al., 2000, Nat. Med. 6:1278-81), і присутність Jagged1 збільшує щеплення популяцій кісткового мозку людини, збагачених HSC (Karanu et al., 2000, J. Exp. Med. 192:1365-72). Більш недавно була продемонстрована передача сигналу Notch у HSC in vivo, і було показано, що вона бере участь в інгібуванні диференціювання HSC. Крім того, передача сигналу Notch, напевне, є необхідною для Wntопосередкованого самовідновлення HSC (Duncan et al., 2005, Nat. Immunol. 6:314). Шлях передачі сигналу Notch також грає центральну роль у підтримці нервових стволових клітин і ймовірно бере участь у їх нормальній підтримці, а також у разі раку головного мозку (Kopper & Hajdu, 2004, Pathol. Oncol. Res. 10:69-73; Purow et al., 2005, Cancer Res. 65:2353-63; Hallahan et al., 2004, Cancer Res. 64:7794-800). Нервові стволові клітини дають початок всім нейронним і гліальним клітинам у нервовій системі людини під час розвитку, й більш недавно були ідентифіковані в зрілому головному мозку (Gage, 2000, Science 287:1433-8). Миші, дефектні відносно Notch1; генів-мішеней Notch Hes1, 3 і 5 і регулятора передачі сигналу Notch пресиніліну 1 (PS1) виявляють зменшені кількості ембріональних нервових стволових клітин. Крім того, зрілі нервові стволові клітини зменшувалися в кількості в головному мозку гетерозиготних мишей PS1 (Nakamura et al., 2000, J. Neurosci. 20:283-93; Hitoshi et al., 2002, Genes Dev. 16:846-58). Це зменшення в кількості нервових стволових клітин, мабуть, походить з їх передчасного диференціювання в нейрони (Hatakeyama et al., 2004, Dev. 131:5539-50), що дозволяє передбачити, що передача сигналу Notch регулює диференціювання й самовідновлення нервових стволових клітин. Передбачається, що аберантна передача сигналу Notch бере участь у ряді ракових захворювань людини. Ген Notch1 спочатку ідентифікували в субпопуляції Т-клітинних гострих лімфобластних лейкозів у вигляді переміщуваного локуса, що приводить до активації Notchшляху (Ellisen et al., 1991, Cell 66:649-61). Конститутивна активація передачі сигналу Notch у Тклітинах у моделі миші так само генерує Т-клітинні лімфоми, що передбачає його причинну роль (Robey et al., 1996, Cell 87:483-92; Pear et al., 1996, J. Exp. Med. 183:2283-91; Yan et al., 2001, Blood 98:3793-9; Bellavia et al., 2000, EMBO J. 19:3337-48). Було виявлено, що точкові мутації, інерції й делеції, що виробляють аберантну передачу сигналу Notch1, часто присутні в Тклітинних гострих лімфобластних лейкозах/лімфомах як дорослих, так і дітей (Pear & Aster, 2004, Curr. Opin. Hematol. 11:416-33). Часте інсертування вірусу пухлини молочної залози миші як у локус Notch1, так і в локус Notch4 в пухлинах молочної залози й одержання активованих фрагментів білка Notch спочатку дозволило передбачити присутність передачі сигналу Notch у раку молочної залози (Gallahan & Callahan, 1987, J. Virol. 61:66-74; Brennan & Brown, 2003, Breast Cancer Res. 5:69; Politi et al., 2004, Semin. Cancer Biol. 14:341-7). Додаткові дослідження на трансгенних мишах підтвердили роль Notch у розгалуженні проток під час нормального розвитку молочної залози, і конститутивно активна форма Notch4 в епітеліальних клітинах молочної залози інгібує епітеліальне диференціювання й приводить до онкогенезу (Jhappan et al., 1992, Genes & Dev. 6:345-5; Gallahan et al., 1996, Cancer Res. 56:1775-85; Smith et al., 1995, Cell Growth Differ. 6:56377; Soriano et al., 2000, Int. J. Cancer 86:652-9; Uyttendaele et al., 1998, Dev. Biol. 196:204-17; Politi et al., 2004, Semin. Cancer Biol. 14:341-7). Доказ ролі Notch у раку молочної залози людини забезпечується даними, що показують експресію Notch-рецепторів у разі раку молочної залози і їх кореляцію з клінічним результатом (Weijzen et al., 2002, Nat. Med. 8:979-86; Parr et al., 2004, Int. J. Mol. Med. 14:779-86). Крім того, надекспресію шляху Notch спостерігали в раках шийки матки (Zagouras et al., 1995, PNAS 92:6414-8), нирково-клітинних карцином (Rae et al., 2000, Int. J. Cancer 88:726-32), карцином голови й шиї (Leethanakul et al., 2000, Oncogene 19:3220-4), ендометріальних раків (Suzuki et al., 2000, Int. J. Oncol. 17:1131-9) і нейробластом (van Limpt et al., 2000, Med. Pediatr. Oncol. 35:554-8), що дозволяє передбачити роль Notch у розвитку ряду пухлин. Цікаво, що передача сигналу Notch може грати роль у підтримці недиференційованого стану Аре-мутантних неопластичних клітин ободової кишки (van Es & Clevers, 2005, Trends in Mol. Med. 11:496-502). 2 UA 101671 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Шлях Notch бере участь також у множинних аспектах розвитку судин, що включають проліферацію, міграцію, диференціювання гладких м'язів, ангіогенез і артеріально-венозне диференціювання (Iso et al., 2003, Arterioscler. Thromb. Vasс. Biol. 23:543). Наприклад, гомозиготні нуль-мутації в Notch1/4 і Jagged1, а також гетерозиготна втрата DLL4 приводять до важких, хоча й варіабельних дефектів у розвитку артерій і васкуляризації жовткового мішка. Крім того, DLL1-дефектні й Notch2-гіпоморфні ембріони мишей виявляють кровотечу, яка, мабуть, походить із слабкого розвитку васкулярних структур (Gale et al., 2004, PNAS, 101:1594954; Krebs et al., 2000, Genes Dev. 14:1343-52; Xue et al., 1999, Hum. Mel. Genet. 8:723-30; Hrabe de Angelis et al., 1997, Nature 386:717-21; McCright et al., 2001, Dev. 128:491-502). У людей, мутації в Jagged1 асоційовані з синдромом Alagille, пороком розвитку, який включає васкулярні дефекти, й мутації в Notch3 є відповідальними за спадкову судинну деменцію (CADASIL), в якій гомеостаз судин є дефектним (Joutel et al., 1996, Nature 383:707-10). Анти-Notch-антитіла і їх можливе застосування як протиракових терапевтичних речовин повідомлялися раніше. Див., наприклад, Публікацію заявки на патент США №2008/0131434, яка включена в даний опис як посилання в повному обсязі. Див. також Міжнародні Публікації з номерами WO 2008/057144 і WO 2008/076960, а також Публікації заявок на патент США з номерами 2008/0226621, 2008/0118520 і 2008/0131908. СУТЬ ВИНАХОДУ Даний винахід забезпечує нові Notch-зв'язуючі агенти й нові антагоністи одного або декількох Notch-рецепторів людини, а також способи застосування цих агентів і антагоністів. Крім того, даний винахід забезпечує нові поліпептиди, такі як антитіла, які зв'язують один або декілька Notch-рецепторів людини, фрагменти таких антитіл та інші поліпептиди, родинні таким антитілам. У деяких варіантах здійснення цей винахід забезпечує антагоністи Notch2 і/або Notch3 людини, у тому числі, але не лише, антитіла, які специфічно зв'язують Notch2 і/або Notch3 людини. У даному контексті, фраза "Notch2 і/або Notch3" позначає "Notch2", "Notch3" або "як Notch2, так і Notch3". У деяких варіантах здійснення, антитіла або інші антагоністи зв'язуються з областю Notch-рецептора, яка знаходиться зовні лігандзв'язуючого домену (наприклад, EGF10 Notch2 або EGF9 Notch3). У деяких варіантах здійснення, ці антитіла специфічно зв'язують Notch2 людини. В деяких варіантах здійснення, ці антитіла специфічно зв'язують Notch2 і Notch3 людини. В деяких варіантах здійснення, ці антитіла специфічно зв'язують Notch3 людини. Забезпечені також полінуклеотиди, що містять послідовності нуклеїнових кислот, що кодують ці поліпептиди, а також вектори, що містять ці полінуклеотиди. Додатково забезпечені клітини, що містять ці поліпептиди й/або полінуклеотиди цього винаходу. Забезпечені також композиції (наприклад, фармацевтичні композиції), що містять ці нові антагоністи Notch. Забезпечені також способи застосування цих антитіл і антагоністів, такі як способи застосування антагоністів Notch для інгібування зростання пухлини, зменшення онкогенності пухлин, інгібування ангіогенезу й/або лікування раку або інших захворювань, що асоціюються з ангіогенезом. У одному аспекті, цей винахід забезпечує агент (наприклад, антитіло), який специфічно зв'язується з доменом EGF10 (або еквівалентом домену EGF10) одного або декількох Notchрецепторів людини. В деяких варіантах здійснення, цим агентом є антитіло. У деяких варіантах здійснення, цим агентом є антагоніст. У деяких варіантах здійснення, цей агент специфічно зв'язується з EGF10 Notch2 людини і/або EGF9 Notch3 людини. EGF9 є EGF в Notch3 людини, яка є еквівалентом EGF10 в інших Notch-рецепторах людини, Notch1, Notch2 і Notch4. У деяких варіантах здійснення, цей агент специфічно зв'язується з EGF10 Notch2. У деяких варіантах здійснення, цей агент специфічно зв'язується з EGF10 Notch2 і з EGF9 Notch3. У деяких варіантах здійснення, цей агент специфічно зв'язується з EGF9 Notch3. У інших варіантах здійснення, цей агент зв'язується щонайменше з частиною послідовності HKGAL (SEQ ID NO:28) в EGF10 Notch2. У деяких варіантах здійснення, цей агент зв'язується щонайменше з частиною послідовності HEDAI (SEQ ID NO:29) в EGF9 Notch3. У деяких варіантах здійснення кожного з вищезазначених аспектів або варіантів, а також інших аспектів і варіантів, описаних тут у іншому місці, цей агент інгібує зв'язування ліганду з Notch2 і/або Notch3 людини. В деяких варіантах здійснення, цей агент інгібує зв'язування ліганду з Notch2 людини. В деяких варіантах здійснення, цей агент інгібує зв'язування ліганду з Notch2 і/або Notch3. У деяких варіантах здійснення, цей агент інгібує зв'язування ліганду з Notch3. У деяких варіантах здійснення, цим лігандом є DLL4, JAG1 або JAG2. У інших варіантах здійснення, цей агент інгібує передачу сигналу Notch2 і/або Notch3 людини. У деяких варіантах здійснення, цей агент інгібує передачу сигналу Notch2 і/або Notch3. У інших варіантах здійснення, цей агент інгібує передачу сигналу Notch3. У деяких варіантах здійснення, передача сигналу Notch2 і/або Notch3 індукується DLL4, JAG1 або JAG2. Забезпечені також 3 UA 101671 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фармацевтичні композиції, що містять цей агент, і способи використання цього агента для таких застосувань, як інгібування ангіогенезу, інгібування зростання пухлини, зменшення онкогенності пухлини і/або лікування раку. У наступному аспекті, цей винахід забезпечує антитіло, яке специфічно зв'язує Notch2 і/або Notch3 людини, де це антитіло містить (a) CDR1 важкого ланцюга, що містить SSSGMS (SEQ BD NO:5), CDR2 важкого ланцюга, що містить VIASSGSNTYYADSVKG (SEQ ID NO:6), і/або CDR3 важкого ланцюга, що містить SIFYTT (SEQ ID NO:51); і/або (b) CDR1 легкого ланцюга, що містить RASQSVRSNYLA (SEQ ID NO:8), CDR2 легкого ланцюга, що містить GASSRAT (SEQ ID NO:9) і/або CDR3 легкого ланцюга, що містить QQYSNFPI (SEQ ID NO:10). У деяких варіантах здійснення, це антитіло містить (a) CDR1 важкого ланцюга, що містить SSSGMS (SEQ ID NO:5) або його варіант, що містить 1, 2, 3 або 4 консервативних амінокислотних заміни; CDR2 важкого ланцюга, що містить VIASSGSNTYYADSVKG (SEQ ID NO:6), або його варіант, що містить 1, 2, 3 або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або CDR3 важкого ланцюга, що містить SIFYTT (SEQ ID NO:51), або його варіант, що містить 1, 2, 3 або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або (b) CDR1 легкого ланцюга, що містить RASQSVRSNYLA (SEQ ID NO: 8), або його варіант, що містить 1, 2, 3 або 4 консервативних амінокислотних заміни; CDR2 легкого ланцюга, що містить GASSRAT (SEQ ID NO:9), або його варіант, що містить 1, 2, 3 або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або CDR3 легкого ланцюга, що містить QQYSNFPI (SEQ ID NO:10), або його варіант, що містить 1, 2, 3 або 4 консервативних амінокислотних заміни. Забезпечені також фармацевтичні композиції, що містять цей агент, і способи використання цього агента для таких застосувань, як інгібування ангіогенезу, інгібування зростання пухлини, зменшення онкогенності пухлини і/або лікування раку. У наступному аспекті, цей винахід забезпечує антитіло, яке специфічно зв'язує Notch2 і/або Notch3 людини, де це антитіло містить (a) CDR1 важкого ланцюга, що містить SSSGMS (SEQ ID NO:5), CDR2 важкого ланцюга, що містить VIASSGSNTYYADSVKG (SEQ ID NO:6), і/або CDR3 важкого ланцюга, що містить GIFFAI (SEQ ID NO:7); і/або (b) CDR1 легкого ланцюга, що містить RASQSVRSNYLA (SEQ ID NO:8), CDR2 легкого ланцюга, що містить GASSRAT (SEQ ID NO:9), і/або CDR3 легкого ланцюга, що містить QQYSNFPI (SEQ ID NO:10). У деяких варіантах здійснення, це антитіло специфічно зв'язує Notch2. У деяких варіантах здійснення, це антитіло містить (a) CDR1 важкого ланцюга, що містить SSSGMS (SEQ ID NO:5), або його варіант, що містить 1, 2, 3 і 4 консервативних амінокислотних заміни; CDR2 важкого ланцюга, що містить VIASSGSNTYYADSVKG (SEQ ID NO:6), або його варіант, що містить 1, 2, 3 або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або CDR3 важкого ланцюга, що містить GIFFAI (SEQ ID NO:7), або його варіант, що міститьутримує 1, 2, 3 або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або (b) CDR1 легкого ланцюга, що містить RASQSVRSNYLA (SEQ ID NO:8), або його варіант, що містить 1, 2, 3 або 4 консервативних амінокислотних заміни; CDR2 легкого ланцюга, що містить GASSRAT (SEQ ID NO:9), або його варіант, що містить 1, 2, 3 або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або CDR3 легкого ланцюга, що містить QQYSNFPI (SEQ ID NO:10), або його варіант, що містить 1, 2, 3 або 4 консервативних амінокислотних заміни. Забезпечені також фармацевтичні композиції, що містять це антитіло, і способи використання цього антитіла для таких застосувань, як інгібування ангіогенезу, інгібування зростання пухлини, зменшення онкогенності пухлини і/або лікування раку. В іншому аспекті, цей винахід забезпечує антитіло, яке специфічно зв'язує Notch2 і/або Notch3, де це антитіло містить (a) CDR1 важкого ланцюга, що містить SSSGMS (SEQ ID NO:5), CDR2 важкого ланцюга, що містить VIASSGSNTYYADSVKG (SEQ ID NO:6), і/або CDR3 важкого ланцюга, що містить (G/S)(FS)F(F/Y)(A/P)(I/T/S/N) (SEQ ID NO:30); і/або (b) CDR1 легкого ланцюга, що містить RASQSVRSNYLA (SEQ ID NO:8), CDR2 легкого ланцюга, що містить GASSRAT (SEQ ID NO:9), і/або CDR3 легкого ланцюга, що містить QQYSNFPI (SEQ ID NO:10). У деяких варіантах здійснення, це антитіло містить CDR3 важкого ланцюга, що містить SIFYPT (SEQ ID NO:22). У деяких варіантах здійснення, це антитіло містить CDR3 важкого ланцюга, що містить SSSFFAS (SEQ ID NO:23). У деяких варіантах здійснення, це антитіло містить CDR3 важкого ланцюга, що містить SSFYAS (SEQ ID NO:24). У деяких варіантах здійснення, це антитіло містить CDR3 важкого ланцюга, що містить SSFFAT (SEQ ID NO:25). У деяких варіантах здійснення, це антитіло містить CDR3 важкого ланцюга, що містить SIFYPS (SEQ ID NO:26). У інших варіантах здійснення, це антитіло містить CDR3 важкого ланцюга, що містить SSFFAN (SEQ ID NO:27). Забезпечені також фармацевтичні композиції, що містять це антитіло, й способи використання цього антитіла для таких застосувань, як інгібування ангіогенезу, інгібування зростання пухлини, зменшення онкогенності пухлини і/або лікування раку. У іншому аспекті, цей винахід забезпечує поліпептид, який містить: (a) поліпептид (наприклад, варіабельну область важкого ланцюга), що має щонайменше приблизно 80 % 4 UA 101671 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ідентичність послідовності з SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 або SEQ ID NO:20 (з сигнальною послідовністю або без сигнальної послідовності); і/або (b) поліпептид (наприклад, варіабельну область легкого ланцюга), що має щонайменше приблизно 80 % ідентичність послідовності з SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:19 або SEQ ID NO:39 (з сигнальною послідовністю або без сигнальної послідовності). В деяких варіантах здійснення, цим поліпептидом є антитіло. В деяких варіантах здійснення, цей поліпептид специфічно зв'язується з Notch2 і/або Notch3 людини. В деяких варіантах здійснення, цей поліпептид зв'язується з Notch2 людини. В деяких варіантах здійснення, цей поліпептид зв'язується з Notch2 і Notch3. У інших варіантах здійснення, цей поліпептид зв'язується з Notch3. У деяких варіантах здійснення, цей поліпептид містить поліпептид, що має щонайменше приблизно 85 %, щонайменше приблизно 90 %, щонайменше приблизно 95 %, щонайменше приблизно 98 % або приблизно 100 % ідентичність послідовності з SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:13 або SEQ ID NO:50. Забезпечені також фармацевтичні композиції, що містять цей поліпептид, і способи використання цього поліпептиду для таких застосувань, як інгібування ангіогенезу, інгібування зростання пухлини, зменшення онкогенності пухлини і/або лікування раку. Ще в одному аспекті, цей винахід забезпечує поліпептид (наприклад, антитіло або важкий ланцюг або легкий ланцюг антитіла), що містить: (a) поліпептид, що має щонайменше приблизно 80 % ідентичність послідовності з SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:16 або SEQ ID NO:2 (з сигнальною послідовністю або без сигнальної послідовності); і/або (b) поліпептид, що має щонайменше приблизно 80 % ідентичність послідовності з SEQ ID NO:18 або SEQ ID NO:4 (з сигнальною послідовністю або без сигнальної послідовності). В деяких варіантах здійснення, цей поліпептид містить поліпептид, що має щонайменше приблизно 85 %, щонайменше приблизно 90 %, щонайменше приблизно 95 %, щонайменше приблизно 98 % або приблизно 100 % ідентичність послідовності з SEQ ID NO:39 або SEQ ID NO:40. Забезпечені також фармацевтичні композиції, що містять ці антитіла, і способи лікування раку, що передбачають введення терапевтично ефективних кількостей цих антитіл. У іншому аспекті, цей винахід забезпечує поліпептид (наприклад, антитіло або важкий ланцюг або легкий ланцюг антитіла), що містить: (а) поліпептид, що має щонайменше приблизно 80 % ідентичність послідовності з SEQ ID NO:50; і/або (b) поліпептид, що має щонайменше приблизно 80 % ідентичність послідовності з SEQ ID NO:13. У деяких варіантах здійснення, цей поліпептид містить поліпептид, що має щонайменше приблизно 85 %, щонайменше приблизно 90 %, щонайменше приблизно 95 %, щонайменше приблизно 98 % або приблизно 100 % ідентичність послідовності з SEQ ID NO:50 або SEQ ID NO:13. У деяких варіантах здійснення, цей поліпептид є антитілом, яке зв'язує Notch2 людини і/або Notch3 людини. Забезпечені також фармацевтичні композиції, що містять ці антитіла, й способи лікування раку, що передбачають введення терапевтично ефективних кількостей цих антитіл. У іншому аспекті, цей винахід забезпечує антитіло, яке містить антитіло IgG2 59R1 або складається або по суті складається з антитіла IgG2 59R1, що містить важкий ланцюг і легкий ланцюг SEQ ID NO:16 і 18 (з сигнальною послідовністю або без сигнальної послідовності), відповідно, або кодується ДНК, депонованою в Американській Колекції Типових культур (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USA, згідно з умовами Будапештського Договору 15 жовтня 2008 року, що отримала присвоєний номер PTA-9547. Забезпечені також фармацевтичні композиції, що містять це антитіло, і способи використання цього антитіла для таких застосувань, як інгібування ангіогенезу, інгібування зростання пухлини, зменшення онкогенності пухлини і/або лікування раку. У одному додатковому аспекті, цей винахід забезпечує антитіло, яке містить антитіло IgG2 59R5 або складається або по суті складається з антитіла IgG2 59R5, що містить важкий ланцюг і легкий ланцюг SEQ ID NO:49 і SEQ ID NO:18 (з сигнальною послідовністю або без сигнальної послідовності), відповідно, або кодується ДНК, депонованою в ATCC 6 липня 2009 року й що отримала присвоєний номер PTA-10170. Забезпечені також фармацевтичні композиції, що містять це антитіло, й способи використання цього антитіла для таких застосувань, як інгібування ангіогенезу, інгібування зростання пухлини, зменшення онкогенності пухлини і/або лікування раку. У іншому аспекті, цей винахід забезпечує антитіло, яке конкурує за специфічне зв'язування з Notch2 і/або Notch3 людини з антитілом, що містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить SEQ ID NO:14, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить SEQ ID NO:13. У деяких варіантах здійснення, це антитіло конкурує за специфічне зв'язування з антитілом IgG2 59R1, що містить важкий ланцюг і легкий ланцюг SEQ ID NO:16 і 18 (з сигнальною послідовністю або без сигнальної послідовності), відповідно, або кодується ДНК, депонованою в ATCC 15 5 UA 101671 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 жовтня 2008 року і що отримала присвоєний номер PTA-9547. У деяких варіантах здійснення, це антитіло конкурує за зв'язування з Notch2 людини. В деяких варіантах здійснення, це антитіло конкурує за зв'язування з Notch2 і Notch3 людини. У інших варіантах здійснення, це антитіло конкурує за зв'язування з Notch3 людини. Забезпечені також фармацевтичні композиції, що містять це антитіло, й способи використання цього антитіла для таких застосувань, як інгібування ангіогенезу, інгібування зростання пухлини, зменшення онкогенності пухлини і/або лікування раку. У наступному аспекті це антитіло конкурує за специфічне зв'язування з Notch2 і/або Notch3 людини з антитілом, що містить варіабельну область важкого ланцюга, що містить SEQ ID NO:50, і варіабельну область легкого ланцюга, що містить SEQ ID NO:13. У деяких варіантах здійснення, це антитіло конкурує за специфічне зв'язування з антитілом 59R5, що містить важкий ланцюг і легкий ланцюг SEQ ID NO:49 і 18, відповідно, або кодується ДНК, депонованою в ATCC 6 липня 2009 року і що отримала присвоєний номер PTA-10170. У деяких варіантах здійснення, це антитіло конкурує за з Notch2 і Notch3 людини. У деяких варіантах здійснення, це антитіло конкурує за зв'язування з Notch2 і Notch3 людини. У інших варіантах здійснення, це антитіло конкурує за зв'язування з Notch3 людини. Забезпечені також фармацевтичні композиції, що містять це антитіло, й способи використання цього антитіла для таких застосувань, як інгібування ангіогенезу, інгібування зростання пухлини, зменшення онкогенності пухлини і/або лікування раку. У деяких інших аспектах, цей винахід забезпечує поліпептид (з сигнальною послідовністю або без сигнальної послідовності), що містить послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56 і SEQ ID NO:57, а також полінуклеотид, що кодує такий поліпептид. У деяких варіантах здійснення, цей поліпептид є антитілом. У деяких варіантах здійснення це антитіло специфічно зв'язується з Notch2 людини і/або Notch3 людини. У деяких варіантах здійснення, це антитіло специфічно зв'язується з Notch2 людини. У деяких варіантах здійснення, це антитіло специфічно зв'язується з Notch2 людини і Notch3 людини. В деяких варіантах здійснення, це антитіло специфічно зв'язується з Notch3 людини. У іншому аспекті, цей винахід забезпечує полінуклеотид, що містить послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59 і SEQ ID NO:60. У іншому аспекті, цей винахід забезпечує спосіб модуляції функції перицитів і/або клітин гладких м'язів судин у суб'єкта (наприклад, у ділянці пухлини або іншому аберантному ангіогенезі у суб'єкта). В деяких варіантах здійснення, цей спосіб передбачає введення ефективної кількості агента, який специфічно зв'язує Notch2 людини і/або Notch3 людини, цьому суб'єктові. В деяких варіантах здійснення, цей агент є антитілом. У деяких варіантах здійснення, цей агент є антитілом, описаним у будь-якому з вищезазначених аспектів і/або варіантів, а також в інших аспектах і/або варіантах, описаних тут. У деяких варіантах здійснення, цей агент є антагоністом. У деяких варіантах здійснення, цей агент специфічно зв'язується з Notch3 людини і є антагоністом Notch3 людини. У деяких варіантах здійснення, модуляція функції перицитів і/або клітин гладких м'язів судин приводить до інгібування ангіогенезу і/або зростання пухлини. Ще в одному аспекті, цей винахід забезпечує спосіб інгібування ангіогенезу (наприклад, ангіогенезу пухлини) у суб'єкта. В деяких варіантах здійснення, цей спосіб передбачає введення суб'єктові ефективної кількості агента, який специфічно зв'язує Notch2 людини і/або Notch3 людини. У деяких варіантах здійснення, цей агент є антагоністом. У деяких варіантах здійснення, цей агент специфічно зв'язується з Notch2 людини і є антагоністом Notch2 людини. В деяких варіантах здійснення, цей агент специфічно зв'язується з Notch3 людини і є антагоністом Notch3 людини. У деяких варіантах здійснення, цей агент є антагоністом як Notch2, так і Notch3. У деяких варіантах здійснення, цей агент є антитілом. У деяких варіантах здійснення, цей агент є антитілом, описаним у будь-якому з вищезазначених аспектів і/або варіантів, а також в інших аспектах і/або варіантах, описаних тут. У деяких варіантах здійснення, цей антагоніст не є антитілом. У деяких варіантах здійснення, спосіб інгібування ангіогенезу додатково передбачає введення цьому суб'єктові антагоніста ендотеліального чинника зростання судин (VEGF) або ретора VEGF. У деяких варіантах здійснення, цей спосіб є способом інгібування ангіогенезу модуляцією функції перицитів і/або клітин гладких м'язів судин. У одному додатковому аспекті, цей винахід забезпечує спосіб інгібування зростання пухлини у суб'єкта. В деяких варіантах здійснення, цей спосіб передбачає введення цьому суб'єктові терапевтично ефективної кількості антагоніста Notch2 людини і/або Notch3 людини. У деяких 6 UA 101671 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіантах здійснення, цей антагоніст є антитілом, яке специфічно зв'язує Notch2 людини. В деяких варіантах здійснення, цей антагоніст є антитілом, яке специфічно зв'язує як Notch2 людини, так і Notch3 людини. У деяких варіантах здійснення, цей антагоніст є антитілом, яке специфічно зв'язує Notch3 людини. У деяких варіантах здійснення, цей антагоніст є антитілом, описаним у будь-якому з вищезазначених аспектів і/або варіантом, а також в інших аспектах і/або варіантах, описаних тут. У деяких варіантах здійснення, пухлина містить делецію або іншу мутацію в гені гомолога фосфатази й тензину (PTEN). У деяких варіантах здійснення, ця пухлина є пухлиною молочної залози. Ще в одному аспекті, цей винахід забезпечує спосіб вибору суб'єкта для лікування антагоністом Notch2 людини і/або Notch3 людини. У деяких варіантах здійснення, цей спосіб передбачає (a) визначення, чи містить ця пухлина делецію або мутацію в гені гомолога фосфатази й тензину (PTEN); і (b) вибір суб'єкта для лікування антагоністом Notch2 і/або Notch3, якщо ця пухлина містить цю делецію або мутацію. В деяких варіантах здійснення, цього суб'єкта лікують антагоністом Notch2. У деяких варіантах здійснення, цього суб'єкта лікують антагоністом Notch2 і Notch3. У деяких варіантах здійснення, цього суб'єкта лікують антагоністом Notch3. У деяких варіантах здійснення, цей антагоніст є антитілом. У деяких варіантах здійснення, ця пухлина є пухлиною молочної залози. У іншому аспекті, цей винахід забезпечує антитіло, яке специфічно зв'язується з незв'язуючою ліганд областю позаклітинного домену щонайменше одного Notch-рецептора людини (наприклад, 1, 2, 3 або 4 Notch-рецепторів). У деяких варіантах здійснення, ця незв'язуюча ліганд область містить EGF-повтор 10 Notch-рецептора людини або складається з EGF-повтору 10 Notch-рецептора людини (або містить еквівалент EGF10, такий як EGF9 Notch3 людини, або складається з еквіваленту EGF10, такого як EGF9 Notch3 людини). У деяких варіантах здійснення, це антитіло інгібує зростання пухлини. В деяких варіантах здійснення, це антитіло інгібує зв'язування ліганду з Notch-рецептором. В деяких варіантах здійснення, це антитіло інгібує передачу сигналу Notch-рецептором. У деяких варіантах здійснення, цей Notchрецептор є рецептором Notch людини, Notch1, Notch2, Notch3 або Notch4. У деяких варіантах здійснення, це антитіло специфічно зв'язується з Notch2 (наприклад, з EGF10 Notch2). У деяких варіантах здійснення, це антитіло специфічно зв'язується з Notch2 і щонайменше одним додатковим Notch-рецептором. У деяких варіантах здійснення, додатковим Notch-рецептором є Notch3. Забезпечені також фармацевтичні композиції, що містять ці антитіла, і способи лікування раку, що передбачають введення терапевтично ефективних кількостей цих антитіл. У додатковому аспекті, цей винахід забезпечує антитіло, яке специфічно зв'язується з двома або більш (тобто щонайменше з двома або двома, трьома або чотирма) Notch-рецепторами людини. У деяких варіантах здійснення, це антитіло специфічно зв'язується з незв'язуючою ліганд областю позаклітинного домену двох або більше Notch-рецепторів людини. У деяких варіантах здійснення, якщо ці два або більше Notch-рецептори людини містять Notch1, Notch2 або Notch4, це антитіло зв'язується з EGF10 Notch1, Notch2 або Notch4, і, якщо ці два або більше Notch-рецептори людини містять Notch3, це антитіло зв'язується з EGF9 Notch3. У деяких варіантах здійснення, незв'язуюча ліганд область не є EGF4. У деяких варіантах здійснення, ці два або більше Notch-рецептори людини містять Notch2. У деяких варіантах здійснення ці два або більше Notch-рецептори людини містять Notch3. У додаткових варіантах здійснення, ці два або більше Notch-рецептори людини містять Notch2 і Notch3. У деяких варіантах здійснення, це антитіло є антагоністом цих двох або більше Notch-рецепторів людини. У деяких варіантах здійснення, це антитіло інгібує зростання пухлини. Забезпечені також фармацевтичні композиції, що містять ці антитіла, і способи лікування раку, що передбачають введення терапевтично ефективних кількостей цих антитіл. Ще в одному аспекті, цей винахід забезпечує виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з незв'язуючою лігандіз областю позаклітинного домену Notch2-рецептора людини і інгібує зростання пухлини, де ця незв'язуюча ліганд область містить EGF-повтор 10 Notch2-рецептора людини або складається з нього (наприклад, SEQ ID NO:36). У деяких варіантах здійснення, це антитіло не зв'язується з жодною областю Notch2 людини поза EGF-повтором 10. У деяких варіантах здійснення, це антитіло також зв'язується специфічно з EGF-повтором 10 (або його еквівалентом) щонайменше одного додаткового Notch-рецептора людини (наприклад, EGF9 Notch3). У деяких варіантах здійснення, це антитіло зв'язується з EGF10 Notch2 людини і EGF9 Notch3. Забезпечені також фармацевтичні композиції, що містять ці антитіла, й способи лікування раку, що передбачають введення терапевтично ефективних кількостей цих антитіл. Ще в одному аспекті, цей винахід забезпечує виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з незв'язуючою ліганд областю позаклітинного домену Notch3-рецептора людини й інгібує зростання пухлини, де ця незв'язуюча ліганд область містить EGF-повтор 9 Notch3-рецептора 7 UA 101671 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 людини або складається з нього (еквівалент EGF10 в інших Notch-рецепторах). У деяких варіантах здійснення, це антитіло не зв'язується з жодною областю Notch3 людини поза EGFповтором 9. У деяких варіантах здійснення, це антитіло також зв'язується специфічно з EGFповтором 10 щонайменше одного додаткового Notch-рецептора людини. У деяких варіантах здійснення, це антитіло зв'язується з EGF9 Notch3 людини і EGF10 Notch2. Забезпечені також фармацевтичні композиції, що містять ці антитіла, й способи лікування раку, що передбачають введення терапевтично ефективних кількостей цих антитіл. Ще в одному аспекті, цей винахід забезпечує антитіло, яке зв'язує незв'язуюча ліганд область позаклітинного домену Notch-рецептора людини, і містить: (a) CDR1 важкого ланцюга, що містить SSSGMS (SEQ ID NO:5), CDR2 важкого ланцюга, що містить VIASSGSNTYYADSVKG (SEQ ID NO:6)утримує, і/або CDR3 важкого ланцюга, що містить GIFFAI (SEQ ID NO:7); і/або (b) CDR1 легкого ланцюга, що містить RASQSVRSNYLA (SEQ ID NO:8), CDR2 легкого ланцюга, що містить GASSRAT (SEQ ID NO:9), і/або CDR3 легкого ланцюга, що містить QQYSNFPI (SEQ ID NO:10). У деяких варіантах здійснення, Notch-рецептор людини є Notch2. У деяких варіантах здійснення, це антитіло зв'язується зіз EGF10 Notch2-рецептора людини і/або EGF9 Notch3рецептора людини. У одному додатковому аспекті, цей винахід забезпечує антитіло, яке конкурує з таким антитілом за специфічне зв'язування з незв'язуючою ліганд областю позаклітинного домену Notch2 в аналізі конкурентного зв'язування. Забезпечені також фармацевтичні композиції, що містять ці антитіла, і способи лікування раку, що передбачають введення терапевтично ефективних кількостей цих антитіл. У іншому аспекті, цей винахід забезпечує антитіло, яке зв'язує незв'язуюча ліганд область позаклітинного домену Notch-рецептора людини і містить: (a) CDR1 важкого ланцюга, що містить SSSGMS (SEQ ID NO:5), CDR2 важкого ланцюга, що містить VIASSGSNTYYADSVKG (SEQ ID NO:6), і/або CDR3, що містить SIFYTT (SEQ ID NO:51); і/або (b) CDR1 легкого ланцюга, що містить RASQSVRSNYLA (SEQ ID NO:8), CDR2 легкого ланцюга, що містить GASSRAT (SEQ ID NO:9), і/або CDR3 легкого ланцюга, що містить QQYSNFPI (SEQ ID NO:10). У деяких варіантах здійснення, Notch-рецептор людини є Notch2. У деяких варіантах здійснення, це антитіло зв'язується з рецепторами Notch2 і Notch3 людини. У деяких варіантах здійснення, це антитіло зв'язується з EGF10 Notch2-рецептора людини і EGF9 Notch3-рецептора людини. У іншому варіанті здійснення, цей винахід забезпечує антитіло, яке конкурує з таким антитілом за специфічне зв'язування з незв'язуючою ліганд областю позаклітинного домену Notch2 в аналізі конкурентного зв'язування. Забезпечені також фармацевтичні композиції, що містять ці антитіла, і способи лікування раку, що передбачають введення терапевтично ефективних кількостей цих антитіл. Забезпечені також способи інгібування ангіогенезу, що передбачають введення цих композицій. У деяких варіантах здійснення кожного з вищезазначених аспектів або варіантів, а також інших аспектів і/або варіантів, описаних тут у іншому місці, це антитіло специфічно зв'язується як з Notch2 людини, так і Notch3 людини. У деяких варіантах здійснення кожного з вищезазначених аспектів або варіантів, а також інших аспектів і/або варіантів, описаних у іншому місці тут, це антитіло є рекомбінантним антитілом. У деяких варіантах здійснення, це антитіло є моноклональним антитілом. У деяких варіантах здійснення, це антитіло є химерним антитілом. У деяких варіантах здійснення, це антитіло є гуманізованим антитілом. У деяких варіантах здійснення, це антитіло є антитілом людини. У деяких варіантах здійснення, це антитіло є моновалентним, бівалентним або мультивалентним. У деяких варіантах здійснення, це антитіло є моноспецифічним антитілом. У деяких варіантах здійснення, окремий антигензв'язуючий сайт цього антитіла зв'язує (або здатний зв'язувати) незв'язуюча ліганд область позаклітинного домену більш ніж одного Notchрецептора людини (наприклад, Notch 2 і Notch3). У деяких альтернативних варіантах здійснення, це антитіло є біспецифічним антитілом. У деяких варіантах здійснення, це антитіло є IgG1-антитілом. У деяких варіантах здійснення, це антитіло є IgG2-антитілом. У деяких варіантах здійснення, це антитіло кон'юговано з цитотоксичною частиною. В деяких варіантах здійснення, це антитіло є виділеним. У додаткових варіантах здійснення, це антитіло є по суті чистим. У деяких варіантах здійснення кожного з вищезазначених аспектів або варіантів, а також інших аспектів і/або варіантів, описаних у іншому місці тут, рак або пухлина, які лікують цим антитілом, є раком або пухлиною молочної залози, колоректальним раком або пухлиною, раком або пухлиною легенів, підшлункової залози, передміхурової залози або голови й шиї. У деяких варіантах здійснення, ці рак або пухлина є меланомою. В деяких варіантах здійснення, ці рак або пухлина є раком або пухлиною молочної залози. В деяких варіантах здійснення, ці рак або пухлина є колоректальним раком або колоректальною пухлиною. В деяких варіантах 8 UA 101671 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 здійснення, ці рак або пухлина є раком або пухлиною підшлункової залози. В деяких варіантах здійснення, ці рак або пухлина є раком або пухлиною передміхурової залози. В деяких варіантах здійснення кожного з вищезазначених аспектів або варіантів, а також інших аспектів і/або варіантів, описаних у іншому місці тут, способи лікування раку включають інгібування зростання пухлини. В деяких варіантах здійснення, способи лікування раку передбачають зменшення онкогенності пухлин (наприклад, зменшенням випадків (частоти) ракових стволових клітин у цій пухлині). У деяких варіантах здійснення кожного з вищезазначених аспектів або варіантів, а також інших аспектів і/або варіантів, описаних у іншому місці тут, ці антагоніст або антитіло вводять у комбінації з додатковою терапією раку. В деяких варіантах здійснення, ця додаткова терапія раку включає променеву терапію, хіміотерапію і/або додаткове терапевтичне антитіло. В деяких варіантах здійснення, ця додаткова терапія для раку включає хіміотерапевтичний агент. У деяких варіантах здійснення, цей хіміотерапевтичний агент включає паклітаксел (наприклад, ТАКСОЛ), іринотекан, гемцитабін і оксаліплатин. У деяких варіантах здійснення, додаткове терапевтичне антитіло є антитілом, яке специфічно зв'язує Notch-рецептор людини (наприклад, Notch1, 2, 3 або 4), або ліганд Notch-рецептора людини (наприклад, DLL4 або JAG1). У деяких варіантах здійснення, це додаткове терапевтичне антитіло є анти-DLL4-антитілом. У деяких варіантах здійснення, додаткове терапевтичне антитіло є антитілом, яке специфічно зв'язує ендотеліальний чинник зростання судин (VEGF). У деяких варіантах здійснення, це додаткове терапевтичне антитіло зв'язує рецептор VEGF. У деяких варіантах здійснення кожного з вищезазначених аспектів або варіантів, а також інших аспектів і/або варіантів, описаних у іншому місці тут, це антитіло вводять суб'єктові в комбінації з другим терапевтичним агентом, який є антиангіогенним агентом. Крім того, цей винахід забезпечує клітинні лінії (наприклад, гібридомні клітинні лінії), що містять або продукують антитіла або інші поліпептиди, описані тут. Забезпечені також полінуклеотиди (наприклад, вектори), що включають полінуклеотиди, що кодують поліпептиди або варіабельні області легкого ланцюга або варіабельні області важкого ланцюга описаних тут антитіл, а також клітинні лінії, що містять такі полінуклеотиди. У деяких варіантах здійснення, даний винахід забезпечує спосіб лікування раку, де цей рак містить ракові стволові клітини, що передбачає введення цьому суб'єктові терапевтично ефективної кількості антитіла, яке зв'язує Notch-рецептор. У конкретнішому аспекті, даний винахід забезпечує спосіб лікування раку, де цей рак містить стволові клітини, експресуючі один або декілька членів сімейства Notch-рецепторів, що передбачає введення цьому суб'єктові терапевтично ефективної кількості антитіла, яке зв'язує ці члени сімейства Notch-рецепторів. Даний винахід забезпечує антитіла, які зв'язуються з незв'язуючою ліганд областю позаклітинного домену Notch-рецептора людини і є терапевтично ефективними проти раку. Таким чином, у деяких варіантах здійснення, даний винахід забезпечує антитіло, яке специфічно зв'язується з незв'язуючою ліганд областю позаклітинного домену Notch-рецептора людини і яке інгібує зростання пухлини. У деяких варіантах здійснення, даний винахід додатково забезпечує спосіб лікування раку, причому цей спосіб передбачає введення терапевтично ефективної кількості антитіла, яке специфічно зв'язується з незв'язуючою ліганд областю позаклітинного домену білка Notch-рецептора людини й інгібує зростання пухлини. Тут обговорюються різні переваги використання антитіла, яке зв'язує члени сімейства Notchрецепторів або ліганди до цих Notch-рецепторів для лікування таких ракових захворювань. У деяких варіантах здійснення, деякі Notch-рецептори високо експресуються в певних солідних пухлинах, наприклад, молочної залози й ободової кишки, й це забезпечує вмістище для активного лікарського засобу, де цей лікарський засіб зв'язується з Notch-рецептором. Зрозуміло, що антитіла, які зв'язують надекспресовані Notch-рецептори, мають кращий профіль безпеки, ніж існуючі доступні хіміотерапевтичні лікарські засоби. Далі, цей винахід забезпечує спосіб лікування раку в людини, що має рак, що містить ракові стволові клітини, не характеризується надекспресією раковою стволовою клітиною одного або декількох Notch-рецепторів, що передбачає введення цій людині терапевтично ефективної кількості антитіла, яке зв'язується з Notch-рецептором і блокує активацію лігандом Notchрецептора. Цей винахід додатково забезпечує спосіб лікування раку в людини, що передбачає введення цій людині терапевтично ефективних кількостей (a) першого антитіла, яке зв'язує Notch-рецептор і інгібує зростання або проліферацію ракових стволових клітин, які надекспресують Notch-рецептори; і (b) другого антитіла, яке зв'язує Notch-рецептор і блокує активацію лігандом Notch-рецептора. 9 UA 101671 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід забезпечує також спосіб лікування раку, де цей рак вибраний з групи, що складається з раку молочної залози, раку ободової кишки, ректального й колоректального раку, що передбачає введення терапевтично ефективної кількості антитіла, яке зв'язує Notch. Цей винахід забезпечує також інший спосіб лікування раку, де цей рак вибраний з групи, що складається з раку молочної залози, раку ободової кишки, підшлункової залози, передміхурової залози, легені, ректального й колоректального раку, що передбачає введення терапевтично ефективної кількості антитіла, яке блокує активацію лігандом Notch-рецептора. Цей винахід забезпечує також ще один спосіб лікування раку, де цей рак вибраний з групи, що складається з раку молочної залози, ободової кишки, підшлункової залози, передміхурової залози, легені, ректального й колоректального раку, що передбачає введення терапевтично ефективної кількості антитіла, яке зв'язує Notch, і антитіла, яке блокує активацію лігандом Notch-рецептора. У наступних варіантах здійснення, цей винахід забезпечує промислові вироби для застосування (серед іншого) у вищеописаних способах. Наприклад, цей винахід забезпечує промисловий виріб, що містить контейнер і композицію, що міститься в ньому, де ця композиція містить антитіло, яке зв'язує Notch, і додатково містить вкладиш упаковки, який вказує, що ця композиція може бути використана для лікування раку, що містить ракові стволові клітини. У деяких варіантах здійснення, цей винахід забезпечує промисловий виріб, що містить контейнер і композицію, що міститься в ньому, де ця композиція містить антитіло, яке зв'язує Notch, і додатково містить вкладиш упаковки, який вказує, що ця композиція може бути використана для лікування раку, що містить ракові стволові клітини, які експресують один або декілька Notchрецепторів. У деяких варіантах здійснення, цей винахід відноситься до промислового виробу, що містить контейнер і композицію, що міститься в ньому, де ця композиція містить антитіло, яке зв'язує Notch-рецептор і блокує активацію лігандом Notch-рецептора, й додатково містить вкладиш упаковки, який вказує, що ця композиція може бути використана для лікування раку, де цей рак містить ракові стволові клітини, які не характеризуються надекспресією Notch-рецептора. У деяких варіантах здійснення забезпечений промисловий виріб, який містить (a) перший контейнер з композицією, що міститься в ньому, де ця композиція містить перше антитіло, яке зв'язує Notch-рецептор та інгібує зростання ракових клітин, що містять ракові стволові клітини, надекспресуючі Notch; і (b) другий контейнер з композицією, що міститься в ньому, де ця композиція містить друге антитіло, яке зв'язує Notch і блокує активацію лігандом Notchрецептора. У деяких варіантах здійснення, забезпечений наступний промисловий виріб, який містить контейнер і композицію, що міститься в ньому, де ця композиція містить антитіло, яке зв'язує Notch і блокує активацію лігандом Notch-рецептора, і, крім того, містить вкладиш упаковки, який указує, що ця композиція може бути використана для лікування раку, вибраного з групи, що складається з раку ободової кишки, підшлункової залози, передміхурової залози, легені й колоректального раку. Цей винахід додатково забезпечує: антитіло (наприклад, антитіло людини або гуманізоване антитіло), яке зв'язує Notch і блокує активацію лігандом Notch-рецептора; композицію, що містить це антитіло й фармацевтично прийнятний носій; і імунокон'югат, що містить це антитіло, кон'юговане з цитотоксичним агентом. У одному аспекті, цей винахід забезпечує виділений полінуклеотид, що кодує будь-яке з антитіл або поліпептидів вищезазначених аспектів або варіантів здійснення, а також інших аспектів і/або варіантів здійснення, описаних у іншому місці тут. У деяких варіантах здійснення, цей винахід забезпечує вектор, що містить цей полінуклеотид. У деяких варіантах здійснення, клітина-хазяїн містить цей полінуклеотид або цей вектор. У інших варіантах здійснення, спосіб одержання цього антитіла передбачає культивування клітини-хазяїна, що містить цей полінуклеотид, так що цей полінуклеотид експресується і, необов'язково, додатково передбачає витягання цього антитіла з культури клітини-хазяїна (наприклад, з культурального середовища клітини-хазяїна). Крім того, цей винахід забезпечує виділений полінуклеотид, що кодує гуманізоване антитіло або антитіло людини, як описано у вищезазначених варіантах здійснення або аспектах, а також описаних у іншому місці тут; вектор, що містить цей полінуклеотид; клітину-хазяїна, що містить цей полінуклеотид або вектор; а також спосіб одержання цього антитіла, що передбачає культивування клітини-хазяїна, що містить цей полінуклеотид, так що цей полінуклеотид експресується, і що необов'язково передбачає додаткове витягання цього антитіла з культури клітини-хазяїна (наприклад, з культурального середовища клітини-хазяїна). Цей винахід додатково відноситься до імунокон'югату, що містить антитіло, яке зв'язує Notch, кон'югованого з однією або декількома молекулами каліхеаміцину, і застосування таких 10 UA 101671 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кон'югатів для лікування Notch-експресуючого раку, наприклад, раку, в якому ракові стволові клітини надекспресують Notch. Коли аспекти або варіанти цього винаходу описуються у вигляді формули Маркуша або іншого групування альтернатив, у тому числі, але не лише, груп альтернатив, розділених за допомогою "і/або" або "або", даний винахід включає не лише всю цю групу, перераховану в цілому, але й кожен член цієї групи окремо й усі можливі підгрупи цієї основної групи, а також основну групу, в якій відсутні один або декілька членів цієї групи. Даний винахід передбачає також певне виключення одного або декількох членів цієї групи в заявленому винаході. Наприклад, такий вираз, як "X і/або Y", включає "X" окремо, "Y" окремо, а також "X" і "Y" разом. КОРОТКИЙ ОПИС ІЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРІАЛУ/ФІГУР Фігура 1. Антитіла й варіанти 59R1 зв'язують Notch2 людини і блокують зв'язування ліганду. (A) FACS-аналіз зв'язування фрагмента Fab 59R1 з Notch2 людини. "Клон 1" є Fab 59R1, який, як було показано, зв'язує Notch2 людини на стабільно трансфікованих клітинах HEK293. "Клон 5" є Fab іншого клона, виділеного з фагової бібліотеки, який не зв'язує Notch2. (B) FACS-аналіз блокування зв'язування ліганду (JAG1) фрагментом Fab 59R1. "Клон 1" є Fab 59R1, який, як було показано, блокує зв'язування злиття hJagged1 ECD-Fc з Notch2 людини на стабільно трансфікованих клітинах HEK293. "Клон 5" є Fab іншого клона, виділеного з фагової бібліотеки, який не блокував зв'язування ліганду в цьому аналізі. (C) FACS-аналіз зв'язування антитіла IgG2 59R1 IgG2 з Notch2 людини на стабільно трансфікованих клітинах HEK293. (D) FACSаналіз блокування зв'язування ліганду (DLLA) антитілом IgG2 59R1. Було показано, що антитіло IgG2 59R1 блокує зв'язування злиття hDLL4 ECD-Fc з Notch2 людини на стабільно трансфікованих клітинах HEK293. (E) Стратегія дозрівання афінності для CDR3 важкого ланцюга 59R1. Вихідна послідовність CDR3 важкого ланцюга показана у вигляді боксу. Зміни залишків, що допускаються, показані нижче за цю вихідну послідовність на цій фігурі. (F) Скринінг послідовностей 59R1 із зрілою афінністю на здатність блокування JAG1. Покращувані варіанти вказані стрілками. Фігура 2. FACS-аналіз перехресної реактивності антитіла IgG2 59R1 з чотирма гомологами Notch людини. Було виявлено, що 59R1 зв'язує hNotch2 і hNotch3 на транзиторно трансфікованих клітинах HEK-293, але не було виявлено, що він виявляє значиме зв'язування з hNotch1 і hNotch4 на тих самих клітинах. Фігура 3. Картування епітопів антитіла 59R1. (A) Анти-Notch2/3-антитіло 59R1 зв'язується з EGF-повтором 10 Notch2 людини. Супернатант з клітин HEK-293, експресуючих рекомбінантні злиті білки Notch2-Fc з указаними EGF-повторами Notch2 між 1 і 12 (x-вісь), використовували в ELISA з анти-Notch2/3-антитілом 59R1. OD (y-вісь) показала зв'язування антитіла (заштриховані стовпці) лише зі злитими білками Notch2, що містять EGF-повтор 10. (Ця фігура показує дані, отримані з двох окремих експериментів, які показані окремо у верхній і нижній діаграмах). (B) EGF-повтори 11 і 12 не беруть участь у зв'язуванні анти-Notch2/3-антитіла 59R1 з повнорозмірним hNotch2. FACS-аналіз клітин HEK-293, трансфікованих лише зеленим флуоресцентним білком (GFP) (x-вісь) (вгорі зліва) або котрансфікованих GFP і або повнорозмірним інтактним Notch2, або повнорозмірним Notch 2 з делетованим EGF-повтором 11 (ΔEGF11), або з делетованим EGF-повтором 12 (ΔEGF12). Зв'язування 59R1 показано вздовж y-осі (РЕ) зі всіма трьома білками Notch2 в GFP-експресуючих клітинах. (C) EGF-повтор 10 бере участь у зв'язуванні анти-Notch2/3-антитіла 59R1 з повнорозмірним hNotch2, але не у зв'язуванні ліганду. Зв'язування анти-Notch2-антитілом 59M70, яке зв'язується з EGF 1-4 hNotch2, вказано як "анти-Notch2-зв'язування". Зв'язування DLL4 вказане як "зв'язування ліганду". Фігура 4. Анти-Notch2/3-антитіло 59R1 інгібує передачу сигналу Notch2 в аналізах з люциферазою як репортер. (A) 59R1 блокує hDLL4-індуковану репортерну активність Notch2. (B) 59R1 блокує hJAG1-індуковану репортерну активність Notch2. (C) 59R1 блокує hJAG2індуковану репортерну активність Notch2. Фігура 5. Антитіло 59R1 проти Notch2/3-рецепторів інгібує утворення пухлини і зростання пухлини in vivo. (A) Анти-Notch2/3 (59R1) інгібує утворення пухлин молочної залози Ре13. Мишей NOD/SCID, ін'єктованих пухлинними клітинами молочної залози PE13, обробляли контрольним антитілом (квадрати) або анти-Notch2/3-антитілом 59R1 (білі трикутники) через 3 два дні після ін'єкції клітин і об'єм пухлини (y-вісь, мм ) вимірювали впродовж часу (x-вісь, дні після ін'єкції клітин). Обробка антитілами 59R1 значимо інгібувала утворення пухлин порівняно з контролем (p < 0,001). (B) Анти-Notch2/3 (59R1) інгібує утворення пухлин молочної залози Т3. Мишей NOD/SCID, ін'єктованих пухлинними клітинами молочної залози Т3, обробляли контрольним антитілом (квадрати) або анти-Notch2/3-антитілом 59R1 (білі трикутники) через 3 два дні після ін'єкції клітин і об'єм пухлини (y-вісь, мм ) вимірювали впродовж часу (x-вісь, дні 11 UA 101671 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 після ін'єкції клітин). Обробка антитілами 59R1 значимо інгібувала утворення пухлин порівняно з контролем (p < 0,001). (C) Анти-Notch2/3 (59R1) інгібує зростання пухлини ободової кишки Colo205. 6-8-тижневих імунодефіцитних самок мишей bg/nu XID на фенотипі Swiss CD-1, ін'єктованих контрольним антитілом (квадрати) або анти-Notch2/3-антитілом 59R1 (ромби) після 3 3 того, як об'єм пухлин досягав розміру 65-200 мм . Середній розмір пухлин (y-вісь, мм ) вимірювали впродовж часу (x-вісь, дні після ін'єкції клітин). Обробка антитілами 59R1 інгібувала утворення пухлин порівняно з контролем (***p