Стійка до гербіцидів рослина сої і спосіб її ідентифікації

Реферат: Винахід стосується трансгенної рослини, рослинного матеріалу і насіння сої, що містять в своєму геномі трансформаційні події стійкості до гербіцидів по специфічних положеннях у межах геному сої, а саме події EE-GM2 та EE-GM3. Винахід належить також до способів та засобів для швидкої й однозначної ідентифікації цих події в біологічних зразках. UA 114171 C2 (12) UA 114171 C2 UA 114171 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Перехресні посилання на родинні заявки Справжня заявка претендує на пріоритет відповідно до попередньої заявки на патент США No 61/367251, поданої 23 липня 2010 р.; попередньої заявки на патент США No 61/263707, поданої 23 листопада 2009 р.; і попередньої заявці на європейський патент No EP 09014565.7, поданої 23 листопада 2009 р., вміст кожної з яких повністю включено в даний документ шляхом посилання. Галузь техніки Даний винахід відноситься до трансгенних рослин, рослинного матеріалу та насіння сої, що характеризується вмістом щонайменше двох специфічних трансформаційних подій, зокрема, присутністю щонайменше двох наборів генів, що кодують білки, що надають стійкість до гербіцидів, кожний з яких характеризується специфічним положенням у геномі сої. Рослини сої, відповідно до винаходу, поєднують фенотип стійкості до гербіцидів з агрономічною продуктивністю, генетичною стабільністю й функціональністю в різному генетичному оточенні, еквівалентними нетрансформованій лінії сої за відсутності гербіциду(ів). Крім того, даний винахід представляє способи й набори для ідентифікації присутності рослинного матеріалу, що включає спеціалізовані трансформаційні події EE-GM3 і EE-GM2 або EE-GM1, у біологічних зразках. Рівень техніки Фенотіпова експресія трансгену в рослинах визначається як структурою гена або генів самих по собі, так і його або їх положенням у геномі рослини. У той же час присутність трансгенів або "чужорідної ДНК" по різних положеннях у межах геному різними шляхами впливає на загальний фенотип рослини. Агрономічно або промислово успішне включення шляхом генетичної маніпуляції в організм рослини ознаки, що представляє інтерес із комерційної точки зору, залежно від різних факторів, може являти собою тривалу процедуру. Фактична трансформація й регенерація генетично трансформованої рослини є лише першим етапом селекції, що включає розширене дослідження генетичних характеристик, схрещування й польові випробування, в остаточному підсумку, що призводять до селекції елітної події. Важливість однозначної ідентифікації елітної події зростає у світлі обговорення нових харчових продуктів/кормів, розподілу продуктів на основі генетично модифікованих і немодифікованих організмів та ідентифікації патентованих матеріалів. В ідеалі такий спосіб ідентифікації є як швидким, так і простим, не потребуючим масштабного лабораторного устаткування. Крім того, цей спосіб повинен забезпечувати результати, що дозволяють однозначно визначити елітну подію без експертної інтерпретації, однак, за необхідністю, що витримують експертну оцінку. Спеціалізовані інструменти для ідентифікації елітних подій EEGM3 і EE-GM1 або EE-GM2 у біологічних зразках описані в даній заявці. У даному винаході EE-GM3 ідентифікували як елітну подію з популяції трансгенних рослин сої при розробці сої культурної (Glycine max), стійкої до гербіцидів, що включає ген, що кодує стійкість до гліфосату, у комбінації з геном, що надає стійкість до інгібіторів 4гідроксифенілпіруватдіоксигенази (HPPD), кожний з яких знаходиться під контролем промотору, що забезпечує експресію в рослинній клітині. EE-GM1 і EE-GM2 раніше ідентифікували як елітні події з популяції трансгенних рослин сої при розробці сої культурної (Glycine max), стійкої до гербіцидів, що включає ген, що кодує стійкість до глюфосинату, що знаходиться під контролем промотору, що забезпечує експресію в рослинній клітині, і описали в заявках W02006/108674 та W02006/108675 (обидві публікації включені в даний документ шляхом посилання). У літературі описані рослини сої, що містять ген стійкості до гербіцидів. Однак, жодна з відомих публікацій не повідомляє про даний винахід. У даній галузі техніки відомо, що одержання комерційної елітної трансформаційної події стійких до гербіцидів рослин сої, що мають прийнятну агрономічну продуктивність без погіршення врожайності й достатньою стійкістю до гербіцидів трьох різних класів, є далеко не простим завданням. Дійсно, повідомлялося, що перша подія сої (подія 40-3-2), що надійшла на ринок як стійка до гербіцидів, характеризувалася значним погіршенням урожайності в порівнянні з ізогенними або приблизно ізогенними лініями (Elmore et al. (2001) Agron. J. 93:408-412). ТМ ТМ Крім того, була виведена соя Optimum GAT (подія 356043), що поєднувала властивості стійкості до гліфосату зі стійкістю до гербіцидів, що діють на ацетолактатсинтазу, однак, повідомлялося, що ця соя сама по собі не відповідала стандартам стійкості до гліфосату (поза комбінацією з іншою подією стійкості сої до гліфосату (наприклад, подією 40-3-2) (див., наприклад, www.bloomberg.com/apps/news?pid=newsarchive&sid=ad4L0hH9MKWE)). Сутність винаходу 1 UA 114171 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід відноситься до трансгенних рослин сої або їх насіння, клітин і тканин, що містять стабільно інтегровану в їх геном експресійну касету, що включає ген стійкості до гербіциду, що включає послідовність, що кодує, гена 2mEPSPS, і ще один ген стійкості до гербіциду, що включає послідовність, що кодує, HPPD-PF W336 (відповідно до опису в Прикладі 1.1 даної заявки і як представлено в SEQ ID No 1), а також другу експресійну касету, що включає ген стійкості до гербіциду, що містить послідовність, що кодує, фосфінотрицинацетилтрансферази відповідно до опису в Прикладі 1 даної заявки і як представлено в SEQ ID No 11. Трансгенні рослини сої або їх насіння, клітини або тканини стійкі до гербіцидів на основі гліфосата, глюфосината та гербіцида-інгібітора HPPD, наприклад, ізоксафлютолу, а при відсутності гербіцидів - мають агрономічну продуктивність, у значній мірі еквівалентну продуктивності нетрансгенної ізогенної лінії. Після застосування одного або більше гербіцидів, до яких рослина має стійкість, вона демонструє агрономічний фенотип, що перевершує фенотип нетрансгенної рослини. Згідно із даним винаходу рослини сої або їх насіння, клітини або тканини містять елітну подію EE-GM3 та EE-GM1 або EE-GM3 та EE-GM2. Зокрема, даний винахід відноситься до трансгенних рослин сої, їх насіння, клітин або тканин, геномна ДНК яких характеризується тим, що її аналіз, відповідно до протоколу ПЦРідентифікації, як описано тут, з використанням двох праймерів до 5'- або 3'-фланкуючої ділянки EE-GM3 і чужорідної ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів в EE-GM-3, відповідно, виявляє фрагмент, специфічний для EE-GM3, і, крім того, аналіз, відповідно до протоколу ПЦРідентифікації, як описано тут, з використанням двох праймерів до 5'- або 3'-фланкуючої ділянки EE-GM1 або EE-GM2 і чужорідної ДНК, що включає гени стійкості до глюфосинату, відповідно, виявляє фрагмент, специфічний для EE-GM1 або EE-GM2. Мішенню праймерів для виявлення EE-GM3 можуть бути 5'-фланкуюча ділянка у межах SEQ ID No: 2 і чужорідна ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів, відповідно. Мішенню праймерів для виявлення EE-GM3, наприклад, праймерів, що включають або складаються (головним чином) з нуклеотидної послідовності SEQ ID No: 5 і SEQ ID No: 4 або SEQ ID No.: 7, відповідно, також можуть бути 3'-фланкуюча ділянка у межах SEQ ID No: 3 і чужорідна ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів, відповідно, і праймери виявляють фрагмент ДНК розміром від 100 до 800 п.о., наприклад, фрагмент розміром приблизно 263 п.о. або приблизно 706 п.о. Мішенню праймерів для виявлення EEGM1 можуть бути 5'-фланкуюча ділянка у межах SEQ ID No: 12 і чужорідна ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів, відповідно. Мішенню праймерів для виявлення EE-GM1, наприклад, праймерів, що включають або складаються (головним чином) з нуклеотидної послідовності SEQ ID No: 16 і SEQ ID No: 17, відповідно, також можуть бути 3'-фланкуюча ділянка у межах SEQ ID No: 13 і чужорідна ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів, відповідно, і праймери виявляють фрагмент ДНК розміром від 100 до 500 п.о., наприклад, фрагмент розміром приблизно 183 п.о. Мішенню праймерів для виявлення EE-GM2 можуть бути 5'-фланкуюча ділянка у межах SEQ ID No: 14 і чужорідна ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів, відповідно. Мішенню праймерів для виявлення EE-GM2, наприклад, праймерів, що включають або складаються (головним чином) з нуклеотидної послідовності SEQ ID No: 18 і SEQ ID No: 19, відповідно, також можуть бути 3'-фланкуюча ділянка у межах SEQ ID No: 15 і чужорідна ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів, відповідно, при цьому праймери виявляють фрагмент ДНК розміром від 100 до 500 п.о., наприклад, фрагмент розміром приблизно 151 п.о. Еталонне насіння, що містить елітну подію EE-GM3, відповідно до винаходу, депоновано в NCIMB під номером доступу NCIMB 41659. Еталонне насіння, що містить елітну подію EE-GM1, відповідно до винаходу, депоновано в NCIMB під номером доступу NCIMB 41658. Еталонне насіння, що містить елітну подію EE-GM2, відповідно до винаходу, депоноване в NCIMB під номером доступу NCIMB 41660. Еталонне насіння, що містить елітну подію EE-GM3 і EE-GM1, було депоновані в ATCC під номером доступу PTA-11041. Еталонне насіння, що містить елітну подію EE-GM3 і EE-GM2, було депоновано в ATCC під номером доступу PTA-11042. Один з варіантів втілення винаходу являє собою насіння, що містить елітну подію EE-GM3 (еталонне насіння, що містить зазначену подію й депоноване в NCIMB під номером доступу NCIMB 41659), і, крім того, що містить елітну подію EE-GM1 (еталонне насіння, що містить зазначену подію й депоноване в NCIMB під номером доступу NCIMB 41658), або насіння, що містить подію EE-GM3 і EE-GM1 (еталонне насіння, що містить зазначені події й депоновано в ATCC під номером доступу PTA-11041), які виростають у рослини сої, стійкі щонайменше до трьох гербіцидів, зокрема, стійкі до гліфосату та/або інгібіторів HPPD, наприклад, ізоксафлютолу та/або інгібіторів гултамінсинтази, наприклад, глюфосинату. Ще один з варіантів втілення винаходу являє собою насіння, що містить елітну подію EEGM3 (еталонне насіння, що містить зазначену подію й депоновано в NCIMB під номером 2 UA 114171 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 доступу NCIMB 41659), і, крім того, що містить елітну подію EE-GM2 (еталонне насіння, що містить зазначену подію й депоновано в NCIMB під номером доступу NCIMB 41660), або насіння, що містить подію EE-GM3 і EE-GM2 (еталонне насіння, що містить зазначені події й депоновано в ATCC під номером доступу PTA-11042), які виростають у рослини сої, стійкі щонайменше до трьох гербіцидів, зокрема, стійкі до гліфосату та/або інгібіторів HPPD, наприклад, ізоксафлютолу та/або інгібіторів гултамінсинтази, наприклад, глюфосинату. Насіння, депоноване в NCIMB під номером доступу NCIMB 41659, являє собою партію насіння, що складається щонайменше приблизно на 95 % з трансгенного насіння, що містить елітну подію EE-GM3, яке виростає у рослини, стійкі до гербіцидів, причому ці рослини є стійкими до гліфосату та/або ізоксафлютолу. Насіння або потомство насіння, одержуване або одержане з депонованого насіння (наприклад, після схрещування з іншими рослинами сої з іншим генетичним оточенням), можна висіяти й обробити зростаючі рослини гліфосатом або інгібіторами HPPD, наприклад, ізоксафлютолом, як описано тут, одержуючи рослини, стійкі до гліфосату або ізоксафлютолу, що містять елітну подію EE-GM3. Насіння, депоноване в NCIMB під номером доступу NCIMB 41658 і NCIMB 41660, являє собою партії насіння, що складаються щонайменше приблизно на 95 % з трансгенного насіння, що містить елітні події EE-GM1 або EE-GM2, відповідно, які виростають у рослини, стійкі до гербіцидів, причому ці рослини є стійкими до глюфосинату. Це насіння можна висіяти та обробити зростаючі рослини глюфосинатом, одержуючи рослини, стійкі до глюфосинату, що містять елітні події EE-GM1 або EE-GM2. Насіння, депоноване в ATCC під номером доступу PTA-11041, являє собою партію насіння, що складається щонайменше приблизно на 95 % з трансгенного насіння, що містить елітну подію EE-GM3 і елітну подію EE-GM1 у гомозиготній формі, яке виростає у рослини, стійкі до гербіцидів, причому ці рослини є стійкими до гліфосату, глюфосинату та/або ізоксафлютолу. Насіння або потомство насіння, одержуване або одержане з депонованого насіння (наприклад, після схрещування з іншими рослинами сої з іншим генетичним оточенням), можна висіяти й обробити зростаючі рослини гліфосатом, глюфосинатом або інгібіторами HPPD, наприклад, ізоксафлютолом, як описано тут, одержуючи рослини, стійкі до гліфосату, глюфосинату або ізоксафлютолу, що містять елітну подію EE-GM3 і EE-GM1. Насіння, депоноване в ATCC під номером доступу PTA-11042, являє собою партію насіння, що складається щонайменше приблизно на 95 % із трансгенного насіння, що містить елітну подію EE-GM3 і елітну подію EE-GM2 у гомозиготній формі, яке виростає у рослини, стійкі до гербіцидів, причому ці рослини є стійкими до гліфосату, глюфосинату та/або ізоксафлютолу. Насіння або потомство насіння, одержувані або одержані з депонованого насіння (наприклад, після схрещування з іншими рослинами сої з іншим генетичним оточенням), можна висіяти й обробити зростаючі рослини гліфосатом, глюфосинатом або інгібіторами HPPD, наприклад, ізоксафлютолом, як описано тут, одержуючи рослини, стійкі до гліфосату, глюфосинату або ізоксафлютолу, що містять елітну подію EE-GM3 і EE-GM2. Даний винахід, крім того, відноситься до клітин, тканин і потомства рослини, що містить елітну подію EE-GM3 і, крім того, що містить елітну подію EE-GM1, які можна одержати шляхом вирощування рослини, що містить елітну подію EE-GM3 і EE-GM1, депонованого в ATCC як PTA-11041, або вирощування рослини, що містить елітну подію EE-GM3, з насіння, депонованого в NCIMB під номером доступу NCIMB 41659, і схрещування зазначеної рослини з рослиною, що містить елітну подію EE-GM1, вирощеною з насіння, депонованого в NCIMB під номером доступу NCIMB 41658. Даний винахід також відноситься до клітин, тканин і потомства рослини, що містить елітну подію EE-GM3 і, крім того, що містить елітну подію EE-GM2, які можна одержати шляхом вирощування рослини, що містить елітну подію EE-GM3 і EE-GM2, депонованого в ATCC як PTA-11042, або вирощування рослини, що містить елітну подію EEGM3, з насіння, депонованого в NCIMB під номером доступу NCIMB 41659, і схрещування зазначеної рослини з рослиною, що містить елітну подію EE-GM2, вирощеною з насіння, депонованого в NCIMB під номером доступу NCIMB 41660. Даний винахід, крім того, відноситься до рослин, які можна одержати з (наприклад, шляхом розмноження та/або схрещування з) рослиною або насінням сої відповідно до опису безпосередньо перед цим. Даний винахід також відноситься до рослин сої, що містять елітну подію EE-GM3 і EE-GM1 або EE-GM3 і EE-GM2. Даний винахід, крім того, відноситься до способу ідентифікації трансгенної рослини або її клітин, або тканин, що містять елітну подію EE-GM3 і EE-GM1 або EE-GM3 і EE-GM2, заснованому на ідентифікації присутності характерних послідовностей ДНК або амінокислотних послідовностей, що кодуються такими послідовностями ДНК трансгенної рослини, клітин або тканин. Відповідно до кращого варіанта втілення даного винаходу такі характерні послідовності 3 UA 114171 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ДНК являють собою послідовності довжиною щонайменше 15 п.о., 15 п.о., щонайменше 20 п.о., 20 п.о. або 30 п.о., або більше, що містять сайти інсерції події, тобто як фрагмент вставленої чужорідної ДНК, що містить гени стійкості до гербіцидів, так і фрагмент генома сої (5'- або 3'фланкуючу ділянку), зістиковані один з одним, що дає можливість специфічної ідентифікації елітної події. Даний винахід, крім того, відноситься до способів ідентифікації елітних подій EE-GM3 і EEGM1 або елітних подій EE-GM3 і EE-GM2 у біологічних зразках, способів, заснованих на використанні праймерів або зондів, що специфічно розпізнають 5'- та/або 3'-фланкуючу послідовність чужорідної ДНК в EE-GM3 і EE-GM1 або EE-GM3 і EE-GM2, що включає гени стійкості до гербіцидів. Зокрема, даний винахід відноситься до способу, що включає ампліфікацію двох нуклеотидних послідовностей, що є присутніми у біологічних зразках, за допомогою двох полімеразних ланцюгових реакцій і щонайменше чотирьох праймерів, причому перший праймер розпізнає 5'- або 3'-фланкуючу ділянку чужорідної ДНК в EE-GM3, що включає гени стійкості до гербіцидів, другий праймер розпізнає послідовність у межах чужорідної ДНК в EE-GM3, що включає гени стійкості до гербіцидів, третій праймер розпізнає 5'- або 3'-фланкуючу ділянку чужорідної ДНК в EE-GM1 або EE-GM2, що включає гени стійкості до гербіцидів, а четвертий праймер розпізнає послідовність у межах чужорідної ДНК в EE-GM1 або EE-GM2, що включає гени стійкості до гербіцидів, переважно для одержання двох фрагментів ДНК розміром від 100 до 800 п.о. Праймери для ідентифікації EE-GM3 можуть розпізнавати послідовність у межах 5'фланкуючої ділянки EE-GM3 (SEQ ID No 2, від положення 1 до положення 1451) або в межах 3'фланкуючої ділянки EE-GM3 (комплементарну SEQ ID No 3 від положення 241 до положення 1408) і послідовність у межах чужорідної ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів (комплементарну SEQ ID No 2 від положення 1452 до 1843 або SEQ ID No 3 від положення 1 до положення 240, або SEQ ID No 20 від положення 1452 до положення 16638, або її комплементарний ланцюг), відповідно. Праймер, що розпізнає 3'-фланкуючу ділянку, може включати нуклеотидну послідовність SEQ ID No 5, та праймер, що розпізнає послідовність у межах чужорідної ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів, може включати нуклеотидну послідовність SEQ ID No 4 або SEQ ID No: 7, описані тут. Праймери для ідентифікації EE-GM1 можуть розпізнавати послідовність у межах 5'-фланкуючої ділянки EE-GM1 (SEQ ID No 12, від положення 1 до положення 209) або в межах 3'-фланкуючої ділянки EE-GM1 (комплементарну SEQ ID No 13 від положення 569 до положення 1000) і послідовність у межах чужорідної ДНК, що включає ген стійкості до гербіциду EE-GM1 (комплементарну SEQ ID No 12 від положення 210 до положення 720 або SEQ ID No 13 від положення 1 до положення 568), відповідно. Праймер, що розпізнає 5'-фланкуючу ділянку EE-GM1, може включати нуклеотидну послідовність SEQ ID No. 16, а праймер, що розпізнає послідовність у межах чужорідної ДНК EE-GM1, може включати нуклеотидну послідовність SEQ ID No.: 17, описану тут. Праймери для ідентифікації EE-GM2 можуть розпізнавати послідовність у межах 5'-фланкуючої ділянки EEGM2 (SEQ ID No. 14, від положення 1 до положення 311) або в межах 3'-фланкуючої ділянки EE-GM2 (комплементарну SEQ ID No 15 від положення 508 до положення 1880) і послідовність у межах чужорідної ДНК, що включає ген стійкості до гербіциду EE-GM1 (комплементарну SEQ ID No 14 від положення 312 до положення 810 або SEQ ID No 15 від положення 1 до положення 507), відповідно. Праймер, що розпізнає 3'-фланкуючу ділянку EE-GM2, може включати нуклеотидну послідовність SEQ ID No 18, а праймер, що розпізнає послідовність у межах чужорідної ДНК EE-GM2, може включати нуклеотидну послідовність SEQ ID No 19, описану тут. ПЦР-ампліфікацію можна виконувати одночасно або послідовно. Зокрема, даний винахід відноситься до способу ідентифікації елітної події EE-GM3 і EE-GM1 у біологічних зразках, причому цей спосіб включає ампліфікацію щонайменше двох нуклеотидних послідовностей, що є присутніми у біологічному зразку, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, що використовує два праймери, що включають або складаються (головним чином) з нуклеотидної послідовності SEQ ID No 4 і SEQ ID No 5, відповідно, що призводить до одержання фрагмента ДНК довжиною приблизно 263 п.о., або два праймери, що включають або складаються (головним чином) з нуклеотидної послідовності SEQ ID No 5 і SEQ ID No 7, відповідно, що призводить до одержання фрагмента ДНК довжиною приблизно 706 п.о., і полімеразної ланцюгової реакції, що використовує два праймери, що включають або складаються (головним чином) з нуклеотидної послідовності SEQ ID No 16 і SEQ ID No 17, відповідно, що призводить до одержання фрагмента ДНК довжиною приблизно 183 п.о. Ці дві полімеразні ланцюгові реакції можна здійснювати одночасно або послідовно. Зокрема, даний винахід відноситься до способу ідентифікації елітної події EE-GM3 і EE-GM2 у біологічних зразках, причому цей спосіб включає ампліфікацію щонайменше двох 4 UA 114171 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеотидних послідовностей, що є присутніми у біологічному зразку, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, що використовує два праймери, що включають або складаються (головним чином) з нуклеотидної послідовності SEQ ID No 4 і SEQ ID No 5, відповідно, що призводить до одержання фрагмента ДНК довжиною приблизно 263 п.о., або два праймери, що включають або складаються (головним чином) з нуклеотидної послідовності SEQ ID No 5 і SEQ ID No 7, відповідно, що призводить до одержання фрагмента ДНК довжиною приблизно 706 п.о., і полімеразної ланцюгової реакції, що використовує два праймери, що включають або складаються (головним чином) з нуклеотидної послідовності SEQ ID No 18 і SEQ ID No 19, відповідно, що призводить до одержання фрагмента ДНК довжиною приблизно 151 п.о. Ці дві полімеразні ланцюгові реакції можна здійснювати одночасно або послідовно. Даний винахід, крім того, відноситься до специфічних фланкуючих послідовностям EE-GM3, описаним тут, у комбінації зі специфічними фланкуючими послідовностями EE-GM1, які можна використовувати для розробки специфічних способів ідентифікації одночасної присутності EEGM3 і EE-GM1 у біологічних зразках. Такі комбіновані специфічні фланкуючі послідовності також можна використовувати як еталонний контрольний матеріал при аналізах ідентифікації. Зокрема, даний винахід відноситься до 5'- та/або 3'-фланкуючих ділянок EE-GM3 у комбінації з 5'- та/або 3' фланкуючими ділянками EE-GM1, які можна використовувати для розробки специфічних праймерів і зондів, як описано далі тут. Крім того, як еталонний матеріал можна використовувати молекули нуклеїнових кислот, переважно, довжиною приблизно 150-850 п.о., що включають послідовність, яку можна ампліфікувати за допомогою праймерів, що включають або складаються (головним чином) з нуклеотидної послідовності SEQ ID No 7 і SEQ ID No 5 або SEQ ID No 4 і SEQ ID No 5, у комбінації з молекулами нуклеїнових кислот, що включають послідовність, яку можна ампліфікувати за допомогою праймерів, що включають або складаються (головним чином) з нуклеотидної послідовності SEQ ID No 16 і SEQ ID No 17; зокрема, такі молекули нуклеїнових кислот одержують при використанні таких праймерів у матеріалі, що включає EE-GM3 і EE-GM1. Даний винахід, крім того, також відноситься до специфічних фланкуючих послідовностей EE-GM3, описаних тут, у комбінації зі специфічною фланкуючою послідовністю EE-GM2, які можна використовувати для розробки специфічних способів ідентифікації одночасної присутності EE-GM3 і EE-GM2 у біологічних зразках. Такі комбіновані специфічні фланкуючі послідовності також можна використовувати як еталонний контрольний матеріал при аналізах ідентифікації. А саме, даний винахід відноситься до 5'- та/або 3'-фланкуючих ділянок EE-GM3 у комбінації з 5'- та/або 3' фланкуючими ділянками EE-GM2, які можна використовувати для розробки специфічних праймерів і зондів відповідно до подальшого опису тут. Крім того, як еталонний матеріал можна використовувати молекули нуклеїнових кислот, переважно, довжиною приблизно 150-850 п.о., що включають послідовність, яку можна ампліфікувати за допомогою праймерів, що включають або складаються (головним чином) з нуклеотидної послідовності SEQ ID No 7 і SEQ ID No 5 або SEQ ID No 4 і SEQ ID No 5, у комбінації з молекулами нуклеїнових кислот, що включають послідовність, яку можна ампліфікувати за допомогою праймерів, що включають або складаються (головним чином) з нуклеотидної послідовності SEQ ID No 18 і SEQ ID No 19; зокрема, такі молекули нуклеїнових кислот одержують при використанні таких праймерів у матеріалі, що включає EE-GM3 і EE-GM2. Даний винахід, крім того, відноситься до способів ідентифікації одночасної присутності EEGM3 і EE-GM1 у біологічних зразках, заснованих на використанні таких специфічних праймерів або зондів. Праймери для виявлення EE-GM3 можуть включати, складатися з або головним чином складатися з нуклеотидної послідовності довжиною від 17 до приблизно 200 послідовних нуклеотидів, які вибирають з нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2, від нуклеотида 1 до нуклеотида 1451, або комплементарного ланцюга нуклеотидної послідовності SEQ ID 3, від нуклеотида 241 до нуклеотида 1408, у комбінації із праймерами, що включають, що складаються з або головним чином складаються з нуклеотидної послідовності довжиною від 17 до приблизно 200 послідовних нуклеотидів, які вибирають з нуклеотидної послідовності SEQ ID No 1, наприклад, нуклеотидної послідовності довжиною від 17 до приблизно 200 послідовних нуклеотидів, які вибирають з комплементарного ланцюга нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2, від нуклеотида 1452 до нуклеотида 1843, або нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3, від нуклеотида 1 до нуклеотида 240. Праймери для виявлення EE-GM1 можуть включати, складатися з або головним чином складатися з нуклеотидної послідовності довжиною від 17 до приблизно 200 послідовних нуклеотидів, які вибирають з нуклеотидної послідовності SEQ ID No 12, від нуклеотида 1 до нуклеотида 209, або комплементарного ланцюга нуклеотидної послідовності SEQ ID 13, від нуклеотида 569 до нуклеотида 1000, у комбінації із праймерами, що включають, складаються з або головним чином складаються з нуклеотидної послідовності 5 UA 114171 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 довжиною від 17 до приблизно 200 послідовних нуклеотидів, які вибирають з нуклеотидної послідовності SEQ ID No 11, наприклад, нуклеотидної послідовності довжиною від 17 до приблизно 200 послідовних нуклеотидів, які вибирають з комплементарного ланцюга нуклеотидної послідовності SEQ ID No 12, від нуклеотида 219 до нуклеотида 720, або нуклеотидної послідовності SEQ ID No 13, від нуклеотида 1 до нуклеотида 568. Праймери також можуть включати зазначені нуклеотидні послідовності, розташовані безпосередньо на їх 3'-кінці, і, крім того, включати неспоріднені послідовності або послідовності, що є похідними від зазначених нуклеотидних послідовностей, але містять невідповідності. Даний винахід, крім того, відноситься до способів ідентифікації одночасної присутності EEGM3 і EE-GM2 у біологічних зразках, заснованих на використанні таких специфічних праймерів або зондів. Праймери для виявлення EE-GM3 можуть включати, складатися з або головним чином складатися з нуклеотидної послідовності довжиною від 17 до приблизно 200 послідовних нуклеотидів відповідно до опису в попередньому абзаці. Праймери для виявлення EE-GM2 можуть включати, складатися з або головним чином складатися з нуклеотидної послідовності довжиною від 17 до приблизно 200 послідовних нуклеотидів, які вибирають з нуклеотидної послідовності SEQ ID No 14, від нуклеотида 1 до нуклеотида 311, або комплементарного ланцюга нуклеотидної послідовності SEQ ID No 15, від нуклеотида 508 до нуклеотида 1880, у комбінації із праймерами, що включають, складаються з або головним чином складаються з нуклеотидної послідовності довжиною від 17 до приблизно 200 послідовних нуклеотидів, які вибирають з нуклеотидної послідовності SEQ ID No 11, наприклад, нуклеотидної послідовності довжиною від 17 до приблизно 200 послідовних нуклеотидів, які вибирають з комплементарного ланцюга нуклеотидної послідовності SEQ ID No 14, від нуклеотида 312 до нуклеотида 810, або нуклеотидної послідовності SEQ ID No 15, від нуклеотида 1 до нуклеотида 507. Праймери також можуть включати зазначені нуклеотидні послідовності, розташовані безпосередньо на їх 3'-кінці, і, крім того, включати неспоріднені послідовності або послідовності, що є похідними зазначених нуклеотидних послідовностей, але містять невідповідності. Даний винахід, крім того, відноситься до наборів для ідентифікації елітних подій EE-GM3 і EE-GM1 у біологічних зразках, що включають щонайменше один праймер або зонд, що специфічно розпізнає 5'- та/або 3'-фланкуючу послідовність чужорідної ДНК в EE-GM3, що включає гени стійкості до гербіцидів, і щонайменше один праймер або зонд, що специфічно розпізнає 5'- та/або 3'-фланкуючу послідовність чужорідної ДНК в EE-GM1, що включає гени стійкості до гербіцидів. Даний винахід, крім того, відноситься до наборів для ідентифікації елітних подій EE-GM3 і EE-GM2 у біологічних зразках, що включають щонайменше один праймер або зонд, що специфічно розпізнає 5'- та/або 3'-фланкуючу послідовність чужорідної ДНК в EE-GM3, що включає гени стійкості до гербіцидів, і щонайменше один праймер або зонд, що специфічно розпізнає 5'- та/або 3'-фланкуючу послідовність чужорідної ДНК в EE-GM2, що включає ген стійкості до гербіциду. Набори, відповідно до винаходу, можуть включати, крім праймера, що специфічно розпізнає 5'- або 3'-фланкуючу послідовність EE-GM3 і 5'- або 3'-фланкуючу послідовність EE-GM1, додатковий праймер, що специфічно розпізнає 5'- та/або 3'-фланкуючу послідовність чужорідної ДНК в EE-GM3, що включає гени стійкості до гербіцидів, і додатковий праймер, що специфічно розпізнає послідовність у межах чужорідної ДНК в EE-GM1, що включає гени стійкості до гербіцидів, для використання відповідно до протоколу ПЦР-ідентифікації. Набори, відповідно до винаходу, можуть також включати, крім праймера, що специфічно розпізнає 5'- або 3'-фланкуючу послідовність EE-GM3 і 5'- або 3'-фланкуючу послідовність EEGM2, додатковий праймер, що специфічно розпізнає 5'- та/або 3'-фланкуючу послідовність чужорідної ДНК в EE-GM3, що включає гени стійкості до гербіцидів, і додатковий праймер, що специфічно розпізнає послідовність у межах чужорідної ДНК в EE-GM2, що включає гени стійкості до гербіцидів, для використання відповідно до протоколу ПЦР-ідентифікації. Праймер, що розпізнає 3'-фланкуючу ділянку EE-GM3, може включати нуклеотидну послідовність SEQ ID No 5, а праймер, що розпізнає трансгени чужорідної ДНК в EE-GM3, що включає гени стійкості до гербіцидів, може включати нуклеотидну послідовність SEQ ID No 4 або 7, або будь-який інший праймер або комбінацію праймерів для виявлення EE-GM3, як описано тут, у комбінації із праймером, що розпізнає 5'-фланкуючу ділянку EE-GM1, що може включати нуклеотидну послідовність SEQ ID No 16, і праймером, що розпізнає трансгени чужорідної ДНК в EE-GM1, що включає гени стійкості до гербіцидів, може включати нуклеотидну послідовність SEQ ID No 17. Праймер, що розпізнає 3'-фланкуючу ділянку EE-GM3, може включати нуклеотидну послідовність SEQ ID No 5, а праймер, що розпізнає трансгени чужорідної ДНК в EE-GM3, що 6 UA 114171 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 включає гени стійкості до гербіцидів, може включати нуклеотидну послідовність SEQ ID No 4 або 7, або будь-який інший праймер або комбінацію праймерів для виявлення EE-GM3, як описано тут, у комбінації із праймером, що розпізнає 5'-фланкуючу ділянку в EE-GM2, що може включати нуклеотидну послідовність SEQ ID No 18, і праймером, що розпізнає трансгени чужорідної ДНК в EE-GM2, що включає гени стійкості до гербіцидів, може включати нуклеотидну послідовність SEQ ID No 19. Даний винахід, крім того, відноситься до набору для ідентифікації елітних подій EE-GM3 і EE-GM1 у біологічних зразках, що включає праймери для ПЦР, що включають або складаються (головним чином) з нуклеотидної послідовності SEQ ID No 5 і SEQ ID No 4, і праймери для ПЦР, що включають або складаються (головним чином) з нуклеотидної послідовності SEQ ID No 16 і SEQ ID No 17, для використання при ідентифікації EE-GM3/EE-GM1 на основі ПЦР. Даний винахід, крім того, відноситься до набору для ідентифікації елітних подій EE-GM3 і EE-GM2 у біологічних зразках, що включає праймери для ПЦР, що включають або складаються (головним чином) з нуклеотидної послідовності SEQ ID No 5 і SEQ ID No 4, і праймери для ПЦР, що включають або складаються (головним чином) з нуклеотидної послідовності SEQ ID No 18 і SEQ ID No 19, для використання при ідентифікації EE-GM3/EE-GM2 на основі ПЦР. Даний винахід також відноситься до набору для ідентифікації елітної події EE-GM3 і EE-GM1 у біологічних зразках, що включає два специфічних зонди, перший з яких включає або складається (головним чином) з послідовності, що відповідає (або комплементарної) послідовності, що має від 80 % до 100 % ідентичності зі специфічною ділянкою EE-GM3, а другий включає або складається (головним чином) з послідовності, що відповідає (або комплементарної) послідовності, що має від 80 % до 100 % ідентичності зі специфічною ділянкою EE-GM1. У кращому випадку послідовність першого зонда відповідає специфічній ділянці, що включає частину 5'- або 3'-фланкуючої ділянки EE-GM3, а другий зонд відповідає специфічній ділянці, що включає частину 5'- або 3'-фланкуючої ділянки EE-GM1. У найбільш кращому випадку EE-GM3-специфічний зонд включає або складається (головним чином) з (або комплементарний) послідовності, що має від 80 % до 100 % ідентичності з послідовністю, розташованій між нуклеотидами 1441-1462 SEQ ID No 2, або послідовністю, що має від 80 % до 100 % ідентичності з послідовністю, розташованої між нуклеотидами 220-260 ID No 3, а EEGM1-специфічний зонд включає або складається (головним чином) з (або комплементарний) послідовності, що має від 80 % до 100 % ідентичності з послідовністю, розташованій між нуклеотидами 199-220 SEQ ID No 12, або послідовності, що має від 80 % до 100 % ідентичності з послідовністю, розташованій між нуклеотидами 558-579 SEQ ID No 13. Даний винахід також відноситься до набору для ідентифікації елітної події EE-GM3 і EE-GM2 у біологічних зразках, що включає два специфічних зонди, перший з яких включає або складається (головним чином) з послідовності, що відповідає (або комплементарна) послідовності, що має від 80 % до 100 % ідентичності зі специфічною ділянкою EE-GM3, а другий включає або складається (головним чином) з послідовності, що відповідає (або комплементарна) послідовності, що має від 80 % до 100 % ідентичності зі специфічною ділянкою EE-GM2. У кращому випадку послідовність першого зонда відповідає специфічній ділянці, що включає частину 5'- або 3'-фланкуючої ділянки EE-GM3, а другий зонд відповідає специфічній ділянці, що включає частину 5'- або 3'-фланкуючої ділянки EE-GM2. У найбільш кращому випадку EE-GM3-специфічний зонд включає або складається (головним чином) з (або комплементарний) послідовності, що має від 80 % до 100 % ідентичності з послідовністю, розташованій між нуклеотидами 1441-1462 SEQ ID No 2, або послідовності, що має від 80 % до 100 % ідентичності з послідовністю, розташованій між нуклеотидами 220-260 ID No 3, а EEGM2-специфічний зонд включає або складається (головним чином) з (або комплементарний) послідовності, що має від 80 % до 100 % ідентичності з послідовністю, розташованій між нуклеотидами 301-322 SEQ ID No 14, або послідовності, що має від 80 % до 100 % ідентичності з послідовністю, розташованій між нуклеотидами 497-518 SEQ ID No 15. Відповідно до іншого аспекту даного винаходу описані послідовності ДНК включають сайт з'єднання події та полінуклеотиди достатньої довжини, що відносяться як до геному сої, так і до чужорідної ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів (трансгену), для кожної події, що забезпечує можливість їхнього використання як праймера або зонда для виявлення EE-GM3 і EE-GM1. Такі послідовності можуть включати щонайменше 9 нуклеотидів геномної ДНК сої та аналогічну кількість нуклеотидів чужорідної ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів (трансгену) EE-GM3 або EE-GM1, з кожної сторони сайту з'єднання, відповідно. У найбільш кращому випадку такі послідовності ДНК включають щонайменше 9 нуклеотидів геномної ДНК сої та аналогічну кількість нуклеотидів чужорідної ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів (трансгену), що примикають до сайту з'єднання в SEQ ID No: 2 або SEQ ID No: 3, і щонайменше 7 UA 114171 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9 нуклеотидів геномної ДНК сої та аналогічну кількість нуклеотидів чужорідної ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів (трансгену), що примикають до сайту з'єднання в SEQ ID No: 12 або SEQ ID No: 13. Згідно ще до одного аспекту даного винаходу описані послідовності ДНК включають сайт з'єднання події й полінуклеотиди достатньої довжини, що відносяться як до геному сої, так і до чужорідної ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів (трансгену), для кожної події, що забезпечує можливість їхнього використання як праймера або зонда для виявлення EE-GM3 і EE-GM2. Такі послідовності можуть включати щонайменше 9 нуклеотидів геномної ДНК сої та аналогічну кількість нуклеотидів чужорідної ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів (трансгену), для EE-GM3 або EE-GM2 з кожної сторони сайту інсерції, відповідно. У найбільш кращому випадку такі послідовності ДНК включають щонайменше 9 нуклеотидів геномної ДНК сої та аналогічну кількість нуклеотидів чужорідної ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів (трансгену), що примикають до сайту з'єднання в SEQ ID No: 2 або SEQ ID No: 3, і щонайменше 9 нуклеотидів геномної ДНК сої та аналогічну кількість нуклеотидів чужорідної ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів (трансгену), що примикають до сайту з'єднання в SEQ ID No: 14 або SEQ ID No: 15. Способи та набори, охоплені даним винаходом, можна використовувати для різних цілей, наприклад, не обмежуючись цим: ідентифікації присутності або визначення (нижнього) граничного значення EE-GM3 і EE-GM1 або EE-GM3 і EE-GM2 у рослинах, рослинному матеріалі або продуктах, наприклад, не обмежуючись цим, у харчових продуктах або кормах (свіжих або оброблених), що включають або які походять з рослинного матеріалу; додатково або альтернативно способи та набори даного винаходу можна використовувати для ідентифікації трансгенного рослинного матеріалу з метою розподілу трансгенних і нетрансгенних матеріалів; додатково або альтернативно способи та набори даного винаходу можна використовувати для визначення якості (тобто процентного вмісту чистого матеріалу) рослинного матеріалу, що включає EE-GM3 і EE-GM1 або EE-GM3 і EE-GM1. Даний винахід, крім того, відноситься до 5'- та/або 3'-фланкуючих ділянок EE-GM3 GM3 у комбінації зі специфічними праймерами та зондами, розробленими на основі 5'- та/або 3'фланкуючих послідовностей EE-GM1 або EE-GM2, а також до специфічних праймерів і зондів, розроблених на основі 5'- та/або 3'-фланкуючих послідовностей EE-GM3 у комбінації зі специфічними праймерами і зондами, розробленими на основі 5'- та/або 3'-фланкуючих послідовностей EE-GM1 або EE-GM2. Даний винахід також відноситься до геномної ДНК, одержаної з рослин сої, що містять елітні події EE-GM3 і EE-GM1, або рослин, що містять елітні події EE-GM3 і EE-GM2. Таку геномну ДНК можна використовувати як еталонний контрольний матеріал при аналізах ідентифікації, описаних тут. Крім того, тут представлені рослини або клітини, частини, насіння або потомство трансгенної сої, стійкої до гербіцидів, кожне з яких містить щонайменше дві елітних події, причому перша із зазначених елітних подій включає чужорідну ДНК, що включає: i) перший химерний ген, що включає модифікований ген epsps з Zea mays, що кодує фермент EPSPS, стійкий до гліфосату, під контролем промотору, що забезпечує експресію в рослинній клітині, і ii) другий химерний ген, що включає модифікований ген hppd з Pseudomonas fluorescens, що кодує фермент, стійкий до гербіцидів-інгібіторів HPPD, під контролем промотору, що забезпечує експресію в рослинній клітині, а друга із зазначених елітних подій включає (третій) химерний ген, що включає модифікований ген стійкості до глюфосинату з Streptomyces viridochromogenes, що кодує фермент глюфосинат- (або фосфінотрицин-) ацетилтрансферазу під контролем промотору, що забезпечує експресію в рослинній клітині. В одному з варіантів втілення перша із зазначених елітних подій включає нуклеотиди з 1 по 1451 з SEQ ID No 2, що примикають до зазначеної чужорідної ДНК безпосередньо зверху, і нуклеотиди з 241 по 1408 з SEQ ID No 3, що примикають до зазначеної чужорідної ДНК безпосередньо знизу, а друга із зазначених елітних подій включає нуклеотиди з 1 по 209 з SEQ ID No 12, що примикають до зазначеної чужорідної ДНК безпосередньо зверху, і нуклеотиди з 569 по 1000 з SEQ ID No 13, що примикають до зазначеної чужорідної ДНК безпосередньо знизу, або друга із зазначених елітних подій включає нуклеотиди з 1 по 311 з SEQ ID No 14, що примикають до зазначеної чужорідної ДНК безпосередньо зверху, і нуклеотиди з 508 по 1880 з SEQ ID No 15, що примикають до зазначеної чужорідної ДНК безпосередньо знизу. В іншому варіанті втілення зазначену елітну подію можна одержати шляхом схрещування з рослиною сої, що виросла з еталонного насіння, що містить зазначені події й депонованого в ATCC під номером доступу PTA-11041 або PTA-11042, або можна одержати з еталонного 8 UA 114171 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 насіння, що містить першу із зазначених подій і депонованого в NCIMB під номером доступу NCIMB 41659, а також з еталонного насіння, що містить другу із зазначених подій і депонованого в NCIMB під номером доступу NCIMB 41658 або в NCIMB під номером доступу NCIMB 41660. У ще одному варіанті втілення аналіз геномної ДНК зазначеної рослини сої або її клітини, частини, насіння або потомства за допомогою протоколу ідентифікації першої із зазначених елітних подій з використанням двох праймерів, що включають нуклеотидні послідовності SEQ ID No 4 і SEQ ID No 5, відповідно, призводить до одержання фрагмента ДНК довжиною 263 п.о. або приблизно 263 п.о., а аналіз за допомогою протоколу ідентифікації другої із зазначених елітних подій з використанням двох праймерів, що включають нуклеотидні послідовності SEQ ID No 16 і SEQ ID No 17, відповідно, призводить до одержання фрагмента ДНК довжиною 183 п.о. або приблизно 183 п.о., а при використанні двох праймерів, що включають нуклеотидні послідовності SEQ ID No 18 і SEQ ID No 19, відповідно, призводить до одержання фрагмента ДНК довжиною 151 п.о. або приблизно 151 п.о. Крім того, тут представлений спосіб ідентифікації трансгенної рослини сої або її клітин, частин, насіння або потомства, що містять 2 елітні події, у біологічних зразках, у якої зазначена рослина, клітини, насіння або потомство стійкі до гліфосату, глюфосинату та гербіцидуінгібітору HPPD (наприклад, ізоксафлютолу), причому зазначений спосіб включає ампліфікацію фрагмента ДНК довжиною між 100 і 500 п.о. з нуклеїнової кислоти першої із зазначених подій, що присутні у біологічному зразку, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, що використовує щонайменше два праймери, один із яких розпізнає 5'-фланкуючу ділянку першої з вищевказаних елітних подій, причому зазначена 5'-фланкуюча ділянка включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1 до нуклеотида 1451 або 3'-фланкуючу ділянку першої із зазначених елітних подій, причому зазначена 3'-фланкуюча ділянка включає нуклеотидну послідовність комплементарного ланцюга SEQ ID No 3 від нуклеотида 241 до нуклеотида 1408, а другий із зазначених праймерів розпізнає послідовність у межах чужорідної ДНК першої із зазначених подій, що включає нуклеотидну послідовність комплементарного ланцюга SEQ ID No 2 від нуклеотида 1452 до нуклеотида 1843 або нуклеотидну послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 1 до нуклеотида 240, і включає ампліфікацію фрагмента ДНК довжиною між 50 і 1000 п.о. або між 100 і 500 п.о. з нуклеїнової кислоти другої із зазначених подій, присутньої в біологічному зразку, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, що використовує щонайменше два праймери, один із яких розпізнає 5'-фланкуючу ділянку другої з вищевказаних елітних подій, причому зазначена 5'-фланкуюча ділянка включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 12 від нуклеотида 1 до 209 або 3'-фланкуючу ділянку другої із зазначених елітних подій, причому зазначена 3'-фланкуюча ділянка включає нуклеотидну послідовність комплементарного ланцюга SEQ ID No 13 від нуклеотида 569 до 1000, а другий із зазначених праймерів розпізнає послідовність у межах чужорідної ДНК другої із зазначених подій, що включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 12 від нуклеотида 210 до нуклеотида 720 або нуклеотидну послідовність SEQ ID No 13 від нуклеотида 1 до нуклеотида 568. Крім того, у даному документі представлений спосіб ідентифікації трансгенної рослини сої або її клітин, частин, насіння або потомства, що містять 2 елітні події, у біологічних зразках, у якому зазначена рослина, клітини, насіння або потомство стійкі до гліфосату, глюфосинату та/або гербіциду-інгібітору HPPD (наприклад, ізоксафлютолу), причому зазначений спосіб включає ампліфікацію фрагмента ДНК довжиною між 50 і 1000 або між 100 і 500 п.о. з нуклеїнової кислоти першої із зазначених подій, що присутні у біологічному зразку, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, що використовує щонайменше два праймери, один із яких розпізнає 5'-фланкуючу ділянку першої з вищевказаних елітних подій, причому зазначена 5'-фланкуюча ділянка включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1 до нуклеотида 1451 або 3'-фланкуючу ділянку першої із зазначених елітних подій, причому зазначена 3'-фланкуюча ділянка включає нуклеотидну послідовність комплементарного ланцюга SEQ ID No 3 від нуклеотида 241 до нуклеотида 1408, а другий із зазначених праймерів розпізнає послідовність у межах чужорідної ДНК першої із зазначених подій, що включає нуклеотидну послідовність комплементарного ланцюга SEQ ID No 2 від нуклеотида 1452 до нуклеотида 1843 або нуклеотидну послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 1 до нуклеотида 240, і включає ампліфікацію фрагмента ДНК довжиною між 50 і 1000 п.о. або між 100 і 500 п.о. з нуклеїнової кислоти другої із зазначених подій, що присутні у біологічному зразку, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, що використовує щонайменше два праймери, один із яких розпізнає 5'-фланкуючу ділянку другої з вищевказаних елітних подій, причому зазначена 5'фланкуюча ділянка включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 14 від нуклеотида 1 до 311 або 3'-фланкуючу ділянку другої із зазначених елітних подій, причому зазначена 3'-фланкуюча 9 UA 114171 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ділянка включає нуклеотидну послідовність комплементарного ланцюга SEQ ID No 15 від нуклеотида 508 до 1880, а другий із зазначених праймерів розпізнає послідовність у межах чужорідної ДНК другої із зазначених подій, що включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 14 від нуклеотида 312 до нуклеотида 810 або нуклеотидну послідовність SEQ ID No 15 від нуклеотида 1 до нуклеотида 507. Крім того, тут представлений набір для ідентифікації трансгенної рослини сої або її клітин, частин, насіння або потомства, що містять 2 елітні події й стійких до гліфосату, глюфосинату й гербіциду-інгібітору HPPD (наприклад, ізоксафлютолу), у біологічних зразках, причому зазначений набір включає праймер, що розпізнає 5'-фланкуючу ділянку першої з вищевказаних елітних подій, причому зазначена 5'-фланкуюча ділянка включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1 до нуклеотида 1451, або праймер, що розпізнає 3'-фланкуючу ділянку першої із зазначених елітних подій, причому зазначена 3'-фланкуюча ділянка включає нуклеотидну послідовність комплементарного ланцюга SEQ ID No 3 від нуклеотида 241 до нуклеотида 1408, і праймер, що розпізнає послідовність у межах чужорідної ДНК першої із зазначених подій, причому зазначена чужорідна ДНК включає нуклеотидну послідовність комплементарного ланцюга SEQ ID No 2 від нуклеотида 1452 до нуклеотида 1843 або нуклеотидну послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 1 до нуклеотида 240, а також зазначений набір включає праймер, що розпізнає 5'-фланкуючу ділянку другої з вищевказаних елітних подій, причому зазначена 5'-фланкуюча ділянка включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 12 від нуклеотида 1 до 209, або праймер, що розпізнає 3'-фланкуючу ділянку другої із зазначених елітних подій, причому зазначена 3'-фланкуюча ділянка включає нуклеотидну послідовність комплементарного ланцюга SEQ ID No 13 від нуклеотида 569 до 1000, а другий із зазначених праймерів розпізнає послідовність у межах чужорідної ДНК другої із зазначених подій, що включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 12 від нуклеотида 210 до нуклеотида 720 або нуклеотидну послідовність SEQ ID No 13 від нуклеотида 1 до нуклеотида 568. Крім того, тут представлений набір для ідентифікації трансгенної рослини сої або її клітин, частин, насіння або потомства, що містять 2 елітні події й стійких до гліфосату, глюфосинату й гербіциду-інгібітору HPPD (наприклад, ізоксафлютолу), у біологічних зразках, причому зазначений набір включає праймер, що розпізнає 5'-фланкуючу ділянку першої з вищевказаних елітних подій, причому зазначена 5'-фланкуюча ділянка включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1 до нуклеотида 1451, або праймер, що розпізнає 3'-фланкуючу ділянку першої із зазначених елітних подій, причому зазначена 3'-фланкуюча ділянка включає нуклеотидну послідовність комплементарного ланцюга SEQ ID No 3 від нуклеотида 241 до нуклеотида 1408, і праймер, що розпізнає послідовність у межах чужорідної ДНК першої із зазначених подій, причому зазначена чужорідна ДНК включає нуклеотидну послідовність комплементарного ланцюга SEQ ID No 2 від нуклеотида 1452 до нуклеотида 1843 або нуклеотидну послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 1 до нуклеотида 240, а також зазначений набір включає праймер, що розпізнає 5'-фланкуючу ділянку другої з вищевказаних елітних подій, причому зазначена 5'-фланкуюча ділянка включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 14 від нуклеотида 1 до 311, або 3'-фланкуючу ділянку другої із зазначених елітних подій, причому зазначена 3'-фланкуюча ділянка включає нуклеотидну послідовність комплементарного ланцюга SEQ ID No 15 від нуклеотида 508 до 1880, а другий із зазначених праймерів розпізнає послідовність у межах чужорідної ДНК другої із зазначених подій, що включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 14 від нуклеотида 312 до нуклеотида 810 або нуклеотидну послідовність SEQ ID No 15 від нуклеотида 1 до нуклеотида 507. Також тут представлені рослина сої, клітина, тканина або насіння рослини, що містять у своєму геномі молекулу нуклеїнової кислоти, що включає нуклеотидну послідовність, щонайменше на 97, 98 або щонайменше на 99 % або 99,5 % ідентичну нуклеотидній послідовності SEQ ID No 20 від положення 1452 до положення 16638, нуклеотидній послідовності SEQ ID No 20 від положення 2257 до положення 16601 або їх комплементарним ланцюгам, або нуклеотидну послідовність, щонайменше на 97, 98 або щонайменше на 99 % або 99,5 % ідентичну SEQ ID No 20 або її комплементарному ланцюгу, що містить у своєму геномі молекулу нуклеїнової кислоти, що включає нуклеотидну послідовність, щонайменше на 97, 98 або щонайменше на 99 % або 99,5 % ідентичну нуклеотидній послідовності EE-GM1 або EEGM2 або їх комплементарним ланцюгам, причому еталонне насіння, що містить EE-GM1, депоноване під номером доступу NCIMB 41658, а еталонне насіння, що містить EE-GM2, депоноване під номером доступу NCIMB 41660. В одному з варіантів втілення даного винаходу нуклеотидна послідовність EE-GM1 або EE-GM2 у зазначеній рослині, клітині, тканині або насінні рослини являє собою послідовність ДНК (наприклад, чужорідну послідовність ДНК) в SEQ ID No 12 або 13 або послідовність ДНК (наприклад, чужорідну послідовність ДНК) в SEQ ID 10 UA 114171 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 No 14 або 15, або послідовність ДНК у складі геному рослини (наприклад, у депонованому насінні, що містять EE-GM1 або EE-GM2 відповідно до винаходу), що містить SEQ ID No 12 і 13 між першим нуклеотидом послідовності SEQ ID No 12 і останнім нуклеотидом послідовності SEQ ID No 13, або послідовність ДНК у складі генома рослини, що містить SEQ ID No 14 і 15 між першим нуклеотидом послідовності SEQ ID No 14 і останнім нуклеотидом послідовності SEQ ID No 15. В одному з варіантів втілення даного винаходу представлена рослина сої, клітина, тканина або насіння рослини, що містять у своєму геномі молекулу нуклеїнової кислоти, що гібридизує з нуклеотидною послідовністю SEQ ID No 1 або її комплементарним ланцюгом або що гібридизує з нуклеотидною послідовністю SEQ ID No 20 від положення 1452 до положення 16638 або її комплементарним ланцюгом, або що гібридизує з нуклеотидною послідовністю SEQ ID No 20 або її комплементарним ланцюгом, що містить у своєму геномі молекулу нуклеїнової кислоти, що гібридизує з нуклеотидною послідовністю EE-GM1 або EE-GM2 або їх комплементарними ланцюгами, причому еталонне насіння, що містить EE-GM1, депоноване під номером доступу NCIMB 41658, а еталонне насіння, що містить EE-GM2, депоноване під номером доступу NCIMB 41660. В одному з варіантів втілення даного винаходу нуклеотидна послідовність EE-GM1 або EE-GM2 у зазначеній рослині, клітині, тканині або насінні рослини являє собою чужорідну послідовність ДНК в SEQ ID No 12 або 13 або чужорідну послідовність ДНК в SEQ ID No 14 або 15, або чужорідну послідовність ДНК у складі генома рослини (наприклад, у депонованому насінні, що містять EE-GM1 або EE-GM2 відповідно до винаходу), що містить SEQ ID No 12 і 13 між першим нуклеотидом послідовності SEQ ID No 12 і останнім нуклеотидом послідовності SEQ ID No 13, або чужорідну послідовність ДНК у складі генома рослини, що містить SEQ ID No 14 і 15 між першим нуклеотидом послідовності SEQ ID No 14 і останнім нуклеотидом послідовності SEQ ID No 15. Стислий опис креслень Наведені далі Приклади, не призначені для обмеження даного винаходу в рамках конкретних описаних варіантів втілення, можна розглядати в сполученні із Фігурами, що додаються, включеними в даний документ за допомогою посилань, на яких: Фіг. 1: Схематичне представлення взаємодії між зазначеними нуклеотидними послідовностями й праймерами для елітної події EE-GM3. чорний прямокутник: чужорідна ДНК; заштрихований прямокутник: ДНК рослинного походження; стрілка з картатим заливанням (a): химерний ген, що кодує HPPD PF W366 (композицію химерного гена див. у Таблиці 1); заштрихована стрілка (б): химерний ген, що кодує 2mEPSPS (композицію химерного гена див. у Таблиці 1); чорні стрілки: олігонуклеотидні праймери, фігури під прямокутниками означають положення нуклеотидів; (в) відноситься до комплементарного ланцюга зазначеної нуклеотидної послідовності; Примітка: схема наведена без врахування масштабу. Фіг. 2: Результати, отримані за допомогою протоколу ПЦР-ідентифікації, розробленого для EE-GM3. Послідовність завантаження гелю: Доріжка 1: Маркер молекулярної маси (леддер 100 п.о.); доріжки 2 і 3: зразки ДНК із рослин сої, що містять трансгенну подію EE-GM3; доріжки 4-7: зразки ДНК із трансгенних рослин сої, що не містять елітну подію EE-GM3, але що містять ті ж самі гени стійкості до гербіцидів (інші трансформаційні події); доріжка 8: зразок ДНК із сої дикого типу; доріжка 9: контроль матриці ДНК відсутній; доріжка 10: маркер молекулярної маси. Фіг. 3: Схематичне представлення взаємодії між зазначеними нуклеотидними послідовностями й праймерами для елітної події EE-GM1. чорний прямокутник: чужорідна ДНК; заштрихований прямокутник: ДНК рослинного походження; стрілка з горизонтальним штрихуванням (г): химерний ген, що кодує фосфінотрицинацетилтрансферазу (композицію химерного гена див. в SEQ ID No 11); чорні стрілки: олігонуклеотидні праймери, фігури під прямокутниками означають положення нуклеотидів; (в) відноситься до комплементарного ланцюга зазначеної нуклеотидної послідовності; Примітка: схема наведена без врахування масштабу. Фіг. 4: Схематичне представлення взаємодії між зазначеними нуклеотидними послідовностями й праймерами для елітної події EE-GM2. чорний прямокутник: чужорідна ДНК; заштрихований прямокутник: ДНК рослинного походження; стрілка з горизонтальним штрихуванням (г): химерний ген, що кодує фосфінотрицинацетилтрансферазу (композицію химерного гена див. в SEQ ID No 11); чорні стрілки: олігонуклеотидні праймери, фігури під прямокутниками означають положення нуклеотидів; (в) відноситься до комплементарного ланцюга зазначеної нуклеотидної послідовності; НЗ: не застосовно. Примітка: схема наведена без врахування масштабу. Фіг. 5: Протокол ПЦР-ідентифікації, розроблений для EE-GM1. Послідовність завантаження гелю: Доріжка 1: зразки ДНК із рослин сої, що містять трансгенну подію EE-GM1; доріжка 2: 11 UA 114171 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зразки ДНК із трансгенних рослин сої, що не містять елітну подію EE-GM1; доріжка 3: контрольні зразки ДНК із рослин сої дикого типу; доріжка 4: контроль матриці ДНК відсутній; доріжка 5: маркер молекулярної маси. Фіг. 6: Протокол ПЦР-ідентифікації, розроблений для EE-GM2. Послідовність завантаження гелю: Доріжка 1: зразки ДНК із рослин сої, що містять трансгенну подію EE-GM2; доріжка 2: зразки ДНК із трансгенних рослин сої, що не містять елітну подію EE-GM2; доріжка 3: контрольні зразки ДНК із рослин сої дикого типу; доріжка 4: контроль матриці ДНК відсутній; доріжка 5: маркер молекулярної маси. Детальний опис кращих варіантів втілення винаходу Включення молекули рекомбінантної ДНК у геном рослини звичайно є результатом трансформації клітини або тканини. Конкретний сайт вбудовування звичайно обумовлений випадковим вбудовуванням. ДНК, включену в геном рослини в результаті трансформації рослинної клітини або тканини рекомбінантної ДНК, або "що трансформує ДНК" і походить з такої ДНК, що трансформує, тут і далі називають "чужорідною ДНК", що включає один або більше "трансгенів". Трансгени EEGM3 являють собою гени стійкості до гліфосату й гербіциду-інгібітору HPPD. "Рослинна ДНК" у контексті даного винаходу відноситься до ДНК, що походить із трансформованої рослини. Рослинна ДНК звичайно знаходиться в тому же генетичному локусі відповідної рослини дикого типу. Чужорідну ДНК можна характеризувати по положенню й конфігурації в сайті вбудовування молекули рекомбінантної ДНК у геном рослини. Сайт генома рослини, куди вбудовують рекомбінантну ДНК, також називають "сайтом інсерції" або "сайтом-мішенню". Інсерція рекомбінантної ДНК в ділянку генома рослини, що називають'передінсерційна рослинна ДНК", може бути пов'язана з делецією рослинної ДНК, що називають "делецією сайту-мішені". "Фланкуюча ділянка" або "фланкуюча послідовність" тут відноситься до послідовності довжиною щонайменше 20 п.о., переважно щонайменше 50 п.о., і до 5000 п.о. ДНК, що відрізняється від включеної ДНК, переважно ДНК генома рослини, пов'язаної із чужорідним ДНК безпосередньо зверху або пов'язаної із чужорідним ДНК безпосередньо знизу. Результатом процедур трансформації, що призводять до випадкового вбудовування чужорідної ДНК, є одержання трансформантів з різними фланкуючими ділянками, характерними й унікальними для кожного трансформанта. Якщо рекомбінантну ДНК включають у геном рослини шляхом традиційного схрещування, сайт її інсерції в геномі рослини або її фланкуючі ділянки в загальному випадку не змінюються. "Виділена нуклеїнова кислота (послідовність)" або "виділена ДНК (послідовність)" тут відноситься до нуклеїнової кислоти або ДНК (послідовності), що більше не знаходиться в природному оточенні, з якого її виділили, наприклад, нуклеотидної послідовності в геномі рослини або іншої бактерії-хазяїна, або нуклеотидної кислоті або ДНК у складі гібрида із ДНК або нуклеїновою кислотою з іншого джерела, наприклад, у складі химерного гена під контролем промотору, що забезпечує експресію у рослинній клітині. Подією називають (штучний) генетичний локус, що у результаті генно-інженерних маніпуляцій несе чужорідну ДНК або трансген, що включає щонайменше одну копію гена або генів, що цікавить дослідника. Типові алельні стани події являють собою наявність або відсутність чужорідної ДНК. Подію описують фенотипічно по експресії трансгену. На генетичному рівні подія є частиною генетичної композиції рослини. На молекулярному рівні подію можна описувати по рестриктазній карті (наприклад, відповідно до визначення за допомогою саузерн-блоттинга), що відрізняється зверху або знизу-фланкуючими послідовностями трансгена, положенням молекулярних маркерів та/або молекулярною конфігурацією трансгена. Звичайно трансформація ДНК, що трансформує рослини, що включає щонайменше один ген, що цікавить дослідника, призводить до одержання популяції трансфорамнтів, що містить сукупність окремих подій, кожна з яких є унікальною. Подію описують по чужорідній ДНК і щонайменше одній з фланкуючих послідовностей. Елітна подія в даному описі являє собою подію, яку обирають із групи подій, отриманих шляхом трансформації однієї й тієї ж ДНК, що трансформує, на основі експресії й стабільності трансгена(ів) і її сумісності з оптимальними агрономічними характеристиками рослини, що містить цю подію. Таким чином, критерії селекції елітної події являють собою один або більше, переважно два або більше, найбільше переважно - всі критерії з наступного списку: а. присутність чужорідної ДНК не ставить під загрозу інші бажані характеристики рослини, наприклад, характеристики, що відносяться до агрономічної продуктивності або комерційної цінності; б. подія описується чітко певною молекулярною конфігурацією, що стабільно успадковується й для якої можна розробити придатні інструменти контролю ідентичності; 12 UA 114171 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 в. ген(и), що цікавить(ять) дослідника, демонструє(ють) коректну, адекватну й стабільну просторову й тимчасову фенотипічну експресію як у гетерозиготному (або гемізиготному), так і в гомозиготному стані події на комерційно прийнятному рівні в діапазоні умов навколишнього середовища, за яких можливо нормальне агрономічне використання рослин, що несуть зазначену подію. У кращому випадку чужорідна ДНК асоційована з положенням у геномі рослини, що дозволяє легко включати чужорідні послідовності в комерційно бажане генетичне оточення. Елітний статус події підтверджують інтрогресією елітної події в різні варіанти генетичного оточення, що мають відношення до розглянутого питання, і спостереженням відповідності одному, двом або усім вищенаведеним критеріям, наприклад, а., б. і в… Таким чином, "елітна подія" відноситься до генетичного локусу, що містить чужорідну ДНК і відповідає вищеописаним критеріям. Рослина, рослинний матеріал або потомство, наприклад, насіння, можуть містити одну або більше елітних подій у складі свого генома. Розроблені інструменти для ідентифікації елітної події або рослини, або рослинного матеріалу, що містить елітну подію, або продукту, що включає рослинний матеріал, що містить елітну подію, засновані на специфічних геномних характеристиках елітної події, наприклад, специфічної рестриктазної карти ділянки генома, що містить чужорідну ДНК, молекулярних маркерів або послідовності фланкуючої(их) ділянки(ок) чужорідної ДНК. Після секвенування однієї або обох фланкуючих ділянок чужорідної ДНК можна розробити праймери та зонди, що специфічно розпізнають цю (ці) послідовність(і) у нуклеїновій кислоті (ДНК або РНК) зразка за допомогою молекулярно-біологічних методик. Наприклад, можна розробити ПЦР-методику ідентифікації елітної події в біологічних зразках (наприклад, зразках рослин, рослинного матеріалу або продуктів, що містять рослинний матеріал). Така ПЦР заснована щонайменше на двох специфічних "праймерах", один із яких розпізнає послідовність у межах 5'- або 3'-фланкуючої ділянки елітної події, а другий розпізнає послідовність у межах чужорідної ДНК. У кращому випадку праймери мають послідовність довжиною від 15 до 35 нуклеотидів, що при оптимізованих для ПЦР умовах "специфічно розпізнає" послідовність у межах 5'- або 3'-фланкуючої ділянки елітної події або чужорідної ДНК елітної події, відповідно, що призводить до ампліфікації специфічного фрагмента ("інтегрованого фрагмента" або відрізняльного амплікона) зі зразка нуклеїнової кислоти, що містить елітну подію. Це означає, що при оптимізованих для ПЦР умовах відбувається ампліфікація тільки інтегрованого фрагмента-мішені й жодної іншої послідовності, що входить до складу генома рослини або чужорідної ДНК. ПЦР-праймери, придатні для ідентифікації EE-GM3, можуть являти собою: - олігонуклеотиди довжиною від 17 до приблизно 200 нуклеотидів, що включають на своєму 3'-кінці нуклеотидну послідовність довжиною щонайменше 17 послідовних нуклеотидів, переважно 20 послідовних нуклеотидів, які вибирають із ДНК рослини в складі 5'-фланкуючої послідовності (SEQ ID No 2 від нуклеотида 1 до нуклеотида 1451) (праймери, що розпізнають 5'фланкуючі послідовності); або - олігонуклеотиди довжиною від 17 до приблизно 200 нуклеотидів, що включають на своєму 3'-кінці нуклеотидну послідовність довжиною щонайменше 17 послідовних нуклеотидів, переважно 20 послідовних нуклеотидів, які вибирають із ДНК рослини в складі 3'-фланкуючі послідовності (комплементарного ланцюга SEQ ID No 3 від нуклеотида 241 до нуклеотида 1408) (праймери, що розпізнають 3'-фланкуючі послідовності); або - олігонуклеотиди довжиною від 17 до приблизно 200 нуклеотидів, що включають на своєму 3'-кінці нуклеотидну послідовність довжиною щонайменше 17 послідовних нуклеотидів, переважно 20 послідовних нуклеотидів, які вибирають із включених послідовностей ДНК (комплементарного ланцюга SEQ ID No 2 від нуклеотида 1452 до нуклеотида 1843) (праймери, що розпізнають чужорідну ДНК); або - олігонуклеотиди довжиною від 17 до приблизно 200 нуклеотидів, що включають нуклеотидну послідовність довжиною щонайменше 17 послідовних нуклеотидів, переважно 20 послідовних нуклеотидів, які вибирають із включених послідовностей ДНК (SEQ ID No 3 від нуклеотида 1 до нуклеотида 240); або - придатні олігонуклеотиди довжиною від 17 до приблизно 200 нуклеотидів, що включають нуклеотидну послідовність довжиною щонайменше 17 послідовних нуклеотидів, переважно 20 послідовних нуклеотидів, які вибирають з нуклеотидної послідовності фрагмента включеної ДНК або її комплементарного ланцюга (SEQ ID No 1 або SEQ ID No 20 від нуклеотида 1452 до нуклеотида 16638). Зрозуміло, що довжина праймерів може бути більше зазначених 17 послідовних нуклеотидів і може, наприклад, становити 20, 21, 30, 35, 50, 75, 100, 150, 200 нуклеотидів і навіть більше. 13 UA 114171 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Праймери можуть повністю складатися з нуклеотидної послідовності, яку вибирають із зазначених нуклеотидних послідовностей фланкуючих послідовностей та чужорідних послідовностей ДНК. У той же час, нуклеотидна послідовність 5'-кінця праймерів (тобто поза 17 послідовними нуклеотидами, розташованими на 3'-кінці є менш критичною. Так, 5'-послідовність праймерів може включати або складатися з нуклеотидної послідовності, яку вибирають із фланкуючих послідовностей або чужорідної ДНК, якщо це необхідно, але може містити декілька (наприклад, 1, 2, 5 або 10) неспівпадінь. 5'-послідовність праймерів може навіть повністю бути нуклеотидною послідовністю, що не має відношення до фланкуючих послідовностей або чужорідної ДНК, наприклад, нуклеотидної послідовності, що являє собою один або декілька сайтів розпізнавання ферментів рестрикції. Такі неспоріднені послідовності або фланкуючі послідовності ДНК із неспівпадіннями в кращому випадку не повинні перевищувати 100, а в більш кращому випадку - 50 або навіть 25 нуклеотидів у довжину. Крім того, що підходять Праймери можуть містити, складатися з або в основному складатися з нуклеотидної послідовності на їх 3'-кінці, що перекриває область з'єднання послідовностей рослинної ДНК і послідовностей чужорідної ДНК (розташованої в положенні 1451-1452 в SEQ ID No 2 і 240-241 в SEQ ID No 3 для EE-GM3), що робить зазначені 17 послідовних нуклеотидів, розташованих на 3'-кінці, похідними як чужорідної ДНК, так і послідовностей рослинного походження SEQ ID No 2 або 3. Для фахівця буде очевидно, що правильно обрана пара праймерів для ПЦР, крім того, не повинна містити послідовностей, комплементарних один одному. Для цілей даного винаходу "комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності, представленої в SEQ ID No: X", являє собою нуклеотидну послідовність, що є похідною представленої нуклеотидної послідовності шляхом заміщення нуклеотидів їх комплементарними нуклеотидами відповідно до правил Чаргаффа (A  T; G  C) і читання послідовності в напрямку від 5" до 3", тобто протилежно представленої нуклеотидної послідовності. Приклади придатних праймерів для EE-GM3 являють собою послідовності олігонуклеотидів SEQ ID No 5 (праймер, що розпізнає 3'-фланкуючу послідовність), SEQ ID No 4 (праймер, що розпізнає чужорідну ДНК для використання із праймерами, що розпізнають 3'-фланкуючу послідовність) або SEQ ID No 7 (праймер, що розпізнає чужорідну ДНК для використання із праймерами, що розпізнають 3'-фланкуючу послідовність). Інші приклади придатних олігонуклеотидних праймерів для EE-GM3 містять на 3'-кінці наступні послідовності або складаються (головним чином) з таких послідовностей: a. праймери, що розпізнають 5'-фланкуючу послідовність: - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 264 до нуклеотида 283 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 266 до нуклеотида 285 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1240 до нуклеотида 1259 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 265 до нуклеотида 285 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 265 до нуклеотида 283 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1239 до нуклеотида 1259 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1241 до нуклеотида 1259 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1244 до нуклеотида 1263 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1248 до нуклеотида 1267 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1250 до нуклеотида 1269 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 262 до нуклеотида 279 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 263 до нуклеотида 279 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 264 до нуклеотида 285 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 266 до нуклеотида 283 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1238 до нуклеотида 1259 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1242 до нуклеотида 1259 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1243 до нуклеотида 1263 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1245 до нуклеотида 1263 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1247 до нуклеотида 1267 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1249 до нуклеотида 1269 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1249 до нуклеотида 1267 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 263 до нуклеотида 285 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 267 до нуклеотида 283 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1242 до нуклеотида 1263 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1243 до нуклеотида 1259 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1246 до нуклеотида 1267 14 UA 114171 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1246 до нуклеотида 1263 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1248 до нуклеотида 1269 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1250 до нуклеотида 1271 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1250 до нуклеотида 1267 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1241 до нуклеотида 1263 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1245 до нуклеотида 1267 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1247 до нуклеотида 1269 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1247 до нуклеотида 1263 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1249 до нуклеотида 1271 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1242 до нуклеотида 1261 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1241 до нуклеотида 1261 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1243 до нуклеотида 1261 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1240 до нуклеотида 1261 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1244 до нуклеотида 1261 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1239 до нуклеотида 1261 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1245 до нуклеотида 1261 b. праймери, що розпізнають чужорідну ДНК, для використання із праймерами, що розпізнають 5'-фланкуючу послідовність: - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1732 до нуклеотида 1751 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1735 до нуклеотида 1754 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1731 до нуклеотида 1750 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1732 до нуклеотида 1750 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1732 до нуклеотида 1752 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1731 до нуклеотида 1749 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1732 до нуклеотида 1749 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1731 до нуклеотида 1751 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1732 до нуклеотида 1753 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1731 до нуклеотида 1748 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1732 до нуклеотида 1748 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1735 до нуклеотида 1751 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1731 до нуклеотида 1752 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1732 до нуклеотида 1754 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1731 до нуклеотида 1747 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1731 до нуклеотида 1753 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1727 до нуклеотида 1746 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1727 до нуклеотида 1745 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1727 до нуклеотида 1747 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1727 до нуклеотида 1744 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1727 до нуклеотида 1748 15 UA 114171 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - комплементарний нуклеотида 1749 - комплементарний нуклеотида 1745 - комплементарний нуклеотида 1744 - комплементарний нуклеотида 1746 - комплементарний нуклеотида 1747 - комплементарний нуклеотида 1748 - комплементарний нуклеотида 1744 - комплементарний нуклеотида 1745 - комплементарний нуклеотида 1746 - комплементарний нуклеотида 1478 - комплементарний нуклеотида 1686 - комплементарний нуклеотида 1486 - комплементарний нуклеотида 1527 - комплементарний нуклеотида 1686 - комплементарний нуклеотида 1687 - комплементарний нуклеотида 1689 - комплементарний нуклеотида 1704 - комплементарний нуклеотида 1705 - комплементарний нуклеотида 1709 - комплементарний нуклеотида 1486 - комплементарний нуклеотида 1497 - комплементарний нуклеотида 1498 - комплементарний нуклеотида 1507 - комплементарний нуклеотида 1508 - комплементарний нуклеотида 1688 - комплементарний нуклеотида 1690 - комплементарний нуклеотида 1691 - комплементарний нуклеотида 1706 - комплементарний нуклеотида 1707 - комплементарний нуклеотида 1708 ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1727 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1726 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1726 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1726 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1726 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1726 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1724 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1724 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1724 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1461 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1670 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1469 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1508 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1667 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1670 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1673 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1688 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1688 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1692 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1467 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1481 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1481 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1491 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1491 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1672 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1673 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1673 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1688 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1691 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1691 до 16 UA 114171 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - комплементарний нуклеотида 1487 - комплементарний нуклеотида 1499 - комплементарний нуклеотида 1505 - комплементарний нуклеотида 1506 - комплементарний нуклеотида 1507 - комплементарний нуклеотида 1508 - комплементарний нуклеотида 1686 - комплементарний нуклеотида 1687 - комплементарний нуклеотида 1688 - комплементарний нуклеотида 1689 - комплементарний нуклеотида 1707 - комплементарний нуклеотида 1709 - комплементарний нуклеотида 1710 - комплементарний нуклеотида 1500 - комплементарний нуклеотида 1509 - комплементарний нуклеотида 1689 - комплементарний нуклеотида 1690 - комплементарний нуклеотида 1691 - комплементарний нуклеотида 1705 - комплементарний нуклеотида 1706 - комплементарний нуклеотида 1710 - комплементарний нуклеотида 1488 - комплементарний нуклеотида 1507 - комплементарний нуклеотида 1510 - комплементарний нуклеотида 1512 - комплементарний нуклеотида 1513 - комплементарний нуклеотида 1514 - комплементарний нуклеотида 1692 - комплементарний нуклеотида 1694 - комплементарний нуклеотида 1695 ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1469 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1481 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1489 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1489 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1489 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1489 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1666 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1667 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1670 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1672 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1688 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1691 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1692 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1481 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1491 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1670 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1672 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1672 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1687 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1687 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1691 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1472 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1488 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1491 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1495 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1495 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1495 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1673 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1678 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1678 до 17 UA 114171 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - комплементарний нуклеотида 1696 - комплементарний нуклеотида 1703 - комплементарний нуклеотида 1704 - комплементарний нуклеотида 1711 - комплементарний нуклеотида 1488 - комплементарний нуклеотида 1506 - комплементарний нуклеотида 1511 - комплементарний нуклеотида 1690 - комплементарний нуклеотида 1697 - комплементарний нуклеотида 1709 - комплементарний нуклеотида 1487 - комплементарний нуклеотида 1508 - комплементарний нуклеотида 1511 - комплементарний нуклеотида 1512 - комплементарний нуклеотида 1687 - комплементарний нуклеотида 1688 - комплементарний нуклеотида 1692 - комплементарний нуклеотида 1693 - комплементарний нуклеотида 1707 - комплементарний нуклеотида 1490 - комплементарний нуклеотида 1491 - комплементарний нуклеотида 1501 - комплементарний нуклеотида 1509 - комплементарний нуклеотида 1515 - комплементарний нуклеотида 1691 - комплементарний нуклеотида 1694 - комплементарний нуклеотида 1698 - комплементарний нуклеотида 1489 - комплементарний нуклеотида 1689 - комплементарний нуклеотида 1708 ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1678 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1687 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1687 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1692 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1469 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1488 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1491 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1670 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1678 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1688 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1467 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1488 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1495 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1491 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1666 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1667 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1672 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1673 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1687 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1472 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1472 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1481 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1489 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1495 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1670 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1673 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1678 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1469 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1667 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1687 до 18 UA 114171 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1688 до нуклеотида 1710 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1691 до нуклеотида 1711 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1472 до нуклеотида 1492 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1489 до нуклеотида 1510 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1666 до нуклеотида 1688 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1687 до нуклеотида 1709 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1692 до нуклеотида 1712 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1467 до нуклеотида 1488 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1469 до нуклеотида 1490 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1488 до нуклеотида 1509 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1489 до нуклеотида 1511 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1678 до нуклеотида 1699 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1472 до нуклеотида 1493 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1472 до нуклеотида 1494 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1481 до нуклеотида 1502 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1670 до нуклеотида 1692 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1469 до нуклеотида 1491 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1488 до нуклеотида 1510 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1691 до нуклеотида 1712 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1692 до нуклеотида 1713 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1692 до нуклеотида 1714 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1467 до нуклеотида 1489 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1678 до нуклеотида 1700 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1481 до нуклеотида 1503 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1691 до нуклеотида 1713 c. праймери, що розпізнають 3'-фланкуючу послідовність: - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 828 до нуклеотида 847 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 830 до нуклеотида 849 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 828 до нуклеотида 846 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 828 до нуклеотида 848 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 830 до 19 UA 114171 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеотида 848 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 830 до нуклеотида 850 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 828 до нуклеотида 845 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 830 до нуклеотида 847 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 828 до нуклеотида 849 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 830 до нуклеотида 851 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 828 до нуклеотида 844 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 830 до нуклеотида 846 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 828 до нуклеотида 850 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 830 до нуклеотида 852 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 992 до нуклеотида 1009 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 731 до нуклеотида 752 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 776 до нуклеотида 795 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 731 до нуклеотида 753 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 776 до нуклеотида 794 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 776 до нуклеотида 796 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 776 до нуклеотида 793 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 776 до нуклеотида 797 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 776 до нуклеотида 792 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 776 до нуклеотида 798 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 733 до нуклеотида 752 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 733 до нуклеотида 753 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 733 до нуклеотида 754 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 733 до нуклеотида 755 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 838 до нуклеотида 854 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 246 до нуклеотида 263 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 838 до нуклеотида 855 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 245 до нуклеотида 264 d. Праймери, що розпізнають чужорідну ДНК, для використання із праймерами, що розпізнають 3'-фланкуючу послідовність: - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 173 до нуклеотида 192 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 22 до нуклеотида 41 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 172 до нуклеотида 192 20 UA 114171 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 174 до нуклеотида 192 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 191 до нуклеотида 210 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 171 до нуклеотида 192 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 175 до нуклеотида 192 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 190 до нуклеотида 210 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 192 до нуклеотида 210 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 176 до нуклеотида 192 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 189 до нуклеотида 210 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 193 до нуклеотида 210 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 188 до нуклеотида 210 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 194 до нуклеотида 210 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 199 до нуклеотида 218 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 200 до нуклеотида 218 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 197 до нуклеотида 218 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 201 до нуклеотида 218 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 201 до нуклеотида 220 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 200 до нуклеотида 220 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 199 до нуклеотида 220 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 200 до нуклеотида 221 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 199 до нуклеотида 221 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 150 до нуклеотида 172 ПЦР-праймери, придатні для ідентифікації EE-GM1, описані в заявці WО2006/108674, зокрема, зі сторінки 8 рядка 4 до сторінки 26 рядка 7 (включеної в даний документ шляхом посилання). ПЦР-праймери, придатні для ідентифікації EE-GM2, описані в заявці WО2006/108675, зокрема, зі сторінки 8 рядка 4 до сторінки 33 рядка 4 (включеної в даний документ шляхом посилання). У даному описі "нуклеотидна послідовність SEQ ID No Z від положення X до положення Y" означає нуклеотидну послідовність, що включає обидва кінцевих нуклеотида. У кращому випадку ампліфікований фрагмент має довжину між 50 і 500 нуклеотидами, наприклад, між 100 і 350 нуклеотидами. Специфічні праймери можуть мати послідовність, на 80100 % ідентичну послідовності в межах 5'- або 3'-фланкуючої ділянці елітної події або чужорідної ДНК елітної події, відповідно, за умови, що неспівпадіння дозволяють здійснювати специфічну ідентифікацію елітної події при використанні цих праймерів в умовах, оптимізованих для ПЦР. У той же час діапазон припустимих неспівпадінь легко визначити експериментально, і ці діапазони відомі фахівцям. Виявлення інтегрованих фрагментів можна здійснювати різними способами, наприклад, за рахунок оцінки розміру фрагментів після аналізу в гелі. Інтегровані фрагменти також можна безпосередньо секвенувати. Крім того, відомі інші способи виявлення ампліфікованих фрагментів ДНК, специфічні по відношенню до послідовностей. Оскільки послідовність праймерів і їх відносне розташування в геномі унікальні для елітної події, ампліфікація інтегрованого фрагмента відбувається тільки в біологічних зразках, що містять нуклеїнову кислоту елітної події. У кращому випадку при здійсненні ПЦР для ідентифікації присутності елітних подій EE-GM3 і EE-GM1 або елітних подій EE-GM3 і EE-GM2 у невідомих зразках включають контроль із набором праймерів, при використанні яких можна ампліфікувати фрагмент у межах "гена домашнього господарства" виду рослини, що містить зазначену подію. Гени домашнього господарства являють собою гени, що експресуються в більшості типів клітин і пов'язані з метаболічною активністю, загальною для всіх клітин. У кращому випадку розмір фрагмента, ампліфікованого з гена домашнього господарства, перевищує розмір ампліфікованого інтегрованого фрагмента. Залежно від аналізованих зразків можна включати інші контролі. Стандартні протоколи ПЦР описані, наприклад, в "PCR Applications Manual" (Roche Molecular Biochemicals, 2nd Edition, 1999) і інших джерелах. Оптимальні умови для ПЦР, включаючи послідовність специфічних праймерів, зазначені в "Протоколі ПЦР-ідентифікації (або ідентифікації за допомогою полімеразної ланцюговоїреакції)” для кожної елітної події. Разом з тим, необхідно розуміти, що може виникнути необхідність корекції ряду параметрів протоколу ПЦР-ідентифікації до умов, специфічних для лабораторії, і їх незначної модифікації для одержання аналогічних результатів. Наприклад, при використанні різних способів підготовки ДНК може потребуватися корекція, наприклад, використовуваної кількості праймерів, полімерази й умов гібридизації. Аналогічно вибір інших праймерів може диктувати інші 21 UA 114171 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 оптимальні умови протоколу ПЦР-ідентифікації. Разом з тим, ці варіанти корекції очевидні для фахівців і, більше того, детально описані в сучасних керівництвах із застосування ПЦР, наприклад, у зазначеному вище керівництві. Як альтернатива для ампліфікації інтегрованих фрагментів, які можна використовувати як "специфічні зонди" для ідентифікації EE-GM3 і EE-GM1 або EE-GM3 і EE-GM2 у біологічних зразках, можна використовувати специфічні праймери. Взаємодія нуклеїнової кислоти біологічного зразка із зондами в умовах, при яких можлива гібридизація зонда з відповідними фрагментами нуклеїнової кислоти зразка, призводить до утворення гібридів нуклеїнова кислота/зонд. Утворення цих гібридів можна виявити (наприклад, за рахунок мічення нуклеїнової кислоти або зонда), відповідно до чого утворення цих гібридів вказує на присутність EE-GM3 і EE-GM1 або EE-GM3 і EE-GM2. Такі способи ідентифікації, які засновані на гібридизації зі специфічним зондом (на твердофазному носії або в розчині), описані в спеціальній літературі. Специфічний зонд у кращому випадку являє собою послідовність, що при оптимізованих умовах специфічно гібридизує з ділянкою в межах 5'- або 3'-фланкуючої ділянки елітної події, а також переважно містить безперервний із цією ділянкою фрагмент чужорідної ДНК (тут і далі має назву "специфічної ділянки"). У кращому випадку специфічний зонд включає послідовність довжиною від 50 до 500 п.о., переважно від 100 до 350 п.о., що щонайменше на 80 %, переважно на 80-85 %, більш переважно на 85-90 %, особливо переважно на 90-95 %, найбільше переважно на 95 %-100 %, ідентична (або комплементарна) нуклеотидній послідовності специфічної ділянки. У кращому випадку специфічний зонд включає послідовність довжиною від приблизно 15 до приблизно 100 безперервних нуклеотидів, ідентичну (або комплементарну) специфічної ділянці елітної події. Крім того, використовуючи представлену в даному документі специфічну інформацію про послідовність елітної події, можна розробити специфічні способи виявлення елітних подій EEGM3 і EE-GM1 або елітних подій EE-GM3 і EE-GM2, що відрізняються від способів ампліфікації на основі ПЦР. Такі альтернативні способи виявлення включають способи виявлення посилення лінійного сигналу на основі інвазивного розщеплення конкретних нуклеотидних структур, також відомого як технологія InvaderTM (відповідно до опису, наприклад, у патентах США 5985557 "Invasive Cleavage of Nucleic Acids", 6001567 "Detection of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavage", включених у даний документ як посилання). Для виявлення EE-GM3 за допомогою цього способу послідовність-мішень можна гібридизувати з міченим першим олігонуклеотидом, що включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1452 до нуклеотида 1469 або її комплементарний ланцюг, або зазначеним нуклеотидним зондом, що включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 223 до нуклеотида 240 або її комплементарний ланцюг, а потім гібридизувати з другим олігонуклеотидом, що включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1434 до нуклеотида 1451 або її комплементарний ланцюг, або зазначеним нуклеотидним зондом, що включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 241 до нуклеотида 258 або її комплементарний ланцюг, причому перший і другий олігонуклеотид перекриваються щонайменше на один нуклеотид. Подвійна або потрійна структура, що утвориться при цій гібридизації, дає можливість селективного розщеплення зонда ферментом (Cleavase®) при збереженні послідовності-мішені. Після цього здійснюють виявлення розщепленого міченого зонда, можливо, через проміжний етап, що призводить до подальшого посилення сигналу. Для виявлення EE-GM1 за допомогою цього способу послідовність-мішень можна гібридизувати з міченим першим олігонуклеотидом, що включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 12 від нуклеотида 210 до нуклеотида 227 або її комплементарний ланцюг, або зазначеним нуклеотидним зондом, що включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 13 від нуклеотида 561 до нуклеотида 568 або її комплементарний ланцюг, а потім гібридизувати з другим олігонуклеотидом, що включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 12 від нуклеотида 192 до нуклеотида 209 або її комплементарну ланцюг, або зазначеним нуклеотидним зондом, що включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 13 від нуклеотида 569 до нуклеотида 586 або її комплементарний ланцюг, причому перший і другий олігонуклеотид перекриваються щонайменше на один нуклеотид. Подвійна або потрійна структура, що утвориться при цій гібридизації, дає можливість селективного розщеплення зонда ферментом (Cleavase®) при збереженні послідовності-мішені. Після цього здійснюють виявлення розщепленого міченого зонда, можливо, через проміжний етап, що призводить до подальшого посилення сигналу. Для виявлення EE-GM2 за допомогою цього способу послідовність-мішень можна гібридизувати з міченим першим олігонуклеотидом, що включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 14 від нуклеотида 312 до нуклеотида 329 або її комплементарний ланцюг, або зазначеним нуклеотидним зондом, що включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 15 від нуклеотида 490 до нуклеотида 507 або її комплементарний 22 UA 114171 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ланцюг, а потім гібридизувати з другим олігонуклеотидом, що включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 14 від нуклеотида 294 до нуклеотида 311 або її комплементарну ланцюг, або зазначеним нуклеотидним зондом, що включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 15 від нуклеотида 508 до нуклеотида 525 або її комплементарний ланцюг, причому перший і другий олігонуклеотид перекриваються щонайменше на один нуклеотид. Подвійна або потрійна структура, що утвориться при цій гібридизації, дає можливість селективного розщеплення зонда ферментом (Cleavase®) при збереженні послідовності-мішені. Після цього здійснюють виявлення розщепленого міченого зонда, можливо, через проміжний етап, що призводить до подальшого посилення сигналу. Термін "набір", як використовується тут, відноситься до набору реактивів для здійснення способу відповідно до винаходу, зокрема, ідентифікації елітної події EE-GM3 у біологічних зразках або визначення статусу зіготності рослинного матеріалу, що містить EE-GM3. Зокрема, кращий варіант втілення набору, відповідно до винаходу, включає щонайменше один або два специфічних праймери, відповідно до вищенаведеного опису для ідентифікації елітної події, або три специфічних праймери для визначення статусу зіготності. Необов'язково набір може ще включати будь-який інший реактив, описаний тут у протоколі ПЦР-ідентифікації. В альтернативному випадку, згідно ще одного варіанта втілення даного винаходу, набір може включати специфічний зонд, відповідно до вищенаведеного опису, що специфічно гібридизує з нуклеїновою кислотою біологічних зразків, для ідентифікації присутності EE-GM3 у них. Необов'язково набір може ще включати будь-який інший реактив (включаючи буфер для гібридизації, мітку, але не обмежуючись ними) для ідентифікації EE-GM3 у біологічних зразках з використанням специфічного зонда. Набір, відповідно до винаходу, може бути використаний, а його компоненти можуть бути специфічно адаптовані для цілей контролю якості (наприклад, чистоти партій насіння), виявлення присутності або відсутності елітної події в рослинному матеріалі, що включає рослинний матеріал або його похідні, що існує, наприклад, не обмежуючись цим, у харчових продуктах або кормах. Як використовується тут, "ідентичність послідовності" стосовно нуклеотидних послідовностей (ДНК або РНК) відноситься до кількості положень, що містять ідентичні нуклеотиди, розділеному на кількість нуклеотидів у більш короткій з двох послідовностей. Вирівнювання двох нуклеотидних послідовностей здійснюють відповідно до алгоритму Уілбера й Ліпманна (Wilbur and Lipmann, 1983, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80:726), використовуючи розмір вікна, рівний 20 нуклеотидам, довжину слова, що дорівнює 4 нуклеотидам, і штраф за пропуск, рівний 4. Комп'ютерний аналіз і інтерпретацію даних про послідовність, включаючи вирівнювання послідовностей відповідно до вищенаведеного опису, можна виконати, наприклад, за допомогою програмного пакета аналізу послідовностей Genetics Computer Group (GCG, біотехнологічний центр Вісконсинського університету). Послідовності називають "істотно подібними", якщо такі послідовності мають ідентичність, що становить щонайменше приблизно 75 %, зокрема, щонайменше приблизно 80 %, більш конкретно - щонайменше приблизно 85 %, ще конкретніше - щонайменше приблизно 90 %, особливо - щонайменше приблизно 95 %, найбільшою мірою - щонайменше приблизно 98 % або щонайменше приблизно 99 %. Очевидно, що якщо про послідовності РНК говорять як про істотно подібні або що мають деякий ступінь ідентичності з послідовностями ДНК, то тимідин (T) у послідовності ДНК прирівнюють до урацилу (U) у послідовності РНК. Крім того, очевидно, що згодом у послідовностях ДНК можуть виникати невеликі неспівпадіння або мутації й що деякі неспівпадіння можуть бути припустимими для специфічних для події праймерів або зондів відповідно до винаходу, тому будь-яка послідовність ДНК, зазначена тут у будь-якому варіанті втілення даного винаходу для будь-якої 3'- або 5'-фланкуючої ДНК, або для будь-якої включеної або чужорідної ДНК, або будьякого праймера, або зонда відповідно до винаходу, також включає послідовності, істотно подібні з послідовностями, представленими тут, наприклад, послідовності, що гібридизують з або мають щонайменше 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або щонайменше 99 % ідентичність з послідовностями, наведеними для будь-якої 3'- або 5'-фланкуючої ДНК, для будь-якого праймера або зонда, або для будь-якої включеної або чужорідної ДНК згідно із даним винаходом. Термін "праймер", як використовується тут, включає будь-яку нуклеїнову кислоту, здатну бути затравкою синтезу нуклеїнової кислоти, що утворюється, в процесі матричного синтезу, наприклад, ПЦР. Звичайно праймери являють собою олігонуклеотиди довжиною від 10 до 30 нуклеотидів, однак, можна використовувати й більш довгі послідовності. Праймери можуть бути представлені у дволанцюговій формі, хоча кращою є одноланцюгова форма. Зонди можна використовувати як праймери, однак, вони призначені для зв'язування із ДНК або РНК 23 UA 114171 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мішенями й не потрібні в процесі ампліфікації. Термін "розпізнавання", як використовується тут у відношенні специфічних праймерів, відноситься до того, що специфічні праймери специфічно гібридизують з послідовністю ДНК елітної події в умовах, установлених відповідно до способу (наприклад, в умовах відповідно до протоколу ПЦР-ідентифікації), причому специфічність визначають за допомогою позитивних і негативних контролів. Термін "що гібридизує", як використовується тут відносно специфічних зондів, відноситься до того, що зонд зв'язується зі специфічною ділянкою нуклеотидної послідовності елітної події в умовах стандартної жорсткості. Умови стандартної жорсткості, як використовується тут, відносяться до умов гібридизації, описаних тут, або до стандартних умов гібридизації відповідно до опису в Sambrook et al., 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY), що, наприклад, може включати наступні етапи: 1) іммобілізацію фрагментів геномної ДНК рослини на фільтрі, 2) попередню гібридизацію фільтра протягом 1-2 годин при 42 °C в 50 % формаміді, 5 X стандартному фосфатно-сольовому буфері з ЕДТА (SSPE), 2 X реактиві Денхардта й 0,1 % ДСН або протягом 1-2 годин при 68 °C в 6 X стандартному цитратно-сольовому буфері (SSC), 2 X реактиві Денхардта й 0,1 % ДСН, 3) внесення міченого гибридізаційного зонда, 4) інкубування протягом 16-24 годин, 5) промивання фільтра протягом 20 хв. при кімнатній температурі в 1 X SSC, 0,1 % ДСН, 6) трикратне промивання фільтра протягом 20 хв., кожен раз при 68 °C в 0,2 X SSC, 0,1 % ДСН, і 7) експонування фільтра протягом 24-48 годин на рентгенівську плівку при -70 °C з посилюючим екраном. Як використовується тут, біологічний зразок являє собою зразок рослини, рослинного матеріалу або продуктів, що містять рослинний матеріал. Термін "рослина" включає тканини рослини сої культурної (Glycine max) на будь-якій стадії розвитку, а також будь-які клітини, тканини або органи, зібрані або що походять від такої рослини, включаючи будь-яке насіння, листя, стеблини, квітки, корені, окремі клітини, гамети, культури клітин, культури тканин або протопласти, але не обмежуючись ними. "Рослинний матеріал", як використовується тут, відноситься до матеріалу, одержаного або що походить від рослини. Продукти, що включають рослинний матеріал, відносяться до продуктів харчування, кормів або інших продуктів, виготовлених з використанням рослинного матеріалу, або, можливо, забрудненого рослинного матеріалу. Варто розуміти, що в контексті даного винаходу такі біологічні зразки перевіряють на присутність нуклеїнових кислот, специфічних для EE-GM3, EE-GM1 і EE-GM2, припускаючи присутність нуклеїнових кислот у цих зразках. Таким чином, способи в даний заявці для ідентифікації елітної події EE-GM3 і EE-GM2 або EE-GM3 і EE-GM1 у біологічних зразках відносяться до ідентифікації нуклеїнових кислот, що включають зазначену елітну подію, у біологічних зразках. Як використовується тут, термін "що включає" необхідно розуміти як позначення наявності зазначених властивостей, одиниць, етапів, реагентів або компонентів, до яких відноситься термін, що не виключає наявності або додавання одного або декількох властивостей, одиниць, етапів, компонентів або їхніх груп. Так, наприклад, нуклеїнова кислота або білок, що включають нуклеотидну або амінокислотну послідовність, можуть включати, крім фактично зазначених, додаткові нуклеотиди або амінокислоти, тобто бути частиною більшої нуклеїнової кислоти або білка. Химерний ген, що включає функціонально або структурно визначену послідовність ДНК, може включати додаткові послідовності ДНК, наприклад, послідовності промотору й термінатора транскрипції. Даний винахід також відноситься до розробки комбінації елітної події EE-GM3 і елітної події EE-GM1 або комбінації елітної події EE-GM3 і елітної події EE-GM2 у сої, до рослин, що включають комбінацію цих подій, до потомства, одержаного від цих рослин, і до рослинних клітин або рослинного матеріалу, що походить від рослин, що включають зазначені комбінації. Рослини, що включають елітні події EE-GM3 і EE-GM1 або EE-GM3 і EE-GM2, можна одержати відповідно до опису в прикладі 1. Комбінації одержують шляхом схрещування рослин, що містять окремі події, за допомогою загальноприйнятих способів схрещування й ідентифікації їх потомства, що містить дві різних події. Рослини сої або рослинний матеріал, що містить EE-GM3 і EE-GM1, можна ідентифікувати відповідно до протоколу ПЦР-ідентифікації, описаного для EE-GM3 і EE-GM1 у Прикладі 2. Стисло геномну ДНК сої, що присутня у біологічному зразку, піддають ПЦР-ампліфікації, використовуючи праймер, що специфічно розпізнає послідовність у межах 5'- або 3'-фланкуючої послідовності EE-GM3, наприклад, праймер з послідовністю SEQ ID No: 5, і праймер, що розпізнає послідовність чужорідної ДНК, наприклад, праймер з послідовністю SEQ ID No: 4, а також використовуючи праймер, що специфічно розпізнає послідовність у межах 5'- або 3' 24 UA 114171 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фланкуючої послідовності EE-GM1, наприклад, праймер з послідовністю SEQ ID No: 16, і праймер, що розпізнає послідовність чужорідної ДНК, наприклад, праймер з послідовністю SEQ ID No: 17. Рослини сої або рослинний матеріал, що містить EE-GM3 і EE-GM2, можна ідентифікувати відповідно до протоколу ПЦР-ідентифікації, описаного для EE-GM3 і EE-GM2 у Прикладі 2. Стисло геномну ДНК сої, що присутня у біологічному зразку, піддають ПЦР-ампліфікації, використовуючи праймер, що специфічно розпізнає послідовність у межах 5'- або 3'-фланкуючої послідовності EE-GM3, наприклад, праймер з послідовністю SEQ ID No: 5, і праймер, що розпізнає послідовність чужорідної ДНК, наприклад, праймер з послідовністю SEQ ID No: 4, а також використовуючи праймер, що специфічно розпізнає послідовність у межах 5'- або 3'фланкуючої послідовності EE-GM2, наприклад, праймер з послідовністю SEQ ID No: 18, і праймер, що розпізнає послідовність чужорідної ДНК, наприклад, праймер з послідовністю SEQ ID No: 19. ДНК-праймери, що ампліфікують частину ендогенної послідовності сої, використовують як позитивний контроль ПЦР-ампліфікації. Якщо при ПЦР-ампліфікації з матеріалу одержують фрагменти очікуваного розміру, цей матеріал містить рослинний матеріал з рослини сої, що несе елітну подію EE-GM3 і EE-GM1, або з рослини сої, що несе елітну подію EE-GM3 і EE-GM2. Рослини, що несуть EE-GM3 і EE-GM1 або EE-GM3 і EE-GM2, характеризуються стійкістю до гліфосату, а також до інгібіторів HPPD, наприклад, ізоксафлутолу, а також стійкістю до глюфосинату. Рослини, що несуть комбінації подій, при відсутності застосування гербіцидів, також характеризуються агрономічними характеристиками, порівнянними з доступними для надбання сортами сої. Виявлено, що присутність чужорідної ДНК в областях інсерції генома рослини сої, описаних тут, надає рослинам, що містять цю подію, особливо цікаві фенотипічні й молекулярні характеристики. Один з варіантів втілення даного винаходу представляє комбінацію елітних подій EE-GM3 і EE-GM1 та/або EE-GM2 у рослинах сої, яку можна одержати шляхом інсерції трансгенів по специфічних положеннях у геномі сої, причому ці елітні події надають таким рослинам сої стійкість до гліфосату, глюфосинату й гербіцидів-інгібіторів HPPD, наприклад, ізоксафлутолу, і не впливають на агрономічну продуктивність такої сої, негативно впливаючи на врожайність таких рослин сої в порівнянні з ізогенними лініями (як використовується тут, "ізогенні лінії" або "майже ізогенні лінії" являють собою лінії сої, що мають таке же генетичне оточення, але не містять трансгенів, наприклад, рослини з генетичним оточенням, аналогічним генетичному оточенню рослини, використовуваного для трансформації, або сестринські лінії, що відділяються, що втратили трансгени). Зокрема, даний винахід представляє комбінацію елітних подій EE-GM3 і EE-GM1 та/або EE-GM2 у рослинах сої, причому інсерція або наявність зазначеної елітної події в геномі таких рослин сої не викликає підвищеної схильності до захворювань, втрати врожайності або посилення полягання таких рослин сої в порівнянні з ізогенними лініями. Отже, даний винахід представляє комбінацію елітних подій у рослинах сої, які позначають як EE-GM3 і EE-GM1 та/або EE-GM2, що призводить до одержання рослин сої, стійких до застосування гліфосата, глюфосината й гербіцидів-інгібіторів HPPD (одночасно або окремо), і не має негативного впливу на зазначені рослини сої в порівнянні з ізогенними лініями, причому зазначені рослини сої не мають статистичні неспівпадіння, що стосуються схильності захворюванням або полягання, у порівнянні з ізогенними рослинами сої. Зазначені характеристики роблять дану комбінацію елітних подій дуже цікавою для контролю стійких до гліфосату бур'янистих рослин на полях сої, а також можуть використовуватися в підходах для запобігання або затримки подальшого розвитку стійкості до гліфосату на полях сої (наприклад, шляхом застосування гліфосата й ізоксафлутола, та/або глюфосината, або ізоксафлутола й гліфосата, та/або глюфосината, або глюфосината й гліфосата, та/або ізоксафлутола, забезпечуючи застосування гербіцидів, що мають щонайменше 2 або навіть 3 різних механізмів дії). Тут також представлені рослина сої або хх фрагменти, що містять подію EE-GM3 і елітну подію EE-GM1 або EE-GM2, причому зразки насіння сої, що містять подію EE-GM3, депоновані в NCIMB під номером доступу 41659, зразки насіння сої, що містять подію EE-GM1, депоновані в NCIMB під номером доступу NCIMB 41658, зразки насіння сої, що містять подію EE-GM2, депоновані в NCIMB під номером доступу NCIMB 41660, зразки насіння сої, що містять подію EE-GM3 і EE-GM1, депоновані в ATCC під номером доступу PTA-11041, а зразки насіння сої, що містять подію EE-GM3 і EE-GM2, депоновані в ATCC під номером доступу PTA-11042. Рослини сої або їх фрагменти, що містять EE-GM3 і EE-GM1 або EE-GM3 і EE-GM2, можна одержати шляхом об'єднання відповідних елітних подій, які можна знайти у відповідному депонованому насінні, за допомогою будь-яких способів, відомих у даній ділянки, включаючи 25 UA 114171 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 схрещування рослин, отриманих з депонованих насіння, збір їхнього потомства й ідентифікацію серед цього потомства рослин, що містять відповідну комбінацію елітних подій. Крім того, тут представлене насіння таких рослин, що містять такі події, а також соєві продукти, виготовлені з такого насіння, що містять подію EE-GM3 і EE-GM1 або EE-GM2. Такі соєві продукти можуть являти собою або містити крупу, мелене насіння, борошно, пластівці та інш. Зокрема, такий соєвий продукт містить нуклеїнову кислоту, що утворює амплікони, характерні для події EE-GM3 і елітної події EE-GM1 або EE-GM2, що включають SEQ ID No 2 або 3, SEQ ID No 14 або 15, та/або SEQ ID No 12 або 13. Крім того, тут представлено спосіб одержання соєвого продукту, що включає одержання насіння сої, що містить подію EE-GM3 і елітну подію EE-GM1 або EEGM2, і виготовлення з них такого соєвого продукту. Крім того, тут представлено рослину сої, що являє собою потомство кожної з вищеописаних рослин сої, що містить подію EE-GM3 і EE-GM1 або EE-GM2. Крім того, тут представлено спосіб одержання рослини сої, стійкого до гербіцидів гліфосату та/або глюфосинату та/або ізоксафлутолу, що включає включення в геном такої рослини події EE-GM3 і події EE-GM1 або EE-GM2, зокрема, шляхом схрещування першої рослини сої, що містить подію EE-GM3, з рослиною сої, що містить EE-GM1 та/або EE-GM2, і шляхом селекції потомства, стійкого до гліфосату та/або глюфосинату, та/або ізоксафлутолу. Крім того, тут представлено рослину, стійку до гліфосату й глюфосинату, та/або ізоксафлутолу без втрати врожайності, що має прийнятні агрономічні характеристики, що містить 2mEPSPS, HPPD і білок PAT, і здатну утворювати амплікон, характерний для подій EEGM3 і EE-GM1 або EE-GM3 і EE-GM2. Крім того, тут представлений спосіб контролю бур'янистих рослин на полі сої, що містить події EE-GM3 і EE-GM1 або EE-GM3 і EE-GM2, або на полі, призначеному для посадки таких рослин сої, що включає обробку поля ефективною кількістю гербіциду на основі ізоксафлутола, гліфосата та/або глюфосината, причому такі рослини мають стійкість д такому(их) гербіциду(ів). Крім того, тут представлені рослина, тканина або насіння сої, що містять EE-GM3 і EE-GM1, що характеризуються вмістом у геномі нуклеотидної послідовності, що має щонайменше 80 %, 90 %, 95 % або 100 % ідентичності з SEQ ID No 2 від нуклеотида 1431 до нуклеотида 1472, і нуклеотидної послідовності, що має щонайменше 80 %, 90 %, 95 % або 100 % ідентичності з SEQ ID No 3 від нуклеотида 220 до нуклеотида 261, або комплементарних ланцюгів таких послідовностей, а також нуклеотидної послідовності, що має щонайменше 80 %, 90 %, 95 % або 100 % ідентичності з SEQ ID No 12 від нуклеотида 199 до нуклеотида 220, і нуклеотидної послідовності, що має щонайменше 80 %, 90 %, 95 % або 100 % ідентичності з SEQ ID No 13 від нуклеотида 558 до нуклеотида 579, або комплементарних ланцюгів таких послідовностей. Крім того, тут представлені рослина, тканина або насіння сої, що містять EE-GM3 і EE-GM2, що характеризуються вмістом у геномі нуклеотидної послідовності, що має щонайменше 80 %, 90 %, 95 % або 100 % ідентичності з SEQ ID No 2 від нуклеотида 1431 до нуклеотида 1472, і нуклеотидної послідовності, що має щонайменше 80 %, 90 %, 95 % або 100 % ідентичності з SEQ ID No 3 від нуклеотида 220 до нуклеотида 261, або комплементарних ланцюгів таких послідовностей, а також нуклеотидної послідовності, що має щонайменше 80 %, 90 %, 95 % або 100 % ідентичності з SEQ ID No 14 від нуклеотида 301 до нуклеотида 322, і нуклеотидної послідовності, що має щонайменше 80 %, 90 %, 95 % або 100 % ідентичності з SEQ ID No 15 від нуклеотида 497 до нуклеотида 518, або комплементарних ланцюгів таких послідовностей. Як використовується тут, термін "ізоксафлутол" відноситься до гербіциду ізоксафлутолу тобто [(5-циклопропіл-4-ізоксазоліл)[2-(метилсульфоніл)-4-(трифторметил)феніл]метанону], його активному метаболіту, дикетонітрилу й будь-яким сумішам розчинів, що містять зазначені сполуки. Гербіциди, що інгібують HPPD, придатні для обробки рослин, що містять події відповідно до даного винаходу, являють собою дикетонітрили, наприклад, 2-циан-3циклопропил-1-(2-метилсульфонил-4-трифторметилфенил)пропан-1,3-дион и 2-циан-1-[4(метилсульфоніл)-2-трифторметилфеніл]-3-(1-метилциклопропіл)пропан-1,3-діон; інші ізоксазоли та піразолінати, наприклад, топрамезон, тобто.[3-(4,5-дигідро-3-ізоксазоліл)-2-метил4-(метилсульфоніл)феніл](5-гідрокси-1-метил-1H-піразол-4-ил)метанон] та пірасульфотол [(5гідрокси-1,3-диметилпіразол-4-іл(2-метилсульфоніл-4-трифторметилфеніл)метанон] або піразофен [2-[4-(2,4-дихлорбензоіл)-1,3-диметилпіразол-5-ілокси]ацетофенон]. В одному з варіантів втілення даного винаходу поле, призначене для посадки рослин сої, що містять подію EE-GM3, можна обробляти гербіцидом-інгібітором HPPD, наприклад, ізоксафлутолом ('IFT'), до посадки рослин сої або посіву насіння, що очищає поле від бур'янистих рослин, знищуваних інгібітором HPPD, і дає можливість нульової обробки ґрунту з посадкою або посівом сої на цьому попередньо обробленому полі згодом (випалюване застосування гербіциду-інгібітору HPPD). Залишкова активність IFT також захищає сходи й 26 UA 114171 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зростаючі рослини сої від конкуренції з бур'янистими рослинами на ранніх стадіях росту. Після досягнення рослинами сої певного розміру й початку повторної появи бур'янистих рослин можна застосовувати гліфосат або суміш інгібітор HPPD-гліфосат як післясходовий гербіцид над верхівками рослин. У ще одному варіанті втілення даного винаходу поле, на якому посіяне насіння, що містить подію EE-GM3, можна обробляти гербіцидом-інгібітором HPPD, наприклад, IFT, до появи сходів рослин сої, але після посіву насіння (поле можна очистити від бур'янистих рослин до посіву іншими засобами, звичайно, за допомогою загальноприйнятих прийомів обробки ґрунту, наприклад, оранки, культиваторної обробки або підготовки посівних місць), причому залишкова активність буде підтримувати поле вільним від бур'янистих рослин, знищуваних гербіцидом, забезпечуючи відсутність конкуренції сходам і зростаючим рослинам з боку бур'янистих рослин (досходове застосування гербіциду-інгібітору HPPD). Після досягнення рослинами сої певного розміру й початку повторної появи бур'янистих рослин можна застосовувати гліфосат або суміш інгібітор HPPD-гліфосат як післясходовий гербіцид над верхівками рослин. В іншому варіанті втілення даного винаходу рослини, що містять подію EE-GM3, можна обробляти гербіцидом-інгібітором HPPD, наприклад, IFT, над верхівками рослин сої (що зійшли з посіяного насіння), що очищає поле від бур'янистих рослин, знищуваних інгібітором HPPD, причому це застосування можна здійснювати разом із (наприклад, у результаті змішування в обприскувачі), до або після обробки гліфосатом у якості післясходового гербіциду над верхівками рослин (післясходове застосування гербіциду-інгібітору HPPD (з гліфосатом або без нього)). Крім того, відповідно до даного винаходу, рослини сої, що несуть EE-GM3 і EE-GM1 або EEGM2, можна обробляти такими інсектицидами, гербіцидами або фунгіцидами, або насіння сої, що несе EE-GM3 і EE-GM1 або EE-GM2, можна покривати шляхом дражирування оболонкою, що містить такі інсектициди, гербіциди або фунгіциди: Гербіциди для сої: алахлор, бентазон, трифторалин, хлоримурон-етил, хлорансулам-метил, феноксапроп, фомесафен, флуазифоп, гліфосат, імазамокс, імазахін, імазетапір, (S-)метолахлор, метрибузин, пендиметалін, тепралоксидим, ізоксафлутол, глюфосинат. Інсектициди для сої: лямбда-цигалотрин, метоміл, паратіон, тіокарб, імідаклоприд, клотіанидин, тіаметоксан, тіаклоприд, ацетаміприд, дінотефуран, флубендіамид, ринаксипір, циазипір, спіносад, спіноторам, емамектін бензоат, фипронил, етипрол, дельтаметрин, β-цифлутрин, гама- і лямбда-цигалотрін, 4-[[(6-хлорпіридин-3-ил)метил](2,2-дифторетил)аміно]фуран-2(5H)-он, спіротетрамат, спіродиклофен, трифлумурон, флонікамід, тіодикарб, бета-цифлутрин. Фунгіциди для сої: азоксистробін, ципроконазол, епоксиконазол, флутріафол, піраклостробін, тебуконазол, трифлоксистробін, протіоконазол, тетраконазол. У наступних прикладах описана ідентифікація елітних подій EE-GM3, EE-GM1 і EE-GM2, і рослин, що містять комбінацію події EE-GM3 з EE-GM1 або EE-GM3 з EE-GM2, і розробка інструментів для специфічної ідентифікації елітної події EE-GM3, EE-GM1 або EE-GM2 і їхніх комбінацій у біологічних зразках. Якщо в Прикладах не зазначене інше, всі рекомбінантні методики здійснювали у відповідності зі стандартними протоколами відповідно до опису в "Sambrook J and Russell DW (eds.) (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York" і в "Ausubel FA, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl ДО (eds.) (2006) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York". Стандартні матеріали та посилання описані в "Croy RDD (ed.) (1993) Plant Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford and Blackwell Scientific Publications, Oxford" і в "Brown ТА, (1998) Molecular Biology LabFax, 2nd Edition, Academic Press, San Diego". Стандартні матеріали й методики полімеразних ланцюгових реакцій (ПЦР) містяться в "McPherson MJ and Møller SG (2000) PCR (The Basics), BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford" і в "PCR Applications Manual, 3rd Edition (2006), Roche Diagnostics GmbH, Mannheim або www.roche-appliedscience.com”. Необхідно розуміти, що може виникнути необхідність корекції ряду параметрів будь-якого лабораторного протоколу, наприклад, протоколів ПЦР-ідентифікації в нижченаведених Прикладах, до умов, специфічних для лабораторії, і їх незначної модифікації для одержання аналогічних результатів. Наприклад, при використанні різних способів підготовки ДНК або виборі інших праймерів можуть знадобитися інші оптимальні умови для протоколу ПЦР. Разом з тим, ці варіанти корекції очевидні для фахівців і, більше того, докладно описані в сучасних 27 UA 114171 C2 керівництвах по застосуванню ПЦР. В описі й прикладах наведені посилання на наступні послідовності: SEQ ID No. 1: фрагмент SalI нуклеотидної послідовності вектора pSF10. SEQ ID No. 2: нуклеотидна послідовність, що включає 5’-ділянку, що фланкує чужорідну ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів в EE-GM3. SEQ ID No. 3: нуклеотидна послідовність, що включає 3’-ділянку, що фланкує чужорідну ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів в EE-GM3. SEQ ID No. 4: праймер SOY028 SEQ ID No. 5: праймер SOY029 SEQ ID No. 6: праймер SMP187 SEQ ID No. 7: праймер STV019 SEQ ID No. 8: нуклеотидна послідовність амплікону SEQ ID No. 9: праймер 1 для ампліфікації контрольного фрагменту (SOY01) SEQ ID No. 10: праймер 2 для ампліфікації контрольного фрагменту (SOY02) SEQ ID No. 11: нуклеотидна послідовність pB2/P35SAcK SEQ ID No. 12: нуклеотидна послідовність, що включає 5’-ділянку, що фланкує чужорідну ДНК в EE-GM1 SEQ ID No. 13: нуклеотидна послідовність, що включає 3’-ділянку, що фланкує чужорідну ДНК в EE-GM1 SEQ ID No. 14: нуклеотидна послідовність, що включає 5’-ділянку, що фланкує чужорідну ДНК в EE-GM2 SEQ ID No. 15: нуклеотидна послідовність, що включає 3’-ділянку, що фланкує чужорідну ДНК в EE-GM2 SEQ ID No. 16: праймер SOY06 SEQ ID No. 17: праймер SOY07 SEQ ID No. 18: праймер SOY09 SEQ ID No. 19: праймер SOY010 SEQ ID No. 20: нуклеотидна послідовність чужорідної ДНК і рослинних фланкуючих послідовностей в EE-GM3 SEQ ID No. 21: праймер SHA130 SEQ ID No. 22: праймер SHA178 5 10 Приклади 1. Трансформація Glycine max генами стійкості до гербіцидів. 1.1. Опис чужорідної ДНК, що включає химерні гени 2mEPSPS і HPPD-Pf-W336 Плазміда pSF10 являє собою вектор клонування, похідний від pUC19, що містить химерний ген 2mepsps і химерний ген hppd-Pf-W336, розташовані у фрагменті SalI розміром приблизно 7.3 т.п.о. Повний опис ДНК, що містяться між двома сайтами рестрикції SalI, наведено нижче в Таблиці 1. Нуклеотидна послідовність представлена в SEQ ID No: 1. Таблиця 1 Положення нуклеотидів у ДНК, що міститься між сайтами рестрикції SalI в pSF10 (SEQ ID No 1) Положення нуклеотидів Орієнтація 188-479 комплементарний ланцюг 480-1556 Опис і посилання 3'nos: послідовність, що включає 3’нетрансльовану область гена нопалінсинтази з T-ДНК pTiT37 Agrobacterium tumefaciens (Depicker et al., 1982, Journal of Molecular and Applied Genetics, 1, 561-573) hppdPf W336: послідовність, що кодує, 4гідроксифенілпіруватдіоксигенази штаму Pseudomonas fluorescens A32, модифікована заміною амінокислоти гліцин-336 триптофаном, відповідно до опису в Boudec et al. (2001), патент США US6245968B1 комплементарний ланцюг 28