Фармацевтична субстанція солі амінокислоти l-лізину та есцину

Реферат: Винахід належить до фармацевтики і стосується фармацевтичної субстанції, що являє собою сіль амінокислоти L-лізину та есцину, який являє собою суміш есцину Іа, есцину Іb, ізоесцину Іа UA 100962 C2 (12) UA 100962 C2 та ізоесцину Іb, де співвідношення суми есцину Іа та есцину Іb і суми ізоесцину Іа та ізоесцину Іb складає 2,0-9,0:8,0-1,0. Винахід також стосується фармацевтичної композиції. UA 100962 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід стосується медицини та фармації, а саме створення нових лікарських засобів, які використовують для лікування патологічних станів, що супроводжуються явищами набряку та/чи набухання головного та/чи спинного мозку різного ступеня тяжкості; набряками м'яких тканин, в тому числі із залученням опорно-рухового апарату. Відомі лікарські засоби на основі сапоніну каштану кінського - есцину, зокрема Аесцин, котрі мають протинабряковий ефект [Інструкція до медичного застосування препарату АЕСЦИН®, "Polfa" Kutno Pharmaceutical Company, Польща]. Є відомими властивості есцину знижувати судинну проникність [Matsuda H., Li Y., Murakami Т., Ninomiya К., Yamahara J., Yoshikawa M. Effects of escins Iа, Ib, Ila, and lIb from horse chestnut, the seeds of Aesculus hippocastanum L., on acute inflammation in animals. // Biol Pharm Bull. 1997 Oct;20(10):1092-5], у тому числі за рахунок стабілізації ендотеліоцитів [Arnould Т., Janssens D., Michiels С, Remade J. Effect of aescine on hypoxia-induced activation of human endothelial cells. // Eur J Pharmacol. 1996 Nov 14;315(2):22733]. Також відомим є застосування водорозчинної солі есцину, а саме натрію есцинату, у вигляді внутрішньовенних ін'єкцій при лікуванні черепно-мозкової травми, що супроводжується набряком мозку [Put Т. Advances in the conservative treatment of acute traumatic cerebral edema. Controlled clinical trial with follow-up examination. MMW Munch Med Wochenschr 1979; 121(31):1019-22], а також при лікуванні посттравматичних і постопераційних набряків м'яких тканин [Wilhelm К, Feldmeier C. The prevention and treatment of postoperative and post-traumatic oedema. Chemical laboratory tests on the renal tolerance of beta-aescin (reparil) (author's transl). Med Klin. 1975 Dec 19;70(51-52):2079-83]. Позитивні результати такого лікування були підтвердженні результатами клінічних досліджень. Крім того, за даними експериментальних та клінічних досліджень, препарати есцину мають не тільки протинабрякову, але й протизапальну та знеболюючу дію [Sirtori C.R. Aescin: pharmacology, pharmacokinetics and therapeutic profile. // Chem Pharm Bull (Tokyo).-2001 May.-49(5)]. Найбільш близьким до заявленого винаходу є препарат L-лізину есцинат® [інструкція для медичного застосування препарату L-лізину есцинат®, Корпорація "Артеріум", Україна], що містить сіль амінокислоти L-лізину та есцину та пропіленгліколь і виявляє протизапальну, протинабрякову та знеболюючу дію. Недоліком використання даного препарату є вузький терапевтичний діапазон, що обумовлює ризик виникнення побічних реакцій, таких як флебіт та гемоліз, при введенні терапевтичної дози, що складає 5-10 мл, та низьку ефективність при застосуванні менших доз. Вищевикладене обґрунтовує доцільність створення лікарського засобу, що проявлятиме більшу протинабрякову і протизапальну дію та матиме безпечніший терапевтичний профіль у порівнянні з існуючим аналогом. В основу винаходу поставлена задача - розробити фармацевтичну субстанцію та прийнятну фармацевтичну композицію шляхом використання існуючих різновидів есцину, що матиме виражений протинабряковий ефект у поєднанні з протизапальною та знеболюючою дією і зменшеною частотою розвитку побічних реакцій у порівнянні з існуючим аналогом. Вирішення поставленої задачі забезпечує створення солі амінокислоти L-лізину та суміші тритерпенових сапонінів, а саме есцину Iа, есцину Іb, ізоесцину Iа, ізоесцину Ib (сумарний есцин), що одержують із плодів каштану видів Aesculus hippocastanum, Aesculus turbinata, Aesculus chinensis або Aesculus chinensis var. wilsonii. Несподівано нами було встановлено, що терапевтичний ефект від солі амінокислоти Lлізину та есцину залежить від співвідношення суми есцину Iа та есцину Іb (-есцину) до суми ізоесцину Iа та ізоесцину Іb (-есцину), а саме використання сумарного есцину із співвідношенням -есцину до -есцину 2-9:8-1 для одержання солі амінокислоти L-лізину та сумарного есцину з заданим співвідношенням компонентів, а також виключення пропіленгліколю зі складу фармацевтичної композиції, дозволяє досягти кращого терапевтичного ефекту від її застосування та забезпечити меншу частоту побічних реакцій у порівнянні з аналогом. Субстанцію солі L-лізину та сумарного есцину з заданим співвідношенням -есцину до есцину (:) отримують шляхом використання комерційно доступних субстанцій L-лізину, есцину Iа, есцину Іb, ізоесцину Іа та ізоесцину Іb, які можна придбати, наприклад, в таких компаніях: Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd., Китай, AvaChem Scientific, США, ChromaDex, США. Крім того можна виділити як сумарний есцин, так і окремі субстанції есцину Іа, есцину Іb, ізоесцину Іа та ізоесцину ІЬ із плодів каштану видів Aesculus hippocastanum, Aesculus turbinata, Aesculus chinensis або Aesculus chinensis var. wilsonii будь яким шляхом, які описані, наприклад, в US Patent 3,163,636, 1961 /Genuine escin from horse chestnut estracts, and process of producing the same; J. Chen, W. Li, B. Yang, X. Guo, F. Sen-Chun Lee, X. Wang. Determination of four major saponins in the seeds of Aesculus chinensis Bunge using accelerated solvent extraction followed by 1 UA 100962 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 high-performance liquid chromatography and electrospray-time of flight mass spectrometry / Analytica Chimica Acta 596 (2007) 273-280; F. Wei, L.-Y. Ma, W.-T. Jin, S.-Ch. Ma, G.-Zh. Han, I.A. Khan, and R.-Ch. Lin. Antiinflammatory Triterpenoid Sapbnins from the Seeds of Aesculus chinensis / Chem. Pharm. Bull. 52(10) (2004) 1246-1248; M. Yoshikawa, T. Murakami, H. Matsuda, J. Yamahara, N. Murakami, I. Kitagawa. Bioactive saponins and glycosides. III. 1) Horse chestnut. (1): The structures, inhibitory effects on ethanol absorption, and hypoglycemic activity of escins la, Ib, IIa, IIb, and IlIa from the seeds of Aesculus hippocastanum L. / Chem. Pharm. Bull. 44 (1996)1454-1464. Спосіб отримання солі амінокислоти L-лізину та сумарного есцину із заданим співвідношенням -есцину до -есцину відбувається по тій самій схемі, що і спосіб отримання солі амінокислоти L-лізину та есцину, який є відомим з патенту України № 22509 від 22.05.1997, з відмінністю в тому, що використовувана субстанція есцину вже має задане співвідношення есцину до -есцину. Субстанцію сумарного есцину з заданим співвідношенням -есцину до есцину отримують загальновідомими методами середньому спеціалісту в даній галузі техніки, наприклад, шляхом змішування у заданому співвідношенні субстанцій -есцину та -есцину або шляхом стандартизації субстанції есцину шляхом змішування різних серій субстанцій есцину та/або додаткового введення -есцину чи -есцину для досягнення їх заданого співвідношення. Для перевірки наявності вищевказаного технічного результату були поставлені експерименти, які відображені у прикладах нижче. Приклад 1. Приготування первинних розчинів Для приготування тестових розчинів використані комерційні субстанції -есцину та -есцину (Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd., Китай), субстанція L-лізину, чистий пропіленгліколь, 96 % етанол, 0,9 % розчин натрію хлориду та вода для ін'єкцій. Первинні розчини солі L-лізину та -есцину і солі L-лізину та -есцину готували шляхом розчинення 150 мг (точна наважка, у перерахунку на 100 % речовину) відповідної субстанції есцину (- чи -) у 3 мл 0,646 % (m/V) розчину L-лізину основи (при кімнатній температурі, при необхідності для розчинення субстанції есцину використовували ультразвукову баню). Розчин № 1. Первинний розчин солі -есцину і L-лізину доводили ізотонічним розчином натрію хлориду до 15 мл. Розчин № 2. Первинний розчин солі -есцину і L-лізину доводили ізотонічним розчином натрію хлориду до 15 мл. Розчин № 3. 10 мл розчину № 1 доводили ізотонічним розчином натрію хлориду до 100 мл з наступною стерильною фільтрацією. Розчин № 4, 10 мл розчину № 2 доводили ізотонічним розчином натрію хлориду до 100 мл з наступною стерильною фільтрацією. Розчин № 5. До 1 мл розчину № 1 додавали 2 мл чистого пропіленгліколю та доводили об'єм водою для ін'єкцій до 10 мл з наступною стерильною фільтрацією. Розчин № 6. До 1 мл розчину № 2 додавали 2 мл чистого пропіленгліколю та доводили об'єм водою для ін'єкцій до 10 мл з наступною стерильною фільтрацією. Розчин № 7. До 4 мл розчину № 1 додавали 8 мл 96 % етанолу та доводили об'єм водою для ін'єкцій до 10 мл з наступною стерильною фільтрацією. Розчин № 8. До 4 мл розчину № 2 додавали 8 мл 96 % етанолу та доводили об'єм водою для ін'єкцій до 10 мл з наступною стерильною фільтрацією. Приклад 2. Вивчення протинабрякової активності субстанцій солей L-лізину та сумарного есцину з різними співвідношеннями -есцину та -есцину. Досліди проводилися на 110 білих щурах-самцях лінії Вістар масою 120-160 г. Тварини утримувалися в стандартних умовах віварію. В кожній групі було по 10 тварин, що розрізнялися за мітками, нанесеними розчином фукорцину на різних ділянках тіла. Групи були однорідними за віком та масою тварин. Для відтворення набряку була використана модель карагенанового запалення стопи. Для цього за допомогою інсулінового шприца з тонкою голкою кожному щуру у ліву задню лапку субплантарно вводили 0,1 мл 1 % суспензії карагенану (Sigma) у фізіологічному розчині. Об'єм лапи визначали за допомогою водяного плетизмометра (Ugo Basile, Італія) безпосередньо перед дослідом, а також через 1, 2,4 і 6 годин після введення карагенану. Розраховували приріст об'єму лапки. Отримані результати підлягали статистичній обробці за допомогою програми статистичного аналізу AnalystSoft, StatPlus, версія 2009. Робочі розчини готували безпосередньо перед введенням шляхом змішування в стерильних умовах розчинів №3 та №4 у заданих об'ємних співвідношеннях (:):1:15, 1:9,1:4,2:3, 1:1, 3:2, 4:1, 9:1 та 15:1. Розчини вводили з розрахунку 10 мл/кг маси щура в попередньо катетеризовану стегнову вену безпосередньо після субплантарної ін'єкції карагенану. Тваринам контрольної групи 2 UA 100962 C2 5 10 вводився фізіологічний розчин (10 мл/кг). Додатково 10 щурам вводили розчин лікарського засобу L-лізину есцинату 0,1 % з розрахунку 10 мл/кг. Як свідчать дані експерименту (таблиця 1), протинабряковий ефект спостерігався у всіх групах експериментального лікування, проте величина ефекту у різних групах суттєво відрізнялася. Найменший антиексудативний ефект, що досягав порогу статистичної значущості лише на 2-й годині експерименту, відмічено при введенні розчинів зі співвідношеннями : 9:1, 15:1 та 1:15. В цілому залежність ефекту від співвідношення а:р носила дзвоноподібний характер з максимумом при співвідношенні :=1:4-3:2, що було неочікуваним результатом та не випливало з наявної інформації про есцин. Антиексудативний ефект, що тривав до четвертої години досліду, був відмічений в діапазоні співвідношень  та -есцинів у складі субстанції від 1:9 до 4:1. Таблиця 1 Динаміка приросту об'єму лапки щура при карагенановому запаленні на фоні експериментального лікування із застосуванням субстанцій солей L-лізину та сумарного есцину з різними співвідношеннями -есцину та -есцину. № групи 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. Приріст об'єму лапки, стандартна похибка) 1 година 2 години Контроль (0,9 % NaCl) 0,33±0,041 0,76±0,039 L-лізину есцинат 0,22±0,032* 0,55±0,031* Розчин субстанції 0,26±0,040 0,61±0,035* 1:15 Розчин субстанції 1:9 0,24±0,034 0,58±0,040* Розчин субстанції 1:4 0,21±0,020* 0,52±0,029* Розчин субстанції 2:3 0,17±0,037* 0,47±0,042+ Розчин субстанції 1:1 0,22±0,032* 0,50±0,035* Розчин субстанції 3:2 0,20±0,031* 0,53±0,037* Розчин субстанції 4:1 0,25±0,045 0,52±0,042* Розчин субстанції 9:1 0,29±0,041 0,64±0,038* Розчин субстанції 0,31±0,045 0,67±0,035* 15:1 Розчини, вводяться що мл (середнє арифметичне 4 години 1,02±0,042 0,77±0,035* 6 годин 0,83±0,054 0,67±0,039* 0,91±0,038 0,77±0,040 0,85±0,038* 0,73±0,029* 0,71±0,032* 0,75±0,041* 0,74±0,039* 0,83±0,048* 0,92±0,037 0,75±0,044 0,68±0,027* 0,63±0,040* 0,67±0,045* 0,66±0,035* 0,74±0,051 0,82±0,042 0,90±0,042 ± 0,80±0,038 *- р