Амфіфільні блок-кополімери n-похідних природних двоосновних амінокислот та поліетерів гліколів

Реферат: Галузь застосування: Створення нових дисперсних систем для транспорту лікарських препаратів в живому організмі, а також в косметичних, фармацевтичних засобах та біологічно активних добавках. Суть винаходу: вперше одержано амфіфільні блок-кополімери N-похідних природних двоосновних амінокислот та поліетерів гліколів загальної формули: R4 O O NH C CH R2 O C O де O R1 R3 CH2 O k C R4 NH CH R3 R2 C O O CH2 HC O l n , UA 106270 C2 (12) UA 106270 C2 k=2, R1= CH R2= CH2 R3= H R4= C (CH2)J ; або CH2 ; або l=2-35, CH2 n=2-25 CH3 CH3 j=16 O . Технічний результат: синтезовані блок-ко-полімери завдяки регулярному чергуванню у макромолекулі ліпофільних і гідрофільних блоків проявляють себе, як поверхнево-активні речовини - понижають поверхневий натяг на межі вода повітря та солюбілізують не розчинні в воді речовини. Лабільний естерний зв'язок, який з'єднує окремі блоки у блок-кополімерах забезпечує біодеградабельність, а будова елементарних ланок - легкий метаболізм та виведення з організму. Колоїдно-хімічні властивості блок-кополімерів є в широких межах регульованими, і це створює передумови для побудови на їх основі систем дисперсних частинок складної архітектури, які можуть бути перспективними, як наноконтейнери для доставки лікарських засобів. Табл. 3. R4 O NH O R4 R3 NH HO C R2 CH C O O R1 R3 CH2 C O k CH R2 C O O HC CH2 O H l n UA 106270 C2 5 10 15 20 25 30 35 Винахід стосується хімії високомолекулярних сполук, а саме амфіфільних блок-кополімерів, які можуть бути використані при створенні нових типів засобів для транспорту лікарських препаратів в живому організмі, а також в косметичних, фармацевтичних засобах та біологічно активних добавках. Відомо полімери природніх амінокислот (тирозин, глютамін). Вони володіють біосумісністю та біодеградабельністю та не містять пептидних зв'язків. [Kohn J., Langer R. A new approach to the development of bioerodible polymers for controlled release applications employng naturally occuring aminoacids. In: Polymeric materials, science and engineering, vol. 51. ACS, Washington DC, 1984, p. 119-121]. Проте невелика кількість відповідних амінокислот обмежує можливість регулювання колоїдно-хімічних властивостей таких полімерів, що робить їх малопридатними для створення дисперсних систем транспорту ліків. Відомо амфіфільні блок-кополімери поліетерів етилен(пропілен)поліамінокислот та гліколів. Вони є поверхнево-активними, їх властивості регулюються зміною властивостей окремих блоків, вони здатні до біодеградації. [Polymeric micelles from poly(ethylene glycol)-poly(amino acid) block 1,3 copolymer for drug and gene delivery. Kensuke Osada , R. James Christiel and Kazunori 1,2,3 1 2 Kataoka , * -Department of Materials Engineering, Graduate School of Engineering, -Center for 3 Disease Biology and Integrative Medicine, Graduate School of Medicine, and -Center for Nanobio Integration, University of Tokyo, 7-3-1 Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo 113-8656, Japan J. R. Soc. Interface (2009) 6, S 325-S 339doi:10.1098/rsif.2008.0547.focus Published online 1 April 2009]. Проте наявність пептидних зв'язків у блоці поліамінокислоти не виключає взаємодії такої макромолекули з живим організмом по схемі "чужий білок" з завідомо негативною реакцією. Амфіфільні блок-кополімери застосовуються для одержання водних міцелярних розчинів. Міцели блок-кополімеру у воді можна розглядати як структури "ядро-оболонка", при цьому ядро містить гідрофобну частину молекул блок-кополімерів, а оболонка сформована гідрофільною частиною. Вводячи у ядро міцел різноманітні лікарські препарати ліпофільної природи, домагаються їх солюбілізації у водному середовищі і так покращують розчинність і біологічну доступність погано розчинних у воді ліків. В основу винаходу поставлено задачу - створення нових амфіфільних блок-кополімерів Nпохідних природних двоосновних амінокислот та поліетерів гліколів, властивості яких можна би було регулювати, зокрема їх гідрофільно ліпофільний баланс (ГЛБ), що забезпечило би надання їм поверхнево-активних властивостей та здатність утворювати стійкі колоїдні системи в водних розчинах, що солюбілізують ліпофільні сполуки, в тому числі лікарські препарати, проявляючи властивості наноносіїв. Поставлена задача вирішується тим, що вперше одержано блок-кополімери N-похідних двоосновних природних амінокислот та поліетерів гліколів загальної формули (1): R4 O HO C NH R2 CH O C O O R1 CH2 C O R4 NH CH k R3 R3 R2 C O O CH2 HC (1) O H l n , де k=2, R1= R2= CH2 R3= H R4= 40 CH C (CH2)J CH2 ; або ; або l=2-35, CH2 n=2-25 CH3 CH3 j=16 O . Сполуки заявленої структури, що належать до класу блок-кополімерів, в літературі не описані і синтезовані вперше. Синтезовані блок-кополімери проявляють себе як поверхнево-активні речовини - понижають поверхневий натяг на межі вода-повітря та солюбілізують не розчинні в воді речовини у 1 UA 106270 C2 5 10 15 20 кількостях, достатніх для моделювання дисперсних засобів транспорту та пролонгованої цільової доставки ліків. В блок-кополімерах вказаної структури (1) блоки сполучені між собою через естерний зв'язок, завдяки чому вони, при введенні в організм, не будуть сприйматися як елементи чужорідного білка, на відміну від традиційних поліамінокислот, у яких основний ланцюг, як і у білків, утворений через пептидний зв'язок. Разом з тим естерний зв'язок, який здатний до ферментативного гідролізу, забезпечує біодеградабельність, а будова елементарних ланок легкий метаболізм та виведення з організму. Колоїдно-хімічні властивості блок-кополімерів, зокрема ГЛБ, регулюється за рахунок молекулярної маси гідрофільного блока - поліетеру етиленгліколю або пропіленгліколю і це створює передумови для побудови на їх основі систем дисперсних частинок складної архітектури, які можуть бути перспективними, як наноконтейнери для доставки лікарських засобів. В загальному вигляді амфіфільні блок-кополімери N-похідних природніх двохосновних амінокислот та поліетерів гліколів відображаються наступною схемою: [со-А-со-В]n, де n = 2-25. Блок A в даному блок-кополімері є діестером діетиленглікою або дипропіленгліколю і Nзаміщених глутамінової або аспарагінової кислоти. Блок В в даному блок-кополімері є гідрофільною складовою і в свою чергу є лінійним полімером, а саме поліетером етиленгліколю або пропіленгліколю із ступенем поліконденсації l = 2-35. Синтез блок-кополімерів проводили у дві стадії. На першій стадії отримували блок А взаємодією N-похідного глутамінової (Glu-St) або аспарагінової (Asp-St) кислоти HO O HO O C O CH NH C (CH2 )16 CH3 CH NH C H2 C (CH2 )16 CH3 H2 C CH2 C C HO O C H O O 2.Asp-St 1.Glu-St та діетеру етиленгліколю (DEG) або діетеру пропіленгліколю (DPG) при дії тіонілу хлористого згідно схеми (2). 25 O O R2 C HO CH OH + NH C R4 C HO R1 CH2 R3 O +2SOCl2 O OH -2HCl, SO2 k NH -2H2O HO C R2 CH O C O O R1 CH2 R3 C O R4 NH CH R2 C OH O k R4 Блок А , де k=2, R1 = CH R2 = CH2 R3 = H R4 = C (CH2)J O CH2 ; або ; або CH2 CH3 CH3 j=16 . 30 На другій стадії отримували амфіфільні блок-кополімери взаємодією блоків А, отриманих на першій стадії, та поліетерів гліколів (поліетиленгліколю, поліпропіленгліколю або їх кополімерів 2 UA 106270 C2 5 10 15 20 25 з молекулярною масою 300-1500 Да). Реакція конденсації проведена за механізмом низькотемпературної активаційної естерифікації (реакція Стегліха) з використанням дициклогексилкарбодііміду як активатора карбоксильної групи. Формула (1) відображає отриманий амфіфільний блок-кополімер, який містить у своєму складі блок А - Glu-St-DPG/DEGGlu-St (ліпофільний фрагмент) та блок В - поліетер етиленгліколю (гідрофільний фрагмент). Будову отриманих блок-кополімерів підтверджували ІЧ та 1Н ЯМР спектроскопією при застосуванні приладів Thermo Scientific Nicolet 8700 та JEOL's ECA Series Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer. Молекулярну масу визначали гель-проникною хроматографією, використовуючи модуль Waters Alliance 2690 з рефрактометром Wyatt Optilab DSP, багатокутовим лазерним фотометром Dawn (Wyatt) і колонками Waters Styragel HR 3-4. Для калібрування використовували полістирольні стандарти, розчинник тетрагідрофуран марки "Для ВЕРХ". Розміри частинок дисперсної фази синтезованих блок-кополімерів у водних середовищах визначали на приладі Malvern autosizer 4700, поверхневий натяг визначали по методу відриву кільця (тензіометр Du Nouy), солюбілізацію барвника - за допомогою фотометра ЛМФ-72М. ПРИКЛАДИ Приклад 1 Синтез діестеру пропіленгліколю (DPG) і 2-(гептадеканоїламіно)пентадіонової кислоти (GluSt). В реактор завантажують 0,1 моль (41,3 г) 2-(гептадеканоїламіно)пентадіонової кислоти (GluSt), 0,05 моль (6,7 г) діетеру пропіленгліколю (DPG) та розчинник (суміш метилену хлористого з диметилформамідом 5:1) 200 г. Реакційну масу нагрівають до кипіння (45 °C), при цьому вихідна кислота повністю розчиняється. Повільно прикапують розчин 0,115 моль (13,7) тіонілу хлористого в метилені хлористому 124 г. Витримують 30 хвилин. Потім додають 0,155 моль (11,64 г) триетиламіну і витримують ще 2 години при тій же температурі. Для виділення продукту реакційну масу промивають водою. Осад білого кольору, що утворився, відділяють центрифугованням і висушують. Отримали сполуку Glu-St-DPG-Glu-St. Вихід становив 90-92 %. Кислотне число за даними потенціометричного титрування становило 1,96-2,03. Будова отриманої сполуки підтверджена 1Н ЯМР спектром: 30 O E(H) G C I J CH2 K O CH2 CH2 O C CH3 C B OH NH L O D H2C CH2 F C CH3 A Таблиця 1 Віднесення сигналів 1Н ЯМР спектра протонів ліпофільного блока В (GluSt-DPG-GluSt) Позн. Зсув Тип А 0,87 т 1,13 1 (α ) д В 1,27 2 (β ) С д 1,24 с к-сть Інтеграл протонів Стеароїл 6 5,99 Віднесення H3C CH2 O CH2 CH2 CH2 CH2 CH O CH3 CH2 O Фрагмент C O CH CH2 O C CH3 CH2 CH2 DPG * O ( CH2 ) 14 CH2 3 CH2 CH2 61,5 Стеароїл 56 UA 106270 C2 Таблиця 1 Віднесення сигналів 1Н ЯМР спектра протонів ліпофільного блока В (GluSt-DPG-GluSt) Позн. Зсув Тип D 1,61 м Віднесення CH2 ( CH2 ) CH2 CH2 C к-сть Інтеграл протонів 0,9 Стеароїл 4 4,02 4 4,01 ** 0,94 0 * 1,95 * 2,54 * 0,37 Glu NH O ** * O O 3,82 Glu CH2 CH2 CH C 4 Glu C Стеароїл Glu O шм 2,0 NH CH2 14 CH2 CH2 O Е Фрагмент 2 1,85 Glu 2 1,03 CH2 CH2 F 2,25 м CH2 ( CH2 ) CH2 CH2 C O CH2 O G 2,42 NH CH2 14 CH2 CH2 CH C O м C O CH2 NH O CH2 O Н 2,74 м C CH2 CH2 CH C O O CH2 NH O CH2 O 3 3,2 (β ) м I 4 3,5 (α ) м 3,6-4,1 5 (β ) с J 6 5,1 (α ) с CH2 CH O CH2 4,6 с CH2 O CH2 O C CH CH2 O C O CH2 CH O C DPG O CH2 CH2 O CH CH2 O CH2 CH2 O CH2 CH2 CH2 CH C K C CH2 CH2 CH2 DPG O O CH2 NH O CH2 CH2 CH2 CH C L 6,5 ш NH O O CH2 CH2 1 - відповідає розміщенню СН3 фрагмента в α положенні до карбонільної групи; - відповідає розміщенню СН3 фрагмента в β положенні до карбонільної групи; 3 - відповідає розміщенню СН2 групи DPG в β положенні до карбонільної групи; 4 - відповідає розміщенню СН2 групи DPG в α положенні до карбонільної групи; 5 - відповідає розміщенню гідрогену на вторинному атомі карбону в β положенні до карбонільної групи; 6 - відповідає розміщенню гідрогену на вторинному атомі карбону в α положенні до карбонільної групи; * - сума протонів рівна 12; ** - сума протонів рівна 4. 2 4 UA 106270 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Дані ІЧ-спектроскопії, а саме наявність в спектрі смуг поглинання з частотою 3050 (сер, -1 шир.), 1680-1735 (с), 1530 (ср), 1270 (с) см свідчать про наявність в молекулі вільних -1 карбоксильних груп поряд з естерними групами (смуги поглинання 1220 (с) см ) та етерних -1 групами оксіетиленого ряду (1080 (с) та 670 (ср) см ). Приклад 2 Здійснювали аналогічно до прикладу 1, але як діол використовували діетер етиленгліколю (DEG). Отримали - Glu-St-DEG-Glu-St. Вихід 89-91 %. Приклад 3 Здійснювали аналогічно до прикладу 1, але як кислоту використовували 2(гептадеканоїламіно)бутандіонову кислоту (Asp-St). Отримали Asp-St-DPG-Asp-St. Вихід 8792 %. Отримані сполуки охарактеризовані 1Н ЯМР, ІЧ-спектроскопією (Приклад 1, 2, 3). Наявність 2 г-екв карбоксильних груп в одному молі сполуки, згідно даних потенціометричного титрування, узгоджується з теоретичним значенням і дає можливість використовувати отримані блоки на стадії утворення блок-кополімерів за конденсаційним механізмом. Приклад 4 Синтез амфіфільних блок-кополімерів - псевдополіамінокислот - здійснювали взаємодією ліпофільних блоків А, отриманих на першій стадії (Приклади 1-3), з поліетерами гліколів. У тригорлий реактор, оснащений мішалкою, зворотним холодильником і крапельною лійкою, -3 завантажують сполуку Glu-St-DPG-Glu-St 4 г (4,3·10 моль) (приклад 1), поліетер етиленгліколю -3 (PEG-300) з молекулярною масою 300 Да 1,6 г (5,3·10 моль) і розчинник - бензол 30 мл. Реакційну суміш охолоджують до 5÷7 °C і при перемішуванні з крапельної лійки додають по -3 краплях дициклогексилкарбодіімід 1 г (4,8·10 моль), розчинений у 4,2 г бензолу. По закінченні прибавлення реакційну масу розігрівають до 40 °C і витримують 4 год. Дициклогексилсечовину, що виділилась в осад, відфільтровують, а фільтрат упарюють у вакуумі. Для очистки блоккополімер, розчиняють у водному ацетоні (1 % води), готуючи ≈10 % розчин. До одержаного розчину додають 0,1N HCl до рН = 3. При цьому виділяється осад, який фільтрують. Фільтрат упарюють, сушать у вакуумі спочатку над NaOH, a потім над Р2О5 до сталої маси. Одержано блок-кополімер [co-Glu(St)-DPG-Glu(St)-co-PEG-300]n. Вихід 84-88 %. Приклад 5 Здійснювали аналогічно до прикладу 4, але як гідрофільний блок використовували поліетер етиленгліколю з молекулярною масою 600 Да (PEG-600) (3,2 г). Одержано блок-кополімер [coGlu(St)-DPG-Glu(St)-co-PEG-600]n. Вихід - 85-87 %. Приклад 6 Здійснювали аналогічно до прикладу 4, але як гідрофільний блок використовували поліетер етиленгліколю з молекулярною масою 1500 Да (PEG-1500) (8 г). Одержано блок-кополімер [coGlu(St)-DPG-Glu(St)-co-PEG-1500]n. Вихід - 72-75 %. Амфіфільні блок-кополімери - псевдополіамінокислоти, одержані на основі блоків Glu-St1 DPG-Glu-St та ПЕГ-300, ПЕГ-600 та ПЕГ-1500 (Приклади 4-6) охарактеризовані ІЧ та Н ЯМР спектроскопією: -1: ІЧ спектр, см 2974, 2918, 2850, 1454, 1356, 1043 (СН3, СН2, С-С), 1736, 1180 (С=О, С-О-С (естер)), 1107 (С-О-С), 3300, 1539 (NH), 1651 (С=О (амід)). 1 H ЯМР (CDCl3), м.ч.: 0,87 т. (3Н, СН3), 1,13 м. (3Н, О-СН(СН3)-СН2-), 1,24 с. (28Н, (СH2), 1,61 м. (2Н, (СН2)14-СН2-СН2), 2,0 м. (2Н, С(О)-СН2-СН2), 2,20 м. (2Н, -СН2-СН2-C(O)NH), 2,42 м. (2Н, CH2-CH2-CH(NH-R), 3,5 м. (2Н, СH(CH3)-СН2-О), 3,63 с. (nН, О-(СН2-СН2)n-О), 4,25 м. (2Н, СН2СН2-С(О)), 4,6 с. (1Н, -CH(NH-R)-), 5,1 с. (1Н, СН2-СH(СН3)-С(О)), 6,5 с. (1Н, NH-R). В таблиці 2 наведено розрахункові та визначені значення відношень інтегралів сигналів від протонів гідрофільних блоків В ПЕГ (5 = 3,63 м.ч.), до сигналів протонів ліпофільних фрагментів залишку 2-(гептадеканоїламіно)-пентадіонової кислоти (δ = 1,24 м.ч.). 5 UA 106270 C2 Таблиця 2 Відношення інтегралів сигналів від протонів гідрофільних блоків до сигналів протонів ліпофільних фрагментів розрахункові та визначені Відношення сигналів Визначена Кількість Мол. протонів блока В до Розрахункова кількість протонів протонів Приклад маса кількість оксіетильованого гептадеканового протонів гептадеканового № блока B, фрагменту блока А протонів* ланцюга блока В, фрагменту, Да δ = 3,63 м. ч. δ = 1,24 м. ч. розрахункове визначене 4 300 26,6 25,02 56,0 0,51 0,45 5 600 54,4 53,1 56,0 0,97 0,95 6 1500 146,6 135,3 56,0 2,62 2,42 * - не враховує протони α-метиленових фрагментів; 1 5 10 15 Порівняння даних Н ЯМР спектроскопії вихідної сполуки A (Glu-St-DPG-Glu-St) з даними для [co-Glu(St)-DPG-Glu(St)-co-PEG-600]3 демонструє, що у структурі блок-кополімеру як результат проведення синтезу появляється сильний сигнал зі зміщенням 3,6 м. ч., який стосується сигналів протонів етилідену у структурі поліетеру гліколю PEG-600 (Блок В). У результаті цього, співвідношення протонів гідрофільної природи до протонів ліпофільної природи змінюється з 1:10 у вихідній сполуці до приблизно 6:10 у структурі отриманих блоккополімерів. Поверхнево-активні властивості для ряду отриманих блок-кополімерів (псевдополіамінокислот), наведено в таблиці 3. Для отриманих блок-кополімерів спостерігається пониження поверхневого натягу їх водних розчинів до σ = 35÷42 мН/м. На ізотермах поверхневого натягу спостерігаються два злами при концентраціях С ккм1 і Сккм2, що свідчить про впорядкованість процесу утворення міцел та їх здатність до перебудови з ростом концентрації полімеру. Ця властивість має надзвичайно важливе значення для створення дисперсних систем доставки лікарських препаратів. В таблиці 3 наведено колоїдно-хімічні характеристики синтезованих блок-кополімерів з різною величиною гідрофільного блока В та солюбілізуючу здатність їх розчинів ліпофільного барвника Судану III. 20 Таблиця 3 Колоїдно-хімічні властивості блок-кополімерів Блок-кополімер [co-GluSt-DPG-GluSt-coPEG-300] (Приклад 4) [co-GluSt-DPG-GluSt-coPEG-600] (Приклад 5) [co-GluSt-DPG-GluSt-coPEG-1500] (Приклад 6) MM, Да Δσ* Сккм1, % Сккм2, % Солюбілізуюча здатність р-ну блоккополімеру для Судану III г/г р-ну 2980 37 0,0038 0,048 0,26 3405 33 0,0030 0,042 0,25 4550 30 0,022 0,05 0,12 * - різниця поверхневих натягів для чистого розчинника і розчину блок-кополімеру при його концентрації Сккм1. 25 Розмір міцел диблок-кополімерів у розчинах у воді визначали при концентраціях блоккополімеру [co-Glu(St)-DPG-Glu(St)-co-PEG-600]3 (Приклад 5), що відповідала серединам характерних ділянок ізотерм поверхневого натягу. При концентраціях, менших за ККМ 1, спостерігається мономодальний розподіл частинок за розміром з середнім діаметром 25-30 нм, який відповідає розмірам асоціатів окремих макромолекул. Розмір первинних міцел, які утворюються одразу після перевищення концентрації СККМ1 становить 135 нм. Подальше збільшення концентрації блок-кополімеру у розчині приводить до перебудови первинних міцел у 6 UA 106270 C2 субміцелярну структуру з середнім розміром 450÷500 нм. При концентрації полімеру в розчині, вищій за СККМ2, відбувається подальше впорядкування агрегатів - до міцелярних утворень ще більшого розміру. Одержані дані підтверджують впорядковану організацію дисперсної фази синтезованих блок-кополімерів - псевдополіамінокислот у їх водних розчинах. 5 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ Амфіфільні блок-кополімери N-похідних природних двоосновних амінокислот та поліетерів гліколів загальної формули: R4 O O NH C CH R2 O C O O 10 R1 CH2 O C R4 NH CH k R3 R3 R2 O C CH2 HC O l n O , де k=2, R1= CH R2= CH2 R3= H R4= C (CH2)J CH2 ; або ; або l=2-35, CH2 n=2-25 CH3 CH3 j=16 O . Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 7