Спосіб визначення успадкування стійкості картоплі до збудника раку synchytrium endobioticum (schilb) perc.

Реферат: Спосіб визначення успадкування стійкості картоплі до збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb) Perc включає зараження паростків картоплі літніми зооспорангіями збудника хвороби і їх аналіз. З вихідних батьківських форм картоплі, а також з гібридів, отриманих від різних комбінацій схрещування, виділяють окисно-відновні ферменти, визначають їх активність, підбирають стійкі до раку вихідні батьківські форми картоплі для схрещування та отримують стійкі нащадки. UA 88375 U (12) UA 88375 U UA 88375 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі сільського господарства, зокрема до захисту рослин від негативної дії шкідливих організмів. В сільському господарстві відомий метод інфрачервоної мікроскопії для діагностики ушкодження і стійкості зернових до шкідників [2]. В картоплярстві відомі польові та лабораторні способи визначення стійкості та її успадкування сортів та гібридів картоплі до збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb) Perc. [3, 6, 7]. Польовий спосіб визначення ракостійкості картоплі заснований на безпосередньому зараженні зразків картоплі зимовими зооспорангіями збудника раку у природних польових умовах [3]. Лабораторний спосіб включає в себе зараження паростків картоплі літніми зооспорангіями зі свіжих ракових наростів (найближчий аналог) [3]. Спосіб, що вирішується у найближчому аналогу, полягає в тому, що він включає в себе зараження паростків картоплі літніми зооспорами зі свіжих ракових наростів за температури 1113 °C. Після 21 дня проводився облік реакції рослин на дію зооспор з ракових наростів картоплі. У сприйнятливих сортів картоплі спостерігається деформація паростків картоплі та поява ракових наростів, а у стійких - поява поодиноких сорусів та некротичне відмирання тканини паростків картоплі. Згадані способи та найближчий аналог мають такі недоліки: 1. Вони є трудомісткими. 2. Їх використання пов'язане з витратами часу, який займає цілий вегетаційний період розвитку рослин картоплі та патогену. 3. Їх використання потребує зараження зразків картоплі збудником раку, який є карантинним організмом і потребує суворого дотримання правил роботи з карантинними організмами. В основу корисної моделі поставлено задачу: розробити спосіб визначення успадкування стійкості картоплі до збудника раку шляхом аналізу окисно-відновних ферментів вихідних батьківських форм картоплі, а також отриманих після схрещування гібридів. Поставлена задача досягається тим, що у запропонованому способі шляхом виділення ферментів з вихідних батьківських форм картоплі, а також з отриманих після схрещування гібридів, з наступним аналізом ферментативної активності пероксидази виявлена вища активність у сприйнятливих форм картоплі і таким чином можна відібрати стійкі вихідні батьківські форми й отримати стійкі нащадки без використання збудника раку, який є карантинним організмом. 1. Для аналізу не використовується інфекційний матеріал (зооспори збудника раку), який є карантинним організмом. 2. Запропонований спосіб дозволяє визначити успадкування стійкості за значно коротший термін часу - 1 день (при прототипі - протягом 21 дня). 3. Суттєвою відмінністю нового способу є те, що шляхом аналізу окисно-відновних ферментів вдається відібрати стійкі до раку вихідні батьківські форми картоплі для схрещування та отримати стійкі нащадки. Приклад 1. Для дослідницької роботи використовують чотири вихідні батькові форми картоплі: Гітте, Поліська рожева, Тетерів та гібрид П81 459с19, а також 66 гібридів, одержані в результаті схрещування даних форм. Зразки бульб сортів та гібридів картоплі, коли паростки досягають 1-2 мм, заражують літніми зооспорангіями зі свіжих ракових наростів на протязі 24 годин за 11-13 °C. Для цього на верхівку бульби картоплі навколо паросткової частини приліплюють паперове кільце за допомогою суміші парафіну та вазеліну (1:1). В кільце наливають дистильовану воду, кладуть шматочки свіжого ракового наросту. Зразки залишають у клімокамері з підвищеною вологістю за температури 11-13 °C. Час експозиції 24 години. Інфекцію з паперовими кільцями знімають із бульб і залишають зразки картоплі за температури 17-18 °C протягом 20 діб, після чого відзначають реакцію паростків картоплі на зараження патогеном. Для цього їх аналізують під бінокулярною лупою і визначають ступінь ураження: 1 - некротизована тканина паростка, поодинокі соруси; 2 - розсіяні соруси (якщо більше 5), щільні соруси без деформації паростка; 3 - щільні соруси з деформацією паростка, раковий наріст [3]. Статистичну обробку даних проводили за Масловим Ю.І. [5]. В результаті проведених досліджень з вивчення стійкості до раку різних комбінацій схрещування вихідних батьківських форм картоплі виявлено, що в комбінації схрещування 1 UA 88375 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 стійкий х стійкий (Гітте (♀) х 81 459с19 (♂) до раку з 17 отримано 17 (100 %) гібридів картоплі, стійких до звичайного патотипу збудника раку. В результаті досліджень комбінації схрещування стійкий х сприйнятливий проти раку (Гітте (♀) х Поліська рожева (♂) з 17 отримано 8 (54 %) стійких до хвороби гібридів (П95 9-6, П95 9-7, П95 9-24, П95 9-25, П95 9-26, П95 9-27, П95 9-28, П95 9-31, П95 9-32). При схрещуванні вихідних батьківських форм сприйнятливий х стійкий (Поліська рожева (♂) х 81 459с19 (♂) з 18 виявлено 9 (50 %) стійких проти раку гібридів картоплі (П95 49/3, П95 49/21, П95 49/25, П95 49/28, П95 49/53, П95 49/55, П95 49/57, П95 49/58, П95 49/60). При дослідженні комбінації схрещування батьківських форм картоплі сприйнятливий х сприйнятливий (Поліська рожева (♀) х Тетерів (♂) з 15 отримано 1 - П95 11/57, або (6,9 %) стійких проти раку гібридів. Даний гібрид був стійкий, оскільки вихідну батьківську форму Тетерів, сприйнятливу до раку, в свою чергу було отримано при схрещуванні сприйнятливої до стійкої до раку форм. Дані представлено в додатку 1, таблиця 1. Приклад 2. Як і у прикладі 1 використовували чотири вихідні батьківські форми картоплі: Гітте, Поліська рожева, Тетерів та гібрид П81 459с19, а також 66 гібридів, одержані в результаті схрещування даних форм. Для визначення активності з окисно-відновних ферментів відібрали пероксидазу, яка приймає участь в окислювально-відновлювальних реакціях фотосинтезу, в процесах дихання, метаболізмі білків і регулювання процесів росту, детоксикації перекису водню, катаболізмі фенольних сполук, в утворенні супероксидного радикалу О2 , руйнуванні високо активного радикалу ОН в реакціях з Н2О2. Фермент приймає участь в утворенні фітоімунітету [4, 8]. Це дає підставу назвати пероксидазу "аварійним" ферментом [9]. З 5 г паросткової частини бульб вихідних батьківських форм картоплі та отриманих після схрещування гібридів виділяють екстракт шляхом розтирання з 5 мл трис-боратним буфером (рН 7,8) та центрифугуванням за 6000 об./хв. протягом 10 хвилин. Для визначення пероксидазної активності 1 мл екстракту інкубують з 1 мл 0,1 % розчином перекису водню та забарвлюють 0,01 % розчином бензидину на протязі 5-10 хвилин до появи блакитного забарвлення. Визначають величину екстинкції на спектрофотометрі "Ломо-46" за 600 нм. Активність пероксидази визначали за формулою: А EK/t за методом Бояркіна A.M. (1), де: А - активність ферменту (у мкмоль бензидину х 100/1 г. хв.); Е - величина екстинкції; К - коефіцієнт пропускання світла при 600 нм; t - час інкубації ферменту з субстратом та прояви забарвлення. У варіанті схрещування стійких до раку картоплі сорту Гітте х гібрид 81.459с19 із 17 досліджених гібридів всі мали високий ступінь стійкості (1 ступінь), і їх активність пероксидази коливалась у межах 58,2-67,4 мкмоль/1 г хв. (додаток 2, таблиця 2). У варіанті схрещування нестійкого до раку картоплі сорту на стійкий (Поліська рожева х гібрид 81.459с19) і навпаки стійкий х сприйнятливий (Гітте х Поліська рожева) із 35 досліджених гібридів виділилися 17 стійких до раку зразків з активністю пероксидази 57,3-67,24. У решти 18 сприйнятливих зразків картоплі активність пероксидази склала 29,1-37,4 мкмоль/1 г хв. (таблиця 2, додаток 2). У варіанті схрещування сприйнятливий х сприйнятливий (Поліська рожева х Тетерів) із 15 досліджених гібридів виявлено 1 гібрид (П95 11/57) з 2 ступенем стійкості до раку та 14 сприйнятливих до хвороби. Активність пероксидази у стійкого гібриду склала 58,5. У сприйнятливих вона коливалась у межах 29,1-38,4 мкмоль/1 г хв. В результаті проведеної науково-дослідницької роботи встановлено, що гібриди картоплі, отримані після різних комбінацій схрещування стійкий х стійкий до раку, стійкий х сприйнятливий, сприйнятливий х стійкий та сприйнятливий х сприйнятливий до раку наслідують активність окисно-відновних ферментів вихідних батьківських форм картоплі. Якщо у стійких вихідних батьківських форм картоплі та їх гібридів активність коливалась у межах 29,1-48,3 то у сприйнятливих вона склала 53,1-67,4 мкмоль/1 г хв. За такою ознакою можна відібрати стійкі до раку вихідні батьківські форми картоплі для схрещування, а також отримати стійкі нащадки. Таким чином, шляхом визначення активності пероксидази різних комбінацій схрещування вихідних батьківських форм картоплі, які відрізняються за ступенем стійкості до раку сортів та гібридів картоплі, вдається визначити їх ступінь стійкості до патогену та його успадкування. За такою ознакою можна підібрати стійкі вихідні форми для схрещування і прогнозувати вихід стійких нащадків проти хвороби. 2 UA 88375 U 5 10 15 20 25 30 Процес визначення активності пероксидази 66 зразків картоплі та їх вихідних батьківських форм до раку на спектрофотометрі за 600 нм склав 8,5 годин, а способом зараження зооспорами зі свіжих ракових наростів (прототипом) - 21 день. Запропонований спосіб визначення успадкування стійкості картоплі до раку було підтверджено експериментальною перевіркою, яка здійснювалась при ураженні патогеном сортів та гібридів, отриманих з Поліського відділення Інституту картоплярства НААН України. Літературні джерела: 1. Бояркин A.M. Определение активности пероксидазы. /Биохимия. - 1961. - Вып. 34. С. 628632. 2. Вилкова Н.А., Шапиро И.Д., Борщева Т.А. Использование инфракрасной микроскопии для диагностики повреждения и устойчивости зерновок к клопам. В сб. Методы исследований патологических изменений растений. - М.: Колос, 1976. - С. 216-219. 3. Зеля А.Г., Методологія оцінки та відбору селекційного матеріалу картоплі, стійкого до раку. /А.Г. Зеля, П.О. Мельник // Методичні рекомендації - Чернівці. - 2007. - 20 с. 4. Капустян А.В. Фермент пероксидаза - універсальний маркер зимостійкості рослин // Інтродукція рослин, 2000, № 1. - С. 152-154. 5. Маслов Ю.И. Методы биохимического анализа растений. - М.: Колос, 1978. - 338 с. 6. Патент України на корисну модель № 10504 МКВ A01H3/00, G01 N33/00.A01C1/00.G01J3/28 від 15.11.2005 р. Спосіб визначення наслідування стійкості картоплі до збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. /Зеля А.Г., Костишин С.С., Мельник П.О., Осипчук А.А., Підгаєцький А.А., Бондарчук А.А., Сидорчук В.І., Сологуб О.С. заявл. 05.05.2005 р., опубл. 15.11.2005 р. // Офіційний бюлетень. Промислова власність, Бюл. № 11. С. 56. 7. Патент України на корисну модель № 17048 МКВ А01 С1/00 від 15.09.2006 р. Спосіб визначення стійкості картоплі до збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. /Зеля А.Г., Костишин С.С., Мельник П.О., Тома З.Г., Барбакар М.І. заявл. 16.02.2006 р., опубл. 15.09.2006 р. // Офіційний бюлетень. Промислова власність, Бюл. № 9. С. 78. 8. Починок Х.Н. Методы биохимического анализа растений. Х.Н. Починок / Наукова думка. Киев. - 1979. - С. 166-169. 9. Савич И.М. Пероксидазы - стрессовые белки растений // Успехи совр. биологии, 1989. - Т. 107. - Вып. 3. - С. 406-417. Додаток 1. Таблиця 1 Реакція гібридів картоплі та їх батьківських форм на зараження збудником раку Synchytrium endobioticum (Schilb) Perc. Ступінь стійкості № п/п 1 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Сорти, гібриди картоплі 2 Гітте (♀) (стійка) П94 27-11 П94 27-12 П94 27-21 П94 27-22 П94 27-26 П94 27-39 П94 27-46 П94 27-49 П94 27-52 П94 27-53 П94 27-54 П94 27-55 П94 27-56 П94 27-57 П94 27-58 Ступінь бульб 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 3 Відсоток стійкості Кількість уражених зараження бульб контролю 4 5 0 100 0 92,4±0,56 0 97,6±0,77 0 94,9±0,54 0 97,6±0,77 0 94,4±0,66 0 88,3±0,53 0 96,4±0,54 0 92,5±0,49 0 91,1±0,57 0 94,4±0,66 0 97,6±0,33 0 86,7±0,43 0 91,1±0,57 0 94,1±0,66 0 97,6±0,77 UA 88375 U 17. П94 27-59 18. П94 27-60 19. 81 459с19 (♂) (стійка) Поліська рожева 20. (сприйнятлива) 21. П95 49/3 22. П95 49/5 23. П95 49/21 24. П95 49/25 25. П95 49/28 26. П95 49/35 27. П95 49/48 28. П95 49/53 29. П95 49/54 30. П95 49/55 31. П95 49/56 32. П95 49/57 33. П95 49/58 34. П95 49/59 35. П95 49/60 36. П95 49/61 1 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61. 62. 63. 64. 65. 66. 67. 68. 69. 2 П95 49/62 П95 49/63 81 459c19 (♂) (стійка) Гітте (♀) (стійка) П95 9-1 П95 9-6 П95 9-7 П95 9-8 П95 9-10 П95 9-12 П95 9-22 П95 9-23 П95 9-24 П95 9-25 П95 9-26 П95 9-27 П95 9-28 П95 9-29 П95 9-30 П95 9-31 П95 9-32 Поліська рожева (сприйнятлива) Поліська рожева (сприйнятлива) П95 11/16 П95 11/22 П95 11/26 П95 11/28 П95 11/30 П95 11/37 П95 11/43 П95 11/46 П95 11/47 П95 11/57 1 1 1 (♀) 3 5 97,6±0,77 0 3 0 0 0 3 3 0 5 0 5 0 0 3 0 3 93,8±0,56 91,7±0,72 86,7±0,43 93,8±0,54 97,8±0,56 96,3±0,74 96,3±0,74 98,4±0,42 97,7±0,77 86,7±0,43 97,6±0,77 96,3±0,74 96,6±0,33 96,3±0,74 96,6±0,33 96,3±0,74 3 1 3 1 1 3 2 2 3 3 3 2 2 1 1 1 1 1 3 3 1 2 (♂) 96,3±0,33 97,6±0,77 88,3±0,53 1 3 2 1 1 3 3 2 3 1 3 1 1 3 1 3 (♀) 0 0 0 4 0 3 0 0 3 0 0 3 3 3 3 3 0 0 0 0 0 3 3 0 0 5 86,7±0,43 94,9±0,69 97,8±0,56 97,8±0,56 94,9±0,69 90,2±0,46 94,3±0,43 93,6±0,73 97,7±0,76 89,0±0,66 92,5±0,49 91,2±0,46 93,6±0,73 89,0±0,66 91,2±0,46 93,6±0,73 94,3±0,43 91,2±0,46 94,2±0,46 91,2±0,66 93,6±0,73 3 5 97,8±0,66 3 5 97,8±0,56 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 0 86,9±0,52 85,6±0,51 86,3±0,76 91,7±0,72 95,8±0,53 93,1±0,76 90,4±0,74 91,7±0,72 93,1±0,76 93,8±0,57 4 UA 88375 U П95 11/68 3 3 П95 11/70 3 3 П95 11/75 3 3 П95 11/76 3 3 П95 11/77 3 3 Тетерів (♂) (сприйнятлива) 3 3 НІР ≤ 0,6 Примітка. 1, 2, 3 - ступінь ураження зразків картоплі збудником раку 70. 71. 72. 73. 74. 75. 91,0±0,66 97,7±0,76 93,6±0,73 91,0±0,66 93,1±0,76 99,2±0,57 Додаток 2. Таблиця 2 Активність пероксидази гібридів картоплі та їх батьківських форм; ступінь стійкості до збудника раку 1 2 1. Гітте (♀) (стійка) 2. П94 27-11 3. П94 27-12 4. П94 27-21 5. П94 27-22 6. П94 27-26 7. П94 27-39 8. П94 27-46 9. П94 27-49 10 П94 27-52 11. П94 27-53 12. П94 27-54 13. П94 27-55 14. П94 27-56 15. П94 27-57 16 П94 27-58 17. П94 27-59 18 П94 27-60 19 81 459с19 (♂) (стійка) Поліська рожева 20. (сприйнятлива) 21. П95 49/3 22. П95 49/5 23. П95 49/21 24. П95 49/25 25. П95 49/28 26. П95 49/35 27. П95 49/48 28. П95 49/53 29. П95 49/54 30. П95 49/55 31. П95 49/56 32. П95 49/57 33. П95 49/58 34. П95 49/59 35. П95 49/60 36. П95 49/61 Ступінь стійкості Кількість Активність бульб уражених бульб пероксидази, (М±m) 3 4 5 1 0 67,4±0,66 1 0 58,2±0,66 1 0 64,6±0,77 1 0 65,3±0,66 1 0 62,4±0,77 1 0 65,6±0,66 1 0 65,3±0,33 1 0 62,1±0,66 1 0 63,4±0,33 1 0 62,3±0,66 1 0 59,2±0,66 1 0 65,4±0,33 1 0 60,2±0,33 1 0 59,3±0,66 2 0 58,4±0,66 1 0 64,2±0,77 1 0 65,4±0,33 1 0 63,7±0,77 1 0 65,3±0,33 (♀) 3 5 29,1±0,77 1 3 2 1 1 3 3 2 3 1 3 1 1 3 1 3 0 3 0 0 0 3 3 0 3 0 3 0 0 3 0 3 62,2±0,66 35,7±0,72 58,4±0,43 62,3±0,54 59,6±0,56 37,4±0,74 35,3±0,74 55,4±0,42 29,5±0,77 65,5±0,43 35,3±0,77 59,2±0,74 65,3±0,33 35,2±0,74 65,5±0,33 35,4±0,74 5 5 UA 88375 U 1 2 37. П95 49/62 38. П95 49/63 39. 81 459c19 (♂) (стійка) 40. Гітте (♀) (стійка) 41. П95 9-1 42. П95 9-6 43. П95 9-7 44. П95 9-8 45. П95 9-10 46. П95 9-12 47. П95 9-22 48. П95 9-23 49. П95 9-24 50. П95 9-25 51. П95 9-26 52. П95 9-27 53. П95 9-28 54. П95 9-29 55. П95 9-30 56. П95 9-31 57. П95 9-32 Поліська рожева (♂) 58. (сприйнятлива) Поліська рожева (♀) 59. (сприйнятлива) 60. П95 11/16 61. П95 11/22 62. П95 11/26 63. П95 11/28 64. П95 11/30 65. П95 11/37 66. П95 11/43 67. П95 11/46 68. П95 11/47 69. П95 11/57 70 П95 11/68 71. П95 11/70 72. П95 11/75 73. П95 11/76 74. П95 11/77 75. Тетерів (♂) (сприйнятлива) НІР ≤ 0,6 3 1 3 1 1 3 2 2 3 3 3 2 2 1 1 1 1 1 3 3 1 2 4 0 3 0 0 3 0 0 3 3 3 0 0 0 0 0 0 0 3 3 0 0 5 65,4±0,33 36,3±0,33 66,2±0,66 67,4±0,66 36,3±0,33 58,3±0,66 57,3±0,33 32,4±0,33 30,2±0,66 35,3±0,66 59,1±0,33 57,4±0,66 65,4±0,33 67,5±0,66 65,4±0,66 67,4±0,33 65,3±0,33 35,4±0,66 31,5±0,33 65,4±0,66 57,3±0,33 3 5 29,1±0,66 3 5 29,1±0,66 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 0 3 3 3 3 3 3 35,3±0,33 35,8±0,66 31,3±0,66 30,6±0,66 29,8±0,33 35,4±0,66 38,4±0,33 35,4±0,66 30,5±0,66 58,5±0,33 35,4±0,66 35,8±0,66 29,4±0,33 35,3±0,66 31,4±0,66 32,3±0,33 Примітка. 1, 2, 3 - ступінь ураження зразків картоплі збудником раку ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб визначення успадкування стійкості картоплі до збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb) Perc, що включає зараження паростків картоплі літніми зооспорангіями збудника хвороби і їх аналіз, який відрізняється тим, що з вихідних батьківських форм картоплі, а також з гібридів, отриманих від різних комбінацій схрещування, виділяють окисно-відновні ферменти, визначають їх активність, підбирають стійкі до раку вихідні батьківські форми картоплі для схрещування та отримують стійкі нащадки. 6 UA 88375 U Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 7