Пегільована сполука glp-1

1. Пегільована сполука GLP-1, що має амінокислотну послідовність формули: His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-SerTyr-Leu-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-AlaTrp-Leu-Xaa33-Lys-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-ProPro-Pro-Cys45-Xaa46, Формула І (послідовність № 1), де Xaa8 - D-Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Ser або Thr; Хаа22 - Gly, Glu, Asp або Lys; Хаа33 - Val або Ilе, Хаа46 - Cys або Cys-NH2 і де одна молекула PEG ковалентно зв'язана з Cys45 і одна молекула PEG ковалентно зв'язана з Cys46 або Cys46-NH2. 2. Пегільована сполука GLP-1 за п. 1, де Xaa8 - Gly або Val і Хаа22 - Glu. C2 2 (19) 1 3 кодження панкреатичних -клітин, яке відбувається у міру прогресування інсулінонезалежного цукрового діабету (NIDDM). Суттєвою характерною особливістю GLP-1 є його здатність до стимулювання секреції інсуліну без пов'язаного із цим ризику гіпоглжемії. GLP-1 індукує секрецію інсуліну лише тоді, коли рівні глюкози є підвищеними, на відміну від інших лікарських засобів, принцип дії яких полягає у підвищенні експресії інсуліну незалежно від того, чи є підвищеними рівні глюкози. Придатність лікування, що включає застосування пептидів GLP-1 обмежується тим, що GLP1(1-37) має низьку активність, а два природні скорочені пептиди, GLP-1(7-37)OH та GLP-1(7-36)NH2, швидко виводяться in vivo і мають надзвичайно короткий in vivo період напіввиведення. Відомо, що ендогенно продукована дипептиділпептидаза IV (DPP-IV) інактивує циркулюючі пептиди GLP-1 шляхом видалення N-кінцевих залишків гістидину та аланіну і є головною причиною короткого in vivo періоду напіввиведення. Незважаючи на те, що різноманітні варіанти підходів забезпечили одержання сполук GLP-1 із довшим періодом напіввиведення або більшою активністю порівняно з відповідними характеристиками нативного GLP-1, необхідними є додаткові сполуки для додаткового зменшення виведення та збільшення періоду напіввиведення, з оптимізацією, завдяки цьому, здатності GLP-1 до застосування як лікарського засобу, який може вводитись мінімальну кількість разів впродовж тривалого періоду часу. У міжнародних заявках PCT/US2004/006082 та PCT/US2000/11814 наведено опис ковалентного приєднання однієї або декількох молекул PEG до різних сполук GLP-1 та екзендину. Ці сполуки можуть мати період напіввиведення, який перевищує 24год, що надає можливість здійснення меншої кількості введень пегільованої сполуки GLP-1 з одночасною підтримкою високого рівня згаданої сполуки у крові впродовж тривалого періоду часу. Додатковим дослідженням було з'ясовано суть проблеми, яка полягала у тому, що відокремлення PEG від пегільованої сполуки GLP-1 або екзендину відбувається впродовж тривалого збереження готової продукції на складі. Унаслідок цього вільний пептид GLP-1 або екзендину підвищує профіль початкового впливу максимальної концентрації у межах терапевтичного вікна. Цим забезпечується можливість підвищення ймовірності виникнення побічних ефектів, проявленням яких є нудота і блювання. За допомогою цього винаходу намагаються подолати проблеми, пов'язані з тривалим збереженням готової продукції на складі і потенціалом відокремлення PEG від пегільованої сполуки GLP1 або екзендину шляхом введення двох ділянок пегілування до сполуки GLP-1 або екзендину з подальшим одночасним пегілуванням двох згаданих ділянок пегілування. Цей з варіант підходу має щонайменше чотири переваги. По-перше, пегілування згаданих сполук різко поліпшує in vivo період напіввиведення цих сполук. По-друге, пегілування згаданих сполук уповільнює швидкість абсорбції цих сполук і, таким чином, знижує почат 90896 4 ковий сплеск лікарського засобу, який, як гадають, несе відповідальність за побічні ефекти. По-третє, нерозгалужені поліетиленгліколі можуть застосовуватись безпосередньо для пегілування і спрощують процес синтезу. По-четверте, тандемне пегілування полегшить проблеми, пов'язані з тривалим збереженням готової продукції на складі і потенціалом відділення PEG від пегільованої сполуки GLP-1 або екзендину шляхом зменшення ймовірності того, що обидва поліетиленгліколі будуть відділені від однієї і тієї самої молекули пептиду GLP-1 або екзендину. На додаток до цього, наслідком введення двох ділянок пегілування до сполуки GLP-1 або екзендину на С-кінці згаданої сполуки з подальшим одночасним пегілуванням двох згаданих ділянок пегілування є одержання пегільованих сполук, що мають більшу активність порівняно з тими пегільованими сполуками, де щонайменше одна з ділянок пегілування не знаходиться на С-кінці пептиду. На додаток до цього, наслідком приєднання лінкера, що містить дві ділянки пегілування, на С-кінці сполуки GLP-1 з подальшим одночасним пегілуванням двох згаданих ділянок пегілування є одержання пегільованих сполук GLP-1, що мають більшу активність, порівняно з тими пегільованими сполуками, де ділянки пегілування приєднують на Скінці сполуки GLP-1 без лінкера. Такі пегільовані сполуки GLP-1 можуть застосовуватись із терапевтичною метою для лікування суб'єктів із розладами, що включають (але без обмеження) діабет, ожиріння, відхилення від норми рухової функції шлунка та/або перистальтики кишечнику, недостатність бета-( )-клітин (наприклад, недостатні -клітини або такі -клітини, що не функціонують) та відхилення від норми спорожнення шлунка або кишечнику, з конкретною перевагою, яка полягає у тому, що пегільовані сполуки GLP-1 за цим винаходом потребують введення невеликої кількості доз впродовж 24-годинного періоду, з підвищенням зручності для суб'єкта, який потребує такого лікування, та ймовірності піддатливості суб'єкта до вимог дозованого введення лікарського засобу. Суть винаходу Винахід, опис якого наведено, пропонує сполуки GLP-1, ковалентно зв'язані з двома молекулами поліетиленгліколю (PEG) або його похідної, де кожна молекула PEG зв'язана із залишком цистеїну, наслідком чого є пегільовані сполуки GLP-1 із періодом напіввиведення тривалістю щонайменше 1год або щонайменше 3год, 5год, 7год, 10год, 15год, 20год або щонайменше 24год. Пегільовані сполуки GLP-1 за цим винаходом мають показник виведення 200мл/год/кг або менше чи 180мл/год/кг, 150мл/год/кг, 120мл/год/кг, 100мл/год/кг, 80мл/год/кг, 60мл/год/кг або менше, чи менше ніж 50мл/год/кг, 40мл/год/кг або 20мл/год/кг. Пегільовані сполуки GLP-1 за цим винаходом мають амінокислотну послідовність наведеної нижче формули: His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-SerSer-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Сln-Аlа-Аlа-Lys-Сlu-Рhe-ІlеАlа-Тrp-Leu-Хаа33-Lys-Сlу-Сlу-Рrо-Ser-Ser-Сlу-Ala 5 Pro-Pro-Pro-Cys45-Xaa46 Формула І (Послідовність №1), де Хаа8 - D-Ala, Gly, Val, Leu, lle, Ser або Thr; Xaa22 - Gly, Glu, Asp або Lys; Xaa33 - VaI або lle; Xaa46 - Cys або Cys-NH2 і де одна молекула PEG є ковалентно зв'язаною з Cys45 і одна молекула PEG є ковалентно зв'язаною з Cys46 або Cys46-NH2. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, для пегільованих сполук GLP-1 Формули І: Хаа8 - GIy або Val; Хаа22 - GIy або GIu; Хаа33 - VaI або llе; і Хаа46 - Cys або Cys-NH2. Перевага віддається також пегільованим сполукам GLP-1 Формули І, де Хаа8 - Val; Хаа22 - Glu; Хаа33 - VaI або llе; і Хаа46 - Cys або Cys-NH2. Перевага віддається також пегільованим сполукам GLP-1 Формули І, де Хаа8 - Val; Хаа22 - Glu; Хаа33 - Val; і Xaa46 - Cys. Перевага віддається також пегільованим сполукам GLP-1 Формули І, де Хаа8 - Val; Хаа22 - Glu; Хаа33 Val; і Xaa46 - Cys-NH2. Перевага віддається також пегільованим сполукам GLP-1 Формули І, де Хаа8 Val; Хаа22 - Glu; Хаа33 - llе; і Хаа46 - Cys. Перевага віддається також пегільованим сполукам GLP-1 Формули І, де Хаа8 - Val; Хаа22 - Glu; Хаа33 - llе; і Xaa46 - CyS-NH2. Поліетиленгліколі ("PEG"), застосовані у цьому винаході, мають молекулярну масу у межах від 500Да до 100000Да, або у межах від 5000Да до 40000Да, або у межах від 20000Да до 60000Да, або у межах від 20000Да до 40000Да і можуть бути нерозгалуженими або розгалуженими молекулами, і можуть бути похідними поліетиленгліколю, як описано у цій галузі техніки. Молекула PEG, ковалентно з'єднана зі сполуками GLP-1 за цим винаходом, не призначена для обмеження конкретним типом. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, PEG є нерозгалуженим метоксиполіетиленглікольмалеїнімідом з молекулярною масою 20кДа. Відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, PEG являє собою: Цей винахід включає спосіб стимуляції рецептора GLP-1 у суб'єкта, що потребує такої стимуляції, який відрізняється тим, що включає стадію введення суб'єкту ефективної кількості пегільованої сполуки GLP-1, опис якої наведено. До суб'єктів, що потребують стимуляції рецепторів GLP-1, належать суб'єкти з інсулінонезалежним діабетом, гіперглікемією, індукованою стресом, ожирінням, розладами рухової функції шлунка та/або перистальтики кишечнику або спорожнення шлунка чи кишечнику, у тому числі, наприклад, синдромом подразненої товстої кишки, недостатністю бета( )-клітин і функціональною диспепсією. Детальний опис винаходу Глюкагоноподібним пептидом 1 (GLP-1) є пептид довжиною у 37 амінокислот, що секретується клітинами острівців Лангерганса кишечнику у від 90896 6 повідь на споживання харчових продуктів. У цій галузі техніки описані численні аналоги і похідні GLP-1. У цьому винаході описують модифікації сполук GLP-1, наслідком яких є подовжений період напіввиведення та/або знижений рівень виведення. Включення залишків цистеїну до конкретних амінокислотних ділянок згаданого пептиду забезпечує одержання тіолової групи, з якою поліетиленгліколь (PEG) або похідна PEG може ковалентно зв'язуватись з одержанням пегільованої сполуки GLP-1. Термін "сполука GLP-1",. що вживається у цьому описі, означає нативний GLP-1, [GLP-1(737)ОН або GLP-1(7-36)NH2], аналоги GLP-1, похідні GLP-1, біологічно активні фрагменти GLP-1, подовжений GLP-1 або аналог чи фрагмент подовженого пептиду GLP-1, аналоги екзендину-4 і похідні екзендину-4. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, аналог GLP-1 має амінокислотну послідовність GLP-1(7-37)OH або подовженого пептиду GLP-1, завдяки чому 1, 2, 3, 4, 5 або 6 амінокислот відрізняються від амінокислоти у відповідному положенні GLP-1(7-37)OH або фрагмента GLP-1(7-37)OH, або модифікується таким чином, що 0, 1, 2, 3, 4, 5 або 6 амінокислот відрізняються від амінокислоти у відповідному положенні подовженого пептиду GLP-1. Термін "пегільована" по відношенню до сполуки GLP-1 за цим винаходом означає сполуку GLP1, хімічно модифіковану ковалентним приєднанням двох молекул поліетиленгліколю або його похідної. На додаток до цього передбачається, що термін "PEG" означає поліетиленгліколь або його похідну, відомі у цій галузі техніки (дивись, наприклад, патенти США №5,445,090; №5,900,461; №5,932,462; №6,436,386; №6,448,369; №6,437,025; №6,448,369; №6,495,659; №6,515,100 та №6,514,491). Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, у пегільованих сполук GLP-1 за цим винаходом PEG (або його похідна) ковалентно з'єднаний з двома введеними до сполуки GLP-1 залишками цистеїну. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, два введені до сполуки GLP-1 залишки цистеїну знаходяться у положенні 45 і 46. "Інсулінотропна активність" означає здатність до стимуляції секреції інсуліну у відповідь на підвищені рівні глюкози, із спричиненням, таким чином, поглинання глюкози клітинами і зниження рівнів глюкози у плазмі. Інсулінотропна активність може оцінюватись за допомогою методів, відомих у цій галузі техніки, у тому числі за допомогою in vivo експериментів та in vitro аналізів, за допомогою яких визначається зв'язувальна активність рецептора GLP-1 або активація рецептора, наприклад, аналізів із застосуванням панкреатичних острівцевих клітин або клітин інсуліноми, як описано у EP 619,322 на ім'я Гельфанд (Gelfand) та інші, і у патенті США №5,120,712, відповідно. Інсулінотропну активність у людей традиційно визначають шляхом визначення рівнів інсуліну або рівнів С-пептиду. Для цілей цього винаходу in vitro аналіз передавання сигналу рецептором GLP-1 застосовують для визначення того, чи буде пегільована сполука GLP-1 за цим винаходом демон 7 струвати шсулшотропну активність in vivo. Інсулінотропна активність являє собою активність, що може застосовуватись для демонстрації того, що пегільована сполука GLP-1 є біологічно активною. Усі наведені як приклад пегільовані сполуки GLP-1 за цим винаходом мають інсулінотропну активність (дивись Приклад 6). Словосполучення "in vitro активність", що вживається у цьому описі, є показником здатності пептиду до активації рецептора GLP-1 у клітинному аналізі. In vitro активність виражають як "ЕС50", що означає ефективну концентрацію сполуки, яка забезпечує 50% активність у експерименті з визначенням залежності "разова доза-реакція". Для цілей цього винаходу in vitro активність визначають за допомогою флуоресцентного аналізу, у якому застосовують клітини НЕК-293 (культура клітин нирки людського ембріона), які стабільно експресують людський рецептор GLP-1. Згадані клітини НЕК-293 мають стабільно інтегрований вектор на основі ДНК, до складу якого входить цАМФреактивний елемент (CRE), що спонукає експресію гена люциферази. Взаємодія сполуки GLP-1 або пегільованої сполуки GLP-1 з рецептором ініціює сигнал, наслідком якого є активація цАМФреактивного елемента і подальша експресія люциферази. Значення EC50 для пегільованих сполук GLP-1, наведених у Прикладі 3, були визначені за допомогою аналізу люциферази, опис якого наведено вище. Відносні значення in vitro активності можна визначити шляхом застосування VaI8-GLP1(7-37)ОН або нативного GLP-1 як контролю і призначення контролю 100% еталонного значення. Термін "період напіввиведення з плазми" ("plasma half-life") означає період часу, впродовж якого половина відповідних молекул циркулює у плазмі до виведення. Термін "elimination half-life" ("період напіввиведення (з плазми)") являє собою термін, що вживається альтернативно. Термін "подовжений" або "довший", що вживається у контексті періоду напіввиведення з плазми, вказує на існування статистично значущого збільшення періоду напіввиведення пегільованої сполуки GLP-1, порівняно з періодом напіввиведення еталонної молекули (наприклад, непегільованої форми пептиду або нативного пептиду), що визначається за порівнянних умов. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, пегільована сполука GLP-1 за цим винаходом має період напіввиведення з плазми тривалістю щонайменше 1год, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, щонайменше 3год, 5год, 7год, 10год, 15год, 20год, і відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, щонайменше 24год. Період напіввиведення, про який повідомляють у Прикладі 4 і Прикладі 5, є періодом напіввиведення з плазми; цей період напіввиведення відповідає кінцевій logлінійній швидкості виведення. Фахівцям у цій галузі техніки зрозуміло, що період напіввиведення є похідним параметром, що змінюється у залежності від значення показника виведення та об'єму розподілу. Виведення є показником здатності організму до видалення лікарського засобу. У міру того, як виведення зменшується унаслідок, наприклад, 90896 8 модифікацій лікарського засобу, очікується, що період напіввиведення повинен збільшуватись. Ця зворотна залежність, однак, є точною лише у разі відсутності зміни у об'ємі розподілу. Придатна приблизна залежність між кінцевим log-лінійним періодом напіввиведення (t1/2), показником виведення (C) і об'ємом розподілу (V) надається рівнянням: t1/2≈0,693 (V/C). Показник виведення вказує не те, скільки лікарського засобу видаляється, а, скоріше, об'єм біологічної рідини, наприклад, крові або плазми, який повинен бути повністю звільненим від лікарського засобу для пояснення видалення. Показник виведення виражають як об'єм на одиницю часу. Показник виведення пегільованих сполук GLP-1 за цим винаходом становить 200мл/год/кг або менше чи 180мл/год/кг, 150мл/год/кг, 120мл/год/кг, 100мл/год/кг, 80мл/год/кг, 60мл/год/кг або менше, чи 50мл/год/кг, 40мл/год/кг або 20мл/год/кг або менше (дивись Приклад 4 і Приклад 5). За цим винаходом, амінокислоту Cys включають до складу сполук GLP-1 у положеннях 45 та 46. Молекула, яку одержують, є пегільованою на амінокислотах Cys, наслідком чого є модифікована молекула, що зберігає усю або частину біологічної активності з одночасним довшими періодом напіввиведення, порівняно з періодом напіввиведення немодифікованої молекули або періодом напіввиведення нативної молекули. Сполуки GLP-1 для застосування за цими винаходом можна одержати за допомогою стандартних методів синтезу пептидів у фазі розчину або твердій фазі. Після одержання і очищення сполуки GLP-1, її пегілують шляхом ковалентного зв'язування двох молекул PEG зі сполукою GLP-1. У цій галузі техніки були описані найрізноманітніші методи ковалентного кон'югування поліетиленгліколів із пептидами (дивись оглядову статтю Робертc М. (Roberts M.) та інші, Advanced Drug Delivery Reviews, 54:459-476, 2002). Пегілування пептидів на карбоксильному кінці може здійснюватись шляхом ферментативного сполучення із застосуванням рекомбінантного пептиду GLP-1 як попередника або за альтернативними методами, відомими і описаними у цій галузі техніки. Дивись, наприклад, патент CШA №4,343,898 або International Journal of Peptide & Protein Research, 43:127-138, 1994. Один із способів одержання пегільованих сполук GLP-1 за цим винаходом включає застосування PEGмалеїніміду для безпосереднього приєднання PEG до тіолової групи пептиду. Введення тіолової функціональної групи може забезпечуватись шляхом додання або вставляння залишку Cys до пептиду у положеннях, опис яких було наведено вище. Тіолова функціональна група може також вводитись до бічного ланцюга пептиду (наприклад, ацилування -аміногрупи лізину тіолвмісної кислоти). У процесі пегілування за цим винаходом застосовують реакцію приєднання Міхаеля для одержання стабільного тіоефірного лінкера. Згадана реакція є високоспецифічною і відбувається за умов зниженої жорсткості у присутності інших функціональних груп. PEG-малеїнімід застосовують як реакційноздатний полімер для одержання чітко визначених 9 біологічно активних кон'югатів PEG-білків. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, у цій процедурі застосовується молярний надлишок тіолвмісної сполуки GLP-1 відносно PEGмалеїніміду для спонукання реакції до завершення. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, реакції здійснюють при рН у межах 4,0-9,0 при кімнатній температурі впродовж 1-40год. Надлишок непегільованого тіолвмісного пептиду легко відділяють від пегільованого продукту за допомогою традиційних методів відділення. Зразкові умови, необхідні для пегілування сполук GLP-1, наведені у Прикладі 1 і Прикладі 2. Пегілування цистеїну може здійснюватись за допомогою PEGмалеїніміду або розгалуженого PEG-малеїніміду. Поліетиленгліколем, якому віддається перевага, є нерозгалужений метоксиполіетиленглікольмалеїнімід, молекулярна маса якого становить 20кДа. У типовій формі PEG являє собою нерозгалужений полімер із кінцевими гідроксильними групами, що має формулу HO-CH2CH2-(CH2CH2O)nCH2CH2-OH, Де n - від приблизно 8 до приблизно 4000. Кінцевий атом водню може бути заміненим на захисну групу, наприклад, алкільну або арильну групу. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, PEG має щонайменше одну гідроксильну групу, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, це кінцева гідроксильна група. Це саме та гідроксильна група, яка, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, активується для вступу до реакції з пептидом. Існує багато форм PEG, придатних для цього винаходу. У цій галузі техніки існують численні похідні PEG, придатні для застосування у цьому винаході. (Дивись, наприклад, патенти США №5,445,090; №5,900,461; №5,932,462; №6,436,386; №6,448,369; №6,437,025; №6,448,369; №6,495,659; №6,515,100 та №6,514,491 і Заліпскі C. (Zalipsky S.), Bioconjugate Chem., 6:150-165, 1995). Молекула PEG, ковалентно з'єднана зі сполуками GLP-1 за цим винаходом, не призначена для обмеження конкретним типом. Молекулярна маса PEG становить, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, 500-100000Да, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, 20000-60000Да і, відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, 20000-40000Да. Молекула PEG може бути нерозгалуженою або розгалуженою. Пегільовані сполуки GLP-1 за цим винаходом мають in vitro біологічну активність, яка дорівнює щонайменше 0,5% біологічної активності нативного GLP-1 або Val8-GLP-l(7-37)OH. Пегільовані сполуки GLP-1 за цим винаходом мають in vitro біологічну активність, яка дорівнює щонайменше 1% біологічної активності нативного GLP-1 або VaI8GLP-1(7-37)ОН. Пегільовані сполуки GLP-1 за цим винаходом мають in vitro біологічну активність, яка дорівнює щонайменше 3% біологічної активності нативного GLP-1 або VaI8-GLP-1(7-37)ОН. Така біологічна активність може визначатись за допомогою in vitro аналізу активності, як описано у цьому описі (Приклад 3), або за допомогою інших аналізів GLP-1, відомих у цій галузі техніки. Незважаючи на те, що деякі пегільовані сполуки GLP1 за цим винаходом можуть мати біологічну актив 90896 10 ність, яка є нижчою за біологічну активність нативного GLP-1 або VaI8-GLP-1(7-37)ОН, що визначається за допомогою конкретного аналізу, це зниження активності компенсується подовженим періодом напіввиведення згаданої сполуки та/або нижчим показником виведення. Введення пегільованих сполук GLP-1 може здійснюватись будь-яким шляхом, ефективність якого відома пересічному лікареві. Одним із таких методів є периферичний парентеральний метод введення. Парентеральне введення традиційно розуміється у медичній літературі як введення дозованої лікарської форми до організму за допомогою стерильного шприца або якогось іншого механічного пристрою, наприклад, інфузійного насоса. Периферичні парентеральні шляхи можуть включати внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, підшкірний та внутрішньоочеревинний шляхи введення. Пегільовані сполуки GLP-1 за цим винаходом можуть також бути придатними для введення через рот, через пряму кишку, через ніс або через нижні відділи дихальних шляхів, які не є парентеральними шляхами. З-посеред цих непарентеральних шляхів перевага віддається введенню через нижні відділи дихальних шляхів та через рот. Пегільовані сполуки GLP-1 за цим винаходом можуть застосовуватись для лікування найрізноманітніших захворювань та хворобливих станів. Пегільовані сполуки GLP-1 за цим винаходом здійснюють свої біологічні ефекти, головним чином, шляхом впливання на рецептор, який називають "рецептором GLP-1". Суб'єкти із захворюваннями та/або хворобливими станами, які сприятливо реагують на стимуляцію рецептора GLP-1 або на введення сполук GLP-1, можуть, таким чином, зазнавати лікування пегільованими сполуками GLP-1 за цим винаходом. Кажуть, що ці суб'єкти "потребують лікування сполуками GLP-1" або "потребують стимуляції рецептора GLP-1". До них належать суб'єкти з інсуліннезалежним діабетом, інсулінзалежним діабетом, інсультом (дивись WO 00/16797), інфарктом міокарда (дивись WO 98/08531), ожирінням (дивись WO 98/19698), катаболічними змінами після хірургічного втручання (дивись патент США №6,006,753), функціональною диспепсією та синдромом подразненої товстої кишки (дивись WO 99/64060). До їх числа входять також суб'єкти, що потребують профілактичного лікування сполукою GLP-1, наприклад, суб'єкти, що є схильними до розвитку інсулінонезалежного діабету (дивись WO 00/07617). Схильність до розвитку інсулінонезалежного діабету мають суб'єкти з порушеною толерантністю до глюкози або порушеним рівнем глюкози крові натщесерце, суб'єкти, маса тіла яких приблизно на 25% перевищує нормальну масу тіла для росту та будови тіла суб'єкта, суб'єкти з частковою панкреатектомією, суб'єкти, що мають одного з батьків або обох батьків, які страждають на інсулінонезалежний діабет, суб'єкти, що мають діабет вагітних і суб'єкти, що мають гострий або хронічний панкреатит. Ефективною кількістю пегільованих сполук GLP-1, опис яких наведено у цьому описі, є кількість, яка спричинює виникнення бажаного терапе 11 втичного та/або профілактичного ефекту без спричинення неприйнятних побічних ефектів у разі введення суб'єкту, що потребує стимуляції рецептора GLP-1. "Бажаний терапевтичний ефект" включає один або декілька пунктів із наведених нижче: 1) поліпшення симптому(-ів), пов'язаного(их) із захворюванням або хворобливим станом; 2) затримка появи симптомів, пов'язаних із захворюванням або хворобливим станом; 3) підвищена тривалість життя, порівняно з відсутністю лікування; і 4) вища якість життя, порівняно з відсутністю лікування. Наприклад, "ефективною кількістю" пегільованої сполуки GLP-1 для лікування діабету є кількість, яка змогла б забезпечити краще регулювання концентрації глюкози крові, аніж за відсутності лікування, із забезпеченням, тим самим, уповільнення появи діабетичних ускладнень, наприклад, ретинопатії, невропатії або хвороби нирок. "Ефективною кількістю" пегільованої сполуки GLP-1 для запобігання діабету є кількість, яка змогла б забезпечити уповільнення появи підвищених рівнів глюкози крові, які потребують лікування протигіїтерглікемічними лікарськими засобами, наприклад, сульфонілсечовиною, тіазолідиндіонами, метформіном, інсуліном та/або бігуанідинами. За типовим варіантом пегільовані сполуки GLP-1 за цим винаходом будуть вводитись таким чином, що рівні у плазмі будуть знаходитись у діапазоні від приблизно 5пмоль/л до приблизно 200пмоль/л. Було визначено, що оптимальні рівні Val8-GLP-1(7-37)OH у плазмі знаходяться у межах від приблизно 30пмоль/л до приблизно 200пмоль/л. Доза пегільованої сполуки GLP-1, ефективна для нормалізації глюкози крові хворого, буде залежати від ряду факторів, у тому числі (без обмеження) статі суб'єкта, маси і віку, тяжкості нездатності до регулювання глюкози крові, шляху введення і біодоступності, фармакокінетичного профілю пегільованої сполуки GLP-1, активності і лікарської форми. Типовий діапазон доз для пегільованих сполук GLP-1 за цим винаходом буде становити від приблизно 0,01 мг/доба до приблизно 1000 мг/доба для дорослого. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, доза коливається у межах від приблизно 0,1 мг/доба до приблизно 100 мг/доба, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, від приблизно 1,0 мг/доба до приблизно 10 мг/доба. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, пегільовані сполуки GLP-1 за цим винаходом вводять один раз на два тижні або один раз на тиждень. У залежності від хвороби, яку лікують, може знадобитись більш часте введення пегільованих сполук GLP-1, наприклад, двічі або тричі на тиждень. "Суб'єктом" є ссавець, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, людина, але ним може бути також і тварина, наприклад, домашні тварини (наприклад, собаки, кішки тощо), сільськогосподарські тварини (наприклад, корови, вівці, свині, коні тощо) і лабораторні тварини (наприклад, пацюки, миші, морські свинки тощо). Пептиди, які застосовують для одержання пегільованих сполук GLP-1 за цим винаходом, можна 90896 12 одержати за допомогою стандартних - методів синтезу пептидів у фазі розчину або твердій фазі. Винахід ілюструється наведеними нижче прикладами, які жодним чином не призначені для його обмеження. Приклади Приклад 1 - Пегілування GLP-1-споріднених аналогів: Реакції пегілування здійснюють за умов, які надають можливість утворення тіоефірного зв'язку. Зокрема, рН розчину коливається у межах від приблизно 4 до 9, концентрація тіолвмісного пептиду коливається у межах від 1 до 10 мольних надлишків концентрації метокси-РЕG2-МАL. Реакції пегілування, як правило, здійснюють при кімнатній температурі. Після цього пегільований пептид GLP-1 виділяють за допомогою високоефективної рідинної хроматографії з оберненою фазою (RPHPLC), іонообмінної хроматографії або гельхроматографії за розміром молекул (SEC). Характеристики пегільованих аналогів GLP-1 визначають за допомогою аналітичної PvP-HPLC, HPLCSEC, SDS-PAGE (електрофорез у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію) та/або MALDI (мас-спектрометрія з іонізацією методом лазерної десорбції). Тіолвмісні пептиди GLP-1 вступають до реакції з поліетилеглжольмалеїнімідом (PEG-малеїнімід) для одержання похідних із PEG, ковалентно зв'язаним за допомогою тіоефірного зв'язку. Наприклад, сполука GLP-1 довжиною 46 амінокислот; 7,5мг, 12,8мкмоль розчиняють у 2мл 200мМ розчину фосфатного буфера, що містить 20мМ розчин EDTA (етилендіамінтетраоцтова кислота), рН 7,4. Після цього розчин продувають аргоном. До цього розчину додають 40мг метокси-PEG-MAL, нерозгалуженого або розгалуженого PEGмалеїніміду (компанія Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, штат Алабама) (0,55:1 мольне відношення РЕС:пептид). Реакцію здійснюють впродовж 2год. Після цього 25мг пегільованого пептиду очищають за допомогою RP-HPLC, визначають характеристики за допомогою гель-хроматографії за розміром молекул і випробують на in vitro активність. Приклад 2 - Реакція PEG-малешіміду (2×20КДа) з аналогами GLP Аналоги GLP-1 піддають селективному пегілуванню на введених залишках цистеїну за допомогою активованого малеїнімідом нерозгалуженого mPEG (молекулярна маса 20кДа) (компанія NOF, Inc.). Для реакції пегілування пептид, призначений для пегілування, розчиняють у 100мМ розчині буфера NH4Ac, що містить 10мМ розчин EDTA, при рН 6,8 і додають 1,25-кратний мольний надлишок нерозбавленого розчину mPEG (20кДа). Реакційну суміш перемішують при кімнатній температурі впродовж 1-4год, і за допомогою катіонообмінної хроматографії на сульфопропіл-сефарозі (SPSepharose) відокремлюють пегіпьовану сполуку від вільного PEG і вільного пептиду. Кон'югат знесолюють за допомогою RP-HPLC і ліофілізують. Приклад 3 - Аналіз in vitro активності Клітини НЕК-293, які стабільно експресують рецептор людського GLP-1, висівають (30,000 клі 13 90896 тин/лунка/80мкл модифікованого за способом Дульбекко середовище Ігла F12 із низьким вмістом сироватки), із застосуванням системи CREлюцифераза, на 96-лункові планшети. Через день після посіву, 20мкл аліквоти розчину експериментального білка у 0,5% BSA (сироватковий альбумін великої рогатої худоби) змішують і інкубують із клітинами впродовж 5 год. Як правило, для експериментальних сполук GLP-1 одержують 10 розведень, що містять від 0,001нМ до 10нМ, та 0,0003нМ і 3нМ для стандарту VaI8-GLP-1(7-37)ОН перед доданням до клітин для одержання кривої залежності "доза-реакція", за допомогою якої визначають значення ЕС50. Після інкубації до кожного планшета додають 100мкл люциферази і обережно перемішують впродовж 2хв. Планшети вміщують до люменометра Tri-lux і обчислюють світлову віддачу, що є наслідком експресії люциферази. Середнє значення EC50 для пегільованої сполуки GLP-1 Формули І, де Хаа8 - Val; Хаа22 - Glu; Хаа33 - llе; та Хаа46 - CyS-NH2, становить 0,36±0,04нМ. 14 Приклад 4 - Фармакокінетичний аналіз дериватизованого пептиду GLP-1 Пегільовану сполуку GLP-1 Формули І, де Хаа8 - Val; Хаа22 - Glu; Хаа33 - llе; та Хаа46 - Cys-NH2, вводять внутрішньовенним (IV) або підшкірним (SC) шляхами у дозі 0,1мг/кг пацюкам-самцям лінії SD. Тварин (3 пацюки на групу) знекровлюють через різні періоди часу у межах 0-192год після введення дози. З кожного зразка збирають плазму і аналізують її за допомогою N-кінцевого специфічного радіоімуноаналізу. Фармакокінетичні параметри обчислюють за незалежними від моделі методами (WinNonlin Pro). У разі внутрішньовенного введення, період напіввиведення з плазми пегільованого аналога GLP-1 становить приблизно 1,2 дня, у той час як у разі підшкірного введення період напіввиведення з плазми пегільованого аналога GLP-1 становить приблизно 1,1 дня. З внутрішньовенним або підшкірним введенням у дозі 0,1мг/кг не пов'язують жодних негативних клінічних спостережень. Для згаданої сполуки спостерігається подовжений період напіввиведення з плазми, повільне виведення і підшкірна біодоступність (приблизно 30%). Репрезентативні дані наведені нижче у Таблиці 1. Таблиця 1 Середні (±середнє квадратичне відхилення) значення фармакокінетичних параметрів для пегільованої сполуки GLP-1 Формули l, де Хаа8 - Val; Хаа22 - Glu; Хаа33 - llе; та Хаа46 - Cys-NH2, після внутрішньовенного або підшкірного введення 0,1мг/кг пацюкам-самцям лінії SD Шлях введення Cmaxа (нг/мл) IV SC (SD) 2020 (235) 191 (31) Tmaxb (год) 0,08 (0,00) 24,0 (0,0) АUС0-кінцевас (нг×год/мл) 52292 (4546) 15423 (2821) T1/2d (год) CL/Fe (мл/год/кг) Vss/Ff (мл/кг) 25,8 (2,2) 28,3 (0,8) 1,9 (0,2) 6,5 (1,2) 54 (2,5) 268 (56) а Максимальна концентрація у плазмі, що спостерігалась. Час максимальної концентрації у плазмі, що спостерігалась. с Площа під кривою "концентрація у плазмі-час", що визначалась від 0 до кінцевої часової точки. d Період напіввиведення з плазми. е Загальне виведення з організму як функція біодоступності. f Об'єм розподілу як функція біодоступності. b У разі подібного внутрішньовенного введення Val8-GLP(7-37)OH пацюкам лінії Fischer 344 у дозі 10мкг/кг одержують глибоко відмінні значення виведення і періоду напіввиведення з плазми, як представлено нижче. Виведення: 1449мл/год/кг t1/2 (год): 0,05 Приклад 5 - Фармакокінетичний аналіз дериватизованого пептиду GLP-1 Пегільовану сполуку GLP-1 Формули І, де Хаа8 - Val; Хаа22 - GIu; Хаа33 - llе; та Хаа46 - Cys-NH2, вводять підшкірним (SC) шляхом у дозі 0,01мг/кг самцям макак-крабоїдів. Тварин знекровлюють через різні періоди часу у межах 0-168год після введення дози. З кожного зразка збирають плазму і аналізують її за допомогою N-кінцевого специфічного радіоімуноаналізу. Фармакокінетичні параметри обчислюють за незалежними від моделі методами (WinNonlin Pro). Репрезентативні дані наведені нижче у Таблиці 2. 15 90896 16 Таблиця 2 Середні (±середнє квадратичне відхилення) значення фармакокінетичних параметрів для пегільованої сполуки GLP-1 Формули l, де Хаа8 - VaI; Хаа22 - GIu; Хаа33 - llе; та Xaa46 - Cys-NH2, після підшкірного введення 0,01мг/кг самцям макак-крабоїдів № тварини Cmaxа (нг/мл) Tmaxb (год) Середнє SD 69,49 17,07 48 0 АUС0-кінцевас (нг×год/мл) 7464,78 1612,03 t1/2d (год) CL/Fe (мл/год/кг) Vss/Ff (мл/кг) 75,69 11,67 1,06 0,26 117,15 44,89 Скорочення: SD = cepeднє квадратичне відхилення а Максимальна концентрація у сироватці, що спостерігалась. b Час максимальної концентрації у сироватці, що спостерігалась. с Площа під кривою "концентрація у сироватці-час", що визначалась від 0 до кінцевої часової точки. d Оцінка періоду напіввиведення. е Загальне виведення з організму як функція біодоступності. f Стаціонарний об'єм розподілу як функція біодоступності. Приклад 6 - Фармакодинамічний аналіз дериватизованого пептиду GLP-1 Пегільовану сполуку GLP-1 Формули І, де Хаа8 - Val; Хаа22 - Glu; Хаа33 - llе; та Xaa46 - Cys-NH2, вводять підшкірним (SC) шляхом у дозі 0,01мг/кг самцям макак-крабоїдів. Постадійне внутрішньовенне вливання глюкози здійснюють негайно після підшкірного введення контрольного носія (забуферений фосфатом фізіологічний розчин) і через 1 день, 5 днів і 7 днів після підшкірного введення 0,01мг/кг пегільованого аналога GLP-1. Процедури постадійного внутрішньовенного вливання глюкози здійснюють мавпам, яким було введено седативний засіб, після 16-годинного голодування. Зразки крові відбирають за 10хв до початку вливання глюкози і негайно перед початком вливання глюкози для визначення вихідного рівня. Після цього розпочинають постадійне вливання глюкози (20% розчин декстрози) зі швидкістю 10мг/кг/хв впродовж 20хв із подальшим додатковим вливанням зі швидкістю 25мг/кг/хв впродовж 20хв. Зразки крові відбирають з інтервалами у 10хв впродовж періоду вливання. Рівні інсуліну визначають за допомогою імуноаналізу. Інсулінотропна активність демонструється впродовж щонайменше 7 днів (відносно плацебо; р