Спосіб отримання сумішей поліпептидів з використанням очищеної бромоводневої кислоти

1. Спосіб отримання суміші трифторацетил поліпептидів, не усі з яких мають однакову амінокислотну послідовність, причому кожний поліпептид містить переважно аланін, глутамінову кислоту, тирозин та трифторацетил лізин, де суміш має необхідну середню молекулярну масу, та при якому партію суміші поліпептидів, кожний з яких містить переважно аланін, γбензил глутамат, тирозин та трифторацетил лізин, позбавляють захисних груп у розчині бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті, причому удосконалення включає застосування розчину бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті, що містить менше ніж 0,5 % вільного брому. 2. Спосіб за п. 1, де удосконалення включає застосування розчину бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті, що містить менш ніж 1000 ppm домішок іонів металів. 3. Спосіб за п. 1, де удосконалення включає застосування розчину бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті, що містить менше ніж 0,5 % вільного брому та менш ніж 1000 ppm домішок іонів металів. 4. Спосіб за будь-яким з пп. 1-3, де розчин бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті містить менш ніж 0,1 % вільного брому, менш ніж 0,05 % вільного брому, менше ніж 0,01 % вільного брому, менш ніж 0,001 % вільного брому або не містить вільного брому. 5. Спосіб за будь-яким з пп. 1-3, де розчин бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті містить менш ніж 500 ppm домішок іонів металів, менш ніж 100 ppm домішок іонів металів, менш ніж 10 2 (19) 1 3 91029 4 ють однакову амінокислотну послідовність, причому кожний поліпептид містить переважно аланін, глутамінову кислоту, тирозин та лізин, та суміш має необхідну середню молекулярну масу, при якому a) полімеризують N-карбоксіангідриди тирозину, аланіну, γ-бензил глутамату та N-трифторацетил лізину для утворення суміші захищених поліпептидів; b) позбавляють захищені поліпептиди захисних груп у розчині бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті, причому розчин містить менш ніж 0,5 % вільного брому та менш ніж 1000 ppm домішок іонів металів, для утворення суміші трифторацетил поліпептидів; c) проводять реакцію суміші трифторацетил поліпептидів з водним піперидином для утворення розчину водної суміші поліпептидів, кожний з яких містить переважно аланін, глутамінову кислоту, тирозин та лізин; та d) очищають суміш поліпептидів. 20. Спосіб за п. 19, де в суміші молярна доля аланіну складає 0,427, глютамінової кислоти - 0,141, лізину - 0,337 та тирозину - 0,093. 21. Спосіб отримання глатирамеру ацетату, при якому a) полімеризують N-карбоксіангідриди тирозину, аланіну, γ-бензил глутамату та N-трифторацетил лізину для утворення захищеного глатирамеру ацетату; b) позбавляють захищений глатирамеру ацетат захисних груп у розчині бромоводневої кислоти В оцтовій кислоті, причому розчин містить менш ніж 0,5% вільного брому та менш ніж 1000 ppm домішок іонів металів, для утворення трифторацетил глатирамеру ацетату; c) проводять реакцію трифторацетил глатирамеру ацетату з водним піперидином для утворення розчину глатирамеру ацетату; та d) очищають глатирамеру ацетат. 22. Спосіб за будь-яким з пп. 19-2 1 , при якому продукт етапу d) додатково піддають ультрафільтрації для видалення видів поліпептидів з молекулярною масою менш ніж 5000 Да. 23. Спосіб за будь-яким з пп. 19 - 21, де розчин бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті являє собою 10% - 36% бромоводневу кислоту в оцтовій кислоті. 24. Спосіб за п. 23, де розчин бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті являє собою 33% бромоводневу кислоту в оцтовій кислоті. 25. Спосіб за будь-яким з пп. 19-24, де розчин бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті попередньо обробляють поглиначем брому для видалення вільного брому. 26. Спосіб за п. 25, де поглиначем брому є фенол. 27. Спосіб за будь-яким з пп. 19-26, де розчин бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті готують у неметалевому реакторі. 28. Спосіб за будь-яким з пп. 1 9 - 2 6 , де розчин бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті готують у реакторі, облицьованому склом або політетрафторетиленом. 29. Спосіб за будь-яким з пп. 19-28, де колір розчину бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті складає менш ніж 2000 АРНА, менш ніж 1000 АРНА, менш ніж 700 АРНА або менш ніж 500 АРНА. В даній заявці різні публікації включені посиланнями в їх повному об'ємі. Таким чином, розкриття цих публікацій в їх повному об'ємі включені посиланнями в дану заявку для більш детального опису стану рівня техніки, до якого належить даний винахід. Суміш поліпептидів, не усі з яких мають однакову амінокислотну послідовність, яку називають глатірамера ацетат (GA), продається під торгівельною маркою Сорахоnе® та включає солі оцтової кислоти поліпептидів, що містять L-глутамінову кислоту, L-аланін, L-тирозин та L-лізин при середніх молярних концентраціях 0,141, 0,427, 0,095 та 0,338, відповідно. Середня молекулярна маса Сорахоnе® складає від 4700 та 11000Да ("Сорахоnе", Physician's Desk Reference, (2000), Medical Economics Co., Inc., (Montvale, NJ), 3115). Хімічно назва глатірамера ацетат-полімер L-глутамінової кислоти з L-аланіном, L-лізином, L-тирозином, ацетат (сіль). Його структуральна формула: (GIu, Ala, Lys, Туr) СН3СООН (C5H9NO4 C3H7NO2 C6H14N2O2 C9H11NO3) C2H 4 O2 CAS - 147245-92-9 ("Сорахоnе", Physician's Desk Reference, (2000), Medical Economics Co., Inc., (Montvale, NJ), 3115). Глатірамера ацетат схвалений для зниження частоти рецидивів у пацієнтів з рецидивностихаючим розсіяним склерозом. Розсіяний склероз відноситься до аутоімунних хвороб. Розкрито застосування глатірамера ацетату для лікування інших аутоімунних хвороб (заявка на патент США 2002/0055466 А1, R. Aharoni et al.), запальних не аутоімунних хвороб (заявка на патент США 2005/0014694 А1, V. Wee Yong et al.; та заявка на патент США 2002/0077278 А1, опублікована 20.07.2002 (Young et al.)) та для забезпечення нервової регенерації та/або для попередження або інгібування вторинної дегенерації, яка може відбуватися після первинного ушкодження нервової системи (заявка на патент США 2003/0004099 A1, М. Eisenbach-Schwartz et al.; та заявка на патент США 2002/0037848 A1, опублікована 28.03.2002 (Eisenbach-Schwartz)). Крім того, глатірамера ацетат розкрито у лікуванні хвороб, залежних від імунітету (наприклад, патент США 6514938 В1, 4.02.2003 (Gad et al.); міжнародна публікація РСТ WO01/60392, опублікована 23.08.2001 (Gilbert et al.); та міжнародна публікація РСТ WO00/27417, опублікована 19.05.2000 (Aharoni et al.), а також хвороб, пов'язаних з демієлінізацією (міжнародна публікація РСТ WO01/97846, опублікована 27.12.2001 (Moses et al.). 5 Спосіб отримання, як детально описано в вищезазначених патентах, включає реакцію захищених поліпептидів з 33% бромоводневою кислотою в оцтовій кислоті (патент США 5800808, опублікований 1.09.1998, Konfino, et al.). Ця реакція зняття захисту видаляє гамма-бензольну захисну групу з 5-карбоксилату глутаматного залишку та розщеплює полімер до меншого поліпептиду для утворення трифторацетил поліпептиду (патент США 5800808, опублікований 1.09.1998, Konfino, et al.). Час, необхідний для отримання GA з відповідною середньою молекулярною масою 7000±2000Да, залежить від температури реакції та молекулярної маси захищеного глатірамера ацетату (патент США 5800808, опублікований 1.09.1998, Konfino, et al.). Зняття захисту відбувається при температурі від 20°С до 28°С (патент США 5800808, опублікований 1.09.1998, Konfino, et al.). Контрольну реакцію виконують для кожної партії у різні періоди часу для визначення часу реакції, необхідного при даній температурі для отримання трифторацетил поліпептидів з відповідною молекулярною масою (патент США 5981589, опублікований 9.11.1999, Konfino, et al.). Час, необхідний для реакції варіює, наприклад, від 10 до 50 годин (патент США 5800808, опублікований 1.09.1998, Konfino, et al.). Крім того, патенти США №№5981589, 6048898, 6054430, 6342476, 6362161 та 6620847 також стосуються композицій та способів для виготовлення сумішей поліпептидів, включаючи GA. Даний винахід передбачає удосконалений спосіб виготовлення. Даний винахід передбачає спосіб отримання суміші трифторацетил поліпептидів, не усі з яких мають однакову амінокислотну послідовність, де кожний поліпептид містить переважно аланін, глутамінову кислоту, тирозин та трифторацетил лізин, причому суміш має необхідну середню молекулярну масу, протягом способу партія суміші поліпептидів, кожний з яких містить переважно аланін, -бензил глутамат, тирозин та трифторацетил лізин, позбавляється захисних груп у розчині бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті; причому удосконалення включає застосування розчину бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті, що містить менш ніж 0,5% вільного брому. Даний винахід також передбачає спосіб отримання суміші трифторацетил поліпептидів, не усі з яких мають однакову амінокислотну послідовність, де кожний поліпептид містить переважно аланін, глутамінову кислоту, тирозин та трифторацетил лізин, причому суміш має необхідну середню молекулярну масу, протягом способу партія суміші поліпептидів, кожна з яких містить переважно аланін, -бензил глутамат, тирозин та трифторацетил лізин, позбавляється захисних груп у розчині бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті; причому удосконалення включає застосування розчину бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті, який містить менш ніж 1000ррm домішок іонів металів. Даний винахід також передбачає спосіб утворення суміші трифторацетил поліпептидів, не усі з яких мають однакову амінокислотну послідовність, де кожний поліпептид містить переважно аланін, глутамінову кислоту, тирозин та трифторацетил 91029 6 лізин, причому суміш має необхідну середню молекулярну масу, який включає зняття захисних груп суміші поліпептидів, кожний з яких містить переважно аланін, -бензил глутамат, тирозин та трифторацетил лізин, у розчині бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті, що містить менш ніж 0,5% вільного брому та менш ніж 1000ррm домішок іонів металів. Даний винахід також передбачає композицію, що включає трифторацетильний продукт, отриманий будь-яким способом за даним винаходом, та носій. Крім того, даний винахід передбачає суміш трифторацетил поліпептидів, не усі з яких мають однакову амінокислотну послідовність, де кожний поліпептид містить переважно аланін, глутамінову кислоту, тирозин та трифторацетил лізин, причому суміш має необхідну середню молекулярну масу, не більш ніж 0,1% бромованого тирозину та менш ніж 1000ррm домішок іонів металів. Даний винахід також передбачає композицію, що включає суміш трифторацетил поліпептидів та носій. Даний винахід також передбачає спосіб отримання фармацевтичної композиції, що містить суміш поліпептидів, не усі з яких мають однакову амінокислотну послідовність, де кожний поліпептид містить переважно аланін, глутамінову кислоту, тирозин та лізин, причому суміш має необхідну середню молекулярну масу, при якому a) полімеризують N-карбоксиангідриди тирозину, аланіну, -бензил глутамату та Nтрифторацетил лізину для утворення суміші захищених поліпептидів; b) захищені поліпептиди позбавляють захисних груп у розчині бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті, причому розчин містить менш ніж 0,5% вільного брому та менш ніж 1000ррm домішок іонів металів, для утворення суміші трифторацетил поліпептидів; c) проводять реакцію суміші трифторацетил поліпептидів з водним піперидином для утворення розчину водної суміші поліпептидів, кожний з яких містить переважно аланін, глутамінову кислоту, тирозин та лізин; та d) очищають суміші поліпептидів. Даний винахід також передбачає спосіб отримання глатірамера ацетату, при якому a) полімеризують N-карбоксиангідриди тирозину, аланіну, -бензил глутамату та Nтрифторацетил лізину для утворення захищеного глатірамера ацетату; b) позбавляють захищений глатірамера ацетат захисних груп у розчині бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті, причому розчин містить менш ніж 0,5% вільного брому та менш ніж 1000ррm домішок іонів металів, для утворення трифторацетил глатірамера ацетату; c) проводять реакцію трифторацетил глатірамера ацетату з водним піперидином для утворення розчину глатірамера ацетату; та d) очищають глатірамера ацетат. Крім того даний винахід передбачає спосіб визначення відсотку бромованого тирозину у зразку глатірамера ацетату, при якому 7 a) гідролізують глатірамера ацетат для отримання гідролізату; b) елююють гідролізат на хроматографічній колонці; c) вимірюють рівень бромтирозину в гідролізаті; d) виготовляють зразкові розчини амінокислотних компонентів глатірамера ацетату та бромтирозину; e) елююють зразкові розчини на колонці етапу b); та e) розраховують відсоток бромованого тирозину в глатірамера ацетаті. Даний винахід також передбачає спосіб виготовлення фармацевтичної композиції, що містить суміш поліпептидів, не усі з яких мають однакову амінокислотну послідовність, де кожний поліпептид містить переважно глутамінову кислоту, аланін, тирозин та лізин, причому суміш має попередньо заданий відсоток бромованого тирозину, придатного для включення в фармацевтичну композицію, при якому отримують партії сумішей поліпептидів, що мають неоднорідні амінокислотні послідовності, де кожний поліпептид містить переважно глутамінову кислоту, аланін, тирозин та лізин; вимірювання відсотку бромованого тирозину партії способом, при якому a) гідролізують партію для отримання гідролізату; b) елююють гідролізат на хроматографічній колонці; c) вимірюють рівень бромтирозину в гідролізаті; d) виготовляють зразкові розчини амінокислотних компонентів партії та бромтирозину; є) елююють зразкові розчини на колонці етапу b); та f) розраховують відсотку бромованого тирозину в партії; та включення в фармацевтичну композицію партії, тільки якщо відсоток бромованого тирозину в ній буде менш ніж 0,3%. Даний винахід передбачає спосіб отримання суміші трифторацетил поліпептидів, не усі з яких мають однакову амінокислотну послідовність, де кожний поліпептид містить переважно аланін, глутамінову кислоту, тирозин та трифторацетил лізин, причому суміш має необхідну середню молекулярну масу, при якому партію суміші поліпептидів, кожний з яких містить переважно аланін, -бензил глутамат, тирозин та трифторацетил лізин, позбавляють захисних груп у розчині бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті; причому удосконалення включає застосування розчину бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті, який містить менш ніж 0,5% вільного брому. За одним варіантом здійснення удосконалення також включає застосування розчину бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті, що містить менш ніж 1000ррm домішок іонів металів. Крім того даний винахід передбачає спосіб отримання суміші трифторацетил поліпептидів, не усі з яких мають однакову амінокислотну послідовність, де кожний поліпептид містить переважно аланін, глутамінову кислоту, тирозин та трифтора 91029 8 цетил лізин, причому суміш має необхідну середню молекулярну масу, при якому партію суміші поліпептидів, кожен з яких містить переважно аланін, -бензил глутамат, тирозин та трифторацетил лізин, позбавляють захисних груп у розчині бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті; причому удосконалення включає застосування розчину бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті, який містить менш ніж 1000ррm домішок іонів металів. Даний винахід також передбачає спосіб отримання суміші трифторацетил поліпептидів, не усі з яких мають однакову амінокислотну послідовність, де кожний поліпептид містить переважно аланін, глутамінову кислоту, тирозин та трифторацетил лізин, причому суміш має необхідну середню молекулярну масу, що включає зняття захисних груп суміші поліпептидів, кожен з яких включає переважно аланін, -бензил глутамат, тирозин та трифторацетил лізин, у розчині бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті, який містить менш ніж 0,5% вільного брому та менш ніж 1000ррm домішок іонів металів. За одним варіантом здійснення розчин бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті містить менш ніж 0,1% вільного брому. За іншим варіантом здійснення розчин бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті містить менш ніж 0,05% вільного брому. За наступним варіантом здійснення розчин бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті містить менш ніж 0,01% вільного брому. За іншим варіантом здійснення розчин бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті містить менш ніж 0,001% вільного брому. За наступним варіантом здійснення розчин бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті не містить вільний бром. За іншим варіантом здійснення розчин бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті містить менш ніж 1000ррm домішок іонів металів. За іншим варіантом здійснення розчин бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті містить менш ніж 500ррm домішок іонів металів. За одним варіантом здійснення розчин бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті містить менш ніж 100ррm домішок іонів металів. За іншим варіантом здійснення розчин бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті містить менш ніж 30ррm домішок іонів металів. За іншим варіантом здійснення розчин бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті містить менш ніж 20ррm домішок іонів металів. За наступним варіантом здійснення розчин бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті містить менш ніж 10ррm домішок іонів металів. За іншим варіантом здійснення розчин бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті не містить домішки іонів металів. За іншим варіантом здійснення суміш трифторацетил поліпептидів являє собою трифторацетил глатірамера ацетат ("TFA GA"). За варіантом здійснення бромоводнева кислота в розчині оцтової кислоти складає від 10% до 36%. За іншим варіантом здійснення бромоводнева кислота в розчині оцтової кислоти складає від 9 16% до 33%; від 18% до 33%; від 20% до 37%; від 20% до 33%; від 22% до 33%; від 24% до 33%; від 25% до 35%; від 26% до 33%; від 28% до 33%; від 30% до 34%; від 30% до 33%; або від 32% до 33%. За наступним варіантом здійснення розчин являє собою 33% бромоводневу кислоту в оцтовій кислоті. За іншим варіантом здійснення розчин являє собою 16% бромоводневу кислоту в оцтовій кислоті. За іншим варіантом здійснення розчин попередньо обробляють поглиначем брому для видалення вільного брому. За одним варіантом здійснення поглинач брому являє собою фенол. За наступним варіантом здійснення розчин готують у неметалевому реакторі. За іншим варіантом здійснення розчин готують у реакторі, облицьованому склом або тефлоном. За іншим варіантом здійснення колір розчину бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті складає менш ніж 2000 АРНА (Американська Асоціація Охорони Здоров'я). За наступним варіантом здійснення колір розчину бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті складає менш ніж 1000 АРНА. За іншим варіантом здійснення колір розчину бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті складає менш ніж 700 АРНА. За іншим варіантом здійснення колір розчину бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті складає менш ніж 500 АРНА. Даний винахід також передбачає трифторацетильний продукт, отриманий будь-яким з розкритих способів. Даний винахід також передбачає композицію, що включає трифторацетильний продукт, отриманий будь-яким з розкритих способів, та носій. Крім того даний винахід передбачає суміш трифторацетил поліпептидів, не усі з яких мають однакову амінокислотну послідовність, де кожний поліпептид містить переважно аланін, глутамінову кислоту, тирозин та трифторацетил лізин, причому суміш має необхідну середню молекулярну масу, не більш ніж 0,1% бромованого тирозину та менш ніж 1000ррm домішок іонів металів. За одним варіантом здійснення суміш трифторацетил поліпептидів має середню молекулярну масу від 2000Да до 40000Да. За іншим варіантом здійснення суміш трифторацетил поліпептидів має середню молекулярну масу від 4000Да до 18000Да. За наступним варіантом здійснення суміш трифторацетил поліпептидів має середню молекулярну масу від 4000Да до 13000Да. За іншим варіантом здійснення суміш трифторацетил поліпептидів має середню молекулярну масу від 13000Да до 19000Да. За іншим варіантом здійснення суміш трифторацетил поліпептидів має середню молекулярну масу від 13500Да до 18500Да. За наступним варіантом здійснення суміш трифторацетил поліпептидів має середню молекулярну масу 7000±2000Да. 91029 10 За наступним варіантом здійснення суміш трифторацетил поліпептидів має середню молекулярну масу 7000Да. За іншим варіантом здійснення суміш трифторацетил поліпептидів має середню молекулярну масу 14000Да. За іншим варіантом здійснення суміш трифторацетил поліпептидів має середню молекулярну масу від 4700 до 11000Да. За наступним варіантом здійснення суміш трифторацетил поліпептидів містить менш ніж 1000ррm домішок іонів металів. За іншим варіантом здійснення суміш трифторацетил поліпептидів містить менш ніж 500ррт домішок іонів металів. За наступним варіантом здійснення суміш трифторацетил поліпептидів містить менш ніж 100ррm домішок іонів металів. За іншим варіантом здійснення суміш трифторацетил поліпептидів містить менш ніж 30ррm домішок іонів металів. За наступним варіантом здійснення суміш трифторацетил поліпептидів містить менш ніж 20ррm домішок іонів металів. За іншим варіантом здійснення суміш трифторацетил поліпептидів містить менш ніж 10ррm домішок іонів металів. За іншим варіантом здійснення суміш трифторацетил поліпептидів не містить домішок іонів металів. Даний винахід також передбачає композицію, що включає суміш трифторацетил поліпептидів та носій. Крім того даний винахід передбачає спосіб отримання фармацевтичної композиції, що містить суміш поліпептидів, не усі з яких мають однакову амінокислотну послідовність, де кожний поліпептид містить переважно аланін, глутамінову кислоту, тирозин та лізин, а суміш має необхідну середню молекулярну масу, при якому a) полімеризують N-карбоксиангідриди тирозину, аланіну, -бензил глутамату та Nтрифторацетил лізину для утворення водної суміші захищених поліпептидів; b) позбавляють захищені поліпептиди захисних груп у розчині бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті, який містить менш ніж 0,5% вільного брому та менш ніж 1000ррm домішок іонів металів, для утворення водної суміші трифторацетил поліпептидів; c) проводять реакцію водної суміші трифторацетил поліпептидів з водним піперидином для утворення розчину водної суміші поліпептидів, кожен з яких містить переважно аланін, глутамінову кислоту, тирозин та лізин; та d) очищають водну суміш поліпептидів. За одним варіантом здійснення середня молярна доля в суміші глутамінової кислоти складає 0,129-0,159; аланіну - 0,392-0,462; тирозину 0,0860,100; та лізину 0,300-0,374. За окремим варіантом здійснення середня молярна доля у суміші глутамінової кислоти складає 0,141, аланіну - 0,427, тирозину - 0,093 та лізину - 0,337. Даний винахід також передбачає спосіб отримання глатірамера ацетату, при якому 11 a) полімеризують N-карбоксиангідриди тирозину, аланіну, -бензил глутамату та Nтрифторацетил лізину для утворення захищених глатірамера ацетат; b) позбавляють захищений глатірамера ацетат захисних груп у розчині бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті, причому розчин містить менш ніж 0,5% вільного брому та менш ніж 1000ррm домішок іонів металів, для утворення трифторацетил глатірамера ацетату; c) проводять реакцію трифторацетил глатірамера ацетату з водним піперидином для утворення розчину глатірамера ацетату; та d) очищають глатірамера ацетат. За одним варіантом здійснення продукт етапу d) додатково піддають ультрафільтрації для видалення видів поліпептидів з молекулярною масою менш ніж 5000Да. За варіантом здійснення бромоводнева кислота в розчині оцтової кислоти складає від 10% до 36%. За іншим варіантом здійснення бромоводнева кислота в розчині оцтової кислоти складає від 16% до 33%; від 18% до 33%; від 20% до 37%; від 20% до 33%; від 22% до 33%; від 24% до 33%; від 25% до 35%; від 26% до 33%; від 28% до 33%; від 30% до 34%; від 30% до 33%; або від 32% до 33%. За наступним варіантом здійснення бромоводнева кислота в розчині оцтової кислоти складає 33%. За іншим варіантом здійснення бромоводнева кислота в розчині оцтової кислоти складає 16%. За іншим варіантом здійснення розчин бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті попередньо обробляють поглиначем брому для видалення вільного брому. За іншим варіантом здійснення поглиначем брому є фенол. За наступним варіантом здійснення розчин бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті готують у неметалевому реакторі. За іншим варіантом здійснення розчин бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті готують у реакторі, облицьованому склом або тефлоном. За одним варіантом здійснення колір розчину бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті складає менш ніж 2000 АРНА. За іншим варіантом здійснення колір розчину бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті складає менш ніж 1000 АРНА. За іншим варіантом здійснення колір розчину бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті складає менш ніж 700 АРНА. За наступним варіантом здійснення колір розчину бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті складає менш ніж 500 АРНА. Даний винахід також передбачає спосіб визначення відсотку бромованого тирозин у зразку глатірамера ацетату, при якому a) гідролізують глатірамера ацетат для отримання гідролізату; b) елююють гідролізат на хроматографічній колонці; c) вимірюють рівень бромтирозину в гідролізаті; 91029 12 d) виготовляють зразкові розчини амінокислотних компонентів глатірамера ацетату та бромтирозину; є) елююють зразкові розчини на колонці етапу b); та f) розраховують відсоток бромованого тирозину в глатірамера ацетаті. Даний винахід також передбачає спосіб виготовлення фармацевтичної композиції, що містить суміш поліпептидів, не усі з яких мають однакову амінокислотну послідовність, де кожний поліпептид містить переважно глутамінову кислоту, аланін, тирозин та лізин, причому суміш має попередньо заданий відсоток бромованого тирозину, придатного для включення в фармацевтичну композицію, при якому отримують партію суміші поліпептидів, що мають неоднорідні амінокислотні послідовності, де кожний поліпептид містить переважно глутамінову кислоту, аланін, тирозин та лізин; вимірюють відсоток бромованого тирозину партії способом, при якому a) гідролізують партію для отримання гідролізату; b) елююють гідролізат на хроматографічній колонці; c) вимірюють рівень бромтирозину в гідролізаті; d) виготовляють зразкові розчини амінокислотних компонентів партії та бромтирозину; є) елююють зразкові розчини на колонці етапу b); та f) розраховують відсоток бромованого тирозину в партії; та включають партію в фармацевтичну композицію, тільки якщо відсоток бромованого тирозину в ній буде складати менш ніж 0,3%. За одним варіантом здійснення партія придатна для включення в фармацевтичну композицію, тільки якщо відсоток бромованого тирозину в ній складає менш ніж 0,2%. За іншим варіантом здійснення партія придатна для включення в фармацевтичну композицію, тільки якщо відсоток бромованого тирозину в ній складає менш ніж 0,1%. За наступним варіантом здійснення суміш поліпептидів являє собою глатірамера ацетат ("GA"). Терміни Термін "середня молекулярна маса", як використовується в даній заявці, означає молекулярну масу виду поліпептидів, що присутні у суміші в максимальному відповідному співвідношенні (тобто піковий максимум), коли суміш піддають розділенню за молекулярною масою на гельпроникаючий колонці HPLC (високо ефективна рідинна хроматографія). Це значення можна отримати кількома шляхами, наприклад, за часом утримування на каліброваній колонці; або за кореляцією між положенням піку та положенням хроматографованих сополімерних маркерів з описаними послідовністю та молекулярною масою. Можна використовувати інші способи визначення середньої молекулярної маси, такі як розсіювання світла, та їх показники будуть суттєво відповідати значенню, отриманому за допомогою пікового максимуму. 13 Показали, що поліпептидна суміш за даним винаходом являє собою ацетатну сіль синтетичних поліпептидів, виготовлених хімічною реакцією чотирьох активованих амінокислотних похідних (дві з них L-глутамінова кислота та захищений L-лізин): L-глутамінова кислота (L-Glu), L-аланін (L-Ala), Lтирозин (L-Tyr) та L-лізин (L-Lys) (дві з них захищені, тобто похідна 5Вz-глутамату та похідна 6NТFА-лізину) у специфічному співвідношенні. Термін "суміш", як використовують у даному документі, звичайно означає "суміш поліпептидів за даним винаходом", що включає L-глутамінову кислоту, Lаланін, L-тирозин та L-лізин, та обидва терміни призначені включати остаточні домішки від способу отримання. Діапазон молярної долі залишку кожної амінокислоті складає: L-Glu 0,129-0,153, L-Alla 0,3920,462, L-Tyr 0,086-0,100 та L-Lys 0,300-0,374. Оскільки ніяка реакція не завершується повністю на 100%, та, не дивлячись на те, що практично усі домішки усунуті, невеликі кількості їх можуть залишитися. Такі домішки можна розподілити на три наступних типи: - Близькі за структурою речовини, які являють собою захищені амінокислотні залишки, такі як залишки 5-Bz-L-глутамілу та/або N6-TFA-L-лізилу, що утворюються при неповному видаленні захисних груп. Крім того, поліпептидна суміш за даним винаходом може містити залишки бромованого Lтирозилу, утворені протягом виготовлення у присутності вільного брому у реагенті HBr/оцтова кислота. Молекулярні структури ідентичних за структурою домішок можуть походити від складових мономерів, тобто стартових матеріалів. Ці ідентичні домішки виражені кількісно (після хімічного перетворення) у порівнянні з визначеними стандартними зразками, які є або похідними, або безпосередньо частиною домішок: - залишкові трифторацетильні сполуки (у вигляді фториду); - залишкові бензильовані залишки глутамілу (у вигляді бензил броміду); - залишкові залишки бромованого тирозилу (у вигляді бромтирозину). - Неідентифіковані споріднені речовини (визначені за допомогою RP-HPLC (зворотно-фазова високоефективна рідинна хроматографія) являють собою поліпептиди невеликого молекулярного розміру однакового походження із схожими структурами. Ці речовини ймовірно мають схожі сталі величини, а концентрацію (%) кожної домішки можна розрахувати як % пікової площі відносно пікової площі поліпептидної суміші за даним винаходом. Характеристика домішок ґрунтується на їх відносному часі хроматографічного утримування (RRT) за L-триптофановим стандартом. - Опис даного винаходу охоплює залишкові розчинники та неорганічні домішки, такі як залишковий розчинник 1,4-діоксан, залишковий піперидин та важкі метали. Вільний бром У способі отримання сумішей поліпептидів, таких як GA, для зняття захисних груп GA викорис 91029 14 товували 33% бромоводневу кислоту в оцтовій кислоті. Наприклад, під час розробки способу отримання GA з'ясували, що деякі тирозинові залишки у трифторацетил GA (TFA GA) та у GA були бромовані. Цю домішку виділили та ідентифікували з використанням аналітичної методики, детально описаної у прикладах. З'ясували, що залишок тирозину реагує з бромом з утворенням монобромтирозинового компоненту, що включає або 2бромтирозин, або 3-бромтирозин. Після значного дослідження виявили, що домішка бромованого тирозину була введена до GA через вільний бром НВr в оцтовій кислоті. Вільний бром був присутнім в 33% розчині НВr в оцтовій кислоті, отриманому від постачальника та використовуваному у способі виготовлення. Ужили заходи для зниження рівня вільного брому у 33% розчині НВr в оцтовій кислоті. Наприклад, попередня обробка розчину НВr в оцтовій кислоті поглиначем брому ефективна для видалення частки вільного брому з розчину НВr в оцтовій кислоті. Одним з поглиначів брому, що застосовують у способі очистки НВr, є фенол. Крім фенолу можна застосовувати інші відновники, такі як бісульфіт натрію. Фенол вибрали як поглинач брому тому, що він та його продукт реакції з бромом (бромфеноли) переважно не реагують з захищеними поліпептидами, такими як захищений GA, TFA поліпептидами, такими як TFA GA, та поліпептидами, такими як GA, та їх легко видалити з розчину GA шляхом очищення. Таким же чином, будь-який поглинач брому можна застосувати за умови, що він та його продукт реакції з бромом не реагує з захищеними поліпептидами, такими як захищений GA, TFA поліпептидами, такими як TFA GA, та поліпептидами, такими як GA, та його легко виділити шляхом фінального очищення. Домішки металів GA продають у вигляді двох фармацевтичних дозованих форм, ліофілізованого порошку та попередньо заповнених шприців. Шприці продаються під торгівельною маркою Сорахоnе® (ін'єкція), що звичайно містить прозорий розчин. За інструкціями зберігання потрібно тримати шприці охолодженими. Однак, в попередньо заповнених водних розчинах Сорахоnе® з'являється червоний колір. Джерело кольору в розчинах не з'ясовано. Колір з'являється, коли розчини тримають при кімнатній температурі протягом 12-24 годин. Визначили, що отримання HFr у металевому апараті призводить до слідових домішок іонів металів в НВr. Коли пізніше НВr змішали з захищеним GA, домішки іонів металів в НВr були хелатовані TFA GA та GA. Ці комплекси металів з TFA GA та GA внесли свій внесок до забарвлення. У результаті іншого заходу для забезпечення чистоти, наприклад, в продукті GA, застосовували неметалевий реактор для отримання 33% розчину НВr в оцтовій кислоті. Для утворення розчину НВr в оцтовій кислоті застосовували облицьований склом реактор для попередження утворення домішок, які потім будуть впливати на чистоту, наприклад, GA. Для попередження контакту розчину 15 91029 НВr з металом, частини трубопроводу покрили тефлоном. Подібним чином, можна застосовувати інші типи нереакційних, кислотно стійких неметалевих апаратів для попередження утворення слідових іонів металів в розчині НВr в оцтовій кислоті. Застосування неметалевого апарату для отримання розчину НВr в оцтовій кислоті успішно позбавляє GA червоного кольору. Якщо застосовували неметалевий апарат для отримання розчину НВr в оцтовій кислоті, у результаті розчин переважно не містив іонів металів, та червоний колір GA не утворювався. Крім того, колір кожної партії НВr в оцтовій кислоті вимірюють для визначення рівня домішок перед застосуванням зняття захисних груп GA. З'ясовано, що рівні домішок іонів металів в розчині НВr можна визначити візуальним аналізом. Розчин НВr з індексом кольору нижче 2000 АРНА показаний для створення глатірамера ацетату без червоного кольору. Наступні приклади ілюструють, але не обмежують даний винахід. Приклад 1 - Вплив концентрації брому в розчині НВr в оцтовій кислоті на компонент бромованого тирозину в TFA GA та в GA Для визначення впливу вільного брому в розчині бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті на рівень домішок компоненту бромованого тирозину в TFA-GA та GA до бромоводневої кислоти в оцтовій кислоті додали різні кількості брому. В експерименті у способі отримання застосовували НВr, яку попередньо не обробили поглиначем брому. Додавали різні рівні домішок брому (визначених як відсоток розчину НВr в оцтовій кислоті). Рівень домішки компоненту бромованого тирозину в TFA GA та в GA вимірювали гідролізом TFA GA та GA до їх амінокислотних компонентів, а потім застосовували HPLC для визначення кількості бромтирозину по відношенню до TFA GA та GA. Методика Виготовлення стандартних розчинів Стандартні розчини, що містять 2мкг/мл бромтирозину, виготовили з використанням дистильованої води. Стандартний вихідний розчин амінокислот виготовили з наступних амінокислот: L-Glu L-Ala L-Tyr L-LysHCl близько 100мг близько 130мг близько 75мг близько 200мг Амінокислоти розчинили у воді. Додали кілька крапель 5н NaOH та води до фінального об'єму 25мл. Гідроліз 10мг глатірамера ацетату та 10мг TFA GA незалежно відважили у 5мл в ампули для гідролізу. Ампулу негативного контролю підготовили додаванням 0,5мл стандартного вихідного розчину амінокислот у 5мл ампулу для гідролізу. До кожної ампули додали 0,5мл води та 0,5мл концентрованої НСl, що містить 1% фенолу. Ампули нагрівали до 110°С протягом 24 годин в атмосфері N2. Потім зразки охолодили до кімнатної температури. Кожен з гідролізатів перенесли до 5мл волюметрич 16 них колб та наповнили їх до об'єму дистильованою водою. Хроматографія Бромтирозиновий стандарт та кожен з гідролізатів незалежно елюювали на колонці HPLC з використанням в якості елюєнта ацетонітрил: вода: оцтова кислота у співвідношенні 4:95:1. Колонку обладнали UV детектором та системою реєстрації даних. Як негативний контроль застосовували амінокислотний стандарт для визначення, який пік в гідролізаті глатірамеру ацетату відповідає бромтирозину. Дані аналізу Відсоток компоненту бромованого тирозину в кожному TFA GA та зразку GA розрахували наступним чином: % Бромованого тирозину = р*Ар/As*Cs/Ср, де Р = чистота бромтирозинового стандарту (у відсотках); As = площа піку бромтирозинового стандарту; Ар = площа піку бромтирозину в кожному зразку; Cs = концентрація бромтирозинового стандарту (мкг/мл); Ср = концентрація глатірамера ацетату (або TFA GA); Таблиця 1 показує вплив вільного брому на рівень компоненту бромованого тирозину в TFA глатірамера ацетаті та в глатірамера ацетаті. Таблиця 1 Вплив вільного брому на рівень компоненту бромованого тирозину Бром (%) бром не додавали 0,5 1 5 Бромований тирозин TFA глатірамера ацеглатірамер тат 0,1 0,2 0,7 1,2 4 1,2 2,2 даних немає Результати З прикладу, наведеного вище, видно, що контамінація НВr з бромом підвищує рівні компоненту бромованого тирозину в TFA GA та в GA відносно стандартної реакції, при якій бром не додають. Коли бром не додають, оскільки НВr не обробляють поглиначем брому, кілька вільного брому остається, та контамінація компоненту бромованого тирозину GA та TFA GA стає очевидною. Щоб утворити GA з домішкою компоненту бромованого тирозину з рівнем менш ніж 0,2%, рівень вільного брому в НВr необхідно знизити додаванням поглинача брому. Приклад 2 - Виготовлення 33% розчину НВr в оцтовій кислоті Реактор, облицьований склом, промивають оцтовою кислотою, а потім спорожнюють. В реактор поміщають 1013кг оцтової кислоти. Оцтову кислоту витримують при температурі 10-20°С. В реактор вводять 522кг газоподібної НВr при пере 17 91029 мішуванні розчину. Після введення газу розчин перемішують ще протягом 30 хвилин. Розчин аналізують для визначення вмісту 33% НВr. Приклад 3 - Очищення розчину НВr та оцтової кислоти з застосуванням фенолу як поглинача брому В реактор, облицьований склом, наливають 33% розчин НВr в оцтовій кислоті. Фенол відміряють та додають до розчину НВr у ваговому співвідношенні 1:100. Потім розчин збовтують протягом 12-24 годин. Потім очищений розчин НВr додають до захищеного глатірамера ацетату. Реакція НВr з захищеним GA дає TFA GA. TFA GA реагує з піперидином для утворення GA. Приклад 4 - Рівні бромованого тирозину в різних партіях Рівень компоненту бромованого тирозину в різних партіях глатірамера ацетату визначали за способом, описаним в прикладі 1. Концентрація комНомер партії поненту бромованоGA го тирозину А 0,15 В 0,19 Старий спосіб С 0,14 D 0,15 Е 0,32 X не визначається Новий спосіб Y не визначається Z не визначається Спосіб виготовлення Результати НВr, виготовлена за новим способом, як описано в прикладі 2, та оброблена фенолом як в прикладі 3, була вільна від брому та металевих домішок. Таким чином, виготовлений глатірамера ацетат був суттєво вільним від компоненту бромованого тирозину. НВr, придбана від постачальників (старий спосіб), мала домішки, та тому глатірамера ацетат, виготовлений з її застосуванням, також мав домішки компоненту бромованого тирозину, навіть при застосуванні фенолу як тирозинового поглинача. Приклад 5 - Визначення кольору Колір розчину НВr та оцтової кислоти визначали за допомогою стандартної методики візуального визначення кольору. Індекс кольору Американської Асоціації Охорони Здоров'я (АРНА) є єдиним числовим індексом жовтизни, причому кожна одиниця АРНА відповідає розчиненню 500ррm вихідного розчину платино-кобальту (PtCo) (HunterLab, АРНА Background, Applications Note, Insight on Color Комп’ютерна верстка М. Ломалова 18 November 16-30, 1996, Vol. 8, No. 16. на http://www.hunterlab.com/appnotes/an11_96br2.pdf). АРНА вимірювання є визначення шляхом візуального порівняння розчину з PtCo стандартами, що містять контрольовані кількості хлороплатинату калію та хлориду кобальту. Кожна числова одиниця являє собою еквівалент 1мг платини на літр розчину (ррm). Стандарти та відповідні вимірювання визначають відповідно їх значенню ррm, тобто, АРНА стандарт №20 містить 20ррm платини (American Chemical Society, General Directions та Procedures: Measurement of Physical Properties на http://pubs.acs.org/reagent_demo/secb002.html). Дистильована вода має АРНА значення 0, а вихідний розчин має АРНА значення 500ppm (HunterLab, АРНА Background, Applications Not, Insight on Color, November 16-30, 1996, Vol. 8, No. 16. на http://www.hunterlab.com/appnotes/an11_96br2.pdf). Вимірювання АРНА можна виконати різними інструментами, відомими в даній галузі. Виготовили АРНА стандарт кольору "500" та АРНА стандарт кольору "1000". АРНА стандарт кольору "500" виготовили розчиненням 1,246г хлорплатинату калію, K2PtCl6 (еквівалент до 50мг металевої платини), та 1,00г кристалічного хлориду кобальту, СоСl2-6Н2О (еквівалент до приблизно 250мг металевого кобальту), в дистильованій воді з 100мл концентрованої НСl та доведенням об'єму до 1000мл дистильованою водою. АРНА стандарт кольору "1000" виготовили розчиненням 2,492г хлорплатинату калію K2PtCl6 та 2,00г кристалічного хлориду кобальту СоСl2-6Н2О в дистильованій воді з 200мл концентрованої НСl та доведенням об'єму до 1000мл дистильованою водою. Наступні партії виготовили в неметалевому апараті як описано вище. Колір зразків візуально аналізували за стандартом кольору, розглядаючи вертикальні 100мл пробірки Неслера на білому фоні. Номер партії М N Р Q R Колір (АРНА)