Спосіб отримання поліпептидів

Спосіб отримання тканинних поліпептидів, що включає екстракцію подрібнених кровоносних судин тварин 3% розчином оцтової кислоти у присутності хлориду цинку, преципітацію екстракту, висушування преципітату з наступним його розчи ненням, фільтруванням та люфілізацією, який відрізняється тим, що як кровоносні судини використовують аорти сільськогосподарських тварин, перед екстракцією сировину обробляють ацетоном у співвідношенні 1 8 протягом 24 годин, у екстрагуючий розчин додатково вводять 0,1% хлориду магнію, преципітацію здійснюють ацетоном у співвідношенні 1 8 при температурі +4°С з наступним відмиванням його ацетоном та ефіром, одержують пептиди з молекулярною масою менш ніж ЮкДа шляхом ультрафільтрації через фільтри з діаметром пор ЮкДа Запропонований винахід відноситься до галузі медицини, до медичної промисловості, а саме до способів отримання біологічно-активних речовин із тваринної сировини ВІДОМІ способи отримання біологічно-активних речовин із тваринної сировини (АС № 118782 Заявка № 3588257/28-13 от 3 05 83 В X Хавинсон, В Г Морозов, Кайдашев И П Пути поиска и создания новых лекарственных препаратов естественно существующих пептидных биорегуляторов / В кн Биорегуляция и биоэнергетика - Полтава, 1995 - Вып 3 - С 2 0 - 2 2 Морозов В Г, Хавинсон В X Перспективы применения цитомединов в клинической медицине и геронтологии // Клиническая медицина - 2000 - № 2 - С 4 2 - 4 5 Золоев Г К, Дудко В А , Соколовий Г Е Патофизиологическая и клиническая оценка эффективности даларгина при лечении облитерирующих заболеваний артерий нижних конечностей // Кардиология 1990 - Т 30, № 7 - С 7 7 - 7 9 Катрушов А В Використання нових органоспецифічних поліпептидних препаратів для експериментальної терапії патолопй, викликаних пошкоджуючими факторами оточуючого середовища Автореф дис д м н Київ, 1995 -40 с го цинку протягом 48 - 72 годин, преципітацію екстракту охолодженим ацетоном, висушування преципітату з послідуючим його розчиненням, фільтруванням та люфілізацією (АС № 1227198, 1986, заявка № 3516517/28 от 29 09 82 Способ получения полипептидов В X Хавинсон, В Г Морозов и др) Недоліком відомого способу є недостатня ступінь екстракції поліпептидної речовини та наявність у поліпептидному екстракті баластних великомолекулярних поліпептидів, які погіршують якість речовини, сприяють виникненню алергічних реакцій при її використанні і можуть бути носіями вірусів латентних енцефалітів В основу винаходу поставлена задача створити спосіб отримання поліпептидів, які володіють анпопротекторною дією, шляхом удосконалення відомого способу, досягти підвищення ступеня екстракції поліпептидів та одержання поліпептидної речовини, позбавленої баластних високомолекулярних поліпептидів Поставлену задачу вирішують створенням способу отримання поліпептидів, який включає екстракцію подрібненої сировини (кровоносніх судин сільськогосподарських тварин) 3% розчином оцтової кислоти у присутності хлористого цинку, преципітацію екстракту, висушування преципітату з послідуючим його розчиненням, фільтруванням та люфілізацією, в якому , згідно винаходу, в якості сировини використовують аорти великої рогатої Найбільш близьким до запропонованого способу є спосіб отримання поліпептидів, що включає подрібнення тваринного сировини (судин сільськогосподарських тварин), екстрагування 3% водним розчином оцтової кислоти у присутності хлористо ю ю 45251 худоби, перед екстракцією сировину обробляють Вихід активної речовини складає 11г (на 2кг ацетоном в співвідношенні 1 8 протягом 24 годин, сировини) у екстрагуючий розчин додатково вводять 0,1% Проведено дослідження фізико-хімічних власрозчин хлориду магнію, преципітацію здійснюють тивостей отриманого поліпептид ного комплексу, ацетоном у співвідношенні 1 8 при t = 4°С з посліяке включало визначення біуретової реакції, яка дуючим відмиванням його ацетоном та ефіром, характерна для пептидного типу зв'язків, виявленодержують, використовуючи фільтри з діаметром ня спектрів поглинання водного розчину поліпеппор ЮкДа, пептиди з молекулярною масою до тидів, оптичної густини, відсотку білку у розчинній ЮкДа фракції, вмісту магнію, цинку Результати біуретової реакції були позитивними, спектр поглинання Запропонований спосіб виконують слідуючим поліпептидного комплексу мав характерний пік в чином ультрафіолетовій ДІЛЯНЦІ 200 - 220нм, оптична Тканинний матеріал — вилучені аорти сільсьгустина дорівнювала 0,411 Комплекс поліпептидів когосподарських тварин звільняють від кров'яних містив 1,75% магнію, 2,54% цинку, у розчинній згустків і подрібнюють на фрагменти розміром 2 х фракції містилося 72,4% білку 2 x 2 , які заливають ацетоном на 24 години Після цього фрагменти видаляють з ацетону і висушуУ дослідженнях, що проведені авторами, токють при кімнатній температурі, постійно перемісичності поліпептидного комплексу не виявлено, шуючи Висушений матеріал екстрагують 3% розпроте подальше вивчення у цьому напрямку прочином льодової оцтової кислоти у присутності довжується 0,1% хлориду цинку та 0,1% хлориду магнію при Вивчення фармакологічної активності речовиспіввідношенні 1 8 протягом 72 годин при t = 4°С, ни — пептидного комплексу аорти (ПКА) базувапостійно перемішуючи за допомогою магнітної лось на тому факті, що пептидні молекули масою 4 мішалки Потім за допомогою повторної фільтрації - ЮкДа, які отримані з тканин, можуть відновлювачерез фільтри лавсан + бязь при t = 4°С позбавти структурно-метаболічний гомеостаз ВІДПОВІДНИХ ляються дисперсного осаду Проводять обробку тканин при їхньому пошкодженні в наслідок різних надосадової рідини ацетоном з послідуючим збипатологічних процесів ранням преципітату, промиванням його ацетоном і Проведено дві серії експериментальних досліефіром висушуванням та подрібненням Одержаджень ний преципітат розчиняють у воді, підкисленій до У першому експерименті було відтворено перН 4,5 льодяною оцтовою кислотою, проводять рекисний атероартерюсклероз на статевозрілих освітлюючу фільтрацію, ультрафільтрацію для золотистих сірійських хом'яках за допомогою спеотримання поліпептидів з молекулярною масою до ціального безантиоксидантного раціону (ВоскреЮкДата люфілізують сенский с соавт, 1972) Тварини були поділені порівну на контрольну та дослідну групи 3 50-го Запропонований спосіб отримання поліпептидня перебування на бєзантиоксидантному раціоні дів дозволяє одержати поліпептидний екстракт з на протязі 10 днів щоденно внутрішньом'язово молекулярною масою вагою до ЮкДа ДОСЛІДНІЙ групі вводили ПКА в дозі 0,12мг/кг Речовина, яка отримана запропонованим способом з аорт сільськогосподарських тварин волоУ другому експерименті було відтворено холедіє анпопротекторною дією Вона здатна відновстериновий атеросклероз (Аничков, 1965) на лювати структурно-метаболічні порушення артерій хом'яках, також поділених порівну на контрольну при судинній патології та дослідну групи, шляхом додавання до раціону холестерину в дозі 0,2г/кг на добу на протязі 60 Приклад У якості сировини беруть 2кг тількидіб 3 50-і доби на протязі 10 днів щоденно внутно вилучених аорт сільськогосподарських тварин рішньом'язово ДОСЛІДНІЙ групі вводили ПКА в дозі Усі процедури проводять при температурі + 4°С 0,2мг/кг Аорти звільняють від кров'яних згустків, жирової тканини, подрібнюють на фрагменти розміром Контрольній групі, як і у попередньому експеприблизно 2 х 2 х 2, які заливають ацетоном на 24 рименті, вводили фізіологічний розчин у відповідгодини Після закінчення обробки ацетон видаляному об'ємі Інтактна група складалася з тварин, ють та висушують сировину при кімнатній темпеВІДПОВІДНИХ до експериментальних груп за статтю, ратурі, постійно перемішуючи Висушену тканину віком та КІЛЬКІСТЮ екстрагують 3% розчином льодової оцтової кислоЧерез добу після останньої ін'єкції вищезазнати у присутності 0,1% хлориду цинку та 0,1% хлочених препаратів під ефірним наркозом у тварин риду магнію (співвідношення 1 8) протязі 72 годин, забирали кров з правого передсердя та вилучали постійно перемішуючи за допомогою магнітної аорту мішалки Потім за допомогою повторної фільтрації У тварин з перекисним атероартерюсклерозом через лавсанові та бязеві фільтри позбавляються спостерігалася активація ПОЛ, посилення гемокодисперсного осаду Проводять обробку надосадоагуаляцм, підвищення рівню холестерину (ХС), вої рідини ацетоном (співвідношення 1 8) на проатерогенних ліпопротєїдів (ЛП) Розвинулися детязі 24 годин при температурі = 4°С з наступним генеративно-дистрофічні зміни у СТІНЦІ аорти відзбиранням преципітату, промиванням його ефіром мічалася часткова десквамація ендотелію, у ІНТИМІ та ацетоном, висушуванням та подрібненням — поява колагенових волоконець, ЛІПІДІВ, гладкоПреципітат розчиняють у воді, підкисленій до рН м'язових клітин (ГМК) та кислих глікозамшогліканів 4,5 льодяною оцтовою кислотою, проводять освіт(ГАГ), у меди — пошкодження еластичних мемлюючу фільтрацію, ультрафільтрацію для отрибран, накопичення! кислих ГАГ та ЛІПІДІВ мання поліпептидів з молекулярною масою до ПІД ВПЛИВОМ ПКА нивелювалися порушення ЮкДата люфілізують ЛІПІДНОГО спектру крові, зменшилися процеси ПОЛ, 45251 каркасу, зменшилися присутність ЛІПІДНИХ включень та кислих ГАГ (Табл 1, 2) Таблиця 1 нормалізувалися показники коагуляцшного гемостазу, покращився стан інтими аорти, еластичного Вплив ПКА на показники стану ПОЛ та АО захисту крові у хом'яків з атероартерюсклерозом Показники, що досліджувались 1 Стат показники 2 МДА,% приросту М СОД, ум од М ±т р1 Р2 рЗМ ±т р1 Р2 рЗ М ±т р1 Р2 рЗ Каталаза, ум од Церулоплазмін, мг/мл Групи тварин Контрольна 4 231,6(190266) 0,62 ± 0,03 >0,1 Інтактна 3 28,2(19,232,7) 0,57 ± 0,04 1,300 ±0,064 1,530 ±0,063 0,1 Примітка (тут і далі) статистична обробка проведена між показниками інтактної, контрольної, 1-і та 2-і групами тварин, що досліджуються — р1 Дослідна (ПКА) 5 192,7(149,8226,61) 0,60 ± 0,03 >0 1 >0,1 0,1 49,893 ±3,416 >0,1 >0,1 >0,1 між контрольною, 1-ю та 2-ю дослідними — р2, між 1-ю та 2-ю дослідними — рЗ Таблиця 2 Вплив ПКА на ЛІПІДНИЙ спектр сироватки крові та деякі показники коагуляціииого гемостазу у хом'яків з атероартерюсклерозом Показники, що досліджувались Стат показники 1 2 Групи тварин Інтактна Контрольна 3 2,170 ± 0,146 4 Дослідна (ПКА) 5 3,440 ±0,106 2,374 ±0,134 0,1 0,1 >0,1 Холестерин, ммоль/л М ±т Загальні ЛІПІДИ, Г/Л р1 Р2 РЗ М ±т р1 Р2 рЗ 2,74 ±0,12 М ±т 1,743 ± 0,094 Ліпопротеїди низької та ЩІЛЬНОСТІ, г/л Тромбіновий час, с Час рекальціфікацм, с дуже низької р1_ Р2 рЗ М ±т р1 Р2 рЗ М ±т р1 Р2 рЗ При відтворенні холестеринового атероартерюсклерозу у тварин контрольної групи визначалися активація ПОЛ, підсилення гемокоагуаляцм, підвищення рівню ХС, атерогенних ЛП, загальних 2,64 ± 0,09 >0,1 2,185 ±0,085 1767 ±0,044 0,1 0,1 50,25 ± 3,32