Селективні антитіла проти гепсидину-25 та їх застосування

Реферат: Винахід стосується моноклональних антитіл, які зв'язуються з N-кінцем людського гепсидину-25 і відрізняються тим, що мають високу спорідненість та селективність до згаданого поліпептиду. Антитіла за винаходом є прийнятними для підвищення рівнів заліза у сироватці, кількості ретикулоцитів, кількості еритроцитів, рівнів гемоглобіну та/або гематокриту у людини та для лікування різних розладів, таких як анемія, у людини. Антитіла за цим винаходом є також прийнятними як аналітичні інструменти, наприклад сендвіч-ELISA. UA 103032 C2 (12) UA 103032 C2 UA 103032 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід стосується галузі медицини, зокрема, галузі антитіл проти людського гепсидину25. Конкретніше, цей винахід стосується лікування певних захворювань, таких як анемія, шляхом введення пацієнтам, які цього потребують, селективних антитіл проти гепсидину-25. Цей винахід також стосується способів та наборів для виявлення гепсидину-25 та/або діагностування хворобливого стану, який характеризується підвищеними рівнями гепсидину-25. Вважають, що людський гепсидин, поліпептид, який експресується, головним чином, гепатоцитами, є важливим залізорегулювальним білком, який за типом негативного зворотного зв'язку регулює всмоктування заліза у кишечнику, рециклювання заліза макрофагами та мобілізацію заліза з печінкових депо заліза. Доведено, що надпродукування гепсидину відіграє головну роль у патофізіології анемії та/або анемії, спричиненої хронічними захворюваннями. На сьогоднішній день кількість прийнятних та ефективних лікарських засобів для лікування анемії та/або анемії, спричиненої хронічними захворюваннями, є обмеженою. Зокрема, введення еритропоетину є ефективним для лише приблизно 50 % усіх пацієнтів і пов'язане з небажаними побічними ефектами. Окрім того, переливання крові є небажаним через забруднення, інфекції та перевантаження залізом. Людський гепсидин кодується як препропептид з 84 амінокислот, який містить типову Nкінцеву сигнальну послідовність з 24 амінокислот з інформацією про те, що подальша послідовність будується безпосередньо на мембрані ендоплазматичного ретикулума, та ділянку з 35 амінокислот з консенсусним сайтом, безпосередньо за яким йде С-кінцевий біологічно активний залізорегулювальний гормон з 25 амінокислот (гепсидин-25, послідовність SEQ ID NO: 1). Відомо, що in vivo утворюються також різні скорочені на N-кінці форми гепсидину, такі як гепсидин-20 (наприклад, для людей, амінокислоти 6-25 послідовності SEQ ID NO: 1) та гепсидин-22 (наприклад, для людей, амінокислоти 4-25 послідовності SEQ ID NO: 1). Гадають, однак, що гепсидин-25 є найбільш, якщо не єдиною, фізіологічно прийнятною формою гепсидину у людей. Особливо бажаними є лікарські засоби, які, на відміну від попередника або скорочених форм, селективно регулюють концентрацію гепсидину-25. Зокрема, антитіла, які, на відміну від попередника або скорочених форм, селективно зв'язуються з гепсидином-25, забезпечили б численні переваги при лікуванні або діагностуванні розладів, пов'язаних з підвищеними рівнями гепсидину-25. Наприклад, порівняно з неселективними антитілами проти гепсидину, високоафінні селективні антитіла проти гепсидину-25 знизили б ризик виникнення побічних ефектів, та клінічна доза, необхідна для ефективного лікування, була б меншою завдяки тому, що терапевтичні антитіла не зв'язувались би з фізіологічно неприйнятними формами гепсидину. Незважаючи на те, що раніше повідомлялось про нелюдські поліклональні та моноклональні антитіла проти гепсидину (дивись, наприклад, публікації заявок на патент США № 2006/0019339, № 2007/0224186 та № 2008/0213277), у цій галузі все ще залишається велика потреба у моноклональних антитілах, які селективно зв'язуються з гепсидином-25. Таким чином, одним з аспектів цього винаходу є надання антитіл, які селективно зв'язують людський гепсидин-25 у межах амінокислот гепсидину-25 від 1 до 7, включно. Такі антитіла є прийнятними для підвищення рівнів заліза у сироватці, кількості ретикулоцитів, кількості еритроцитів, рівнів гемоглобіну та/або гематокриту у людини для лікування захворювання, стану або розладу, таких як анемія. На додаток до цього, наявні імунологічні аналізи на гепсидин не відрізняють активного, фізіологічно прийнятного, гепсидину-25 від неактивних, фізіологічно неприйнятних, видів гепсидину (дивись, наприклад, KemnaE.H., et al., Haematologica, 93(l):90-97 (2008); Roe M.A., et al., Br. J. Nutr., 97:544-549 (2007); та Luukkonen S. and Punnonen K., Gin. Chem. Lab. Med., 44:1361-1362 (2006)). На цей час єдиними вільно доступними методами селективного аналізу на гепсидин-25 є LC/MS (рідинна хроматографія/мас-спектроскопія) або подібні трудомісткі методи, які потребують виділення різних форм гепсидину (дивись, наприклад, Gutierrez J.A., et al., BioTechniques, 38:S13-S17 (2005), Murphy, et al., Blood, 110:1048-1054 (2007), та Kemna E.H., et al., Clin. Chem., 53:620-628 (2007)). Ці аналізи можуть бути надійними та точними, але їх складність, вартість та високі вимоги до рівня операторського досвіду та вправності є причиною обмеження їх повсякденного застосування. Відповідно, існує також велика потреба у антитілах, які селективно та з високою спорідненістю зв'язуються з людським гепсидином-25, для їх застосування у імунологічних аналізах для виявлення або визначення рівнів гепсидину-25. Таким чином, інший аспект цього винаходу пропонує способи застосування селективних антитіл проти гепсидину-25 у відносно простих, але високочутливих, надійних та селективних імунологічних аналізах для виявлення та визначення рівнів гепсидину-25 у тканинах та біологічних рідинах ссавців. Цей винахід пропонує антитіла, які селективно зв'язують людський гепсидин-25 у межах амінокислот гепсидину-25 від 1 до 7, включно. За одним з варіантів здійснення антитіло за цим 1 UA 103032 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винаходом селективно зв'язує поліпептид, який має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 1, на відміну від споріднених попередників та скорочених поліпептидів, і містить шість CDR (гіперваріабельних ділянок), вибраних з групи, яку складають: (і) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 та HCDR3, які мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 9, 10, 11, 32, 33 та 34, відповідно; (іі) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 та HCDR3, які мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 12, 13, 14, 35, 36 та 37, відповідно; (ііі) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 та HCDR3, які мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 45, 13, 14, 35, 36 та 37, відповідно; (iv) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 та HCDR3, які мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 12, 13, 14, 38, 36 та 37, відповідно; (v) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 та HCDR3, які мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 15, 10, 16, 39, 40 та 41, відповідно; (vi) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 та HCDR3, які мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 20, 21, 22, 42, 43 та 44, відповідно; (vii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 та HCDR3, які мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 20, 21, 23, 42, 43 та 44, відповідно; (viii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 та HCDR3, які мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 24, 25, 23, 42, 43 та 44, відповідно; (іх) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 та HCDR3, які мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 26, 25, 27, 42, 43 та 44, відповідно; та (х) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 та HCDR3, які мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 26, 25, 28, 42, 43 та 44, відповідно. За іншим варіантом здійснення антитіло за цим винаходом зв'язує антигенну детермінанту, яка міститься у межах амінокислот 1-7, включно, людського гепсидину-25, тобто DTHFPIC послідовності SEQ ID NO: 1 або DTNFPIC гепсидину-25 гризунів (послідовність SEQ ID NO: 2 або 3). За варіантом, якому віддається перевага, антитіло за цим винаходом містить поліпептид варіабельної ділянки легкого ланцюга ("LCVR") та поліпептид варіабельної ділянки важкого ланцюга ("HCVR"), де (і) поліпептиди LCVR та HCVR мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 48 та 49, відповідно; (іі) поліпептиди LCVR та HCVR мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 50 та 51, відповідно; (ііі) поліпептиди LCVR та HCVR мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 52 та 51, відповідно; (iv) поліпептиди LCVR та HCVR мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 53 та 54, відповідно; (v) поліпептиди LCVR та HCVR мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 55 та 56, відповідно; (vi) поліпептиди LCVR та HCVR мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 59 та 58, відповідно; (vii) поліпептиди LCVR та HCVR мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 60 та 58, відповідно; (viii) поліпептиди LCVR та HCVR мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 61 та 58, відповідно; (їх) поліпептиди LCVR та HCVR мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 62 та 58, відповідно; або (х) поліпептиди LCVR та HCVR мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 63 та 58, відповідно. За іншим варіантом здійснення цей винахід пропонує ізольовані нуклеїновокислотні молекули, що кодують антитіла за цим винаходом; вектори, які містять нуклеїновокислотні молекули, що кодують антитіла за цим винаходом, факультативно функціонально зв'язані з контрольними послідовностями, які розпізнаються клітиною-хазяїном, трансформованою згаданим вектором; клітини-хазяї, які містять вектори, які містять нуклеїновокислотні молекули, що кодують антитіла за цим винаходом; спосіб продукування антитіла за цим винаходом, який включає культивування клітин-хазяїв, які містять нуклеїновокислотні молекули, що кодують антитіла за цим винаходом, завдяки чому експресується нуклеїнова кислота, і факультативно виділення антитіла з середовища для культивування клітин-хазяїв. За іншим варіантом здійснення цей винахід пропонує фармацевтичну композицію, яка містить антитіло за цим винаходом та фармацевтично прийнятний носій або розріджувач. За варіантом, якому віддається перевага, згадана фармацевтична композиція містить однорідну або по суті однорідну популяцію моноклонального антитіла за цим винаходом та фармацевтично прийнятній носій або розріджувач. За іншим варіантом здійснення цей винахід пропонує людське генно-інженерне моноклональне антитіло, яке селективно зв'язує зрілий людський гепсидин, для застосування у терапії. 2 UA 103032 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 За іншим варіантом здійснення цей винахід пропонує людське генно-інженерне моноклональне антитіло, яке селективно зв'язує зрілий людський гепсидин, для застосування для лікування або запобігання анемії у людини. Цей винахід також передбачає застосування людського генно-інженерного моноклонального антитіла, яке селективно зв'язує зрілий людський гепсидин, для виготовлення лікарського засобу. Крім того, цей винахід передбачає застосування людського генно-інженерного моноклонального антитіла, яке селективно зв'язує зрілий людський гепсидин, у способі підвищення рівнів заліза у сироватці, кількості ретикулоцитів, кількості еритроцитів, рівнів гемоглобіну та/або гематокриту у тварини, за варіантом, якому віддається перевага, виду ссавців, за варіантом, якому віддається більша перевага, людини. Цей винахід також пропонує спосіб підвищення рівнів заліза у сироватці, кількості ретикулоцитів, кількості еритроцитів, рівнів гемоглобіну та/або гематокриту, який включає введення людині, яка цього потребує, ефективної кількості людського генно-інженерного моноклонального антитіла, яке зв'язує зрілий людський гепсидин. За іншим варіантом здійснення цей винахід пропонує спосіб лікування захворювання, стану або розладу у людини, сприятливим для якого є підвищення рівня заліза у сироватці, кількості ретикулоцитів, кількості еритроцитів, рівнів гемоглобіну та/або гематокриту, у тому числі (але без обмеження) анемії, наприклад, анемії, спричиненої хронічними захворюваннями, запалення, хронічного захворювання та/або раку. Цей винахід пропонує також спосіб визначення кількості гепсидину-25 у зразку тканини або біологічної рідини, який одержали від ссавця, що включає стадії: (і) одержання зразка тканини або біологічної рідини від згаданого ссавця; (іі) введення згаданого зразка у контакт з селективним антитілом проти гепсидину-25 або його фрагментом; та (ііі) визначення кількості гепсидину-25 у згаданому зразку безпосередньо або опосередковано за допомогою кількісного, напівкількісного або якісного способу. За іншим варіантом здійснення антитіла за цим винаходом є прийнятними для способу кількісного визначення білка гепсидину-25 у зразку тканини або біологічної рідини, який одержали від ссавця, який включає: (і) сенсибілізацію твердої основи першим антитілом, яке зв'язує антигенну детермінанту, яка міститься між амінокислотами 5-25, включно, послідовності SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 3 (мишачі амінокислоти 5-25) або послідовності SEQ ID NO: 2 (пацючі амінокислоти 5-25); (іі) одержання експериментального зразка тканини або біологічної рідини від згаданого ссавця; (ііі) нанесення експериментального зразка на сенсибілізовану антитілом тверду основу; (ііі) надання можливості будь-якому присутньому гепсидину утворення комплексу гепсидин-перше антитіло за відповідних умов для зв'язування гепсидину-першого антитіла; (iv) видалення незв'язаного зразка; (v) нанесення другого антитіла, яке зв'язує антигенну детермінанту, яка міститься у межах амінокислот 1-7, включно, людського гепсидину-25 або гепсидину-25 гризунів, тобто DTHFPIC або DTNFPIC, відповідно, на тверду основу; (vi) надання можливості будь-якому присутньому гепсидину-25 утворення комплексу друге антитілогепсидин-25-перше антитіло за відповідних умов для зв'язування другим антитілом будь-якого комплексу гепсидин-25-перше антитіло; та (v) видалення незв'язаного другого антитіла; і (vi) виявлення присутності або відсутності другого антитіла. Присутність або відсутність другого антитіла може виявлятись безпосередньо або опосередковано і може визначатись за допомогою кількісного, напівкількісного або якісного способу. Опис фігур На Фіг. 1 зображений мас-спектр MALDI-TOF (мас-спектрометрія з іонізацією методом лазерної десорбції у матричному розчині з часопролітним аналізатором) форм людського гепсидину, імунопреципітованого з людської сироватки із селективним Mab 3.23 проти гепсидину-25. Сигнал 1 має масу, яка відповідає очікуваній масі інтактного людського гепсидину-25 (приблизна молекулярна маса (MW) 2790 Дальтон (Да)). Сигнал 2 має масу, яка відповідає очікуваній масі інтактного людського гепсидину-20 (молекулярна маса 2192 Да). Як показує хроматограма, Mab 3.23 проти гепсидину-25 зв'язує виявні кількості гепсидину-25 і набагато менші кількості гепсидину-20. Mab 3.23, як видається, не зв'язує виявних кількостей гепсидину-22 (молекулярна маса 2436 Да), гепсидину-24 (молекулярна маса 2674 Да) або прогепсидину (молекулярна маса 6929 Да). Мас-спектр одержали за допомогою MALDI-TOF мас-спектрометра у лінійному режимі з утворенням позитивних іонів з а-ціано-4гідроксикоричною кислотою (пептидна матриця) як носієм для зразків по суті як описано у Прикладі 6 нижче. На Фіг. 2 зображений збільшений вид відповідної ділянки (молекулярна маса 2000-3000 Да) мас-спектра, представленого на Фіг. 1. Як показує хроматограма, Mab 3.23 зв'язує гепсидин-25 (Сигнал 1) і, набагато меншою мірою, гепсидин-20 (Сигнал 2). Селективне Mab 3.23 проти 3 UA 103032 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гепсидину, як видається, не зв'язує виявник кількостей гепсидину-22 (молекулярна маса 2436 Да) або гепсидину-24 (молекулярна маса 2674 Да). На Фіг. 3 зображений мас-спектр MALDI-TOF форм людського гепсидину, імунопреципітованого з людської сироватки із селективним Mab 5E8 проти гепсидину-25. Сигнал 1 має масу, яка відповідає очікуваній масі інтактного людського гепсидину-25 (2790 Да). Як показує хроматограма, Mab 5E8 проти гепсидину-25 зв'язує виявні кількості лише гепсидину-25. Мас-спектр одержали за допомогою MALDI-TOF мас-спектрометра у лінійному режимі з утворенням позитивних іонів з а-ціано-4-гідроксикоричною кислотою (пептидна матриця) як носієм для зразків по суті як описано у Прикладі 6 нижче. На Фіг. 4 зображений збільшений вид відповідної ділянки (молекулярна маса 2000-3000 Да) мас-спектра, зображеного на Фіг. 1. Як показує хроматограма, Mab 5E8 зв'язує виявні кількості гепсидину-25 (Сигнал 1). Mab 5E8 не зв'язує виявних кількостей гепсидину-20 (молекулярна маса 2192 Да), гепсидину-22 (молекулярна маса 2436 Да), гепсидину-24 (молекулярна маса 2674 Да) або прогепсидину (молекулярна маса 6929 Да). На Фіг. 5 зображена калібраційна крива для гепсидину-25, яку одержали шляхом послідовного розбавлення синтезованого гепсидину-25 (темні кола), розпочинаючи з концентрації 10 мкг/л (10 нг/мл), з проведенням імунологічного MSD сендвіч-аналізу, опис якого наведений у Прикладі 8. Імунологічний MSD сендвіч-аналіз був специфічним для гепсидину-25 і не розпізнавав гепсидину-20 (темні трикутники) або гепсидину-22 (світлі кола). У цьому описі вжиті наведені нижче скорочення: ACN: ацетонітрил, BSA: бичачий сироватковий альбумін, DTT: дитіотреітол, EDTA: етилендіамінтетраоцтова кислота, ELISA: твердофазний імуноферментний аналіз, ІМАС: іммобілізована металоафінна хроматографія, IPTG: ізопропіл-р-D-1-тіогалактопіранозид, Mab: моноклональне антитіло, Mabs: моноклональні антитіла, MALDI-TOF: мас-спектрометрія з іонізацією методом лазерної десорбції у матричному розчині з часопролітним аналізатором, PBS: фосфатно-буферний фізіологічний розчин, SPR: поверхневий плазмонний резонанс, TEA: трифтороцтова кислота. Усі скорочення амінокислот, вжиті у цьому описі, є скороченнями, прийнятими Відомством з патентів і товарних знаків США, як наведено у § 1.822 (В)(2) 37 Кодексу законів США. Цей винахід пропонує антитіла, які селективно зв'язують гепсидин-25 шляхом спрямованого зв'язування антигенної детермінанти, яка міститься у межах амінокислот від 1 до 7, включно, гепсидину-25. Такі антитіла є прийнятними для підвищення рівнів заліза у сироватці, кількості ретикулоцитів, кількості еритроцитів, рівнів гемоглобіну та/або гематокриту у людини для лікування захворювання, стану або розладу, наприклад, анемії. Окрім того, цей винахід пропонує способи застосування таких антитіл у відносно простих, однак високочутливих та селективних, імунологічних аналізах для виявлення та/або визначення рівнів гепсидину-25 у тканинах та біологічних рідинах ссавців. Термін "гепсидин", при вживанні у цьому описі, означає будь-яку форму білка гепсидину, який, як відомо, є присутнім у організмі ссавців. Термін "зрілий гепсидин", при вживанні у цьому описі, означає будь-яку зрілу, біологічно активну, форму білка гепсидину, який експресується у організмі ссавців. Словосполучення "людський гепсидин", при вживанні у цьому описі, означає будь-яку форму білка гепсидину, який є присутнім у організмі людей. Словосполучення "людський гепсидин-25", при вживанні у цьому описі, означає зрілу форму людського гепсидину, який має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 1. Загальна структура антитіла є добре відомою у цій галузі. У разі антитіла типу IgG, існує чотири амінокислотні ланцюги (два "важкі" ланцюги і два "легкі" ланцюги), які є поперечно зшитими за допомогою внутрішньоланцюгових та міжланцюгових дисульфідних зв'язків. У разі експресії у певних біологічних системах, антитіла, які мають немодифіковані послідовності людської Fc-ділянки, глікозилуються на згаданій Fc-ділянці. Антитіла можуть також глікозилуватись у інших положеннях. Субодиничні структури та об'ємні конфігурації антитіл є добре відомими у цій галузі. Кожен важкий ланцюг містить N-кінцеву варіабельну ділянку важкого ланцюга ("HCVR") та константну ділянку важкого ланцюга ("HCCR"). Константна ділянка важкого ланцюга містить три домени (СНІ, СН2 та СНЗ) у разі IgG, IgD та IgA; і 4 домени (СНІ, СН2, СНЗ та СН4) у разі IgM та IgE. Кожен легкий ланцюг містить варіабельну ділянку легкого ланцюга (у цьому описі "LCVR") та константну ділянку легкого ланцюга ("LCCR"). Варіабельні ділянки кожної пари легкий/важкий ланцюг утворюють антигензв'язувальний центр антитіла. HCVR та LCVR можуть крім того підрозділятись на гіперваріабельні ділянки, які називають ділянками, що обумовлюють комплементарність (CDR), які чергуються з більш консервативними ділянками, які називають каркасними ділянками (FR). Кожна з HCVR та LCVR містить три CDR та чотири FR, які від амінокінця до карбоксильного кінця розміщуються таким чином: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. У цьому описі три CDR важкого ланцюга 4 UA 103032 C2 5 10 15 20 25 30 35 позначені як "CDRH1, CDRH2 та CDRH3" і три CDR легкого ланцюга позначені як "CDRL1, CDRL2 та CDRL3". CDR містять більшість залишків, які забезпечують специфічні взаємодії з антигеном. Розподіл амінокислот до кожного домену відповідає добре відомим домовленостям (наприклад, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest, " National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Антитіла за цим винаходом можуть мати константну ділянку важкого ланцюга, вибрану з будь-якого класу імуноглобулінів (IgA, IgD, IgG, IgM та IgE). За варіантом, якому віддається перевага, антитіла за цим винаходом містять константну ділянку, яка походить з Fc-ділянки людського або мишачого IgG. Термін "моноклональне антитіло" означає антитіло, яке походить з однієї копії або клону, у тому числі, наприклад, будь-якого еукаріотного, прокаріотного або фагового клону, а не спосіб, за допомогою якого воно продукується. За варіантом, якому віддається перевага, моноклональне антитіло за цим винаходом існує у однорідній або по суті однорідній популяції. Антитіло за цим винаходом може бути інтактним, тобто містити повні або повномірні константні ділянки, у тому числі Fc-ділянку, або частиною чи фрагментом такого антитіла, за умови, що будь-яка скорочена форма містить антигензв'язувальну частину та зберігає антигензв'язувальну здатність. Такі скорочені форми включають, наприклад, Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент або F(аb')2-фрагмент, які містять CDR або варіабельні ділянки описаних селективних антитіл проти гепсидину-25. Окрім того, такі скорочені форми антитіла можуть бути одноланцюговим Fv-фрагментом, який можна одержати шляхом сполучення ДНК, яка кодує LCVR та HCVR, з лінкерною послідовністю. (Дивись, Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, crop. 269-315, 1994). Незалежно від того, чи є фрагменти або частини визначеними, термін "антитіло", який вживають у цьому описі, охоплює такі фрагменти або частини, а також одноланцюгові форми, якщо не зазначено інше. Доки частина білка або фрагмент білка зберігає здатність селективного зв'язування гепсидину-25 та нейтралізації однієї або декількох біологічних активностей, характерних для гепсидину-25 ссавців in vivo або in vitro, доти вона охоплюється визначенням терміну "антитіло". Антитіла за цим винаходом можна одержати за допомогою методів, добре відомих у цій галузі, наприклад, за допомогою технології рекомбінантних ДНК, методу фагового дисплею, методів синтезу або комбінацій таких методів чи інших методів, широко відомих уцій галузі (дивись, наприклад, Jayasena S.D., Clin. Chem., 45:1628-1650 (1999) та Fellouse F.A., et al., J. Мої. Biol., 373(4):924-940 (2007)). У наведених нижче Таблиці 1 та Таблиці 2 представлені CDR, яким віддається перевага, для антитіл за цим винаходом. Таблиця 1 Fab LCDR1 Консенсусна 1 SASSSX1SX2MY (SEQ ID NO: 6) 4С11 SASSSVSYMY (SEQ ID NO: 9) 1G8 SASSSASYMY (SEQ ID NO: 12) 1В4 SASPSVSYMY (SEQ ID NO: 45) 1Е3 SASSSASYMY (SEQ ID NO: 12) 3А9 SASSSVSSMY (SEQ ID NO: 15) Консенсусна 2 KSSQSLLYX5NGKTYLT NO: 17) KSSQSLLYSNGKTYLT NO: 20) KSSQSLLYSNGKTYLT NO: 20) KSSQSLLYRNGKTYLT NO: 24) 5Е8 ОВ3 ОВ1 (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID 5 LCDR2 LTSX3LAS (SEQ NO: 7) LTSNLAS (SEQ NO: 10) LTSHLAS (SEQ NO: 13) LTSHLAS (SEQ NO: 13) LTSHLAS (SEQ NO: 13) LTSNLAS (SEQ NO: 10) LVSKLDX6 (SEQ NO: 18) LVSKLDS (SEQ NO: 21) LVSKLDS (SEQ NO: 21) LVSKLDP (SEQ NO: 25) LCDR3 ID QQWSSX4PPT (SEQ ID NO: 8) ID QQWSSNPPT (SEQ ID NO: 11) ID QQWSSGPPT (SEQ ID NO: 14) ID QQWSSGPPT (SEQ ID NO: 14) ID QQWSSGPPT (SEQ ID NO: 14) ID QQWSSYPPT (SEQ ID NO: 16) ID X7QGSHFPWX8 (SEQ ID NO: 19) ID VQGSHFPWT (SEQ ID NO: 22) ID HQGSHFPWT (SEQ ID NO: 23) ID HQGSHFPWT (SEQ ID NO: 23) UA 103032 C2 Продовження таблиці 1 Fab ОН4 ОЕ1 Fab LCDR1 LCDR2 LCDR3 KSSQSLLYPNGKTYLT (SEQ ID LVSKLDP (SEQ ID IQGSHFPWT (SEQ ID NO: 26) NO: 25) NO: 27) KSSQSLLYPNGKTYLT LVSKLDP FQGSHFPWV LCDR1 LCDR2 LCDR3 (SEQ ID NO: 26) (SEQ ID NO: 25) (SEQ ID NO: 28) *X1 - V або A, X2 - Y або S; X3 - N або Н, Х4 - N, G або Y; X5 - S, R або Р; Х6 - S або P; X7 - V, H, І або F; X8 - T або V. 5 Таблиця 2 Fab Консенсусна 4C11 1G8 1B4 1E3 3A9 Консенсусна 2 5E8 ОВ3 OB1 ОН4 ОЕ1 HCDR1 GX9SLX10X11X12G X13GX14G (SEQ ID NO: 29) GFSLSTYGIGVG (SEQ ID NO: 32) GYSLSTPGIGVG (SEQ ID NO: 35) GYSLSTPGIGVG (SEQ ID NO: 35) GLSLSTPGIGVG (SEQ ID NO: 38) GFSLNSYGFGIG (SEQ ID NO: 39) GFAFSSYDMS (SEQ ID NO: 42) GFAFSSYDMS (SEQ ID NO: 42) GFAFSSYDMS (SEQ ID NO: 42) GFAFSSYDMS (SEQ ID NO: 42) GFAFSSYDMS (SEQ ID NO: 42) GFAFSSYDMS (SEQ ID NO: 42) HCDR2 HCDR3 HIWWN X15X16K X17YNT I X19YYG X20X21X22 GFAY X18LKS (SEQ ID NO: 30) (SEQ ID NO: 31) HIWWNDNKSYNTALKS ID NO: 33) HRVWNDAKSYNTALKS ID NO: 36) HIWWNDAKSYNTALKS ID NO: 36) HIWWNDAKSYNTALKS ID NO: 36) HIWWNGNKYYNTTLKS ID NO: 40) TIISGGTYTYYPDSVKG ID NO: 43) TIISGGTYTYYPDSVKG ID NO: 43) TIISGGTYTYYPDSVKG ID NO: 43) TIISGGTYTYYPDSVKG ID NO: 43) TIISGGTYTYYPDSVKG ID NO: 43) TIISGGTYTYYPDSVKG ID NO: 43) (SEQ IGYYGSTSGFAY (SEQ ID NO: 34) (SEQ IGYYGSTAGFAY (SEQ ID NO: 37) (SEQ IGYYGSTAGFAY (SEQ ID NO: 37) (SEQ IGYYGSTAGFAY (SEQ ID NO: 37) (SEQ IHYYGNSYGFAY (SEQ ID NO: 41) (SEQ DGYIH (SEQ ID NO: 44) (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ DGYIH (SEQ ID NO: 44) DGYIH (SEQ ID NO: 44) DGYIH (SEQ ID NO: 44) DGYIH (SEQ ID NO: 44) DGYIH (SEQ ID NO: 44) * X9 - F, Y або L; X10 - S або N, X11 - T або S; X12 - Y або Р, X13 - I або F; X14 - V або I; X15 - D або G; X16 - А або N; X17 - S або Y; X18 - А або T; X19 - G або H; X20 - S або N; X21 - T або S; X22 - S, А або Y. 10 15 20 Цей винахід включає (але без обмеження ними) антитіла, які містять: а) варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка містить: і) LCDR1, яка має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO: 6, 9, 12, 45, 15, 17, 20, 24 та 26; іі) LCDR2, яка має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO: 7, 10, 13, 18, 21 та 25; та ііі) LCDR3, яка має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO: 8, 11, 14, 16, 19, 22, 23, 17 та 28; та b) варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка містить: і) HCDR1, яка має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO: 29, 32, 35, 38, 39 та 42; іі) HCDR2, яка має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO: 30, 33, 36, 40 та 43; та 6 UA 103032 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ііі) HCDR3, яка має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO: 31, 24, 27, 41 та 44. Альтернативно антитіло за цим винаходом, якому віддається перевага, містить: a) LCVR, яка містить: і) LCDR1, яка має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO: 9, 12, 20 та 26; іі) LCDR2, яка має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO: 10, 13, 21 та 25; та ііі) LCDR3, яка має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO: 11, 14, 23 та 27; та b) HCVR, яка містить: і) HCDR1, яка має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO: 32, 35 та 42; іі) HCDR2, яка має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO: 33, 36 та 43; та ііі) HCDR3, яка має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 34, 37 та 44. Інше антитіло за цим винаходом, якому віддається перевага, містить LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 та HCDR3, які мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 20, 21, 22, 42, 43 та 44, відповідно. Інше антитіло за цим винаходом, якому віддається перевага, містить LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 та HCDR3, які мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 26, 25, 28, 42, 43 та 44, відповідно. Інше антитіло за цим винаходом, якому віддається перевага, містить LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 та HCDR3, які мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 24, 25, 23, 42, 43 та 44, відповідно. Антитіло за цим винаходом, якому віддається більша перевага, містить LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 та HCDR3, які мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 26, 25, 27, 42, 43 та 44, відповідно. Антитіло за цим винаходом, якому віддається ще більша перевага, містить LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 та HCDR3, які мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 9, 10, 11, 32, 33 та 34, відповідно. Антитіло за цим винаходом, якому віддається ще більша перевага, містить LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 та HCDR3, які мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 12, 13, 14, 35, 36 та 37, відповідно. Антитіло за цим винаходом, якому віддається ще більша перевага, містить LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 та HCDR3, які мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 45, 13, 14, 35, 36 та 37, відповідно. Антитіло за цим винаходом, якому віддається найбільша перевага, містить LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 та HCDR3, які мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 20, 21, 23, 42, 43 та 44, відповідно. Антитіло за цим винаходом, якому віддається найбільша перевага, містить LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 та HCDR3, які мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 12, 13, 14, 38, 36 та 37, відповідно. Антитіло за цим винаходом, якому віддається найбільша перевага, містить LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 та HCDR3, які мають амінокислотні послідовності, представлені послідовностями SEQ ID NO: 15, 10, 16, 39, 40 та 41, відповідно. Антитіло за цим винаходом, якому віддається перевага, містить LCVR, яка має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO: 46, 48, 50, 52, 53, 55, 57, 59, 60, 61, 62 та 63. Інше антитіло за цим винаходом, якому віддається перевага, містить HCVR, яка має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яку складають послідовності SEQ ID NO: 47, 49, 51, 54, 56 та 58. Інше антитіло за цим винаходом, якому віддається перевага, містить LCVR, яка має послідовність SEQ ID NO: 59, та HCVR, яка має послідовність SEQ ID NO: 58. Інше антитіло за цим винаходом, якому віддається перевага, містить LCVR, яка має послідовність SEQ ID NO: 60, та HCVR, яка має послідовність SEQ ID NO: 58. Інше антитіло за цим винаходом, якому віддається перевага, містить LCVR, яка має послідовність SEQ ID NO: 61, та HCVR, яка має послідовність SEQ ID NO: 58. Інше антитіло за цим винаходом, якому віддається перевага, містить LCVR, яка має послідовність SEQ ID NO: 62, та HCVR, яка має послідовність SEQ ID NO: 58. Інше антитіло за цим винаходом, якому віддається перевага, містить LCVR, яка має послідовність SEQ ID NO: 63, та HCVR, яка має 7 UA 103032 C2 5 10 послідовність SEQ ID NO: 58. Антитіло за цим винаходом, якому віддається найбільша перевага, містить LCVR, яка має послідовність SEQ ID NO: 48, та HCVR, яка має послідовність SEQ ID NO: 49. Інше антитіло за цим винаходом, якому віддається найбільша перевага, містить LCVR, яка має послідовність SEQ ID NO: 55, та HCVR, яка має послідовність SEQ ID NO: 56. Такі LCVR, за варіантом, якому віддається перевага, є зв'язаними з константною ділянкою легкого ланцюга або важкого ланцюга. Моноклональні антитіла за цим винаходом, яким віддається перевага, позначені у цьому описі як 4С11, 1G8, 1В4, 1Е3, 3А9, 2, 5Е8, ОВ3, OB1, OH4 та ОЕ1. Амінокислотні послідовності SEQ ID NO, які кодують Mabs 4C11, 1G8, 1В4, 1ЕЗ, 3А9, 5Е8, ОВЗ, OB1, OH4, ОЕ1, 3.12, 3.23 та/або різні їх фрагменти, подані у наведеній нижче Таблиці 3. Таблиця 3 Mab 20 25 30 35 40 HC Консенсусна 1 4С11 1G8 1В4 1Е3 3А9 Консенсусна 2 5Е8 ОВ3 ОВ1 ОН4 OE1 3.23 3.12 15 LC 64 66 68 70 71 73 75 77 78 79 80 81 82 84 65 67 69 69 72 74 76 76 76 76 76 76 83 85 LC VR 46 48 50 52 53 55 57 59 60 61 62 63 LCDR 1 6 9 12 45 12 15 17 20 20 24 26 26 LCDR 2 7 10 13 13 13 10 18 21 21 25 25 25 LCDR 3 8 11 14 14 14 16 19 22 23 23 27 28 HC VR 47 49 51 51 54 56 58 58 58 58 58 58 HCD R1 29 32 35 35 38 39 42 42 42 42 42 42 HCD R2 30 33 36 36 36 40 43 43 43 43 43 43 HCD R3 31 34 37 37 37 41 44 44 44 44 44 44 Термін "антигенна детермінанта" означає ту частину молекули, яка може розпізнаватись та зв'язуватись антитілом на одному або декількох антигензв'язувальних центрах антитіла. Антигенні детермінанти, як правило, складаються з хімічно активних поверхневих угруповань молекул, таких як амінокислоти або бічні ланцюги цукрів, і, як правило, мають специфічні об'ємні структурні характеристики, а також специфічні зарядові характеристики. За варіантом, якому віддається перевага, антитіла за цим винаходом зв'язуються з антигенною детермінантною на N-кінці зрілого гепсидину. За варіантом, якому віддається більша перевага, антитіла за цим винаходом зв'язуються з антигенною детермінантною, яка міститься у межах амінокислот гепсидину-25 з 1 до 7, включно. За варіантом, якому віддається більша перевага, антитіла за цим винаходом зв'язуються з N-кінцем людського гепсидину-25. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, антитіла за цим винаходом зв'язуються з антигенною детермінантною, яка міститься у межах амінокислот людського гепсидину-25 з 1 до 7, включно. За варіантом, якому віддається найбільша перевага, антитіла за цим винаходом зв'язуються з антигенною детермінантою, яка міститься у межах амінокислот DTHFPIC послідовності SEQ ID NO: 1. Термін "зв'язувальна спорідненість (KD)", вжитий у цьому описі, означає швидкість дисоціації конкретної взаємодії антиген-антитіло. КD являє собою відношення швидкості дисоціації, яку також називають "константою дисоціації(koff)", до швидкості асоціації або "константи асоціації (kon)". Таким чином, КD дорівнює koff/kon і виражається як молярна концентрація (М). З цього випливає, що чим меншим є значення KD, тим сильнішою є спорідненість до зв'язування. Таким чином, КD=1 мкМ означає більш слабку зв'язувальну спорідненість порівняно з KD=1 нМ. Значення KD можна одержати за методиками, відомими у цій галузі. Термін "селективне", вжитий у цьому описі відносно антитіла проти гепсидину-25 за цим винаходом, означає антитіло, яке зв'язує гепсидин-25 зі значенням КD" поиблизно у 1000, 500, 200, 100, 50, 10 разів або поиблизно у 5 разів нижчим за значення, з яким антитіло зв'язує щонайменше одну форму-попередник гепсидину-25 та/або щонайменше одну скорочену на Nкінці форму гепсидину-25, яка є присутньою у того самого виду ссавців, як визначається засобами SPR при температурі 25 °C. На додаток до цього або альтернативно селективне антитіло проти гепсидину-25 за цим винаходом зв'язується з гепсидином-25, але не зв'язується або лише мінімально зв'язується із щонайменше однією формою-попередником гепсидину-25 8 UA 103032 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 та/або щонайменше однією скороченою на N-кінці формою гепсидину-25, яка є присутньою у того самого виду ссавців, у разі проведення аналізу методами імунологічного аналізу та/або мас-спектрометрії MALDI-TOF, опис яких наведено у Прикладах 4-8, поданих нижче. За варіантом, якому віддається перевага, формою-попередником гепсидину-25 є прогепсидин, за варіантом, якому віддається більша перевага, людський прогепсидин і за варіантом, якому віддається найбільша перевага, людський прогепсидин, який містить амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 90. За варіантом, якому віддається перевага, скороченою на N-кінці формою гепсидину-25 є людський гепсидин-20 (тобто амінокислоти 6-25 послідовності SEQ ID NO: 1) або людський гепсидин-22 (амінокислоти 4-25 послідовності SEQ ID NO: 1). Термін "виявляти" або "виявлення" вжитий у найширшому значенні з включенням кількісних, напівкількісних або якісних визначень молекули-мішені. За одним з аспектів цього винаходу методи, опис яких наведено у цій заявці, можуть лише визначати присутність або відсутність конкретного поліпептиду гепсидину у біологічному зразку, і, таким чином, поліпептид гепсидин є виявним або, альтернативно, невиявним у зразку у разі аналізування за допомогою згаданого методу. Термін "біологічна активність" щодо антитіла за цим винаходом охоплює (але без обмеження) спорідненість до зв'язування антигенної детермінанти або антигензв'язувальну спорідненість, in vivo та/або in vitro стабільність антитіла, імуногенні властивості антитіла, наприклад, у разі введення людині, та/або здатність нейтралізувати або антагонізувати біологічну активність гепсидину-25, in vivo або in vitro, у тому числі (але без обмеження) пригнічення порушення регуляції рівнів заліза у сироватці на тваринній моделі запалення, наприклад, у разі контрольного аналізу запалення, індукованого IL-6. Вищезгадані властивості або характеристики можна спостерігати або вимірювати за допомогою визнаних у цій галузі методів, у тому числі (але без обмеження) сцинтиляційного аналізу із застосуванням МІПів (молекулярно-імпринтованих полімерів), ELISA (твердофазний імуноферментний аналіз), імунологічного аналізу за допомогою аналізатора ORIGEN (компанія IGEN), аналізу гасіння флуоресценції, ELISA з гасінням флуоресценції, конкурентного ELISA, поверхневого плазмонного резонансу (SPR), у тому числі (але без обмеження) SPR із застосуванням біосенсора ВІАсоге, аналізів нейтралізації in vitro та in vivo без обмеження (дивись, наприклад, WO 2006/062685). Термін "біологічна активність" відносно гепсидину охоплює (але без обмеження) специфічне зв'язування гепсидину з іншим білком, у тому числі (але без обмеження) з його рецептором феропортином, одну або декілька феропортин-опосередкованих функцій гепсидину, наприклад, індуковану гепсидином інтерналізацію та/або деградацію феропортину (дивись, наприклад, Nemeth E., et al., Hepcidin Regulates Iron Efflux by Binding to Ferroportin and Inducing Its Internalization, Science 306, 2090-2093, (2004)), регуляцію гепсидином опосередкованого феропортином відтоку заліза, індуковане гепсидином зниження рівнів заліза у сироватці, кількості ретикулоцитів, кількості еритроцитів, рівнів гемоглобіну та/або гематокриту у людини, стабільність білків, тобто вплив гепсидину на рівні або активність іншого білка in vivo або in vitro, та рівні експресії та/або тканинного розподілу гепсидину. Термін "пригнічувати" або "нейтралізувати", вжитий у цьому описі відносно біологічної активності антитіла за цим винаходом, означає здатність антитіла значною мірою антагонізувати, забороняти, запобігати, стримувати, уповільнювати, порушувати, ліквідувати, зупиняти, зменшувати або спричинювати зворотний розвиток біологічної активності гепсидину, у тому числі (але без обмеження) біологічної активності людського, пацючого або мишачого гепсидину-25. Терміни "суб'єкт" та "пацієнт", які взаємозамінно вживають у цьому описі, означають ссавця, за варіантом, якому віддається перевага, людину. У певних варіантах здійснення цього винаходу пацієнт має захворювання, розлад або стан, сприятливим для якого було б зниження рівня гепсидину, зниження біологічної активності гепсидину та/або підвищення рівня заліза у сироватці, кількості ретикулоцитів, кількості еритроцитів, рівнів гемоглобіну та/або гематокриту. Словосполучення "специфічно зв'язує", вжите у цьому описі стосовно утворення зв'язку між антитілом та поліпептидом гепсидином, означає, що антитіло зв'язує поліпептид гепсидин зі значенням Кр меншим ніж приблизно 500 нМ, при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. За одним із варіантів здійснення антитіло за цим винаходом має значення Кр для людського гепсидину-25 (послідовність SEQ ID NO: 1) менше ніж приблизно 100 нМ, менше ніж приблизно 50 нМ, менше ніж приблизно 25 нМ, менше ніж приблизно 10 нМ, менше ніж приблизно 5 нМ, менше ніж приблизно 1 нМ або менше ніж приблизно 800 пМ, при визначенні засобами SPR при 9 UA 103032 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається перевага, антитіло за цим винаходом також специфічно зв'язує щонайменше один зрілий поліпептид гепсидин ссавця нелюдського виду при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається більша перевага, згадане антитіло також специфічно зв'язує щонайменше один поліпептид гепсидин25, вибраний з групи, яку складають мишачий гепсидин-25, пацючий гепсидин-25 та гепсидин-25 макак-крабоіщів (послідовності SEQ ID NO: 3, 2 та 4, відповідно), при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, згадане антитіло також специфічно зв'язує гепсидин-25 макак-крабощів (послідовність SEQ ID NO: 4) при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, згадане антитіло також специфічно зв'язує мишачий та/або пацючий гепсидин-25 (послідовності SEQ ID NO: 3 та 2, відповідно) при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. За одним із варіантів здійснення антитіло за цим винаходом має значення Kq для людського гепсидину-25 (послідовність SEQ ID NO: 1) менше ніж приблизно 100 нМ, менше ніж приблизно 50 нМ, менше ніж приблизно 25 нМ, менше ніж приблизно 10 нМ, менше ніж приблизно 5 нМ, менше ніж приблизно 1 нМ або менше ніж приблизно 800 пМ при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C, та і) згадане антитіло має значення КD для людського прогепсидину, людського гепсидину-20 (послідовність SEQ ID NO: 88) або людського гепсидину-22 (послідовність SEQ ID NO: 89), яке є у щонайменше приблизно 200, приблизно 100, приблизно 50, приблизно 10 або приблизно 5 разів вищим при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C або іі) зв'язування згаданого антитіла з людським прогепсидином, людським гепсидином20 (послідовність SEQ ID NO: 88) або людським гепсидином-22 (послідовність SEQ ID NO: 89) не виявляється або мінімально виявляється методом імунологічного аналізу та/або методом мас-спетрометрії MALDI-TOF, опис яких наведений у Прикладах 4-7. За варіантом, якому віддається перевага, згадане антитіло також специфічно зв'язує щонайменше один зрілий поліпептид гепсидин ссавця нелюдського виду при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається більша перевага, згадане антитіло також специфічно зв'язує щонайменше один поліпептид гепсидин-25, вибраний з групи, до складу якої входить мишачий гепсидин-25, пацючий гепсидин-25 та гепсидин-25 макак-крабоїдів (послідовності SEQ ID NO: 3, 2 та 4, відповідно) при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, згадане антитіло також специфічно зв'язує гепсидин-25 макак-крабоїдів (послідовність SEQ ID NO: 4) при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, згадане антитіло також специфічно зв'язує мишачий та/або пацючий гепсидин-25 (послідовності SEQ ID NO: 2 та З, відповідно) при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. За іншим варіантом здійснення антитіло за цим винаходом має значення KD для людського гепсидину-25 (послідовність SEQ ID NO: 1) від приблизно 100 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 1 нМ або від приблизно 35 нМ до приблизно 1 нМ при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C, та і) згадане антитіло має значення Кр для людського прогепсидину, людського гепсидину-20 (послідовність SEQ ID NO: 88) або людського гепсидину-22 (послідовність SEQ ID NO: 89), яке є у щонайменше приблизно 200, приблизно 100, приблизно 50, приблизно 10 або приблизно 5 разів вищим при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C або іі) зв'язування згаданого антитіла з людським прогепсидином, людським гепсидином-20 (послідовність SEQ ID NO: 88) або людським гепсидином-22 (послідовність SEQ ID NO: 89) не виявляється або мінімально виявляється методом імунологічного аналізу та/або методом мас-спетрометрії MALDI-TOF, опис яких наведений у Прикладах 4-7. За варіантом, якому віддається перевага, згадане антитіло також специфічно зв'язує щонайменше один зрілий поліпептид гепсидин ссавця нелюдського виду при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається більша перевага, згадане антитіло також специфічно зв'язує щонайменше один поліпептид гепсидин-25, вибраний з групи, яку складають мишачий гепсидин-25, пацючий гепсидин-25 та гепсидин-25 макак-крабоїдів (послідовності SEQ ID NO: 3, 2 та 4, відповідно), при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, згадане антитіло також специфічно зв'язує гепсидин-25 макак-крабоїдів (послідовність SEQ ID NO: 4) при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, згадане антитіло також специфічно зв'язує мишачий та/або пацючий гепсидин-25 (послідовності SEQ ID NO: 2 та 3, відповідно) при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. За одним з варіантів здійснення антитіло за цим винаходом має значення KD для людського гепсидину-25 (послідовність SEQ ID NO: 1) менше ніж приблизно 100 нМ, менше ніж приблизно 10 UA 103032 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 50 нМ, менше ніж приблизно 25 нМ, менше ніж приблизно 10 нМ, менше ніж приблизно 5 нМ, менше ніж приблизно 1 нМ або менше ніж приблизно 800 пМ при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається перевага, антитіло за цим винаходом також має значення KD від приблизно 100 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 1 нМ або від приблизно 35 нМ до приблизно 1 нМ для щонайменше одного зрілого поліпептиду гепсидину ссавця нелюдського виду при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається більша перевага, згадане антитіло також має значення Kd від приблизно 100 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 1 нМ або від приблизно 35 нМ до 1 нМ для щонайменше одного поліпептиду гепсидину-25, вибраного з групи, яку складають мишачий гепсидин-25, пацючий гепсидин-25 та гепсидин-25 макаккрабоїдів (послідовності SEQ ID NO: 3, 2 та 4, відповідно), при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, згадане антитіло також має значення КD від приблизно 100 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 1 нМ або від приблизно 35 нМ до 1 нМ для гепсидину-25 макак-крабоїдів (послідовність SEQ ID NO: 4) при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, згадане антитіло також має значення Kd від приблизно 100 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 1 нМ або від приблизно 35 нМ до 1 нМ для мишачого та/або пацючого гепсидину-25 (послідовності SEQ ID NO: 3 та 2, відповідно) при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. За іншим варіантом здійснення, антитіло за цим винаходом має значення KD для людського гепсидину-25 (послідовність SEQ ID NO: 1) від приблизно 100 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 1 нМ або від приблизно 35 нМ до 1 нМ при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається перевага, антитіло за цим винаходом також має значення KD від приблизно 100 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 1 нМ або від приблизно 35 нМ до приблизно 1 нМ для щонайменше одного зрілого поліпептиду гепсидину ссавця нелюдського виду при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається більша перевага, згадане антитіло також має значення KD від приблизно 100 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 1 нМ або від приблизно 35 нМ до 1 нМ для щонайменше одного поліпептиду гепсидину-25, вибраного з групи, яку складають мишачий гепсидин-25, пацючий гепсидин-25 та гепсидин-25 макак-крабоїдів (послідовності SEQ ID NO: 3, 2 та 4, відповідно), при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, згадане антитіло також має значення KD від приблизно 100 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 1 нМ або від приблизно 35 нМ до 1 нМ для гепсидину-25 макак-крабоїдів (послідовність SEQ ID NO: 4) при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, згадане антитіло також має значення KD від приблизно 100 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 1 нМ або від приблизно 35 нМ до 1 нМ для мишачого та/або пацючого гепсидину-25 (послідовності SEQ ID NO: 3 та 2, відповідно) при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. За одним з варіантів здійснення антитіло за цим винаходом має значення KD для людського гепсидину-25 (послідовність SEQ ID NO: 1) менше ніж приблизно 100 нМ, менше ніж приблизно 50 нМ, менше ніж приблизно 25 нМ, менше ніж приблизно 10 нМ, менше ніж приблизно 5 нМ, менше ніж приблизно 1 нМ або менше ніж приблизно 800 пМ при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C, та і) згадане антитіло має значення КD для людського прогепсидину, людського гепсидину-20 (послідовність SEQ ID NO: 88) або людського гепсидину-22 (послідовність SEQ ID NO: 89), яке є у щонайменше приблизно 200, приблизно 100, приблизно 50, приблизно 10 або приблизно 5 разів вищим при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C або іі) зв'язування згаданого антитіла з людським прогепсидином, людським гепсидином20 (послідовність SEQ ID NO: 88) або людським гепсидином-22 (послідовність SEQ ID NO: 89) не виявляється або мінімально виявляється методом імунологічного аналізу та/або методом мас-спетрометрії MALDI-TOF, опис яких наведений у Прикладах 4-7. За варіантом, якому віддається перевага, згадане антитіло також має значення КD від приблизно 100 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 1 нМ або від приблизно 35 нМ до приблизно 1 нМ для щонайменше одного зрілого поліпептиду гепсидину ссавця нелюдського виду при визначенні засобами SPR при температурі 11 UA 103032 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 25 °C. За варіантом, якому віддається більша перевага, згадане антитіло також має значення К D від приблизно 100 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 1 нМ або від приблизно 35 нМ до 1 нМ для щонайменше одного поліпептиду гепсидину-25, вибраного з групи, яку складають мишачий гепсидин-25, пацючий гепсидин-25 та гепсидин-25 макак-крабоїдів (послідовності SEQ ID NO: 3, 2 та 4, відповідно), при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, згадане антитіло також має значення КD від приблизно 100 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 1 нМ або від приблизно 35 нМ до 1 нМ для гепсидину-25 макак-крабоїдів (послідовність SEQ ID NO: 4) при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, згадане антитіло також має значення KD від приблизно 100 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 1 нМ або від приблизно 35 нМ до 1 нМ для мишачого та/або пацючого гепсидину-25 (послідовності SEQ ID NO: 3 та 2, відповідно) при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. За іншим варіантом здійснення антитіло за цим винаходом має значення KD для людського гепсидину-25 (послідовність SEQ ID NO: 1) від приблизно 100 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 1 нМ або від приблизно 35 нМ до приблизно 1 нМ при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C, та і) згадане антитіло має значення Ко для людського прогепсидину, людського гепсидину-20 (послідовність SEQ ID NO: 88) або людського гепсидину-22 (послідовність SEQ ID NO: 89), яке є у щонайменше приблизно 200, приблизно 100, приблизно 50, приблизно 10 або приблизно 5 разів вищим при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C або іі) зв'язування згаданого антитіла з людським прогепсидином, людським гепсидином-20 (послідовність SEQ ID NO: 88) або людським гепсидином-22 (послідовність SEQ ID NO: 89) не виявляється або мінімально виявляється методом імунологічного аналізу та/або методом мас-спетрометрії MALDI-TOF, опис яких наведений у Прикладах 4-7. За варіантом, якому віддається перевага, згадане антитіло також має значення Кр від приблизно 100 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 1 нМ або від приблизно 35 нМ до приблизно 1 нМ для щонайменше одного зрілого поліпептиду гепсидину ссавця нелюдського виду при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається більша перевага, згадане антитіло також має значення Кр від приблизно 100 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 1 нМ або від приблизно 35 нМ до 1 нМ для щонайменше одного поліпептиду гепсидину-25, вибраного з групи, яку складають мишачий гепсидин-25, пацючий гепсидин-25 та гепсидин-25 макаккрабоїдів (послідовності SEQ ID NO: 3, 2 та 4, відповідно), при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, згадане антитіло також має значення KD від приблизно 100 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 1 нМ або від приблизно 35 нМ до 1 нМ для гепсидину-25 макак-крабощів (послідовність SEQ ID NO: 4) при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. За варіантом, якому віддається ще більша перевага, згадане антитіло також має значення КD від приблизно 100 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 800 пМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 1 нМ або від приблизно 35 нМ до 1 нМ для мишачого та/або пацючого гепсидину-25 (послідовності SEQ ID NO: 3 та 2, відповідно) при визначенні засобами SPR при температурі 25 °C. Експресія антитіла Для одержання рекомбінантного вектора експресії, трансфікування клітин-хазяїв, вибору трансформантів, ізолювання ліній клітин-хазяїв, які продукують антитіло за цим винаходом, культивування цих клітин-хазяїв та виділення антитіла з культурального середовища, застосовують стандартні методи молекулярної біології. Цей винахід спрямований також на клітини-хазяї, які експресують антитіло проти гепсидину за цим винаходом. Для експресії антитіла за цим винаходом можуть застосовуватись найрізноманітніші системи експресії клітин-хазяїв, відомі у цій галузі, у тому числі прокаріотні (бактеріальні) та еукаріотні системи експресії (такі як дріжджі, бакуловірус, клітини рослин, ссавців та інших тварин, трансгенні тварини та клітини-гібридоми), а також системи експресії фагового дисплею. Антитіло за цим винаходом можна одержати шляхом рекомбінантної експресії генів легких та важких ланцюгів імуноглобуліну у клітині-хазяїні. Для рекомбінантної експресії антитіла, клітину-хазяїна трансформують, трансдукують, інфікують тощо одним або декількома рекомбінантними векторами експресії, які несуть фрагменти ДНК, які кодують легкі та/або важкі імуноглобулінові ланцюги антитіла, так що легкі та/або важкі ланцюги експресуються клітиною 12 UA 103032 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 хазяїном. Важкий ланцюг і легкий ланцюг можуть експресуватись незалежно від різних промоторів, з якими вони є функціонально зв'язаними у одному векторі, або альтернативно важкий ланцюг і легкий ланцюг можуть експресуватись незалежно від різних промоторів, з якими вони є функціонально зв'язаними у двох векторах - один з яких експресує важкий ланцюг і один експресує легкий ланцюг. Факультативно важкий ланцюг і легкий ланцюг можуть експресуватись у різних клітинах-хазяях. Клітини-хазяї можуть також застосовуватись для продукування частин або фрагментів інтактних антитіл, наприклад, Fab-фрагментів або молекул scFv, традиційними методами. Наприклад, може виникнути необхідність трансфікування клітини-хазяїна ДНК, яка кодує легкий ланцюг або важкий ланцюг антитіла за цим винаходом. Технологія рекомбінантних ДНК може також застосовуватись для видалення певної частини або усієї ДНК, яка кодує будь-який з або обидва легкий та важкий ланцюги, яка не є необхідною для зв'язування з людським гепсидином25. Молекули, експресовані такими скороченими молекулами ДНК, також охоплюються антитілами за цим винаходом. Цей винахід пропонує клітину-хазяїна, яка містить нуклеїновокислотну молекулу за цим винаходом. За варіантом, якому віддається перевага, клітина-хазяїн за цим винаходом містить один або декілька векторів або генно-інженерних конструкцій, які містять нуклеїновокислотну молекулу за цим винаходом. Наприклад, клітиною-хазяїном за цим винаходом є клітина, до якої було введено вектор за цим винаходом, де згаданий вектор містить полінуклеотид, який кодує LCVR антитіла за цим винаходом, та/або полінуклеотид, який кодує HCVR антитіла за цим винаходом. Цей винахід пропонує також клітину-хазяїна, до якої було введено два вектори за цим винаходом; один містить полінуклеотид, який кодує LCVR антитіла за цим винаходом, і один містить полінуклеотид, який кодує HCVR, наявні у антитіла за цим винаходом, кожен з яких є функціонально зв'язаним з енхансерним/промоторним регуляторними елементами (які були одержані, наприклад, з мавпячого вірусу SV40, цитомегаловірусу (CMV), аденовірусу тощо, наприклад, CMV енхансерний/AdMLP (головний пізній промотор аденовірусу) промоторний регуляторний елемент або SV40 енхансерний/AdMLP промоторний регуляторний елемент) для стимулювання високих рівнів транскрипції генів. Після завершення експресії інтактні антитіла, окремі легкі та важкі ланцюги або інші форми імуноглобулінів за цим винаходом можуть бути очищені за стандартними методами у цій галузі, у тому числі фракціонуванням сульфатом амонію, іонообмінним хроматографуванням, афінним (наприклад, білок А) хроматографуванням, хроматографуванням з оберненою фазою, гідрофобним хроматографуванням, хроматографуванням на колонці з гідроксилапатитом, гельелектрофорезом тощо. Перевагу для фармацевтичних варіантів застосування віддають по суті чистому імуноглобуліну із щонайменше приблизно 90 %, приблизно 92 %, приблизно 94 % або приблизно 96 % однорідністю, і найбільшу перевагу віддають імуноглобуліну з приблизно 9899 % однорідністю. Після завершення очищення, часткового або до необхідного ступеня однорідності, стерильні антитіла можна застосовувати з терапевтичними цілями, зазначеними у цьому описі. Людське генно-інженерне антитіло За варіантом, якому віддається перевага, антитіло за цим винаходом, призначене для застосування з терапевтичними цілями, має послідовність каркасної та константної ділянки (тією мірою, у якій вони існують у антитілі), яку одержали від людини для зменшення ймовірності того, що згадане антитіло буде викликати імунну реакцію. Людські генно-інженерні антитіла становлять особливий інтерес, оскільки вони є цінними для терапевтичного застосування і зменшують ймовірність утворення людських антитіл проти мишачого антигену, що часто спостерігається у разі антитіл мишачого походження або антитіл, які містять складові частини мишачого походження, у разі введення людині. За варіантом, якому віддається перевага, введені людські генно-інженерні антитіла можуть мати період напіввиведення, що більше нагадує період напіввиведення природних людських антитіл, на відміну, наприклад, від мишачих антитіл, що надає можливість введення суб'єкту менших доз та з меншою частотою. Словосполучення "людські генно-інженерні антитіла", вжите у цьому описі, означає антитіло, щонайменше одна частина якого має людське походження. Наприклад, людське генноінженерне антитіло може містити складові частини, які були одержані з антитіла нелюдського походження, наприклад, мишачого, та складові частини, які були одержані з антитіла людського походження, з'єднані між собою, наприклад, хімічним шляхом за допомогою традиційних методів (наприклад, синтетичних) або одержані у вигляді безперервного поліпептиду методами генної інженерії. За варіантом, якому віддається перевага, "людське генно-інженерне антитіло" має CDR, які походять з або які одержують з вихідного антитіла, тобто нелюдського антитіла, за варіантом, 13 UA 103032 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 якому віддається перевага, мишачого Mab або його фрагмента, наприклад, мишачого Fab 4C11, у той час як каркасна та константна ділянка, тією мірою, у якій вона є присутньою (або значна чи суттєва її частина, тобто щонайменше приблизно 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 %), кодуються інформацією про нуклеїновокислотну послідовність, яка знаходиться на людській зародковій імуноглобуліновій ділянці (дивись, наприклад, International ImMunoGeneTics Database) або у її рекомбінованій або мутованій формах, незалежно від того, продукуються чи ні згадані антитіла у людській клітині. За варіантом, якому віддається перевага, щонайменше дві, три, чотири, п'ять або шість CDRs людського генно-інженерного антитіла оптимізуються з CDRs нелюдського вихідного антитіла, з якого одержали людське генно-інженерне антитіло, для одержання необхідної властивості, наприклад, поліпшеної специфічності, афінності або нейтралізації, яка може бути ідентифікована за допомогою відбіркового аналізу, наприклад, ELISA. За варіантом, якому віддається перевага, оптимізована CDR у антитілі за цим винаходом містить щонайменше одну заміну амінокислотного залишку, порівняно з CDR, присутньою у вихідному мишачому Fab 4C11, ЗА9 або 5Е8. Певні заміни амінокислотних залишків у CDRs людських генно-інженерних антитіл за цим винаходом, порівняно з CDRs вихідного мишачого Fab 4C11, ЗА9 або 5Е8, зменшують ймовірність нестабільності антитіла (наприклад, видалення одного або декількох Asn залишків CDR) або зменшують ймовірність імуногенності антитіла у разі введення людині (наприклад, як прогнозується технологією IMMUNOFILTER™ (компанія Xencor, Inc., Monrovia, штат Каліфорнія). Людські генно-інженерні антитіла за варіантом, якому віддається перевага, містять мінімальну послідовність, яку одержують із нелюдського антитіла. Людські генно-інженерні антитіла можуть містити залишки, які є відсутніми як у антитіла-реципієнта, так і у послідовностях CDR або каркасної ділянки, імпортованих з вихідного антитіла. Людські генноінженерні антитіла можна піддавати in vitro мутагенезу за методами повсякденного застосування у цій галузі і, тому, амінокислотні послідовності каркасних ділянок HCVR та LCVR людських генно-інженерних рекомбінантних антитіл є послідовностями, які, у разі одержання з цих споріднених із людськими зародковими послідовностями HCVR та LCVR, можуть не існувати за природних умов у межах людського зародкового репертуару антитіл in vivo. Передбачається, що такі амінокислотні послідовності каркасних ділянок HCVR та LCVR людських генно-інженерних рекомбінантних антитіл є на щонайменше приблизно 85 %, приблизно 90 %, приблизно 92 %, приблизно 94 %, приблизно 95 %, приблизно 96 %, приблизно 98 %, за варіантом, якому віддається більша перевага, щонайменше на приблизно 99 % або за варіантом, якому віддається найбільша перевага, 100 % ідентичними людській зародковій послідовності. У варіантах здійснення, яким віддається перевага, людське генно-інженерне антитіло за цим винаходом містить людські зародкові каркасні послідовності легкого ланцюга та людські зародкові каркасні послідовності важкого ланцюга (дивись, наприклад, WO 2005/005604). У цій галузі доступними є численні методи одержання людських генно-інженерних антитіл (дивись, наприклад, WO2006/06046935; Queen, et al., Proc. Natl. Acad. Set USA 88:2869 (1991); Jones et al., Nature, 321:522 (1986); Riechmann, et al., Nature, 332:323-327 (1988); та Verhoeyen, et al., Science, 239:1534 (1988)). Наприклад, людські генно-інженерні антитіла можна продукувати шляхом одержання нуклеїновокислотних послідовностей, які кодують HCVR та LCVR вихідного антитіла (наприклад, мишачого антитіла або антитіла, що продукується гібридомою), яке селективно зв'язує гепсидин-25, ідентифікування CDRs у згаданих HCVR та LCVR (нелюдських), і пересадження таких CDR-кодувальних нуклеїновокислотних послідовностей на вибрані людські нуклеїновокислотні послідовності, які кодують каркасні ділянки. Факультативно CDR може бути оптимізована шляхом довільного мутагенезу або мутагенезу у конкретних положеннях з метою заміни однієї або декількох амінокислот CDR іншою амінокислотою перед пересадження CDR на каркасну ділянку. Альтернативно CDR може бути оптимізована після введення до людської каркасної ділянки за допомогою методів, доступних фахівцю у цій галузі. Після пересадження CDR-кодувальних послідовностей на вибрані людські послідовності, які кодують каркасні ділянки, одержані послідовності ДНК, які кодують людські генно-інженерні послідовності варіабельних ділянок важкого ланцюга та варіабельних ділянок легкого ланцюга, експресують з одержанням людського генно-інженерного антитіла, яке зв'язує гепсидин-25. Людські генно-інженерні HCVR та LCVR можуть експресуватись як частина цілої молекули антитіла проти гепсидину-25, тобто як гібридний білок з людськими послідовностями константного домену. Однак послідовності HCVR та LCVR можуть також експресуватись за відсутності послідовностей константних ділянок з одержанням, наприклад, людського генно 14 UA 103032 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інженерного Fv або Fab проти гепсидину-25 (дивись, наприклад, WatkinsJ., et al., Anal. Biochem. 253:37-45 (1997) та Watkins J., et al., Anal. Biochem. 256:169-177, (1998)). Варіанти діагностичного застосування Антитіла за цим винаходом являють собою засіб точного виявлення або визначення кількості гепсидину-25 у тканині або біологічній рідині для оцінювання схильності до захворювань та станів, стимульованих гепсидином-25, та для виявлення і діагностування таких захворювань та станів у пацієнтів, які страждають на них. Наприклад, селективні антитіла проти гепсидину-25 за цим винаходом можуть бути введені до складу чутливих і надійних імунологічних аналізів, таких як ELISA, RIA (радіоімунологічний аналіз), імунодифузійних аналізів або імунодетекторних аналізів, таких як SPR. Подібним чином, селективні антитіла проти гепсидину-25 за цим винаходом є також прийнятними для імуногістохімічних (ІНС) та імунофлуоресцентних (IF) аналізів зразків тканин або біологічних рідин. Такі аналізи можуть застосовуватись для виявлення рівнів гепсидину-25, які відхиляються від норми, і, таким чином, діагностування захворювань та станів, які стимулюються гепсидином-25. Конкретніше, цей винахід пропонує способи діагностування у пацієнта захворювання або стану, пов'язаного з гепсидином-25, шляхом визначення рівня гепсидину-25 у зразку тканини або біологічної рідини від згаданого пацієнта та порівняння рівня гепсидину-25 у згаданому зразку з рівнем гепсидину25 у відповідному зразку від одного або декількох контрольних індивідуумів або з еталонним стандартом, з виявленням, тим самим, хворобливого стану, пов'язаного з рівнем гепсидину-25, який відхиляється від норми. Згаданий хворобливий стан може являти собою одне або декілька генетичних або негенетичних захворювань, пов'язаних зі зниженими рівнями заліза у сироватці, кількістю ретикулоцитів, кількістю еритроцитів, рівнями гемоглобіну та/або гематокриту. За варіантом, якому віддається перевага, згаданий хворобливий стан може являти собою одне або декілька генетичних або негенетичних захворювань, пов'язаних з анемією. Пропонується також спосіб моніторингу у пацієнта захворювання або стану, пов'язаного з гепсидином-25. Згаданий спосіб включає визначення рівня гепсидину-25 у зразку тканини або біологічної рідини від пацієнта, який страждає на або знаходиться під загрозою виникнення захворювання або стану, пов'язаного з гепсидином-25, у перший момент часу; визначення рівня гепсидину-25 у одному або декількох зразках тканини або біологічної рідини від згаданого пацієнта в один або декілька різних моментів часу; порівняння рівнів гепсидину-25, визначених у різні моменти часу, і, тим самим, здійснення моніторингу захворювання або стану, що стимулюється гепсидином-25. Селективні антитіла проти гепсидину-25 за цим винаходом є особливо прийнятними для застосування у високопродуктивних методах. До таких методів належать методи із застосуванням біочипів, завдяки чому багато зразків можуть випробуватись на мікропланшеті або предметному склі чи інших відомих у цій галузі засобах для розміщення досліджуваних культур. Присутність гепсидину-25 або його рівні у біологічному зразку можна встановити шляхом об'єднання згаданого біологічного зразка з, наприклад, антитілом за цим винаходом за умов, прийнятних для утворення комплексу антиген-антитіло. Згадане антитіло безпосередньо або, за варіантом, якому віддається більша перевага, опосередковано мітять виявною міткою для полегшення виявлення зв'язаного або незв'язаного антитіла. У цій галузі є добре відомими різноманітні методи виявлення утворення імунних комплексів, наприклад, ELISA, RIA, імуноблотинг (наприклад, дот-блотинг, слот-блотинг, вестерн-блотинг тощо), способи та методи непрямої флуоресценції, які полягають у виявленні змін фізичних параметрів, такі як, наприклад, SPR та подібні методи. До таких варіантів застосування належать методи, в яких використовують селективне антитіло проти гепсидину-25 за цим винаходом, кон'юговане з виявною міткою для виявлення гепсидину у біологічному зразку, наприклад, у людській біологічній рідині або у клітинному чи тканинному екстракті. Антитіла за цим винаходом можуть застосовуватись у таких аналізах з або без модифікації виявною міткою. У разі модифікування виявною міткою, антитіла за цим винаходом можуть бути модифіковані шляхом ковалентного або нековалентного приєднання виявної мітки. Термін "виявна", вжитий у цьому описі, визначає характерну ознаку речовини (кон'югату, сполуки або складової), яка дозволяє ідентифікувати або відслідковувати згадану речовину за допомогою детектора із застосуванням відомих аналітичних методів. До типових прикладів виявних міток належать (без обмеження) хромофори, флуоресцентні мітки, фосфоресцентні мітки, люмінесцентні мітки, радіоактивні мітки, різні ферменти (такі як лужна фосфатаза або пероксидаза хрону), магнітні мітки (наприклад, діамагнітні, парамагнітні та феромагнітні матеріали) і кластери, які містять атоми (іони) важких металів, а також будь-які інші відомі виявні мітки. Кількість стандартного утвореного комплексу антитіло-антиген можна визначати різними методами, відомими у цій 15 UA 103032 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 галузі, такими як, наприклад, фотометричні або колориметричні методи. За варіантом, якому віддається перевага, антитіла за цим винаходом застосовують без модифікації, тобто опосередковано міченими за методами, добре відомими у цій галузі. Цей винахід є прикладом здійснення способу виявлення білка гепсидину-25 у біологічному зразку, який включає інкубування антитіла за цим винаходом з біологічним зразком за умов та впродовж періоду часу, достатніх для надання можливості згаданому антитілу зв'язатись із білком, гепсидином-25, і виявлення згаданого зв'язування. За варіантом, якому віддається перевага, згаданим антитілом є 5Е8, ОН4 та/або ОВ3. Способом виявлення білка гепсидину-25 у біологічному зразку, якому віддається превага, є сендвіч-ELISA, що включає інкубування першого антитіла за цим винаходом з біологічним зразком за умов та впродовж періоду часу, достатніх для надання можливості згаданому антитілу зв'язатись із білком, гепсидином-25, видалення незв'язаного зразка, застосування другого антитіла, яке селективно зв'язує антигенну детермінанту, яка знаходиться у межах амінокислот 1-7 послідовності SEQ ID NO: 1, видалення незв'язаного другого антитіла і виявлення зв'язування згаданого другого антитіла. За варіантом, якому віддається перевага, згаданим першим антитілом є 3.23 або 3.12 і згаданим другим антитілом є ОН4 або ОВ3. Mab 3.23 проти гепсидину містить два поліпептиди легкого ланцюга і два поліпептиди важкого ланцюга, де кожен з поліпептидів легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 82, і кожен з поліпептидів важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 83, і зв'язує поліпептид, який має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 1. Mab 3.12 проти гепсидину містить два поліпептиди легкого ланцюга і два поліпептиди важкого ланцюга, де кожен із поліпептидів легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 84, і кожен з поліпептидів важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 85, і зв'язує поліпептид, який має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 1. Способом виявлення білка гепсидину-25 у біологічному зразку, якому віддається більша перевага, є сендвіч-ELISA, що включає інкубування першого антитіла, яке специфічно зв'язує антигенну детермінанту, яка знаходиться у межах амінокислот 5-25 гепсидину, з біологічним зразком за умов та впродовж періоду часу, достатніх для надання можливості згаданому антитілу зв'язатись з білком(-ами) гепсидину, видалення незв'язаного зразка, застосування другого антитіла, яке зв'язує антигенну детермінанту, яка знаходиться у межах амінокислот 1-7 гепсидину-25, видалення незв'язаного другого антитіла і виявлення присутності або відсутності зв'язування згаданого другого антитіла. За варіантом, якому віддається перевага, згаданим першим антитілом є 3.23 або 3.12 і згаданим другим антитілом є ОН4 або ОВ3. За варіантом, якому віддається більша перевага, друге антитіло є неміченим, і зв'язування виявляють опосередковано за методами, відомими у цій галузі. Цей винахід пропонує також композиції, способи та набори для скринінгу зразків, які, як гадають, містять гепсидин-25. Такому скринінгу можуть піддаватись зразки від пацієнтів або лабораторні зразки, які, як гадають, містять або продукують такий поліпептид. Набір може включати в себе селективне антитіло проти гепсидину-25 за цим винаходом. Згаданий набір може включати в себе відповідний буфер та реактиви для виявлення взаємодії між зразком та селективним антитілом проти гепсидину-25 за цим винаходом. Запропонований реактив може бути агентом, міченим радіоактивною міткою, флуоресцентною міткою або ферментативною міткою, здатним до зв'язування або взаємодії з антитілом за цим винаходом, таким як антимишаче IgG антитіло. Реактив згаданого набору може надаватись як рідкий розчин, прикріплений до твердої основи, або як сухий порошок. У разі, якщо реактив надається у вигляді рідкого розчину, за варіантом, якому віддається перевага, згаданим рідким розчином є водний розчин. За варіантом, якому віддається перевага, у разі, якщо реактив, що надається, є прикріпленим до твердої основи, згаданою твердою основою може бути хроматографічне середовище, планшет для випробування, який має певну кількість лунок, або предметне скло мікроскопа. У разі, якщо реактивом, що надається, є сухий порошок, згаданий порошок можна відновлювати шляхом додання прийнятного розчинника, який також може надаватись у складі набору. Набір за цим винаходом надається у контейнері, який, як правило, являє собою флакон, в який можуть бути вміщені антитіло, антиген або реактив для виявлення, за варіантом, якому віддається перевага, поділене(-ий) на відповідні аліквоти. Набори за цим винаходом будуть також, як правило, включати в себе засіб для розміщення контейнерів зі зразками антитіла, антигену і реактиву. Такими контейнерами можуть бути пластикові контейнери, у яких зберігаються необхідні ампули та один або декілька необхідних хімічних реактивів, таких як 16 UA 103032 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 хроматографічний матеріал, розчинники та елюенти, контрольні пробірки, детергенти, антитіла та хімічні реактиви для реакції виявлення. Варіанти терапевтичного застосування Захворювання або стани, які стимулюються гепсидином-25, можна попереджати або лікувати шляхом введення пацієнту, який цього потребує, фармацевтичної композиції, яка містить селективне антитіло проти гепсидину-25, друге антитіло, яке зв'язує антигенну детермінанту, яка знаходиться у межах амінокислот 1-7, включно, (1) людського гепсидину-25, тобто DTHFPIC (послідовність SEQ ID NO: 5), та/або (2) мишачого гепсидину-25, тобто DTNFPIC (послідовність SEQ ID NO: 86). Фармацевтична композиція, яка містить антитіло за цим винаходом, може застосовуватись для підвищення рівнів заліза у сироватці, кількості ретикулоцитів, кількості еритроцитів, рівнів гемоглобіну та/або гематокриту у людини, коли ефективну кількість вводять людині, яка потребує цього. Крім того, антитіло за цим винаходом може застосовуватись для лікування станів, захворювань або розладів, у разі яких присутність гепсидину-25 спричинює чи сприяє небажаним патологічним ефектам, або зниження рівнів гепсидину-25 чи біологічної активності гепсидину чинить терапевтично сприятливу дію на людей. Такі стани, захворювання або розлади охоплюють анемію, у тому числі (але без обмеження) анемію, яка є наслідком інфекції, запалення, хронічного захворювання та раку. Суб'єктами можуть бути чоловіки або жінки. За варіантом, якому віддається перевага, людина має або знаходиться під загрозою появи небажано низького рівня заліза у сироватці, низької кількості ретикулоцитів, кількості еритроцитів, рівнів гемоглобіну та/або гематокриту. За варіантом, якому віддається більша перевага, людина страждає на або знаходиться під загрозою виникнення анемії, у тому числі (але без обмеження) анемії, яка є наслідком інфекції, запалення, хронічного захворювання та/або раку. Крім того, антитіло за цим винаходом застосовується для виготовлення лікарського засобу для лікування або запобігання анемії, у тому числі (але без обмеження) анемії, яка є наслідком інфекції, запалення, хронічного захворювання та раку. Селективні антитіла проти гепсидину-25 за цим винаходом є прийнятними також для запобігання та лікування захворювань та станів, стимульованих гепсидином-25. Селективні моноклональні антитіла проти гепсидину-25 за цим винаходом можна вводити до складу фармацевтичних композицій для пасивної імунізації проти гепсидину-25. Функціональні фрагменти моноклональних антитіл за цим винаходом, такі як Fab-фрагменти, Р(аЬ')2фрагменти та будь-які фрагменти, які зберегли здатність до селективного зв'язування гепсидину-25, також можуть включатись до складу фармацевтичних композицій та застосовуватись у терапії. Крім того, селективні моноклональні антитіла проти гепсидину-25 за цим винаходом можуть застосовуватись у імунологічних аналізах для моніторингу розвитку захворювань та станів, які стимулюються гепсидином-25, для яких рівень або кількість гепсидину-25 є показником успішного лікування чи розвитку захворювання або стану. Більше того, моноклональні антитіла за цим винаходом є прийнятними для застосування у способах оцінювання лікування з блокуванням гепсидину-25 у пацієнта із захворюванням або станом, який стимулюється гепсидином-25. Такі способи включають стадії: a) одержання першого зразка біологічної рідини від пацієнта перед або на початкових етапах лікування; b) визначення рівня гепсидину-25 у першому зразку за допомогою імуноаналітичного методу; c) одержання другого зразка біологічної рідини від пацієнта через відповідний період часу, впродовж якого лікування могло б мати ефект; d) визначення кількості гепсидину-25 у другому зразку за допомогою імуноаналітичного методу; e) порівняння визначеної кількості гепсидину-25 у першому зразку з кількістю гепсидину-25 у другому зразку з визначенням ефективності лікування зі зв'язуванням або блокуванням гепсидину-25. Вищенаведений спосіб, який застосовується для оцінювання лікування зі зв'язуванням або блокуванням гепсидину-25 у пацієнта, є особливо цінним у клінічній практиці, де часовий розподіл прийняття рішень з продовженням однієї чи іншої програми лікування може мати критичні наслідки для пацієнта. Спосіб за цим винаходом надає інформацію, на якій грунтуються ці критичні рішення. Згаданий спосіб забезпечує визначення кількості гепсидину-25 перед або на початкових етапах лікування і забезпечує здійснення одного або декількох 17 UA 103032 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 визначень кількості гепсидину-25 впродовж одного або декількох періодів після започаткування лікування, зокрема, коли вважають, що лікування почало давати результат. Лікування з блокуванням гепсидину-25 може являти собою пасивне введення пацієнту селективного антитіла проти гепсидину-25. Селективним антитілом проти гепсидину-25 може бути химерне людське/нелюдське антитіло, гуманізоване або повністю людське моноклональне селективне антитіло проти гепсидину-25 чи будь-який фрагмент селективного антитіла проти гепсидину-25, який є функціональним щодо зв'язування гепсидину-25. У цій галузі є добре відомими різноманітні методи виявлення утворення імунних комплексів, наприклад, ELISA, RIA, імуноблотинг (наприклад, дот-блотинг, слот-блотниг, вестерн-блотинг тощо), способи та методи непрямої флуоресценції, які полягають у виявленні змін фізичних параметрів, такі як, наприклад, SPR та подібні методи. За одним широко застосовуваним методом утворення імунного комплексу виявляють завдяки застосуванню мітки, такої як радіоактивна мітка або ферментна мітка (така як лужна фосфатаза або пероксидаза хрону). Подальші переваги можна одержати завдяки застосуванню другого зв'язувального ліганду, такого як друге антитіло або молекула, зв'язана з авідином, для зв'язування біотинілованого ліганду, за методами, добре відомими у цій галузі. Терміни "лікування" та "лікувати", вжиті у цьому описі, означають введення речовини пацієнту, який має захворювання, стан або розлад, опис яких наведено у цій заявці, симптом такого захворювання, стану або розладу чи схильність до такого захворювання, стану або розладу, з метою одержання терапевтичного ефекту, наприклад, для лікування, полегшення, зміни, впливу, контролювання, припинення, поліпшення симптомів або запобігання захворюванню, стану або розладу, симптому захворювання, стану або розладу чи схильності до захворювання, стану або розладу. За варіантом, якому віддається перевага, пацієнт, що зазнає лікування, є ссавцем, і за варіантом, якому віддається більша перевага, людиною. Схеми приймання лікарського засобу можуть регулюватись для забезпечення оптимальної бажаної реакції (наприклад, терапевтичної реакції). Наприклад, може вводитись разова ударна доза, можуть вводитись декілька менших доз впродовж певного періоду часу або доза може бути пропорційно зменшена або збільшена, як того потребують вимоги терапевтичної ситуації. Фармацевтичні композиції Антитіло за цим винаходом може включатись до складу фармацевтичної композиції, прийнятної для введення людині. Антитіло за цим винаходом можна вводити людині самостійно або у комбінації з фармацевтично прийнятним носієм та/або розріджувачем однією або декількома дозами. Такі фармацевтичні композиції розробляють так, щоб вони були прийнятними для вибраного способу введення, і відповідним чином застосовують фармацевтично прийнятні розріджувачі, носій та/або допоміжні речовини, такі як диспергувальні агенти, буфери, поверхнево-активні речовини, консерванти, солюбілізатори, агенти для регулювання ізотонічності, стабілізатори тощо. Згадані композиції можуть розроблятись за традиційними методами, відомими у цій галузі. До прийнятних носіїв для фармацевтичних композицій належить будь-який матеріал, який, у разі комбінування з моноклональним антитілом за цим винаходом, зберігає активність молекули і не реагує з імунною системою суб'єкта. Фармацевтичну композицію, яка містить моноклональне антитіло проти гепсидину-25 за цим винаходом, можна вводити суб'єкту, який знаходиться під загрозою виникнення або демонструє такі патології, опис яких наведено у цій заявці, наприклад, анемічні розлади, із застосуванням стандартних методів введення. Словосполучення "ефективна кількість", вжите у цьому описі, означає кількість, необхідну (у дозах та впродовж періодів часу і для певних засобів введення) для досягнення бажаного терапевтичного результату. Ефективна кількість антитіла може змінюватись у залежності від таких факторів як хворобливий стан, вік, стать та маса індивідууму і здатність антитіла або частини антитіла спричинювати бажану реакцію у індивідуума. Ефективною кількістю також є кількість, у разі якої будь-який токсичний або шкідливий ефекти антитіла переважуються терапевтично сприятливими ефектами. Ефективною кількістю є принаймні мінімальна, однак менша за токсичну, кількість активного агента, необхідна для справляння терапевтично ефективної дії на суб'єкта. Інакше кажучи, ефективною кількістю або терапевтично ефективною кількістю антитіла за цим винаходом є кількість, яка у ссавців, за варіантом, якому віддається перевага, у людей (і) підвищує рівні заліза у сироватці, кількість ретикулоцитів, кількість еритроцитів, рівні гемоглобіну та/або гематокриту, або (іі) лікує стан, розлад чи захворювання, у разі якого присутність гепсидину-25 спричинює або сприяє небажаному патологічному ефекту, або (ііі) результатом зниження рівнів гепсидину-25 або біологічної активності гепсидину є сприятлива терапевтична дія на ссавця, за 18 UA 103032 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіантом, якому віддається перевага, на людину, яка страждає на анемію (але без обмеження), в тому числі (але без обмеження) анемії, спричиненої хронічними захворюваннями, в тому числі (але без обмеження) анемію, яка є наслідком інфекції, запалення, хронічного захворювання та/або раку. Ефективну кількість антитіла за цим винаходом можна вводити однією дозою або декількома дозами. Крім того, ефективну кількість антитіла за цим винаходом можна вводити декількома дозами у кількостях, які були б меншими за ефективну кількість, якби не вводились більше одного разу. Як добре відомо у галузі медицини, дози для будь-якого суб'єкта залежать від багатьох факторів, у тому числі частоти та шляху введення, загального стану здоров'я та інших лікарських засобів, які вводяться одночасно. Окрім того, доза може змінюватись у залежності від типу та тяжкості захворювання. Величина типової дози може становити, наприклад, від приблизно 0,1 мг до приблизно 100 мг; за варіантом, якому віддається перевага, від приблизно 1 мг до приблизно 100 мг; за варіантом, якому віддається більша перевага, від приблизно 5 мг до приблизно 50 мг; однак передбачаються дози, менші або більші за цей діапазон, зокрема, приймаючи до уваги вищезгадані фактори. Добова схема парентерального введення лікарського засобу може включати від приблизно 10 мкг/кг до приблизно 10 мг/кг загальної маси тіла, за варіантом, якому віддається перевага, від приблизно 100 мкг/кг до приблизно 10 мг/кг, за варіантом, якому віддається більша перевага, від приблизно 1 мг/кг до приблизно 10 мг/кг. Розвиток можна контролювати періодичним оцінюваням з відповідним регулюванням дози. Ці запропоновані кількості антитіла значною мірою залежать від терапевтичних міркувань. Ключовим фактором вибору відповідної дози та планування є одержаний результат. Факторами для розгляду у цьому контексті є конкретний розлад для лікування, клінічний стан конкретного пацієнта, причина розладу, місце доставки антитіла, конкретний тип антитіла, спосіб введення, планування та частота введення та інші фактори, відомі лікарям-практикам. Антитіло за цим винаходом можна вводити такими шляхами як пероральний, парентеральний, інгаляційний або місцевий. За варіантом, якому віддається перевага, антитіла за цим винаходом можуть бути включені до складу фармацевтичної композиції, прийнятної для парентерального введення. Термін "парентеральний", вжитий у цьому описі, включає внутрішньовенне, внутрішньом'язове, підшкірне, ректальне, вагінальне або внутрішньоочеревинне введення. Перевагу віддають парентеральній доставці шляхом внутрішньовенної, внутрішньоочеревинної або підшкірної ін'єкції. Найбільшу перевагу віддають підшкірній ін'єкції. Прийнятні носії для таких ін'єкцій є добре відомими у цій галузі. Фармацевтична композиція, як правило, повинна бути стерильною та стабільною за умов виготовлення та зберігання у наданому контейнері, у тому числі, наприклад, герметично закритій ампулі, шприці або іншому пристрої для доставки, наприклад, шприц-ін'єкторі. Таким чином, фармацевтичні композиції можна піддати стерилізуванню фільтруванням після одержання лікарської форми або перетворити на мікробіологічно прийнятні іншим чином. Наведені нижче приклади запропоновані лише з ілюстративною метою і не призначені для обмеження обсягу цього винаходу. Приклади Приклад 1: Одержання людського гепсидину-25 Людський гепсидин-25 можна одержати з комерційних джерел (наприклад, компанія Peptide International (Louisville, штат Кентуккі)) або продукувати за допомогою різноманітних методів синтезу або технологій рекомбінантних ДНК, відомих у цій галузі. Наприклад, гібридний білок, який містить двадцять п'ять амінокислот гепсидину-25 і має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 95, експресується у клітинах Е. соlі. Тільця включення виділяють з 3 літрів клітин Е. соlі, які експресують гібридний білок людського гепсидину-25 після 3-6 год. індукції 1 мМ розчином IPTG (ізопропіл--D-1-тіогалактопіранозид) при температурі 37 °C. Тільця включення солюбілізують у буфері А (50 мМ трис-буферу та 8 М сечовини (рН 8,0)). Супернатант пропускають через ІМАС (іммобілізована металоафінна хроматографія) колонку (20 мл смоли). Колонку промивають буфером А, доки оптична густина не повернеться до вихідного рівня, і зв'язані поліпептиди періодично елююють із колонки 0,5 М розчином імідазолу у буфері А. Гібридний білок людського гепсидину-25 змішують, і відновлюють за допомогою 50 мМ розчину DTT. Після цього цей гібридний білок повторно укладають шляхом розбавлення змішаного матеріалу у 2 М розчині сечовини, 3 мМ розчині цистеїну, 50 мМ розчині трис-буфера (рН 8,0) до кінцевої концентрації білка, меншої за 50 мкг/мл. Цей матеріал перемішують при кімнатній температурі, і окиснюють киснем повітря впродовж 48 год. Окиснені поліпептиди пропускають через ІМАС колонку (20 мл) зі швидкістю потоку 5 мл/хв, і гібридний білок людського гепсидину-25 періодично елююють із колонки 0,5 М розчином імідазолу у буфері А. Змішані фракції, які містять гібридний білок людського гепсидину-25, концентрують, і 19 UA 103032 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 пропускають через колонку для гель-хроматографування (наприклад, SUPERDEX® 75, GE Healthcare, XK26/60), зрівноважену 50 мМ розчином трис-буферу, 4 М розчином сечовини (рН 8,0), зі швидкістю потоку 3 мл/хв. Елюйований мономерний гібридний білок змішують, потім розбавляють у 50 мМ розчині трис-буфера, 2 М розчині сечовини, 5 мМ розчині СаСl2 (рН 8,0), після чого розщеплюють за допомогою ентерокінази з одержанням людського гепсидину-25 (послідовність SEQ ID NO: 1). Нерозщеплений гібридний білок людського гепсидину-25 видаляють шляхом пасивної іммобілізованої металоафінної хроматографії (як описано вище). Вихідний потік з ІМАС колонки після цього завантажують у хроматографічну колонку С-18 для хроматографування з оберненою фазою зі швидкістю потоку 4,0 мл/хв. Колонку промивають 0,1 % розчином TFA у воді до повернення показника оптичної густини до вихідного рівня, і зв'язані поліпептиди елююють із колонки лінійним градієнтом ACN від 20 % до 40 % з 0,1 % TFA зі швидкістю 0,5 %/хв. Фракції, які містять поліпептид людського гепсидину-25, змішують, і аналізують шляхом N-кінцевого амінокислотного секвенування та засобами мас-спектрометрії з іонізацією методом лазерної десорбції у матричному розчині із часопролітним аналізатором (MALDI-MS). Поліпептиди, які кодують пацючий гепсидин-25, мишачий гепсидин-25 та гепсидин-25 макаккрабоїдів і різні скорочені на N-кінці форми людського гепсидину-25, у тому числі гепсидин-22 та гепсидин-20, одержували по суті таким самим чином як описано для людського гепсидину-25. Приклад 2: Продукування антитіл проти N-кінцевого гепсидину-25 Мишей імунізують N-кінцевим пептидом гепсидину (амінокислоти 1-7 послідовності SEQ ID NO: 1), кон'югованим за допомогою пептидного лінкера, який складається з п'яти амінокислот (тобто GPGPG), з пептидною послідовністю OVA (овальбумін) (амінокислоти 323-336), тобто повномірним імуногеном DTHFPICGPGPGISQAVHAAHAEINE (послідовність SEO ID NO: 87). і + + селезінки цих мишей збирають на 27 день. В-клітини сортують (1 клітина/лунка) на Ag та IgG В-клітини пам'яті та клітини зародкового центру, і впродовж 2 тижнів сумісно культивують з клітинами лінії EL4B. Після цього одержані супернатанти, які містять IgG, розбавляють у 1,4 рази і піддають скринінгу шляхом проведення ELISA у трьох форматах: 1) 96-лункові планшети сенсибілізують розчином зв'язувального білка NEUTRAVTDIN™ (деглікозилована та ізоелектрично нейтральна форма авідину (компанія Pierce Biotechnology, Rockville, штат Іллінойс), 2 мкг/мл) у карбонатному буфері впродовж ночі. Сайти неспецифічного зв'язування блокують казеїном впродовж 1 год. Після цього планшет тричі промивають PBS з 0,05 % твін-20, і 100 нМ розчин біотинілованого гепсидину інкубують на планшеті впродовж 1 год. Планшет знову промивають як описано. Після цього супернатанти культури, які містять IgG, інкубують впродовж 1 год., і планшет промивають. Специфічне зв'язування антитіла проти гепсидину-25 виявляють за допомогою суміші (0,5 мкг/мл) козячого антимишачого IgG Fcy-лужної фосфатази. Активність лужної фосфатази визначають шляхом додання відповідної кількості субстрату РМР/АМР (розчин (6 мг/мл) фенолфталеїнмонофосфату (РМР) у 0,5 М розчині трис-буферу, рН 10,2, 2 % 2-аміно-2-метил-1-пропанолу (AMP), 0,1 % №N3), і визначають показник оптичної густини при 560 нм; 2) 96-лункові планшети сенсибілізують розчином (2 мкг/мл) козячого антимишачого каппа IgG у карбонатному буфері впродовж ночі. Потім сайти неспецифічного зв'язування блокують казеїном впродовж 1 год. Планшет тричі промивають PBS з 0,05 % твін20, і супернатанти культури, які містять IgG, інкубують впродовж 1 год. Після цього на планшеті впродовж 1 год. інкубують біотинілований гепсидин-25 (100 нМ), і планшет промивають як описано вище. Специфічне зв'язування гепсидину-25 з іммобілізованим антитілом після цього тм виявляють шляхом додання розчину (1 мкг/мл) NEUTRAVIDIN-AP™, кон'югату NEUTRAVIDIN лужної фосфатази (компанія Pierce Biotechnology, Rockford, штат Іллінойс), визначають активність лужної фосфатази шляхом додання субстрату РМР/АМР, і визначають оптичну густину при 560 нм; та 3) 96-лункові планшети сенсибілізують 100 нМ розчином гепсидину-25 у воді впродовж ночі при температурі 37 °C. Після цього сайти неспецифічного зв'язування блокують казеїном впродовж 1 год., і планшет тричі промивають PBS з 0,05 % твін-20. Після цього супернатанти культури, які містять IgG, інкубують впродовж 1 год., і планшет знову промивають як описано. Специфічне зв'язування антитіла проти N-кінцевого гепсидину-25 виявляють за допомогою суміші (0,5 мкг/мл) козячого антимишачого IgG Fcy-лужної фосфатази. Активність лужної фосфатази визначають за допомогою субстрату РМР/АМР, і показник оптичної густини визначають при 560 нм. Після цього за допомогою В-клітин, які експресують мишачі антитіла, специфічні для N-кінця гепсидину-25, наприклад, 3А9, 4С11 та 5Е8, ізолювали РНК, варіабельні ділянки ампліфікували за допомогою RT-PCR (полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскриптазою) з подальшим клонуванням у доступних мишачих IgGl векторах або важкому і легкому ланцюгу, 20 UA 103032 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відповідно. Із застосуванням SPR була підтверджена ідентичність тимчасово експресованих мишачих антитіл як специфічних антитіла проти N-кінцевого гепсидину-25. Приклад 3: Визначення афінного зв'язування Fabs та Mabs проти гепсидину за допомогою SPR Для визначення кінетики зв'язування та афінності антитіл, наприклад, антитіл, розкритих у цьому описі, можна застосовувати Біосенсор на основі поверхневого плазмонного резонансу, такий як ВІАсоге® Т100. Система ВІАсоrе® використовує оптичні властивості SPR для виявлення зміни концентрації білків молекул, які взаємодіють у межах декстранової біосенсорної матриці. За виключенням зазначеного, усі реактиви та матеріали закуповують від компанії ВІАсоге® АВ (Upsala, Швеція). Усі визначення здійснюють при температурі 25 °C. Зразки розчиняють у буфері HBS-EP (150 мМ розчин хлориду натрію, 3 мМ розчин EDTA, 0,05 % (у відношенні маси до об'єму) розчин поверхнево-активної речовини Р-20 та 10 мМ розчин ГЕПЕС-буфера, рН 7,4). Для захоплення Fabs з людським каппа-ланцюгом козячі антитіла проти людського каппа-ланцюга іммобілізують у протокових кюветах 1-4 сенсорного планшета СМ5 на рівні 5000-10000 реакційних одиниць (Ru) із застосуванням набору для зв'язування амінів. Для захоплення Mabs з мишачим IgGl, козячі антитіла проти мишачого Fc гамма-ланцюга іммобілізують у протокових кюветах 1-4 сенсорного планшета СМ5 на рівні 5000-10000 Ru із застосуванням набору для зв'язування амінів. Для захоплення антитіл з людським IgG4 білок А іммобілізують у протокових кюветах 1-4 сенсорного планшета СМ5 на рівні 400-700 Ru із застосуванням набору для зв'язування амінів. Fabs, одержані з периплазми клітин Е. coli, та Mabs, одержані з культури клітин ссавців, оцінюють із застосуванням численних аналітичних циклів. Кожен цикл складається з таких етапів: 0,3-2 хв введення Fab або Mab (~10 мкл/хв) з метою захоплення 200-1000 Ru, 2 хв введення (50 мкл/хв) різних концентрацій людського гепсидину-25 (від 600 нМ до 0,1 нМ), який одержали, як описано у наведеному вище Прикладі 1, з подальшими 2-Ю хв для дисоціації і відновлення із застосуванням 30 мкл 10 мМ розчину гліцину гідрохлориду, рН 1,5. Визначення здійснюють при температурі 25 °C, швидкість асоціації та дисоціації для кожного циклу визначають із застосуванням моделі зв'язування "1:1 з масопередачею" із застосуванням комп'ютерної програми BIAevaluation. Мишачі моноклональні антитіла 3А9, 4С11, 5Е8, ОВ3, ОН4, ОВ1 та ОЕ1 демонстрували зв'язування людського гепсидину-25 зі спорідненістю (КD) від приблизно 36 нМ до приблизно 1 нМ. Мишаче моноклональне антитіло ОН4 зв'язує людський гепсидин-25 з Кр приблизно 1,2 нМ, але виявно не зв'язується з людським гепсидином-20 або людським гепсидином-22. Мишаче моноклональне антитіло 5Е8 зв'язує людський гепсидин-25, але виявлювано не зв'язується з мишачим або пацючим гепсидином-25. Мишаче моноклональне антитіло 4С11 зв'язує людський, мишачий та пацючий гепсидин-25 і, набагато меншою мірою, людський гепсидин-22 (приблизно 209 нМ), але не людський гепсидин-20. Приклад 4: Визначення пар Mabs, що одночасно зв'язують людський гепсидин-25 Моноклональні антитіла, які одержали проти амінокислот 1-7, включно, людського гепсидину-25, які демонстрували високоафінне зв'язування з людським гепсидином-25 за результатами аналізу засобами SPR, перевіряли на їх здатність до одночасного зв'язування з людським гепсидином-25 з Mab 3.23. Стисло, на Віасоrе® Т100, козяче антимишаче IgGl Fc поліклональне антитіло іммобілізували у протокових кюветах 1-4 планшета СМ5 на рівні 5000-15000 реакційних одиниць (Ru). Mab 5E8 іммобілізували у протоковій кюветі 2, Маb 4С11 іммобілізували у протоковій кюветі 3 і Mab 3A9 іммобілізували у протоковій кюветі 4. Протокову кювету 1 застосовували як еталонну протокову кювету. Після цього у всі протокові кювети вносили людський гепсидин-25. Усі протокові кювети з іммобілізованими Mabs 5E8, 4С11 та 3А9 продемонстрували збільшення Ru, що вказує на зв'язування цих Mabs з людським гепсидином-25. Після цього у всі протокові кювети вводили Mab 3.23. Лише протокова кювета 2, з іммобілізованим Mab 5E8, продемонструвала одночасне зв'язування людського гепсидину-25 Mabs 5E8 та 3.23. Крім того, Mabs Hu22, 3.23, 3.12 та негативне контрольне людське IgG4 антитіло іммобілізували на окремих протокових кюветах сенсорного планшета СМ4 (компанія Віасоrе) на рівні 1000-4000 Ru. Після цього у згадані протокові кювети вводили людський гепсидин-25. Потім у згадані протокові кювети вводили Mab 5E8. Протокові кювети з іммобілізованими Mabs Hu22, 3.23, та 3.12 продемонстрували зв'язування людського гепсидину-25 з одночасним зв'язуванням Mab 5E8. У протоковій кюветі з іммобілізованим негативним контрольним людським IgG4 не спостерігалось зв'язування ні людського гепсидину-25, ні Mab 5E8. Окрім того, Mab 5E8 не зв'язувало людський гепсидин-25 одночасно ні з кролячими поліклональними сироватками проти KLH (гемоціанін лімфи равлика)-коньюгованих пептидів, які складались з амінокислот 1-7 людського та мишачого гепсидину-25 (компанія Alpha Diagnostic International, 21 UA 103032 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 San Antonio, штат Техас; номер за каталогом Нерс13-S), ні з очищеним препаратом IgG (компанія Alpha Diagnostic International; номер за каталогом Нерс13-А)). Приклад 5: Сендвіч-ELISA для визначення рівня людського гепсидину-25 Лунки багатолункового планшета сенсибілізують впродовж 1 год. при кімнатній температурі розчином Mab 3.23 з концентрацією 2 мг/л у карбонатно-бікарбонатному сенсибілізувальному буфері, рН 9,40 (компанія Pierce Biotechnology, Rockville, штат їллінойс). Після цього вміст лунок відсмоктують, і лунки тричі промивають TBST (забуференим TRIS фізіологічним розчином, який містить трис-буфер (10 ммоль/л), рН 7,4, NaCl (150 ммоль/л) та твін-20 (1 мл/л)). Після цього лунки впродовж 1 год. блокують TBS-казеїновим блокувальним буфером (150 мМ NaCl, 25 мМ трис-буферу, 1 % казеїну, рН 7,4, з протимікробним препаратом Kathon (компанія Pierce Biotechnology; номер за каталогом 37532). Після цього для одержання калібраційної кривої до ряду лунок додають 100 мкл стандартного розчину гепсидину-25 (різні концентрації синтезованого людського гепсидину-25 у аналітичному буфері, який містить 50 ммоль/л ГЕПЕСбуферу, рН 7,40, 150 ммоль/л NaCl, 10 мл/л неіоногенної поверхнево-активної речовини Triton® Х-100 (компанія Union Carbide Corp., Danbury, штат Коннектикут), 5 ммоль/л EDTA та 5 ммоль/л етиленглікотетраоцтової кислоти (EGTA)). У подальшому зразки сироватки розбавляють 1:20 у аналітичному буфері, додають у відповідні лунки, і планшет для проведення ELISA інкубують впродовж 1 год. при кімнатній температурі. Після відсмоктування вмісту лунки тричі промивають TBST, і у лунки додають 100 мкл розчину (1 мг/мл, розведення 1:1000) біотинілованого моноклонального антитіла 5Е8 проти гепсидину з подальшим 1 год. інкубуванням при кімнатній температурі. Після відсмоктування вмісту лунки тричі промивають TBST, і у лунки додають 100 мкл розчину полістрептавідину-HRP (пероксидаза хрону) (компанія Pierce Biotechnology, Rockville, штат Іллінойс) з подальшим 30 хв інкубуванням при кімнатній температурі. Після цього лунки тричі промивають TBST. Після останнього відсмоктування TBST у лунки додають 100 мкл розчину субстрату для проявлення, 3,3',5,5'-тетраметилбензидину (компанія Pierce Biotechnology, Rockville, штат Іллінойс), з подальшим 30 хв інкубуванням при кімнатній температурі. Реакцію припиняють доданням однакового об'єму 2N розчину фосфорної кислоти, і планшети зчитують при 450 нм. Концентрації гепсидину-25 у сироватці 40 нормальних індивідів та хворих на рак пацієнтів, які були визначені за допомогою сендвіч-ELISA, опис якого було наведено вище, становили від 5 мкг/л до 656 мкг/л і прямо корелювали з концентраціями гепсидину-25 у сироватці, які визначали за допомогою стандартного LC/MS аналізу (r=0,98, p