Вірус північноамериканського репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (prrs) та його застосування
Номер патенту: 108902
Опубліковано: 25.06.2015
Автори: Калверт Джей Ґреґорі, Велч Сайо-Кун Ван, Слейд Девід Івелл
Формула / Реферат
1. Виділена полінуклеотидна молекула, що містить послідовність ДНК, що кодує молекулу інфекційної РНК, яка кодує північноамериканський вірус PRRS, де вказана послідовність ДНК є SEQ ID NO:6.
2. Вакцина для захисту свиней проти зараження вірусом PRRS, що містить:
(а) генетично модифікований північноамериканський вірус PRRS, який кодується полінуклеотидною молекулою відповідно до п. 1;
(b) вказану інфекційну молекулу;
(c) вказану полінуклеотидну молекулу у вигляді плазміди або
(d) вірусний вектор, що містить вказану полінуклеотидну молекулу, де вірус PRRS є здатним викликати ефективну імунозахисну відповідь проти зараження вірусом PRRS з кількістю, що буде ефективною для отримання імунного захисту проти інфекції та прийнятний для ветеринарного застосування носій.
3. Полінуклеотидна молекула РНК, яка є комплементарною до будь-якої полінуклеотидної послідовності ДНК за п. 1.
Текст
Реферат: Винахід належить до виділеної полінуклеотидної молекули, що містить послідовність ДНК, що кодує молекулу інфекційної РНК, яка кодує модифікований північноамериканський вірус PRRS, а також вакцини для захисту свиней проти зараження вірусом PRRS, що містить генетично UA 108902 C2 (12) UA 108902 C2 модифікований північноамериканський вірус PRRS, який кодується заявленою полінуклеотидною молекулою, інфекційною молекулою, полінуклеотидною молекулою у вигляді плазміди або вірусного вектора, що містить вказану полінуклеотидну молекулу, де вірус PRRS є здатним викликати імунозахисну відповідь проти зараження вірусом. UA 108902 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Вірус північноамериканського репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (PRRS) та його застосування Заявлений винахід належить до ветеринарії та стосується інфекційних клонів кДНК РНКвірусів позитивної полярності, нових РНК - вірусів та їх модифікованих живих форм, а також отримання вакцин, зокрема, свинячих вакцин, з застосуванням цих клонів кДНК. Свинячий репродуктивний та респіраторний синдром (PRRS) характеризується наявністю викиденей, мертвонародженістю та іншими репродуктивними проблемами у свиноматок та молодих свиней, а також дихальними захворюваннями у молодих свиней. Збудником цього синдрому є вірус PRRS (PRRSV), член родини Arteriviridae та ряду Nidovirales. Нідовіруси є вірусами з оболонкою, які мають геноми, що складаються з одноланцюгової РНК позитивної полярності. Геномна РНК вірусу, що має ланцюг позитивної полярності виконує подвійну роль, яка полягає у експресії та зберіганні генетичної інформації. Реплікація та транскрипція у нідовірусів відбувається без участі ДНК. Неструктурні білки у них транслюються прямо з геномної РНК у вигляді великих полібілків, які потім розщеплюються вірусними протеазами на окремі функціональні білки. 3’-котермінальні структури субгеномних РНК (sg РНК) типу “ nested set “ синтезуються з геному та виконують функцію матричних РНК для трансляції структурних білків. Отже, відтворення нідовірусної геномної РНК є комбінованим процесом геномної реплікації та синтезу sg РНК. Два різних генотипи цього вірусу виникло майже одночасно на початку 1980’х років, один у Північній Америці та інший у Європі. Зараз вірус PRRS є поширеним у всіх країнах, де існує свинарство та вважається однією з найбільш економічно важливих хвороб, що впливає на світове свинарство у цілому. На додачу до цього, у Китаї та прилеглих країнах також були виділені генотипи з сильною вірулентністю, які головним чином мають відношення до північноамериканських генотипів. Незважаючи на значний прогрес у розумінні біології PRRSV, контролювати вірус залишається важко. Вакцинація тварин у польових умовах виявилася значною мірою неефективною. PRRS звичайно знову з'являється в імунізованих стадах та більшість кампаній по вакцинації проти PRRSV, що проводять на фермах, в кінцевому рахунку демонструють неспроможність контролювати цю хворобу. Не обмежуючись теоретичними даними, слід зауважити, що інфікування свиней PRRSV дикого типу або їх вакцинація з живою послабленою формою цього патогена, на жаль, тільки викликає потужне виробництво ненейтралізуючих антитіл. Протягом цього інтервалу у часі, наприклад, клітини організму секретують тільки обмежені кількості гамма - інтерферону (IFN-γ). Отже, здається, що PRRSV за своєю суттю стимулює виникнення незбалансованої імунної відповіді, що відрізняється наявністю стійкого та сильного гуморального (на основі антитіл) імунітету та мінливої, обмеженої, але потенційно захисної T -хелперної (Th) 1–відповіді, подібної до дії IFN-γ. Однією з характеристик інфекції PRRSV, що найбільш імовірно сприяє незбалансованому розвитку адаптивного імунітету, є відсутність адекватної вродженої імунної відповіді. Звичайно, інфіковані вірусом клітини виділяють інтерферон типу I “ IFN ” (в тому числі, IFN-α та IFN-β), що захищає від інфекції сусідські клітини. На додачу до цього, інтерферон типу I, що вивільнюється, взаємодіє з підгрупою непримірованих (“наївних“) T – клітин, сприяючи їх перетворенню на клітини, що виділяють вірус-специфічний інтерферон типу II (IFN-γ). На відміну від цього, IFN-α відповіді свиней на дію PRRSV практично не існує. Слід очікувати, що таке неефективне стимулювання патогеном виробництва IFN-α значно впливає на природу адаптивної імунної відповіді хазяїна, оскільки IFN-α активує експресію гена IFN-γ. Відповідно, вищезгаданий цитокін контролює домінантний шлях активування розвитку адаптивного імунітету, а саме опосередкованих T - клітинами IFN-γ відповідей та максимального антивірусного імунного захисту. У зв'язку з цим стає очевидним, що ймовірний зв'язок між вродженим та адаптивним імунітетом при вірусних інфекціях відбувається через спеціальний тип дендритних клітин, що мають можливість виробляти велику кількість інтерферону типу I та відіграють ключову роль у поляризації функції Т - клітин. Особливо, ключову роль у отриманні антивірусного імунітету відіграє досить рідкий та надзвичайний тип дендритних клітин, так звані плазмоцитоїдні дендритні клітини (PDC), що також відомі, як клітини, що виробляють природний IFN-α/β. Ця роль полягає у їх здатності викликати диференціацію непримірованих T - клітини у клітини, що виділяють IFN-γ. Хоча клітини PDC зустрічаються рідко, вони є надзвичайно потужними виробниками IFN-α, де кожна клітина здатна виробляти 3-10 пг IFN-α у відповідь на дію вірусу. На відміну від цього, моноцити виробляють у 5 – 10 разів менше IFN-α / клітину. Був також описаний фенотип та деякі біологічні властивості свинячих PDC (Summerfield et al., 2003, Immunology 110:440). Нещодавні дослідження визначили, що PRRSV не стимулює свинячі PDC до виділення IFN-α (Calzada et al., 2010, Veterinary immunology and immunopathology 135:20). 1 UA 108902 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Цей факт, у поєднанні зі спостереженням того, що екзогенно доданий IFN-α під час вакцинації, як було знайдено, покращує інтенсивність PRRSV- специфічної IFN-γ відповіді (W.A. Meier et al., Vet. immunol. immunopath. 102, pp 299-314, 2004), висвітлює вирішальну роль, яку відіграє IFN-α при зараженні свиней цим вірусом. З урахуванням очевидної важливої ролі IFN-α у розвитку захисного імунітету, важливим є визначення здатності різних матеріалів вірусу PRRS стимулювати та/або інгібувати продукування IFN-α. Відповідно, існує нагальна потреба у нових та покращених модифікованих живих вакцинах для захисту проти PRRS. Як було відмічено вище, стає ясним, що віруси, що походять від pCMV-S-P129-PK, нового інфекційного клону кДНК та від інших клонів, мають фенотип, що відрізняється від фенотипу вірусу P129 дикого типу або двох модифікованих живих вакцин PRRS, що зараз присутні на ринку. Не обмежуючись теорією, заявлений винахід передбачає отримання вакцин, що сприяють клітинно -опосередкованій імунній відповіді проти вірусу та характеризує нову та ефективну генерацію PRRS вакцин. У першому втіленні, заявлений винахід стосується виділеної полінуклеотидної молекули, яка містить послідовність ДНК, що кодує інфекційну молекулу РНК, що у свою чергу кодує вірус PRRS, генетично модифікований таким чином, щоб у вигляді вакцини він викликав у свиней ефективну захисну імунну відповідь проти вірусу PRRS. У певних аспектах, винахід стосується послідовності ДНК, як вказано тут, що містить SEQ ID NO:1, SEQ ID NO.:2, SEQ ID NO.:3, SEQ ID NO.:4 або SEQ ID: NO:6 або послідовності, що має до них принаймні 70 % тотожності, переважно 80 % тотожності та більш переважно 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % тотожності. У певних втіленнях, винахід передбачає плазміду, що містить, як зазначено тут, виділену полінуклеотидну молекулу та промотор, здатний до транскрипції полінуклеотидної молекули у прийнятній клітині-хазяїні. У іншому втіленні, північно-американський або китайський PRRS, що кодує послідовність цієї плазміди також додатково кодує один або декілька прийнятних для виявлення гетерологічних антигенних епітопа. Заявлений винахід також передбачає трансфіковану клітину-хазяїна, що містить вказані тут плазміди. У іншому аспекті, заявлений винахід передбачає вакцину для захисту свиней від зараження вірусом PRRS. Вакцина може містити північноамериканський або китайський вірус PRRS, що кодується інфекційною молекулою РНК або плазмідою, де кожна з яких кодується вказаною тут виділеною полінуклеотидною молекулою. У ще іншому аспекті, вакцина містить вірусний вектор з вказаним тут полінуклеотидом. Вказана тут вакцина може вибірково містити прийнятний для ветеринарного застосування носій. У одному важливому аспекті, вакцина має понижений інгібіторний ефект відносно α - інтерферону порівняно з вірусом PRRS дикого типу P129 (див. ATCC 203488, 203489, US Patent No. 6,500,662). У одному втіленні, заявлений винахід передбачає діагностичний набір, що містить полінуклеотидні молекули, за допомогою яких можна відрізнити (так званий DIVA тест) свиней, природно інфікованих диким штамом вірусу PRRS та свиней, вакцинованих вказаною тут модифікованою живою вакциною. У інших втіленнях, винахід передбачає спосіб захисту свиней від зараження штамом вірусу PRRS, що полягає у введенні тварині імуногенно захисної кількості вказаної тут вакцини. Подальші та бажані втілення винаходу стосуються виділеного вірусу репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (PRRS) або полінуклеотидної послідовності, що його кодує, де білок, що кодується ORF1 (відкритою рамкою зчитування 1a) є вибраним з групи, що охоплює білки, які містять будь-яку з наступних амінокислотних послідовностей, де підкреслені залишки, як вважається, є новоутвореними: AMANVYD (SEQ ID NO: 9); IGHNAVM (SEQ ID NO: 12); TVPDGNC (SEQ ID NO: 15); CWWYLFD (SEQ ID NO: 18); HGVHGKY (SEQ ID NO: 21); AAKVDQY (SEQ ID NO: 24); PSATDTS (SEQ ID NO: 27); LNSLLSK (SEQ ID NO: 30); APMCQDE (SEQ ID NO: 33); CAPTGMD (SEQ ID NO: 36); PKVAKVS (SEQ ID NO: 39); AGEIVGV (SEQ ID NO: 42); ADFNPEK (SEQ ID NO: 45); та QTPILGR (SEQ ID NO: 48). У додатковому бажаному втіленні винаходу, винахід стосується виділеного північноамериканського або китайського PRRS, що містить будь-яку з вищезазначених послідовностей у межах білка, що кодується ORF1a, в тому числі будь-які комбінації (2, 3, 4… - 17) цих виявлених послідовностей. Винахід додатково передбачає виділений вірус репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (PRRS), де його білок, що кодується ORF1a є вибраним з групи, що охоплює ті амінокислотні послідовності, що містять будь-що з наступного: ANV (див. SEQ ID NO: 9); HNA (див. SEQ ID NO: 12); PDG (див. SEQ ID NO: 15); WYL (див. SEQ ID NO: 18); VHG (див. SEQ ID NO: 21); KVD (див. SEQ ID NO: 24); ATD (див. SEQ ID NO: 27); SLL (див. SEQ ID NO: 30); MCQ (див. SEQ ID NO: 33); PTG (див. SEQ ID NO: 36); VAK (див. SEQ ID NO: 39); EIV (див. SEQ ID 2 UA 108902 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 NO: 42); FNP (див. SEQ ID NO: 45); та PIL (див. SEQ ID NO: 48), в тому числі будь-які комбінації (2, 3, 4… - 17) цих виявлених послідовностей. У додатковому бажаному втіленні, винахід стосується виділеного північноамериканського або китайського вірусу PRRS де, незалежно від ідентичності будь-яких інших певних положень нуклеотидної або амінокислотної послідовності у будь-якій точці полінуклеотиду, що кодує вірус або закодовані у ньому білки, ORF1 вірусного білка містить: (a) будь-яку з наступних певних амінокислот у певних послідовностях, амінокислоту N всередині амінокислотної послідовності ANV (див.SEQ ID NO: 9); амінокислоту N всередині амінокислотної послідовності HNA (див.SEQ ID NO: 12); амінокислоту D всередині амінокислотної послідовності PDG (див.SEQ ID NO: 15); амінокислоту Y всередині амінокислотної послідовності WYL (див.SEQ ID NO: 18); амінокислоту H всередині амінокислотної послідовності VHG (див.SEQ ID NO: 21); амінокислоту V всередині амінокислотної послідовності KVD (див.SEQ ID NO: 24); амінокислоту T всередині амінокислотної послідовності ATD (див.SEQ ID NO: 27); амінокислоту L всередині амінокислотної послідовності SLL (див.SEQ ID NO: 30). амінокислоту C всередині амінокислотної послідовності MCQ (див.SEQ ID NO: 33); амінокислоту T всередині амінокислотної послідовності PTG (див.SEQ ID NO: 36); амінокислоту A всередині амінокислотної послідовності VAK (див.SEQ ID NO: 39); амінокислоту I всередині амінокислотної послідовності EIV (див.SEQ ID NO: 42); амінокислоту N всередині амінокислотної послідовності FNP (див.SEQ ID NO: 45); та амінокислоту I всередині амінокислотної послідовності PIL (див.SEQ ID NO: 48), в тому числі будь-які комбінації (2, 3, 4… - 17) цих виявлених послідовностей або (b) містить вказані певні підкреслені одиничні амінокислоти у певних 3-залишкових пептидних послідовностях ORF1a будь-якого іншого північноамериканського або китайського вірусів PRRS, відповідних зазначеним вище 3-залишковим послідовностям, беручи до уваги те, що зазначені інші певні 3-залишкові амінокислотні послідовності можуть додатково мати одне або два додаткових змінення амінокислотної послідовності, але продовжують впізнаватися у якості відповідних зазначеним вище послідовностям. Для цілей цього втілення винаходу, під “ відповідністю ” мається на увазі те, що споріднені послідовності можуть бути оптимально вирівняні за допомогою алгоритму BLOSUM, як описано у Henikoff et al. Proc Natl. Acad. Sci., USA, 89, pp. 10915-10919, 1992. У додатковому бажаному втіленні винаходу, передбачено виділений вірус репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (PRRS), де його білок, що кодується ORF1a має амінокислотну послідовність, що містить один або декілька варіантів (a), (b), (c) та (d), де кожен вказаний варіант визначено наступним чином: варіант (a): амінокислота N всередині амінокислотної послідовності ANV (див.SEQ ID NO: 9); амінокислота N всередині амінокислотної послідовності HNA (див.SEQ ID NO: 12); амінокислота D всередині амінокислотної послідовності PDG (див.SEQ ID NO: 15), амінокислота Y всередині амінокислотної послідовності WYL (див.SEQ ID NO: 18); амінокислота H всередині амінокислотної послідовності VHG (див.SEQ ID NO: 21) або будьякий різновид варіанту (a); варіант (b): амінокислота V всередині амінокислотної послідовності KVD (див.SEQ ID NO: 24); амінокислота T всередині амінокислотної послідовності ATD (див.SEQ ID NO: 27); амінокислота L всередині амінокислотної послідовності SLL (див.SEQ ID NO: 30). амінокислота C всередині амінокислотної послідовності MCQ (див.SEQ ID NO: 33) або будьякий різновид варіанту (b); варіант (c): амінокислота T всередині амінокислотної послідовності PTG (див.SEQ ID NO: 36); амінокислота A всередині амінокислотної послідовності VAK (див.SEQ ID NO: 39) або будьякий різновид варіанту (c); та варіант (d): амінокислота I всередині амінокислотної послідовності EIV (див.SEQ ID NO: 42); амінокислота N всередині амінокислотної послідовності FNP (див.SEQ ID NO: 45); амінокислота I всередині амінокислотної послідовності PIL (див.SEQ ID NO: 20) або будьякий різновид варіанту (d). Подібні віруси PRRS можуть додатково містити дві або більше з п'яти амінокислотних послідовностей, ідентифікованих у варіанті (a) та/або дві або більше з чотирьох амінокислотних послідовностей, ідентифікованих у варіанті (b) та/або дві амінокислотні послідовності, 3 UA 108902 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ідентифіковані у варіанті (c) та/або та/або дві або більше з трьох амінокислотних послідовностей, ідентифікованих у варіанті (d). Заявлений винахід також передбачає плазміди, здатні до прямої трансфекції прийнятної клітини-хазяїна та до експресії вірусу репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (PRRS) у трансфікованих таким чином прийнятних клітинах-хазяях, де подібні плазміди містять: (a) послідовність ДНК, що кодує молекулу інфекційної РНК, яка кодує вірус PRRS та (b) промотор, здатний до забезпечення транскрипції вказаної молекули інфекційної РНК, де білок, що кодується ORF1a вказаного вірусу має амінокислоту послідовність, що містить: (1) амінокислоту N всередині амінокислотної послідовності ANV (див.SEQ ID NO: 9); амінокислоту N всередині амінокислотної послідовності HNA (див.SEQ ID NO: 12); амінокислоту D всередині амінокислотної послідовності PDG (див.SEQ ID NO: 15), амінокислоту Y всередині амінокислотної послідовності WYL (див.SEQ ID NO: 18); амінокислоту H всередині амінокислотної послідовності VHG (див.SEQ ID NO: 21) або будьякий її різновид; та/або (2) амінокислоту V всередині амінокислотної послідовності KVD (див.SEQ ID NO: 24); амінокислоту T всередині амінокислотної послідовності ATD (див.SEQ ID NO: 27); амінокислоту L всередині амінокислотної послідовності SLL (див.SEQ ID NO: 30). амінокислоту C всередині амінокислотної послідовності MCQ (див.SEQ ID NO: 33) або будьякий її різновид; та/або (3) амінокислоту T всередині амінокислотної послідовності PTG (див.SEQ ID NO: 36); амінокислоту A всередині амінокислотної послідовності VAK (див.SEQ ID NO: 39) або будьякий її різновид; та/або (4) амінокислоту I всередині амінокислотної послідовності EIV (див.SEQ ID NO: 42); амінокислоту N всередині амінокислотної послідовності FNP (див.SEQ ID NO: 45); амінокислоту I всередині амінокислотної послідовності PIL (див.SEQ ID NO: 48) або будьякий її різновид. Зрозуміло, що ORF1a кодує поліпротеїн, що має протеазну функцію та ORF1b кодує поліпротеїн, що має функції реплікази (РНК - полімерази) та гелікази. Додаткову інформацію відносно функцій білків, закодованих у різних ORF (відкритих рамках зчитування) PRRS можна отримати, наприклад, у U.S. Patent No. 7,132,106. Відносно функції ORF7 та інших відкритих рамок зчитування, див. також U.S. Patent No. 7,544,362. Тут слід брати до уваги те, що білки, закодовані у ORF1, як очікується, мають додаткові функції, відомі та невідомі та нові амінокислотні змінення, корисні для практичного втілення заявленого винаходу не обмежуються через їх дії на будь-яку одну певну функцію білків, закодованих у ORF1. У додатковому бажаному втіленні, вказані плазміди містять промотор, який є еукаріотичним промотором, здатним здійснювати запуск ДНК в цільових еукаріотичних клітинах або прокаріотичним чи фаговим промотором, здатним спрямовувати транскрипцію плазміди in vitro. Також винахід передбачає спосіб отримання вірусу PRRS, що полягає у трансфекції прийнятної клітини-хазяїна відповідною плазмідою та у отриманні вірусу PRRS з трансфікованих клітин. Відповідно, у певному бажаному втіленні, винахід стосується виділеної полінуклеотидної молекули, що містить послідовність ДНК, що кодує молекулу інфекційної РНК, яка кодує північноамериканський вірус PRRS, де вказана послідовність ДНК є вибраною з групи, що охоплює: (a) SEQ ID NO:6; (b) послідовність, що має принаймні 85 % тотожності до послідовності ДНК (a) де білок, що кодується її ORF1a має амінокислотну послідовність, яка містить: від групи (b) (1) амінокислоту N всередині амінокислотної послідовності ANV (див.SEQ ID NO: 9); амінокислоту N всередині амінокислотної послідовності HNA (див.SEQ ID NO: 12); амінокислоту D всередині амінокислотної послідовності PDG (див.SEQ ID NO: 15), амінокислоту Y всередині амінокислотної послідовності WYL (див.SEQ ID NO: 18); амінокислоту H всередині амінокислотної послідовності VHG (див.SEQ ID NO: 21), або будьякий її різновид; та/або від групи (b) (2) амінокислоту V всередині амінокислотної послідовності KVD (див.SEQ ID NO: 24); амінокислоту T всередині амінокислотної послідовності ATD (див.SEQ ID NO: 27); амінокислоту L всередині амінокислотної послідовності SLL (див.SEQ ID NO: 30). амінокислоту C всередині амінокислотної послідовності MCQ (див.SEQ ID NO: 33), або будьякий її різновид; та/або від групи (b)(3) 4 UA 108902 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 амінокислоту T всередині амінокислотної послідовності PTG (див.SEQ ID NO: 36); амінокислоту A всередині амінокислотної послідовності VAK (див.SEQ ID NO: 39), або будьякий її різновид; та/або від групи (b)(4) амінокислоту I всередині амінокислотної послідовності EIV (див.SEQ ID NO: 42); амінокислоту N всередині амінокислотної послідовності FNP (див.SEQ ID NO: 45); амінокислоту I всередині амінокислотної послідовності PIL (див.SEQ ID NO: 20), або будьякий її різновид; та (c) послідовність ДНК, що гібридизується з комплементарною частиною послідовності ДНК (a) або (b) у жорстких умовах, що полягають у гібридизації зв'язаної з фільтрами ДНК у 0.5 M NaHPO4, 7 % SDS, 1мM EDTA при 65 °C з промиванням у 0.1 SSC/0/1 %SDS при 68 °C. Винаходом також передбачені клітини-хазяї, трансфіковані полінуклеотидними молекулами та вакцини для захисту свиней проти зараження вірусом PRRS, до складу яких входять: (a) генетично модифікований північноамериканський вірус PRRS, що кодується подібними вищезгаданими полінуклеотидними молекулами або (b) вказана інфекційна молекула або (c) вказана полінуклеотидна молекула у вигляді плазміди або (d) вірусний вектор, що містить вказану полінуклеотидну молекулу, де вірус PRRS є здатним викликати ефективну імунозахисну відповідь проти інфекції вірусу PRRS з кількістю, ефективною для отримання імунного захисту проти інфекції та прийнятний для ветеринарного застосування носій. Винаходом також передбачені полінуклеотидні послідовності РНК, відповідні (тобто за рахунок присутності комплементарних основних кодуючих послідовностей): (a) послідовності ДНК SEQ ID NO:6; (b) послідовності ДНК, що має принаймні 85 % тотожності до послідовності ДНК (a) де білок, що кодується її ORF1a має амінокислотну послідовність, яка містить будь-що з наступного та будь-яку комбінацію будь-чого з наступного: амінокислоту N всередині амінокислотної послідовності ANV (див.SEQ ID NO: 9); амінокислоту N всередині амінокислотної послідовності HNA (див.SEQ ID NO: 12); амінокислоту D всередині амінокислотної послідовності PDG (див.SEQ ID NO: 15), амінокислоту Y всередині амінокислотної послідовності WYL (див.SEQ ID NO: 18); амінокислоту H всередині амінокислотної послідовності VHG (див.SEQ ID NO: 21), амінокислоту V всередині амінокислотної послідовності KVD (див.SEQ ID NO: 24); амінокислоту T всередині амінокислотної послідовності ATD (див.SEQ ID NO: 27); амінокислоту L всередині амінокислотної послідовності SLL (див.SEQ ID NO: 30). амінокислоту C всередині амінокислотної послідовності MCQ (див.SEQ ID NO: 33), амінокислоту T всередині амінокислотної послідовності PTG (див.SEQ ID NO: 36); амінокислоту A всередині амінокислотної послідовності VAK (див.SEQ ID NO: 39), амінокислоту I всередині амінокислотної послідовності EIV (див.SEQ ID NO: 42); амінокислоту N всередині амінокислотної послідовності FNP (див.SEQ ID NO: 45); та амінокислоту I всередині амінокислотної послідовності PIL (див.SEQ ID NO: 20) або (c) послідовність ДНК, що гібридизується з комплементарною частиною послідовності ДНК (a) або (b) у жорстких умовах, що полягають у гібридизації зв'язаної з фільтрами ДНК у 0.5 M NaHPO4, 7 % SDS, 1мM EDTA при 65 °C з промиванням у 0.1 SSC/0/1 %SDS при 68 °C. Відповідно, винахід також передбачає діагностичні набори, що містять полінуклеотидні молекули для розрізнення свиней, природно заражених польовим штамом вірусу PRRS від свиней, вакцинованих вакцинами винаходу, де вказані вакцини (віруси) переважно свідчать про понижений інгібіторний ефект відносно α-інтерферону порівняно з вірусом PRRS дикого типу P129 (SEQ ID NO:5). Стислий опис таблиць та фігур. Таблиця 1 демонструє інфекційні клони кДНК та відповідні віруси, що були отримані шляхом трансфекції клітин PK-9. Таблиця 2 демонструє інгібіторну дію відносно α-інтерферону вірусу PRRS дикого типу та його похідних, адаптованих до зростання у культурі клітин. Таблиця 3 показує інгібіторну дію відносно α-інтерферону вірусу PRRS P129 дикого типу та його отриманих генетично-інженерними способами похідних, адаптованих до зростання у клітинах PK-9, що експресують CD163. Таблиця 4 демонструє понижену інгібіторну дію відносно α-інтерферону вірусів P129-PK-FL та P129-PK-d43/44 порівняно з вірусом P129 дикого типу та вакцинами PRRS Ingelvac ®. Таблиця 5 наводить план досліджень, проведених для оцінки безпечності та ефективності вакцинних вірусів. 5 UA 108902 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Таблиця 6 демонструє всі нуклеотидні відмінності та отримані в результаті цього амінокислотні відмінності між вірусом P129 (0 пасаж) та P129-PK-FL (17 пасаж) відповідно до положення у геномі. Таблиця 7 наводить підсумкові нуклеотидні та амінокислотні відмінності між P129 (0 пасаж) та P129-PK-FL (17 пасаж) відповідно до вірусного білка. Таблиця 8 демонструє всі нуклеотидні відмінності та отримані в результаті цього амінокислотні відмінності між геномами PRRSV, знайденими у інфекційних клонах кДНК pCMVS-P129 та pCMV-S-P129-PK17-FL відповідно до положення у геномі. Таблиці 9 та 10 показує амінокислотні змінення, що сприяють фенотипу вірусу 52 пасажу (SEQ ID NO:6). У Фіг. 1 наведені ректальні температури після вакцинації. У Фіг. 2 наведені ректальні температури після інфікування вірулентним PRRSV NADC20. У Фіг. 3 наведена вага тіла тварин після вакцинації та після інфікування. У Фіг. 4 наведені дані, що стосуються відсотка легенів з ураженнями PRRS після інфікування. У Фіг. 5 наведені результати оцінки легенів після інфікування (LAS) відносно ступеня тяжкості спостережених уражень. Фіг. 6 є гістограмою, де зображені рівні анти-PRRSV антитіл у сироватці після вакцинації та після інфікування (співвідношення S/P для ІФА, де S- субстрат, Р-продукт реакції). Фіг. 7 є графічним зображенням вірусного навантаження у сироватці після інфікування (log ЦПД 50/мл у клітинах PAM, де ЦПД 50 – цитопатична доза 50 %). Фіг. 8 є малюнком, на якому зображені способи, застосовані для отримання вакцин, що містять, як наведено тут, SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:6. Стислий опис послідовностей. SEQ ID NO:1 стосується повного геному P129-PK-FL (17 пасаж). SEQ ID NO:2 стосується повного геному P129-PK-d43/44 (17 пасаж). SEQ ID NO:3 стосується повного геному P129-PK-FL (24 пасаж). SEQ ID NO:4 стосується повного геному P129-PK-d43/44 (34 пасаж). SEQ ID NO:5 стосується повного геному P129 (0 пасаж). SEQ ID NO:6 стосується повного геному P129 (52 пасаж). Як застосовано у цій заявці та у Формулі Винаходу, всі посилання на однину також охоплюють множину, якщо тільки в контексті чітко не вказано іншого. Так, наприклад, посилання на " спосіб " охоплює один або декілька способів та/або етапів описаного тут типу, що будуть зрозумілими фахівцям при читанні цієї заявки тощо. Якщо не визначено іншого, всі застосовані тут технічні та наукові терміни мають таке ж саме значення, яке звичайно є зрозумілим для будь-якого пересічного фахівця у галузі, до якої належить цей винахід. Хоча у практичному втіленні або для перевірки винаходу можуть бути застосовані будь-які подібні або еквівалентні описаним тут способи та матеріали, у цій заявці описані способи та матеріали, які є бажаними. У практичному втіленні заявленого винаходу, якщо навмисно не вказано іншого, застосовані звичайні у цій галузі способи вірусології, імунології, мікробіології, молекулярної біології та способи застосування рекомбінантних ДНК, багато з яких описано нижче з ілюстративною метою. Такі способи більш докладно описані у літературі, див., наприклад., Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); тварин Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984). Під "північноамериканським вірусом PRRS" мається на увазі будь-який вірус PRRS, що має генетичні характеристики, пов'язані з ізолятом північноамериканського вірусу PRRS, як-то, але без обмеження, з вірусом PRRS, якого вперше виділили у Сполучених Штатах приблизно на початку 1990'х років (див., наприклад, Collins, J. E., et al., 1992, J. Vet. Diagn. Invest. 4:117-126); з ізолятом MN-1b північноамериканського вірусу PRRS (Kwang, J. et al., 1994, J. Vet. Diagn. Invest. 6:293-296); штамом PRRS Quebec LAF-exp91 (Mardassi, H. et al., 1995, Arch. Virol. 140:14051418); та ізолятом VR 2385 північноамериканського вірусу PRRS (Meng, X.-J et al., 1994, J. Gen. Virol. 75:1795-1801). Штами північноамериканського вірусу PRRS мають спільні генетичні характеристики, що стосуються подібності геномної нуклеотидної послідовності та подібності амінокислотної послідовності. Штами китайського вірусу зазвичай свідчать про 80-93 % подібності нуклеотидної послідовності з північноамериканськими штамами. Під "європейськім вірусом PRRS" мається на увазі будь-який штам вірусу PRRS, що має генетичні характеристики, пов'язані з вірусом PRRS, якого вперше виділили у Європі приблизно 6 UA 108902 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 у 1991 році (див., наприклад, Wensvoort, G., et al., 1991, Vet. Q. 13:121-130). Європейській вірус PRRS також інколи називають вірусом Лелістада. Під "ефективною імунозахисною відповіддю", "імунозахистом" та подібними термінами для мети заявленого винаходу, мається на увазі імунна відповідь, спрямована проти одного або декількох антигенних епітопів патогена таким чином, щоб вона захищала вакциновану тварину проти зараження цим патогеном. Для цілей заявленого винаходу, захист проти патогенної інфекції стосується не тільки запобігання інфекції, але й також будь-якого прийнятного для виявлення зменшення рівня або швидкості інфекції, спричиненої патогеном або будь-якого прийнятного для виявлення зменшення ступеня тяжкості хвороби або будь-якого симптому або стану, спричиненого патогенною інфекцією у вакцинованій тварині порівняно з невакцинованою інфікованою твариною. Ефективна імунна відповідь може також бути викликана у тварин, що попередньо не були інфіковані патогеном та/або не є інфіковані патогеном під час вакцинації. Ефективна імунозахисна відповідь також може бути викликана у тварин, що вже були інфіковані патогеном під час вакцинації. Генетично модифікований вірус PRRS є "ослабленим", якщо він є менш вірулентним, ніж його немодифікований батьківський штам. Штам є " менш вірулентним ", якщо він демонструє статистично значуще зниження одного або декількох параметрів, що визначають тяжкість хвороби. Подібні параметри можуть охоплювати рівень віремії, лихоманку, тяжкість дихальної недостатності, тяжкість репродуктивних симптомів або кількість або тяжкість уражень легень тощо. Під клітиною-хазяїном, здатним до підтримання реплікації вірусу PRRS" мається на увазі клітина, яка після інфікування вірусом винаходу буде здатною генерувати інфекційний PRRS. Подібні клітини охоплюють свинячі клітини моноцитарних/ макрофагових ліній, як-то клітини альвеолярних макрофагів свиней та їх похідні, клітини нирок мавпи MA-104 та їх похідні, як-то MARC-145 та клітини, трансфіковані рецептором для вірусу PRRS. Також цей термін може охоплювати клітини, що знаходяться у живій тварині (свиня). Під терміном "відкрита рамка зчитування" або "ORF", як тут застосовано, мається на увазі мінімальна нуклеотидна послідовність, необхідна для кодування окремого білка вірусу PRRS без проміжного стоп-кодону. Під " свинею " у цій заявці мається на увазі будь-яка тварина, що відноситься до родини Suidae як-то, наприклад, свиня. Під " вірусом PRRS ", як тут застосовано, якщо не вказано іншого, мається на увазі будь-який штам або північноамериканського або європейського вірусу PRRS. "PRRS" також охоплює симптоми захворювання у свиней, спричинені інфекцією вірусу PRRS. Приклади таких симптомів охоплюють, але без обмеження, лихоманку, викидні у вагітних, дихальну недостатність, ураження легень, втрату апетиту та смертність у молодих свиней. Як тут застосовано, вірус PRRS, що є " нездатним виробляти PRRS " є вірусом, який може інфікувати свиню, але не тягне за собою появу будь-яких хворобливих симптомів, природно пов'язаних з інфекцією свиней вірусом PRRS. "N – білок" PRRSV або "ORF7", як тут застосовано, визначений, як поліпептид, що кодується ORF7 як європейського, так і північноамериканського генотипу вірусу PRRS. До відомих зараз прикладів специфічних ізотипів N- білка можна віднести поліпептид (123 амінокислоти) ізоляту прототипу північноамериканського PRRS VR2322, що має номер доступу PRU87392 у базі даних Genbank та N - білок (128 залишків) ізоляту Лелісад європейського прототипу PRRS, що має номер доступу A26843 у базі даних Genbank. "Ділянка NLS-1 білка PRRSV N" або "ділянка NLS-1 ORF7 PRRSV" має відношення до клітинного сигналу внутрішньоядерної локалізації (NLS) під назвою " pat4 " або " nuc1 " (Nakai & Kanehisa, 1992; Rowland & Yoo, 2003), що містить чотири послідовно розташовані основні амінокислоти (лізин або аргінін) або три основних залишки та гістидин або пролін, що розташовані всередині перших приблизно 15 N-термінальних залишків зрілого N - білка. Наприклад, послідовністю ділянки NLS-1 VR2332 є KRKK, яка розташована у залишках 9-12, у той час, як послідовністю ізоляту Лелістада є KKKK, що розташована у залишках 10-13 N білка. "Ділянка NLS-2 білка PRRSV N" або "ділянка NLS-2 ORF7 PRRSV" має відношення до другого клітинного сигналу внутрішньоядерної локалізації всередині N –білка, що може приймати одну з двох форм. У північноамериканських вірусів PRRS NLS-2 має матричну структуру, яку дослідники назвали характерною послідовністю " pat8 ", що починається з проліну, який знаходиться у межах трьох залишків п'ятизалишкової послідовності, що містить принаймні три основних залишки (K або R) з п'яти (легка модифікація характерної послідовності " pat7 " або " nuc2 " описана у Nakai & Kanehisa, 1992; Rowland & Yoo, 2003). Прикладом такої послідовності є послідовність P…K, розташована у залишку х 41-47 N – білка ізоляту VR2332 північноамериканського вірусу PRRSV. У європейських вірусів PRRS NLS-2 має характерну 7 UA 108902 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовність "pat4" або "nuc1", що являє собою безперервний відрізок з чотирьох основних амінокислот або трьох основних залишків, пов'язаних з гістидином або проліном (Nakai & Kanehisa, 1992; Rowland & Yoo, 2003). NLS-2 ізоляту Лелістада європейського вірусу PRRSV представлений послідовністю K…K та розташований у залишку х 47-50. "Ділянка NoLS N - білка PRRSV" або "ділянка NoLS ORF7 PRRSV" має відношення до клітинного сигналу внутрішньоядерної локалізації (NLS), що має загальну довжину у приблизно 32 амінокислоти та включає ділянку NLS-2 поруч з N – кінцем. Прикладом послідовності ділянки NoLS VR2332 є послідовність P…R, що розташована у залишках 41-72 (Rowland & Yoo, 2003) та, відповідно для ізоляту Лелістада, це є послідовність P…R, що розташована у залишках 4273. Під "трансфікованою клітиною-хазяїном" мається на увазі практично будь-яка клітина-хазяїн, що, як описано у U.S. Pat. No. 5,600,662, при трансфікуванні РНК вірусу PRRS здатна продукувати принаймні віріони PRRS першого етапу. Під “інфекційною молекулою ДНК” у заявленому винаході мається на увазі молекула ДНК, що кодує необхідні елементи для підтримки реплікації, транскрипції та трансляції у функціональний віріон від прийнятної клітини-хазяїна. Також, під “ виділеною полінуклеотидною молекулою ” розуміють композицію речовини, що містить полінуклеотидну молекулу заявленого винаходу, очищену зі свого природного стану, якщо такий є, до будь-якого прийнятного для визначення ступеню. Для мети заявленого винаходу, нуклеотидна послідовність другої полінуклеотидної молекули (або РНК або ДНК) є “ гомологічною ” нуклеотидній послідовності першої полінуклеотидної молекули або має “ тотожність" до вказаної першої полінуклеотидної молекули, коли нуклеотидна послідовність другої полінуклеотидної молекули кодує таку ж саме поліамінокислоту, як і нуклеотидна послідовність першої полінуклеотидної молекули, що базується на основі виродження генетичного коду або коли вона кодує поліамінокислоту, яка є істотно подібною до поліамінокислоти, що кодується нуклеотидною послідовністю першої полінуклеотидної молекули таким чином, щоб бути корисною у практичному втіленні заявленого винаходу. Гомологічні полінуклеотидні послідовності також мають відношення до сенсових та анти-сенсових полінуклеотидних ниток та до всіх додаткових випадків з будь-якою з цих ниток. Для мети заявленого винаходу, полінуклеотидна молекула є корисною у практичному втіленні винаходу, отже є гомологічною або має тотожність у тому разі, коли її можна застосувати у якості діагностичного зонду для визначення вірусу PRRS або вірусного полінуклеотиду у рідині або у зразку тканини інфікованої свині, наприклад, за допомогою способів стандартної гібридизації або ампліфікації. Взагалі, нуклеотидна послідовність другої полінуклеотидної молекули є гомологічною до нуклеотидної послідовності першої полінуклеотидної молекули, якщо існує принаймні приблизно 70 % тотожності нуклеотидної послідовності до нуклеотидної послідовності першої полінуклеотидної молекули на основі алгоритму BLASTN (National Center for Biotechnology Information, також відомий, як NCBI, (Bethesda, Maryland, USA) of United States National Institute of Health). У певному прикладі, для обчислень відповідно до практичного втілення заявленого винаходу, зроблено посилання на BLASTP 2.2.6 [Tatusova TA and TL Madden, "BLAST 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences.” (1999) FEMS Microbiol Lett. 174:247-250.]. Стисло кажучи, дві амінокислотні послідовності вирівнюють для оптимізування значень вирівнювання з застосуванням штрафу за внесення делеції до вирівнювання у 10, штрафу за продовження делеції у 0.1 та оціночної матриці “ blosum 62 ” від Henikoff та Henikoff (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:10915-10919. 1992). Потім відсоток тотожності обчислюють як загальну кількість ідентичних співпадінь x 100/ поділену на довжину більш довгої послідовності +число делецій, введених у більш довгу послідовність для вирівнювання двох послідовностей. Переважно, гомологічна нуклеотидна послідовність має принаймні приблизно 75 % тотожності нуклеотидної послідовності, навіть більш переважно принаймні приблизно 80 %, 85 %, 90 % 95 %, 96 %, 97 %, 98 % та 99 % тотожності нуклеотидної послідовності. Через виродженість генетичного коду, гомологічна нуклеотидна послідовність може містити будь-яку кількість “ мовчущих ” змінень основ, тобто нуклеотидних заміщень, що в результаті, тим не менш, приводять до кодування тієї ж самої амінокислоти. Гомологічна нуклеотидна послідовність може додатково містити “ не-мовчущі ” мутації, тобто заміщення, делеції або додавання основ, що ведуть до появи амінокислотних відмінностей у закодованій поліамінокислоті та доки послідовність зберігає принаймні приблизно 70 % тотожності до поліамінокислоти, що кодується першою нуклеотидною послідовністю або іншим чином, вона є корисною у практичному втіленні винаходу. У цьому відношенні, можуть бути зроблені певні консервативні амінокислотні заміщення, що, як правило, 8 UA 108902 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 не приводять до інактивації загальної функції білка: як-то по відношенню до позитивно заряджених амінокислот (та навпаки) лізину, аргініну та гістидину; по відношенню до негативно заряджених амінокислот (та навпаки), аспарагінової та глютамінової кислот; та по відношенню до певних груп нейтрально заряджених амінокислот (та також навпаки, у всіх випадках), (1) аланіну та серину, (2) аспарагіну, глютаміну та гістидину, (3) цистеїну та серину, (4) гліцину та проліну, (5) ізолейцину, лейцину та валіну, (6) метіоніну, лейцину та ізолейцину, (7) фенілаланіну, метіоніну, лейцину та тирозину, (8) серину та треоніну, (9) триптофану та тирозину, (10) наприклад, тирозину, триптофану та фенілаланіну. Амінокислоти можна класифікувати згідно з їх фізичними властивостями та участю у вторинній та третинній структурі білка. Під консервативними заміщеннями у цій галузі розуміють заміщення однієї амінокислоти іншою, що має подібні властивості. Зразкові консервативні заміщення можна знайти у WO 97/09433, стор.10, опублікована 13.03. 1997 (PCT/GB96/02197, подана 6. 09.1996). Альтернативно, консервативні амінокислоти можна розділити на групи, як описано у Lehninger, (Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp. 71-77). Додаткові прийнятні консервативні змінення та їх застосування описані нижче. Гомологічні нуклеотидні послідовності можна визначити шляхом порівняння нуклеотидних послідовностей, наприклад, за допомогою алгоритму BLASTN, див. вище. Альтернативно, гомологічні нуклеотидні послідовності можна визначити шляхом гібридизації у вибраних умовах. Наприклад, нуклеотидна послідовність другої полінуклеотидної молекули є гомологічною до SEQ ID NO:1 (або будь-якої іншої окремої полінуклеотидної послідовності), якщо вона гібридизується з комплементом SEQ ID NO:1 у помірно жорстких умовах, наприклад, гібридизація зв'язаної з фільтрами ДНК у 0.5 M NaHPO4, 7 % додецилсульфаті натрію (SDS), 1 мM EDTA при 65ºC з промиванням у 0.2xSSC/0.1 % SDS при 42ºC (див. Ausubel et al editors, Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, 1994, pp. 6.0.3 to 6.4.10) або в умовах, що іншим чином приведуть до гібридизації послідовності, що кодує вірус PRRS, як визначено вище. Модифікації умов гібридизації можна емпірично визначити або точно розрахувати, беручи за основу довжину зонда та відсоток пар основ типу гуанозин/цитозин (GC) у ньому. Умови гібридизації можна обчислити, як описано у книзі Sambrook, et al., (Eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989), pp. 9.47 to 9.51. У іншому втіленні, друга нуклеотидна послідовність є гомологічною до SEQ ID NO:1 (або до будьякої іншої послідовності винаходу), якщо вона гібридизується до комплементу SEQ ID NO:1 в умовах високої жорсткості, наприклад, гібридизація прикріпленої на фільтрах ДНК у 0.5 M NaHPO4, 7 % SDS, 1 мM EDTA при 65ºC з промиванням у 0.1xSSC/0.1 % SDS при 68ºC, як це відомо у цій галузі (Ausebel et al. Current Protocols у Molecular Biology, Greene Publishing та Wiley Interscience, New York, 1989.) Крім того, слід розуміти, що виділені полінуклеотидні молекули та молекули РНК заявленого винаходу охоплюють синтетичні молекули та молекули, отримані за допомогою рекомбінантних способів, як-то шляхом клонування та транскрипції in vitro. Полінуклеотидні молекули можна піддати генетичним мутаціям з застосуванням відомих фахівцям рекомбінантних способів, що полягають у застосуванні сайт-спрямованого мутагенезу або у застосуванні випадкового мутагенезу, як-то дії хімічних мутагенів або випромінювання, як відомо у цій галузі. Мутації можна здійснювати за допомогою відомих у цій галузі стандартних способів, наприклад, сайтспрямованого мутагенезу (див., наприклад, у Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) інфекційної копії, як описано у літературі (наприклад, у Meulenberg et al., Adv. Exp. Med. Biol., 1998, 440:199-206). Відповідно, предмет винаходу додатково передбачає спосіб отримання генетично модифікованого північноамериканського вірусу PRRS, що полягає у мутагенезі послідовності ДНК, що кодує молекулу інфекційної РНК, що у свою чергу кодує вірус PRRS, як описано вище та у отриманні експресії генетично модифікованого вірусу PRRS з застосуванням прийнятної системи експресії. Експресію генетично модифікованого вірусу PRRS можна отримати від виділеної полінуклеотидної молекули з застосуваннямзагальновідомих у цій галузі прийнятних систем експресії, приклади яких описані у цій заявці. Наприклад, виділена полінуклеотидна молекула може знаходитися у вигляді плазміди, здатної до експресії закодованого вірусу у прийнятній клітині-хазяїні in vitro, як це буде додатково та більш детально описано нижче. Послідовності N - білка північноамериканського вірусу PRRSV є високо консервативними та вказані послідовності мають приблизно 93-100 % тотожності між собою. N - білки північноамериканського та європейського вірусів PRRSV мають приблизно 57-59 % тотожності та спільні характерні структурні послідовності. Взагалі, визначення належного регіону при порівнянні кодуючих послідовностей PRRS та ізолятів, що можуть бути по-різному 9 UA 108902 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пронумеровані відносно певних нуклеотидів або закодованих амінокислот, легко досягається шляхом ідентифікації консервативних характеристичних амінокислот інтересуючого штаму PRRS та вирівнювання його з референсним штамом. Способи застосування рекомбінантної ДНК охоплюють надзвичайно різноманітні та потужні способи молекулярної біології, спрямовані на модифікацію нуклеїнових кислот на рівні ДНК та дають можливість аналізувати та змінювати геноми на молекулярному рівні. У цьому відношенні, віруси, як-то вірус PRRS, завдяки помірним розмірам свого геному є особливо сприятливими до подібних маніпуляцій. Однак, способи застосування рекомбінантної ДНК не є безпосередньо прийнятними до неретровірусних РНК - вірусів, оскільки ці віруси не мають проміжного етапу їх реплікації за участю ДНК. Для таких вірусів, перед застосуванням до їх геному технологій рекомбінантної ДНК з метою отримання зміненого вірусу, насамперед повинні бути розроблені інфекційні клони кДНК. Ці інфекційні клони можна отримати шляхом отримання повнорозмірної (розміром у довжину генома) кДНК (тут цей термін застосовано у широкому сенсі, де мається на увазі ДНК - копія РНК, не обмежуючись тільки ДНК - копією мРНК) досліджуваного вірусу, після чого інфекційний транскрипт синтезують in vivo у клітинах, трансфікованих повнорозмірною кДНК, але також ці інфекційні транскрипти можна отримати шляхом транскрипції in vitro від повнорозмірної кДНК у складі плазміди, що має у наявності разом з “ коктейлем ” для транскрипції також прокаріотичний промотор або ці інфекційні транскрипти можна отримати також in vitro з застосуванням лігованих фрагментів кДНК неповної довжини, що разом містять повний вірусний геном. У всіх випадках, транскрибована РНК несе всі модифікації, введені у кДНК та може бути застосована для подальшого пасивування модифікованого таким чином вірусу. Отримання інфекційного клону ізоляту європейського вірусу PRRS або вірусу Лелістада описано у U.S. Pat. No. 6,268,199, зміст якого повністю включений сюди шляхом посилання. Отримання інфекційного кДНК клону ізоляту P129 північноамериканського вірусу PRRS (Lee et al., 2005; Yoo et al., 2004) описано у U.S. Pat. No. 6,500,662, зміст якого повністю включений сюди шляхом посилання. Послідовність кДНК P129 описана у U.S. Pat. No. 6,500,662 та має номер доступу AF494042 у базі даних Genbank. Наведені нижче дослідження присвячені застосуванню такого інфекційного клону, що отримав назву pCMV-S-P129 (див. також, U.S. Pat. No. 6,500,662), який експресується за допомогою негайно-раннього промотора CMV у складі плазміди. Як описано у U.S. Pat. No. 6,500,662, також існують інші плазміди та промотори, прийнятні для застосування у цьому випадку. При обиранні повної послідовності з будь-якою інтересуючою відкритою рамкою зчитування та розташування інтересуючого амінокислотного залишку, пересічному фахівцю потрібно просто звернутися до таблиці кодонів для розробки змінень у певному бажаному положенні. Кодони утворюють триплетні послідовності нуклеотидів у мРНК та їх відповідних молекулах кДНК. Кодони у молекулах м РНК відрізняються наявністю урацилової основи (U) на відміну від тимідинової основи (T), що присутня у ДНК. Проста заміна кодону того ж самого амінокислотного залишку в межах полінуклеотиду не приведе до змінення послідовності або структури, що кодує поліпептид. Зрозуміло, що під твердженням того, що окремі три нуклеотидні послідовності " кодують " будь-яку окрему амінокислоту, пересічний досвідчений фахівець буде розуміти, що вищезгадана таблиця лише передбачає засіб ідентифікації певних інтересуючих нуклеотидів. Наприклад, якщо окрема послідовність з трьох нуклеотидів кодує лізин, то вищезгадана таблиця вказує, що двома можливими триплетними послідовностями будуть AAA та AAG. Гліцин, наприклад, кодується GGA, GGC, GGT (GGU у випадку РНК) та GGG. Для заміни лізину на гліциновий залишок у закодованому білку потрібно буде поміняти триплет AAA або AAG у нуклеїновій кислоті, що кодує цей білок на будь-який з триплетів GGA, GGC, GGT або GGG. Як зазначено вище, заявлений винахід спрямований на отримання вакцинних штамів PRRS, де, разом з іншими відповідями, не пригнічуються опосередковані шляхом виробництва інтерферону відповіді хазяїв на вірус. В цьому відношенні, як більш детально описано нижче, існують різні модифікації вірусного геному та їх комбінації, особливо, як наведено тут, знайдені у ORF1a. Слід зазначити, що подібні точки модифікації також можна знайти у додаткових відкритих рамках зчитування геному PRRS, що також описано тут (див. Таблиця 9). Також слід зазначити, що деякі інші попередні підходи до модифікації полінуклеотиду PRRS були успішними для ослаблення дії вірусу PRRS та можливого забезпечення прийнятності застосування вакцини, хоча точна причина цих отриманих результатів взагалі не зрозуміла. Наприклад, було винайдено послаблення вірулентного вірусу PRRS за рахунок мутації або делеції ділянки NLS-2, ділянки NoLS або ділянки NES нуклеокапсиду або N - білка (що кодується ORF7) вірусу, включаючи делецію у відкритій рамці зчитування 7 (ORF7). У іншому 10 UA 108902 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 аспекті, делеція ORF7 знаходиться всередині послідовності, що кодує сигнал ядерної локалізації (NLS) капсидного білка. Делеція ORF7 всередині послідовності, що кодує NLS може охоплювати делецію однієї або декількох амінокислот у положеннях 43-48 або делецію амінокислоти у будь-якому з положень 43 та 44 або у обох з них., див., наприклад, повний зміст патенту US Patent 7,544,362, включеного сюди шляхом посилання. Нуклеокапсидний білок (N) вірусу PRRSV, що кодується ORF7, є маленьким фосфорілованим основним білком (Wootton, Rowland, and Yoo, 2002) що утворює гомодимери (Wootton and Yoo, 2003), кристалічна структура якого нещодавно була визначена (Doan та Dokland, 2003). Вважається, що у інфікованій клітині N - білок має кілька функцій. На додачу до процесу утворення сферичної капсидної структури, у яку запаковується геномна РНК, який відбувається у цитоплазмі, частина N - білка транспортується до ядра, зокрема до ядерця інфікованої клітини. Амінокислотна послідовність N - білка містить два сигнали ядерної локалізації (NLS), сигнал ядерцевої локалізації (NoLS) та сигнал ядерного експорту (NES), що сприяє транспорту до ядра та до ядерця та, відповідно, експорту з ядра (Rowland et al., 1999; Rowland et al., 2003; Rowland та Yoo, 2003). Під час знаходження у ядерці, N - білок взаємодіє з маленьким ядерцевим РНК пов'язаним білком фібриларином та може регулювати процесинг рРНК та рибосомальний біогенез у інфікованій клітині для сприяння вірусній реплікації (Yoo et al., 2003). Вірусні мутації цього типу або окремо або у комбінації з іншими мутаціями, що пом'якшують дію вірусу, є також цінними для розробки нових PRRS вакцин. У іншому прикладі, застосовують ослаблений PRRS, модифікований по ORF1a. Також застосовують делецію послідовності ДНК, що кодує антигенний епітоп між амінокислотами 616-752 у гіперваріабельній ділянці неструктурного білка 2, що знаходиться у кодуючій ділянці ORF1a, див. U.S. Patent 7,618,797, зміст якого повністю включений сюди шляхом посилання. Імунобіологічні дослідження вірусу PRRS вказують на те, що взаємодія вірусу PRRS з PDC заслуговує обстеження. До цього клітинного типу належать 0.2 %-0.8 % мононуклеарних клітин периферичної крові у людей, мишей, щурів, свиней та мавп. Незважаючи на їх дефіцит, ці клітини є важливим компонентом вродженої імунної системи та здатні до секреції великих кількостей IFN-α після вірусного стимулювання. Саме через секрецію IFN-α ці PDC відіграють головну роль у регулюванні антивірусного природного та адаптивного імунітету, оскільки вони сприяють функції природних кілерних клітин, B - клітини та T - клітин. Крім того, за рахунок IFNα, який виділяють PDC також надається допомога дозріванню дендритних клітин на основі свинячих моноцитів (MoDC), що веде до посиленої здатності MoDC презентувати антиген та активувати T - клітини. На пізній стадії вірусної інфекції, PDC диференціюють в унікальний тип зрілих дендритних клітин, що безпосередньо регулюють функцію T - клітин та безпосереднє диференціювання Т - клітин у клітини, здатні секретувати IFN-, який є головним медіатором антивірусного імунітету проти вірусів, в тому числі, проти вірусу PRRS. Не дивним є те, що існують віруси людини, як-то дихальний синцитіальний вірус та вірус кору, які, як відомо, пригнічують здатність PDC секретувати IFN-α. Ця інгібіторна дія, як вважається, відіграє роль у переважанні гуморальної імунної відповіді та супутній імунопатології, яку спостерігали в результаті зараження цими вірусами, а також у підвищеній сприйнятливості хазяїна до вторинних бактеріальних та вірусних інфекцій. На відміну від цього, ізоляти дикого типу PRRSV, а також обидва штами вакцини PRRS Ingelvac (див. нижче, Приклади 5 та наступні) інгібують здатність очищених популяцій свинячих PDC виробляти IFN-α у той час, як нові вірусні стоки P129-PK-FL та P129-PK-d43/44 (див. нижче) демонструють мінімальну, майже нульову інгібіторну дію, спрямовану до цієї функції PDC. Значення цих спостережень полягає, зокрема, у важливості IFN-α у регулюванні розвитку адаптивної імунної відповіді на дію вірусу. Відповідно, дуже ймовірно, що вакцина з послабленим вірусом, що походить від вірусу, що мінімально пригнічує IFN-α буде спричинювати сильну антивірусну захисну імунну відповідь. Попередньо була продемонстрована ад'ювантна дія IFN-α на вірус - специфічну опосередковану Т-клітинами IFN відповідь, викликану PRRS вакциною MLV від Ingelvac та спричинена вакциною інтенсивність вірус - специфічної опосередкованої Т-клітинами IFN- відповіді позитивно корелювала з захисним імунітетом проти вірусу у польових та лабораторних умовах. Відповідно, хоча й не обмежуючись теоретичними даними, було б розумним очікувати, що клітинно - опосередкована імунна відповідь та рівень захисного імунітету, викликані вірусами PRRSV, які не інгібують IFN-α будуть значно вищими, ніж отримані від ізоляту PRRSV, що має фенотип дикого типу (з інгібуванням IFN-α). Відносно заявленого винаходу треба відзначити, що вірус P129-PK-FL, також як і всі п'ять мутантів з делецією, отриманих від інфекційного клону кДНК pCMV-S-P129-PK втрачають здатність інгібувати продукування IFN-α, тому поява цього незвичайного фенотипу не може бути 11 UA 108902 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 виключно спричинена делеціями, а має бути принаймні частково пов'язана з генетичними зміненнями, що були зафіксовані під час конструювання інфекційного клону. Цікаво, що неклонований вірус P129 після серії з 63 пасажів у клітинах PK-9 зберігає здатність інгібувати індукування інтерферону (Таблиця 1). Найбільш вірогідне пояснення загального IFN фенотипу, яке можна побачити у всіх інфекційних вірусів, отриманих від клону є включення однієї або декількох мутацій під час генерації інфекційного клону. Ці мутації могли існувати, можливо на низьких рівнях, у вірусній РНК, що була застосована для отримання інфекційного клону та, зрештою, вони могли існувати у оригінальному ((0 пасаж)) вірусі у свиней або ж вони могли бути отримані та збагачені протягом процесу адаптування вірусу до зростання у клітинах PK-9, що триває 16 пасажів. Не виключена також можливість того, що ці мутації є результатом помилок, викликаних ПЛР або вони виникли через клонування артефактів. У кожному разі, мутації (мутація), відповідальні за втрату ингибуючої IFN-a функції стали “ фіксованими ” під час будівництва інфекційного клону та можна було б очікувати їх присутність у всіх вірусів, отриманих з даного інфекційного клону. Також вірогідна можливість того, що мутації, відповідальні за фенотип зі зміненим інгібуванням IFN-α заздалегідь існували у вірусній РНК, яку застосували для отримання клону кДНК за умовах, що PRRSV, як відомо, легко створює генетичну різноманітність випадкового типу в результаті помилок вірусної РНК -залежної РНК полімерази. Псевдо-види вірусу охоплюють гетерогенну суміш тісно пов'язаних генетичних варіантів, що природно трапляються під час вірусної реплікації in vivo. Ще більш актуальним є спостереження вірусних псевдо-видів після численних пасажів in vitro вірусу PRRSV, отриманого від інфекційного клону кДНК. Це є дуже примітним, оскільки початкова популяція вірусних геномів у попередньо проведених дослідженнях була генетично гомогенною та відмінність послідовності виникла дуже швидко протягом пасивування у культурі клітин. У поточних дослідженнях, рівень геномної гетерогенності може бути вищим, оскільки оригінальний вірус P129 не був клонованим (біологічно або молекулярно) перед 16 пасажами у клітинах PK-9, що ведуть до отримання інфекційного клону. Таким чином, здається правдоподібним шанс вибору РНК-варіанту PRRSV, відповідального за втрату функції інгібування IFN-α серед вірусних псевдо-видів та включення його до інфекційного клону кДНК pCMV-S-P129-PK17-FL. За деяких обставин включення цих мутацій до інфекційного клону можна було б вважати випадковістю, враховуючи, що всі похідні віруси повинні мати цей характерний біологічний фенотип, що може виявитися важливим для розробки ефективних вакцин PRRS наступного покоління. Штам P129 вірусу PRRS дикого типу, подібно до інших штамів цього вірусу, проявляє сильну інгібіторну дію, спрямовану на здатність мононуклеарних клітин периферичної крові (PBMC) та плазмоцитоїдних дендритних клітин (PDC) виробляти альфа - інтерферон (IFN-α). З іншого боку, вірус, отриманий від інфекційного клону кДНК P129 (pCMV-S-P129-PK17-FL) проявляє значне зменшення IFN-α інгібіторного фенотипу. Цей інфекційний клон був отриманий від вірусу, попередньо адаптованого до зростання у клітинній лінії клітин свинячої нирки PK-9, що експресують CD163 протягом курсу з 16 серійних пасажів (див.US Patent 7,754,464,зміст якого повністю включений сюди шляхом посилання). IFN-α інгібіторний фенотип P129-PK-FL та P129PK-d43/44 коливається від низького до незначного та помітно відрізняється від подібного фенотипу будь-якого з двох модифікованих живих вірусних вакцинних штамів PRRS від Ingelvac, обидва з яких також мають сильні інгібіторні властивості. Ці результати вказують на те, що віруси P129-PK-FL та P129-PK-d43/44 є біологічно відмінними від батьківського ізоляту P129 з малою кількістю пасажів, а також від інших вірусів PRRS дикого типу та обох вакцинних штамів PRRS від Ingelvac. Зараз обговорюються потенційні наслідки зменшеного IFN-α інгібіторного фенотипу разом з можливими причинами фенотипичного змінення. Відповідно до практичного втілення заявленого винаходу, нові ізоляти PRRS, що належать до північноамериканського або китайського генотипів можуть бути ідентифіковані у польових умовах, оскільки вони містять певні амінокислоти у певних положеннях білків, що кодуються ORF1 та надають цим вірусам бажаний фенотип. Альтернативно, як було зазначено вище, для змінення генетичної послідовності (та, отже, амінокислотної послідовності) білка, закодованого ORF1, також з метою отримання модифікованих північноамериканського та китайського вірусів PRRS, інфекційних клонів та за їх допомогою вакцин, що будуть забезпечувати ці фенотипи, можуть бути застосовані стандартні генетичні процедури. У бажаних прикладах, фенотипи охоплюють, без обмеження, понижену інгібіторну дію відносно α-інтерферону порівняно з вірусом PRRS дикого типу та, вибірково, здатність до відтворення або до його збереження у тварині - хазяїні (свиня) під час включення міцної імунної відповіді, але зі збереженням маленької прийнятної для виявлення патології. 12 UA 108902 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Отже, у практичному втіленні винаходу, штами або ізоляти північноамериканського вірусу PRRS, що можуть бути застосовані у якості можливих відправних точок охоплюють наведені, наприклад у U.S. Patents 6,500,662; 7,618,797; 7,691,389, 7,132,106; 6,773, 908; 7,264,957; 5,695,766; 5,476,778; 5,846,805; 6,042,830; 6,982,160; 6,241,990; та 6,110,468. Відносно штамів та ізолятів китайського вірусу PRRS, див., наприклад, опубліковану китайську заявку CN200910091233.6 від китайської заявки CN201633909, що має відношення до вірусу TJM-92. У зв'язку з наступним обговоренням, для найбільш поширених амінокислот, що кодуються ДНК, тут застосовані міжнародно визнані одно та трьох-літерні позначення: аланін (Ala, A); аргінін (Arg, R); аспарагін (Asn, N); аспарагінова кислота (Asp, D); цистеїн (Cys, C); глютамінова кислота (Glu, E); глютамін (Gln, Q); гліцин (Gly, G); гістидин (His, H); ізолейцин (Ile, I); лейцин (Leu, L); лізин (Lys, K); метіонин (Met, M); фенілаланін (Phe, F); пролін (Pro, P); серин (ser, S); треонін (Thr, T); триптофан (Trp, W); тирозин (Tyr, Y) та валін (Val, V). У Таблицях 9-10 наведена ідентифікація спостережених амінокислотних змінень, що відповідають за ослаблення вірулентності північноамериканського (та китайського) вірусу PRRS, що корелюють зі зменшеним інгібуванням активності альфа - інтерферону, тим самим дозволяючи отримати безпечну та сильну імунну відповідь до вакцини. У Таблиці 10 наведена ідентифікація дуже бажаних у цьому відношенні амінокислотних модифікацій у ORF1a та показано, як ці мутації зростають завдяки пасивуванню P129 від інших культур (слід зазначити, що перевірка цієї історії також спрощує конструкцію стратегій мутагенезу до (пере) конструювання кодуючої ДНК, що має, у разі необхідності, одну з амінокислотних замін винаходу). У цьому відношенні, найбільш бажані амінокислотні покращення у ORF1a охоплюють (як про це свідчить 52 пасаж P129): аспарагін у 182 положенні, аспарагін у 189, тирозин у 273, гістидин у 302, треонін у 665, цистеїн у 943, треонін у 1429, аланін у 1505, аспарагін у 2410, що також потенційно додають численні можливості для глікозилування та можуть додатково змінювати функцію білка. Відповідно, винахід стосується виділеного вірусу репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (PRRS) де його білок, що кодується ORF1a є вибраним з групи, що охоплює ті амінокислотні послідовності, що містять будь-що з наступного: амінокислоту N всередині амінокислотної послідовності AMANVYD (SEQ ID NO: 9); амінокислоту N всередині амінокислотної послідовності IGHNAVM (SEQ ID NO: 12); амінокислоту D всередині амінокислотної послідовності TVPDGNC (SEQ ID NO: 15); амінокислоту Y всередині амінокислотної послідовності CWWYLFD (SEQ ID NO: 18); амінокислоту H всередині амінокислотної послідовності HGVHGKY (SEQ ID NO: 21); амінокислоту V всередині амінокислотної послідовності AAKVDQY (SEQ ID NO: 24); амінокислоту T всередині амінокислотної послідовності PSATDTS (SEQ ID NO: 27); амінокислоту L всередині амінокислотної послідовності LNSLLSK (SEQ ID NO: 30). амінокислоту C всередині амінокислотної послідовності APMCQDE (SEQ ID NO: 33); амінокислоту T всередині амінокислотної послідовності CAPTGMD (SEQ ID NO: 36); амінокислоту A всередині амінокислотної послідовності PKVAKVS (SEQ ID NO: 39); амінокислоту I всередині амінокислотної послідовності AGEIVGV (SEQ ID NO: 42); амінокислоту N всередині амінокислотної послідовності ADFNPEK (SEQ ID NO: 45); та амінокислоту I всередині амінокислотної послідовності QTPILGR (SEQ ID NO: 48). Більш конкретно, винахід стосується виділеного вірусу репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (PRRS), де його білок, що кодується ORF1a є вибраним з групи, що охоплює ті амінокислотні послідовності, які містять будь-що з наступного: амінокислоту N всередині амінокислотної послідовності ANV (див.SEQ ID NO: 9); амінокислоту N всередині амінокислотної послідовності HNA (див.SEQ ID NO: 12); амінокислоту D всередині амінокислотної послідовності PDG (див.SEQ ID NO: 15); амінокислоту Y всередині амінокислотної послідовності WYL (див.SEQ ID NO: 18); амінокислоту H всередині амінокислотної послідовності VHG (див.SEQ ID NO: 21); амінокислоту V всередині амінокислотної послідовності KVD (див.SEQ ID NO: 24); амінокислоту T всередині амінокислотної послідовності ATD (див.SEQ ID NO: 27); амінокислоту L всередині амінокислотної послідовності SLL (див.SEQ ID NO: 30). амінокислоту C всередині амінокислотної послідовності MCQ (див.SEQ ID NO: 33); амінокислоту T всередині амінокислотної послідовності PTG (див.SEQ ID NO: 36); амінокислоту A всередині амінокислотної послідовності VAK (див.SEQ ID NO: 39); амінокислоту I всередині амінокислотної послідовності EIV (див.SEQ ID NO: 42); амінокислоту N всередині амінокислотної послідовності FNP (див.SEQ ID NO: 45); та амінокислоту I всередині амінокислотної послідовності PIL (див.SEQ ID NO: 48). 13 UA 108902 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Як було зазначено вище, існують численні відомі штами та ізоляти північноамериканського та китайського PRRS та нові штами продовжують розвиватися або будуть виділені. Хоча між всіма цими штамами існує високий рівень тотожності амінокислотної послідовності, досвідчений фахівець буде в змозі швидко розпізнати наявність певного відхилення та, дійсно, ці відмінності та подібності можуть надати перевагу відносно додаткового покращення фенотипичних властивостей всіх вакцинних штамів. По-перше, стосовно всіх характерних амінокислотних послідовностей, визначених, як SEQ ID NOS, як безпосередньо зазначено (на стор. 27-28) вище, підкреслені та бажані амінокислоти (як надано від штаму P129, пасаж 52) як правило, залишаються повністю корисними, навіть якщо сусідні амінокислоти зі вказаних послідовностей SEQ ID NO є іншим чином зміненими. Отже, стосовно до послідовності AMANVYD (SEQ ID NO: 9), вибраної у якості певного характерного прикладу, є взагалі можливим перевірити відповідну експресовану ORF1 білкову послідовність від будь-як північноамериканського або китайського PRRS на присутність відповідної характерної амінокислотної послідовності, навіть якщо в результаті еволюції у інших подібних штамів трапилися додаткові змінення, що викликали заміщення та/або делеції або додавання. Як буде зрозуміло фахівцям, бажані амінокислотні заміщення свідчать про те, що вірус P129 (пасаж 52) буде також залишатися дієздатним, незважаючи на інші заміщення загальної амінокислотної послідовності, що безпосередньо відбуваються у 5" або 3" положеннях біля зазначеної амінокислоти 52 пасажу. Це буде дуже особливим, якщо порівняльні амінокислотні заміщення вважаються консервативними. Отже, відносно AMANVYD (SEQ ID NO: 9) та її суб-послідовності ANV необхідно мати легку можливість визначення відповідної характерної послідовності для порівняння у іншому штамі PRRS, якщо, наприклад, валін у ньому є заміщений ізолейцином або лейцином або будь-яким іншим залишком або якщо відповідний залишок просто втрачено або додано додатковий залишок. Існують численні комп'ютерні програми для визначення вирівнювань та таким чином визначення відповідності характерних поліпептидних послідовностей, наприклад, так звані таблиці BLOSUM (що створені на основі обраного рівня відсоткової тотожності), див. S. Henikoff et al. "Amino Acid Substitution matrices from protein blocks", Proc Natl Acad Sci, USA, 89(22), pp. 10915-10919, Nov 15, 1992., а th також див. A. L. Lehninger et al. Principles of Biochemistry, 2005, MacMillan and Company, 4 edition. Консервативні амінокислотні заміщення можна також легко визначити на основі категоризації на 5 загальних груп: сульфгідрильні (Cys); ароматичні (Phe, Tyr, та Trp); основні (Lys, Arg, His); аліфатичні (Val, Ileu, Leu, Met) та гідрофільні (Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser та Thr). Таким чином, практичне втілення винаходу стосується модифікації будь-якої кодуючої нуклеотидної послідовності північноамериканського або китайського вірусу PRRS для введення у відповідне та прийнятне положення будь-якого з амінокислотних заміщень, зазначених для вірусу P129 (52 пасажу), навіть якщо одна або декілька інших амінокислот, прилеглих до призначеного положення, буде доданою, видаленою або заміненою. Додатково, на подібних засадах, досвідченим фахівцям буде зрозуміло, що з певних заміщень 52 пасажу, визначених для ORF1a відповідно до практичного втілення заявленого винаходу, можна ідентифікувати тільки бажану амінокислоту. Потім також можна застосувати ці консервативні заміщення для будь-якої з амінокислот подібного пасажу 52 або у варіантах P129 або по відношенню до будь-якого іншого північноамериканського або китайського штамів, з суттєвим збереженням призначеного фенотипу пасажу 52. Отже, у якості характерних прикладів: відносно SLL (всередині послідовності SEQ ID NO: 30), відповідний лейциновий залишок може бути додатково заміщений на ізолейцин, валін або метіонін; відносно FNP (всередині послідовності SEQ ID NO: 45), відповідний аспарагін може бути заміщений на будьщо з Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Ser та Thr та відносно VAK (див.SEQ ID NO: 39), відповідний аланін може бути заміщений на будь-що з Asn, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Ser та Thr; хоча можна легко визначити, що обов'язковою вимогою даного винаходу не є умова, щоб будь-які подібні заміщення амінокислот працювати так само, як і першоначально ідентифіковані унікальні амінокислотні заміщення 52 пасажу в певних місцях. Звичайно, застосування стандартних консервативних амінокислотних заміщень у відповідності з будь-якою іншою визнаною моделлю також практикується у заявленому винаході. Наприклад та в тому числі навпаки, у всіх випадках, це є заміщення Asp на Glu та навпаки, Asn на Gln, Arg на Lys, Ser на Cys або Thr, Phe на Tyr, Val на Leu або Ileu, Ala на Gly тощо. На додачу, у практичному втіленні заявленого винаходу, хоча будь-яке з окремих амінокислотних заміщень пасажу 52 (як визначено вище для ORF1a) може бути корисно внесено до будь-якого північноамериканського або китайського вірусу PRRS з очікуваною фенотипичною дією, додатково бажаним є включення, якщо це можливо, у кінцеву конструкцію багатьох зазначених у Таблиці 9 або Таблиці 10 вибраних амінокислотних елементів, що, як 14 UA 108902 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 правило, передбачені відповідною модифікацією кодуючої полінуклеотидної послідовності. Отже, практичне втілення заявленого винаходу стосується надання китайському або північноамериканському вірусу PRRS (та відповідним кодуючим полінуклеотидам) 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 та до будь-якого числа з приблизно 17 визначених заміщень ORF1a 52 пасажу (Таблиця 9), всі з яких будуть розташовані всередині кінцевої вірусної послідовності, включаючи будь-які специфічні пари, триплети або інші вищі комбінації всіх загальним чином визначених амінокислотних заміщень пасажу 52. Подібні амінокислотні заміщення можуть, звичайно, бути введені у відповідні кодуючі нуклеотидні послідовності вірусу шляхом сайт-спрямованого мутагенезу, ПЛР та застосуванням інших способів, відомих у цій галузі. Для демонстрації того, що певний генетично модифікований штам є ослабленим може бути застосований експеримент, описаний нижче. До кожного випробування було включено принаймні 10 свинок на групу, де тварини були отримані з господарства без випадків зараження вірусом PRRSV. Перевірка тварин показала, що вони були вільні від вірус PRRS - специфічних сироваткових антитіл та PRRSV - негативними. Всі тварини, що приймали участь у дослідженнях були однієї породи та з одного джерела. Розподіл тварин на групи здійснили 5 випадковим чином. На 90 день вагітності, тваринам інтраназально ввели по 1 мл PRRSV з 10 ЦПД50 на ніздрю. Для кожної тестової системи було створено принаймні три групи, де одна тестова група була призначена для інфікування вірусом P129; одна тестова група призначена для інфікування вірусом, який, можливо, був ослабленим; та ще існувала одна група суворого контролю. Дослідження вважалися дійсними, коли тварини з групи суворого контролю залишилися PRRSV-негативними протягом всього часу досліджень та у групі, що була інфікована P129 у порівнянні з групою суворого контролю народилося принаймні на 25 % менше живих здорових поросят. Ослаблення дії вірусу, інакше кажучи, менша вірулентність, було визначено, як статистично значне змінення одного або декількох параметрів, що визначають репродуктивну функцію або іншу симптоматику, де значне зменшення принаймні одного з наступних параметрів для тестової групи (вірус, що можливо, є ослабленим) порівняно з групою, інфікованою немодифікованим батьківськім штамом може бути ознакою ослаблення дії вірусу: a) частота мертвонароджень b) викидні на 112 день вагітності або перед ним c) кількість муміфікованих поросят d) кількість менш живих та слабких поросят e) смертність до відлучення Крім того, було бажаним значне збільшення одного з наступних параметрів для тестової групі порівняно з групою, інфікованою немодифікованим батьківськім штамом: f) кількість відлучених поросят на свиноматку g) кількість народжених живих та здорових поросят на свиноматку. Альтернативним чином, дихальні та інші симптоми PRRSV інфекції також можна перевірити для визначення ослаблення. Ослаблений штам є цінним для отримання вакцин. Поточна вакцина вважається ефективною, якщо вона захищає свиню проти зараження вірусом PRRS. Вакцина захищає свиню проти зараження вірусом PRRS, якщо після її введення однієї або декільком здоровим свиням, наступне інфікування біологічно чистим вірусним ізолятом (наприклад, VR 2385, VR 2386, P129 тощо) веде до зменшення тяжкості будь-яких великих або гістопатологічних змінень (наприклад, уражень легенів) та/або симптомів захворювання, порівняно з подібними зміненнями або симптомами, звичайно спричиненими ізолятом у аналогічних незахищених свиней (тобто по відношенню до відповідного контролю). Більш специфічно, ефективність даної вакцини може бути підтверджена шляхом її введення до однієї або до кількох прийнятних свиней, що цього вимагають, з наступним, після відповідного періоду часу (наприклад, 4 тижня), (3-7) інфікуванням великою кількістю (10 TCID(50)) біологічно чистого ізоляту PRRSV. Потім (приблизно через один тиждень) відбирають зразки крові з інфікованих свиней та здійснюють спробу отримання вірусу з цих зразків. Отримання великої кількості вірусу є показником того, що вакцина може бути неефективною, у той час, як отримання зменшених кількостей вірусу (або взагалі, відсутність вірусу) свідчить про можливу ефективність вакцини. Отже, ефективність поточної вакцини можна оцінити кількісно (тобто, у вигляді зниження відсотка консолідованої легеневої тканини порівняно з відповідною контрольною групою) або якісно (наприклад, виділенням PRRSV з крові, виявленням антигену PRRSV у зразках тканини легенів, мигдалин або лімфовузлів шляхом імуноаналізу). Симптоми репродуктивної та дихальної хвороби свиней можна оцінити або кількісно (наприклад, температуру/лихоманку) або напівкількісно (наприклад, як присутність або відсутність одного або декількох симптомів або зменшення тяжкості одного або декількох симптомів, як-то ціанозу, пневмонії, уражень легенів тощо). Здоровою свинею вважається свиня, що або не була уражена інфекційним агентом свинячої репродуктивної та дихальної хвороби або що була уражена інфекційним агентом свинячої 15 UA 108902 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 репродуктивної та дихальної хвороби, але без проявлення симптомів захворювання. Ураженою свинею є така, що проявляє симптоми PRRS або з організму якої можна виділити PRRSV. Вакцини заявленого винаходу можуть бути отримані згідно з прийнятною конвенцією, що охоплює прийнятні для тварин, в тому числі для людини (якщо це необхідно) носії, як-то стандартні буфери, стабілізатори, розріджувачі, консерванти та / або солюбілізатори, можуть бути отримані для сприяння уповільненому вивільненню. Розріджувачі охоплюють воду, фізіологічний розчин, декстрозу, етанол, гліцерин тощо. Ізотонічні добавки охоплюють, серед іншого, хлорид натрію, декстрозу, маніт, сорбіт, лактозу. Стабілізатори охоплюють, серед іншого, альбумін. Фахівцям відомі або будуть для них очевидними інші відповідні вакцинні носії та домішки, в тому числі ті, що є особливо корисними для отримання модифікованих живих вакцин. Див., наприклад, Remington's Pharmaceutical Science, 18th ed., 1990, Mack Publishing, (включено у цю заявку шляхом посилання). Також, вакцина заявленого винаходу може містити один або декілька додаткових імуномодуляторних компонентів, наприклад, серед іншого, ад'ювант або цитокін. Необмежені приклади ад'ювантів, що можуть бути застосовані у вакцині заявленого винаходу охоплюють ад'ювантну систему RIBI (Ribi Inc., Hamilton, Mont.), галун, мінеральні гелі, як-то гель гідроксиду алюмінію, емульсії типу “ олія у воді ” та емульсії типу “ вода у олії ”, як-то, наприклад, повний та неповний ад'юванти Фрейнда, блок-кополімер (CytRx, Atlanta, Ga.), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), ад'ювант AMPHIGEN.RTM., сапонін, Quil A або іншу сапонінову фракцію, монофосфорил-ліпід A та ліпідо-амінний ад'ювант Авридин. Необмежені приклади корисних для вакцини заявленого винаходу емульсій типу “ олія у воді ” охоплюють модифіковані препарати SEAM62 та SEAM 1/2. Модифікований препарат SEAM62 є емульсією типу “ олія у воді ”, що містить 5 % (у обсяговому відношенні) сквалену (Sigma), 1 % (у обсяговому відношенні) детергенту SPAN.RTM. 85 (ICI Surfactants), 0.7 % (у обсяговому відношенні) детергенту TWEEN.RTM. 80 (ICI Surfactants), 2.5 % (у обсяговому відношенні) етанолу, 200 пг/мл Quil A, 100 [мгр]г/мл холестерину та 0.5 % (у обсяговому відношенні) лецитину. Модифікований SEAM 1/2 є емульсією типу “ олія у воді ”, що містить 5 % (у обсяговому відношенні) сквалену, 1 % (у обсяговому відношенні) детергенту SPAN.RTM. 85, 0.7 % (у обсяговому відношенні) детергенту Tween 80, 2.5 % (у обсяговому відношенні) eтанолу, 100.mu.г/мл Quil A та 50.mu.г/мл холестерину. Інші прийнятні для вакцини імуномодуляторні агенти охоплюють, наприклад, один або декілька інтерлейкінів, інтерферонів або інших відомих цитокінів. Вибірково, вакцина заявленого винаходу може бути отримана для уповільненого вивільнення вірусу, молекули інфекційної РНК, плазміди або вірусного вектора заявленого винаходу. Приклади подібних препаратів з уповільненим вивільненням охоплюють комбінації вірусу, молекули інфекційної РНК, плазміди або вірусного вектора з сумішами біосумісних полімерів, як-то, наприклад, полі (молочної кислоти), полі (сополімеру молочної та гліколевої кислоти), метилцелюлози, гіалуронової кислоти, колагену тощо. Питання вибору, структури та застосування здатних до розкладання полімерів у засобах доставки ліків розглянуті у декількох публікаціях, в тому числі, у A. Domb et al., 1992, Polymers for Advanced Technologies 3: 279-292, яка включена до цієї заявки шляхом посилання. Додаткове керівництво по відбору та застосуванню полімерів у фармацевтичних препаратах може бути знайдено у літературі, наприклад, у M. Chasin and R. Langer (eds), 1990, "Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems" in: Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol. 45, M. Dekker, N.Y., що також включено до цієї заявки шляхом посилання. Альтернативно або додатково, вірус, плазміди або вірусний вектор можуть бути мікроінкапсульовані для покращення введення та ефективності. Способи мікроінкапсулювання антигенів добре відомі у цій галузі та охоплюють способи, що описані, наприклад, у U.S. Pat. No. 3,137,631; U.S. Pat. No. 3,959,457; U.S. Pat. No. 4,205,060; U.S. Pat. No. 4,606,940; U.S. Pat. No. 4,744,933; U.S. Pat. No. 5,132,117; та у International Patent Publication WO 95/28227, де всі з яких включені сюди шляхом посилання. Також, для забезпечення уповільненого вивільнення вірусу, плазміди, або вірусного вектора можуть бути застосовані ліпосоми. Детальну інформацію щодо отримання та застосування ліпосомальних композицій можна знайти, серед іншого, у U.S. Pat. No. 4,016,100; U.S. Pat. No. 4,452,747; U.S. Pat. No. 4,921,706; U.S. Pat. No. 4,927,637; U.S. Pat. No. 4,944,948; U.S. Pat. No. 5,008,050; та U.S. Pat. No. 5,009,956, де всі з яких включені сюди шляхом посилання. Ефективна кількість будь-якої з описаних вище вакцин може бути визначена загальноприйнятним чином, починаючи з низької дози вірусу, плазміди з вірусним білком або вірусного вектора, з наступним підвищенням дози та одночасним моніторингом ефектів. Ефективну кількість можна отримати після одиничного або після багаторазового введення вакцини. При визначенні оптимальної дози для тварини також можуть бути взяті до уваги певні 16 UA 108902 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відомі фактори, що охоплюють вид, розміри, вік та загальний стан тварини, наявність в організмі тварини інших ліків тощо. Актуальне дозування звичайно обирають після розгляду результатів інших досліджень на тваринах (див., наприклад, Приклади 2 та 3, наведені нижче). Одним способом визначення можливості досягнення адекватної імунної відповіді є визначення сероконверсії та титру антитіл у тварин після вакцинації. Терміни вакцинації та кількість бустерів, якщо такі потрібні, переважно визначаються лікарем або ветеринаром на основі аналізу всіх відповідних факторів, деякі з яких описані вище. Ефективна кількість дози вірусу, білка, інфекційної молекули ДНК, плазміди або вірусного вектора заявленого винаходу може бути визначена за допомогою відомих способів, беручи за увагу фактори, що можуть бути визначені будь-яким пересічним фахівцем, як-то вага тварини, що підлягає вакцинації. Кількість дози вірусу заявленого винаходу у вакцині заявленого 1 9 винаходу переважно знаходиться у діапазоні приблизно 10 -10 БУО (бляшкоутворюючих 2 8 3 7 одиниць), більш переважно біля 10 -10 БУО та ще переважніше біля 10 -10 БУО. Кількість дози плазміди заявленого винаходу у вакцині заявленого винаходу переважно знаходиться у діапазоні приблизно 0.1 – 100 мг, більш переважно у діапазоні біля 1-10 мг, навіть більш переважно біля 10 – 1 мг. Кількість дози інфекційної молекули ДНК заявленого винаходу у вакцині заявленого винаходу переважно знаходиться у діапазоні приблизно 0.1-100 мг, більш переважно біля 1 – 10 мг, навіть більш переважно біля 10 – 1 мг. Кількість дози вірусного вектору заявленого винаходу у вакцині заявленого винаходу переважно знаходиться у діапазоні 1 9 2 8 приблизно 10 -10 БУО, більш переважно приблизно 10 -10 БУО та ще більш переважніше 3 7 приблизно 10 -10 БУО. Прийнятний розмір дози знаходиться у діапазоні приблизно 0.5-10 мл та більш переважно біля 1-5 мл. Прийнятні дози для вакцин на основі вірусного білка або пептиду відповідно до практичного втілення заявленого винаходу взагалі знаходяться у діапазоні від 1 до 50 мкг/дозу або більш великі кількості можуть бути визначені за допомогою стандартних способів разом з кількістю ад'юванта, що буде визначена відносно кожної такої речовини за допомогою загальноприйнятних методів. У бажаному прикладі винаходу, що стосується вакцинації свиней, оптимальний вік піддослідних тварин дорівнював приблизно 1-21 днів перед відлученням, що також збігався з іншими запланованими вакцинаціями, як-то вакцинаціями проти Mycoplasma hyopneumoniae або PCV. На додачу, бажана схема вакцинації для свиноматок буде містити подібні дози з річним графіком ревакцинації. Ефективна кількість дози вірусу, білка, інфекційної молекули ДНК, плазміди або вірусного вектора заявленого винаходу може бути визначена за допомогою відомих способів, беручи за увагу фактори, що можуть бути визначені будь-яким пересічним фахівцем, як-то вага тварини, що підлягає вакцинації. Наприклад, вакцини можуть бути введені тваринам перорально, парентерально, внутрішньом'язово, внутрішньошкірно, підшкірно, внутрішньом'язово, інтраназально або внутрішньовенно. Пероральна доставка може охоплювати, наприклад, додавання композицій у їжу або у напій для тварин. Фактори, що впливають на дозування вакцини охоплюють, вік та вагу свиней. Заявлений винахід додатково передбачає спосіб отримання вакцини, що містить описані тут вірус PRRS, молекулу інфекційної РНК, плазміду або вірусний вектор, який полягає у комбінуванні ефективної кількості одного вірусу PRRS, молекули інфекційної РНК, плазміди або вірусного вектора заявленого винаходу з прийнятним для фармацевтичного або ветеринарного застосування носієм. На додачу до цього, живу ослаблену вакцину заявленого винаходу можна модифікувати, як описано у U.S. Pat. No. 6,500,662, щоб вона кодувала гетерологічний антигенний епітоп, вбудований у геном вірусу PRRS за допомогою відомих рекомбінантних способів (див. також U.S. Patent 7,132,106, зміст якого повністю включений сюди шляхом посилання). Антигенні епітопи, що є корисними для заявленого винаходу у якості гетерологічних антигенних епітопів охоплюють антигенні епітопи іншого, ніж вірус PRRS свинячого патогену, що у свою чергу охоплюють, але без обмеження, антигенний епітоп свинячого патогену, вибраний з групи, до якої входять парвовирус свиней, цирковірус свиней, свинячий ротавірус, свинячий грип, вірус псевдосказу, вірусу інфекційного гастроентериту, свинячий респіраторний коронавірус, вірус класичної свинячої лихоманки, вірус африканської чуми свиней, вірус енцефаломіокардиту, свинячий параміксовірус, вірус гепатиту TTV, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis, Bacillus anthraci, Bordetella bronchiseptica, Clostridium haemolyticum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Haemophilus parasuis, Leptospira spp., Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynovia, Pasteurella multocida, Salmonella choleraesuis, Salmonella typhimurium, Streptococcus equismilis та Streptococcus suis. Нуклеотидні послідовності, що кодують антигенні епітопи вищевказаних 17 UA 108902 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 свинячих патогенів відомі у цій галузі та можуть бути отримані з загальнодоступних у Інтернеті баз даних генів, як-то база даних Національного центру біотехнологічної інформації Genbank (США). Додаткові особливості та варіанти даного винаходу будуть очевидні фахівцям в даній галузі з обсягу даного додатка, включаючи детальний опис та всі подібні особливості, призначені в якості аспектів винаходу. Також, описані тут особливості винаходу можуть бути перекомбіновані у додаткових втіленнях, що також є призначеними у якості аспектів винаходу незалежно від того, як ці комбінації особливостей певним чином згадуються вище, в якості аспекту або втілення винаходу. Також, в якості критичних обмежень для цього винаходу слід розглядати тільки описані тут обмеження та варіанти винаходу, позбавлені обмежень, що не вказані тут у якості критичних є також призначеними в якості аспектів винаходу. Повинно бути ясно, що винахід можна також здійснити іншим чином, ніж докладно описано у вищенаведеному описі та у Прикладах. Також, у світлі вищевикладених принципів можливі численні модифікації та варіанти даного винаходу та, отже, знаходяться в межах обсягу даного винаходу. Наступні Приклади призначені для ілюстрації та не обмежують винахід. Приклад 1. Адаптація ізоляту P129 PRRSV до клітин PK-9 та його ослаблення. Вірулентний ізолят P129 вірусу PRRS виділили з хворої свині у штаті Індіана у 1995 році у лабораторії діагностики хвороб тварин Університету Пердью. Зразок сироватки цієї свині був підданий одному пасажу у свині з добрим станом здоров'я для збільшення виходу сироватки та стоків легеневого гомогенату. Потім, з отриманої сироватки та стоків легеневого гомогенату була виділена вірусна РНК, яку застосували для визначення консенсусної послідовності повного геному вірусу P129 (0 пасаж). Спочатку РНК примували випадковими гексамерами та застосували її для синтезу кДНК. Геном ампліфікували у вигляді трьох перекриваючихся частин з застосуванням високоточної ПЛР з коректуючою екзонуклеазною активністю. Потім продукти трьох окремих реакцій ПЛР (на сегмент геному) були піддані T/A клонуванню та застосовані для секвенування ДНК з отриманням повнорозмірної консенсусної послідовності геному (див.SEQ ID NO:1). Аліквоту саме такої свинячої сироватки, застосованої для секвенування ДНК, що містила P129 (0 пасаж) потім застосували для інфікування клітин первинних альвеолярних макрофагів (PAM) свиней. Вірус нащадків від PAM інфекції (пасаж 1) відфільтрували крізь 0.1 мкм шприцевий фільтр та застосували для інфікування клітин PK-9. Клітини PK-9 є трансгенною клітинною лінією, отриманою шляхом стійкої трансфекції лінії клітин свинячої нирки PK0809 плазмідою, що кодує версію свинячого гена CD163 з делецією та ген стійкості до неоміцину. Подробиці отримання та характеристики клітинної лінії ПК-9 були описані раніше. Адаптація першого пасажу вірусу, отриманого з PAM клітини до зростання у клітинах PK-9 була важкою та вимагала окремих спроб з кількома паралельними лініями. Моніторинг інфекції проводили шляхом імунофлуоресценції подвійних лунок з застосуванням FITC- кон'югованих моноклональних антитіл SDOW17, специфічних до вірусного нуклеокапсидного білка (Rural Technologies Inc, Brookings South Dakota). Ранні пасажі призвели до появи кількох невеликих вогнищ, але без отримання достатньої кількості вільних від клітин частинок вірусу для ініціювання інфекції свіжого моношару. Ці пасажі здійснювали шляхом обробки інфікованого моношару акутазою (замінником трипсину) та пересіванням клітин у декілька лунок зі свіжим середовищем з або без додавання клітин, не інфікованих PK-9. Після декількох подібних пасажів, деякі лінії показали явне збільшення кількості та розмірів флуоресцентних вогнищ. Деякі з них мали набуту здатність до пасивування з застосуванням рідини, що містила вільний від клітин вірус. Після 17 пасажу (1 пасаж у клітинах PAM та 16 у клітинах PK-9), до однієї лінії, що могла надійно вважатися стійкою були застосовані розведення вільних від клітин зразків рідини від попередніх пасажів, що привело до інфікування всього моношару протягом декількох днів. Вірус також не спричинив жодної цитопатичної дії у клітинах PK-9 на будь-якому рівні пасажу. Потім з клітин, інфікованих PK-9 (17 пасаж) екстрагували РНК, яку далі застосували для отримання інфекційного клону кДНК. Приклад 2. Отримання інфекційного клону кДНК P129-PK (17 пасаж). Інфекційний клон кДНК P129-PK (17 пасаж вірусу) був отриманий на основі плазміди, як описано раніше. Геном вірусу ампліфікували за допомогою зворотної транскрипції та ПЛР у трьох перекриваючихся сегментах з природними унікальними сайтами ендонуклеазної рестрикції у ділянках перекриття. Продукти трьох окремих реакцій ПЛР клонували, секвенували 18 UA 108902 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 та піддали вирівнюванню для отримання консенсусної послідовності для кожного сегмента геному. Якщо жоден з трьох клонованих продуктів даного сегмента не відповідав передбаченій консенсусній амінокислотній послідовності для цього сегмента, тоді один з клонів модифікували шляхом субклонування та / або сайт-спрямованого мутагенезу, доки він не починав відповідати консенсусній амінокислотній послідовності. Потім три геномних сегменти та каркасну плазміду з'єднали з застосуванням стандартних способів клонування та сайтів ендонуклеазної рестрикції з отриманням повнорозмірного клону, що отримав назву pCMV-S-P129-PK17-FL, який зберігав інфекційні властивості при трансфікуванні у клітинах PK-9. Послідовність цього інфекційного клону кДНК наведена у SEQ ID NO:2. Цей геном був істотно ідентичним вірусному геному (17 пасаж), від якого він був побудований, з аутентичним сайтом термінації транскрипції та був позбавлений будь-яких вставок або делецій відносно консенсусної послідовності 17 пасажу. Всередині вірусного геному цього інфекційного клону кДНК були відсутні штучно створені сайти рестрикції або інші цільові заміщення. Нуклеотидні та амінокислотні відмінності між консенсусними послідовностями повного геному P129 (0 пасаж) та геномною послідовністю інфекційного клону pCMV-S-P129-PK17-FL перелічені окремо у Таблиці 6. Таблиця 6 охоплює всі нуклеотидні відмінності та отримані амінокислотні відмінності відповідно положенню у геномі. Підклас цих мутацій несе відповідальність за зміну фенотипу від IFN - інгібіторного ((0 пасаж)) до IFN не-інгібіторного (всі віруси, отримані від інфекційного клону кДНК 17 пасажу). У Таблиці 7 підсумовані нуклеотидні, амінокислотні та неконсервативні амінокислотні відмінності відносно відкритої рамки зчитування (ORF) PRRSV або неструктурного білка (nsp). Згідно з даними цієї таблиці, консервативними серед них вважаються наступні групи амінокислот: [K, R], [D, E], [L, I, V, A], та [S, T]. Приклад 3. Мутанти з делеціями у P129-PK (17 пасаж). У інфекційному клоні кДНК pCMV-S-P129-PK17-FL були штучно створені делеції у двох регіонах геному з отриманням п'яти генетично модифікованих інфекційних клонів. Одним регіоном геному, що зазнав модифікації була послідовність сигналу ядерної локалізації (NLS), розташована у 41-47 амінокислотних положеннях нуклеокапсидного білка (кодується ORF 7 PRRSV). Було створено два типи делеції, що вже були попередньо описані у контексті іншого інфекційного клону PRRSV. Послідовність амінокислотних залишків 41-49 дикого типу була PG…KN. У мутанті "d43/44", також відомому, як "PG--KS", лізинові залишки 43 та 44 були видалені та аспарагіновий залишок 49 був замінений серином. У мутанті "d43/44/46", також відомому, як "PG--S-KS", лізинові залишки 43, 44, та 46 були видалені та аспарагіновий залишок 49 був також замінений серином. Інфекційні клони, отримані від pCMV-S-P129-PK17FL, що містять ці делеції отримали назви, відповідно, pCMV-S-P129-PK17-d43/44 та pCMV-SP129-PK17-d43/44/46. Див. U.S. Patent No. 7,544,362. Другим регіоном геному, що зазнав модифікації була гіпермінлива ділянка nsp2 у ORF1a. Делеція 131 амінокислот (393 нуклеотидів) попередньо була описана у контексті іншого інфекційного клону PRRSV. інфекційний клон, отриманий від pCMV-S-P129-PK17-FL, що містив цю делецію отримав назву pCMV-S-P129-PK17-nsp2. Також, дослідники отримали інфекційні клони на основі pCMV-S-P129-PK17-FL, що поєднують делеції NLS та nsp2, які отримали назви pCMV-S-P129-PK17-nsp2-d43/44 та pCMV-SP129-PK17-nsp2-d43/44/46. Приклад 4. Отримання вірусів та їх зростання у клітинах PK-9. Клітини PK-9 трансфікували шістьма описаними у Прикладі 3 інфекційними клонами з отриманням шести вірусів, як наведено у Таблиці 1. Отримання вірусів з цих інфекційних клонів відбувалося шляхом безпосередньої трансфекції клітин PK-9 кільцевою плазмідою з застосуванням реагенту Lipofectamine 2000. Після трансфекції, відновлені віруси були знову піддані серійному пасивуванню у клітинах PK-9 з метою додаткового підвищення вірусних титрів та послаблення вірулентності. Стоки цих вірусів застосували для перевірки in vitro та оцінки in vivo у якості вакцинних кандидатів. У випадку вірусу P129-PK17-FL, що був отриманий від немодифікованого інфекційного клону pCMV-S-P129-PK17-FL, культивування проводили до загальної кількості у 52 пасажів від свині. Повний геном цього вірусу секвенували на 24 (SEQ ID NO: 3) та на 52 пасажах (SEQ ID NO:6). Приклад 5. Віруси, отримані від інфекційного клону P129-PK (17 пасаж) мають зменшену здатність до інгібування індукування альфа-інтерферону. Клітини MARC-145 та ST підрощували у модифікованому середовищі Ігла (MEM), доповненому 5 % фетальною бичачою сироваткою (FBS) та антибіотиками (50 мкг/мл 19 UA 108902 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гентаміцину, 100 мо (міжнародних одиниць) пеніциліну та 100 мкг/мл стрептоміцину). Клітини альвеолярних макрофагів свиней ZMAC-1 підрощували у середовищі RPMI-1640, доповненому 10 % FBS. Вірусний штам TGE Purdue отримали шляхом інфекції моношарів зливаючихся ST клітин з мінливістю у 0.01 у модифікованому середовищі Ігла. Через годину вірусний інокулюм видалили та клітини інкубували у середовищі MEM, доповненому 2.5 % FBS при 37 °C у атмосфері з 5 % CO2. Вірус вивільнювали шляхом заморожування та відтавання клітинних моношарів після спостереження 80 % цитопатичної дії. Потім вірусний стік TGE центрифугували протягом 15 хв. при 3,500 об/хв. та 4 °C та зберігали при -80 °C до початку вживання. Були отримані вірусні стоки (з клітин PK-9): P129-PK-FL та P129-PK-dnsp2-d43/44/46 8/25 пасажів (8 від інфекційного клону, 25 - від свині). Інші чотири віруси (P129-PK-d43/44, P129-PK-d43/44/46, P129-PK-dnsp2, та P129-PK-dnsp2-d43/44) мали 21/38 пасаж. Робочі стоки різних вірусів PRRS отримали шляхом одиничного пасажу у клітинах ZMAC-1 за виключенням комерційних вакцин Ingelvac PRRS MLV та Ingelvac PRRS ATP, що були відновлені згідно з інструкціями виробника та застосовані безпосередньо для інфекції. Для виділення свинячого PBMC, свіжу гепаринізовану венозну кров розвели розчином Ханка та PBMC отримали шляхом центрифугування у градієнті щільності фікол - гіпак (Ficoll-Hypaque 1077 (Sigma)). Після дворазового промивання розчином Ханка, клітини суспендували у середовищі RPMI з L- глютаміном (Mediatech), доповненим 5 % фетальною бичачою сироваткою (Gibco), 100 од./мл пеніциліном, 0.1 мг/мл стрептоміцином, 1 мM піруватом натрію, 1x розчином замінних амінокислот (Mediatech) 100 од./мл гентаміцином та 250 мM 2меркаптоетанолом (Sigma). Очищення свинячих плазмоцитоїдних дендритних клітин, що проводили, як описано раніше (наведено у Calzada-Nova) має у основі характеристичну експресію цими клітинами глікопротеїнів CD4 та CD172 (Summerfield et al., 2003) Стисло кажучи, свіжий свинячий PBMC суспендували у PBS з 0.5 % BSA та помітили оптимальними кількостями моноклональних антитіл, що розпізнають свинячий CD172 (74-22-15, VMRD). Після одного промивання, клітини інкубували зі вторинними анти-мишачими антитілами кіз, кон'югованими з PE (Southern Biotech) та після ще одного промивання, з FITC -міченими анти-CD4 (74-12-4, VMRD). PDC сортували за допомогою клітинного сортеру і Reflection (iCyt), сортувальні гейти були налаштовані для + low популяції CD4 /CD172 Після сортування, ступінь чистоти клітини підтвердили повторним аналізом. У всіх випадках вона сягала >95 %. Для аналізу вимірювання цитокінової секреції, PBMC або PDC стимулювали різними стимуляторами протягом 16 год. (37 °C, 5 % CO2) або піддали псевдо-стимулюванню. Після інкубування, середовище перекриваючихся стимульованих клітини дослідили на наявність IFNα з застосуванням антиген - зв'язуючого ІФА (“ сандвіч ”- ІФА), отриманого з наявних у продажу моноклональних антитіл (анти-свинячих IFN-α mAb K9 та F17). Стисло кажучи, на планшети типу Immulon II (Dynatech Inc.) нанесли анти- свинячі моноклональні антитіла IFN-α mAb F17 (PBL Laboratories) з наступним інкубуванням протягом ночі при 4 °C, після чого їх блокували середовищем RPMI, доповненим 5 % фетальною бичачою сироваткою. Через 1 год. середовище видалили та у лунки нанесли по 50 мкл досліджуваного супернатанту (дослідження повторювали двічі). Після години інкубування, лунки чотири рази промили та потім інкубували послідовним чином з міченими біотином анти- свинячими моноклональними антитілами IFN-α mAb K9 (PBL Laboratories), HRP-кон'югованим стрептавідином (Zymed Laboratories) та субстратом TMB (KPL). Оптичну щільність визначали за допомогою планшет-рідера для ІФА. Віруси, отримані від інфекційного клону кДНК P129-PK (17 пасаж) були позбавлені здатності інгібувати індукування альфа - інтерферону. Робочі вірусні стоки були отримані з групи чотирьох різних ізолятів вірусу PRRS дикого типу (P3412, P129, IND5, NADC20) з застосуванням клітинної лінії альвеолярних макрофагів свиней ZMAC-1. Додаткові стоки також були отримані з похідних перших двох вірусів дикого типу, адаптованих до зростання у культурі клітин за допомогою повторюючихся пасажів у клітинах PK-9, FK.D4 або MARC-145. Три з чотирьох ізолятів дикого типу (P129, IND5, NADC20) демонстрували легке та ефективне зростання у клітинах ZMAC-1 до 7 титрів приблизно у 10 ЦПД50/мл, у той час, як ізолят P3412 дикого типу досяг титру, що 5 дорівнював тільки 10 ЦПД50/мл. Примітно, що стоки вірусів P129, отриманих у клітинній лінії ZMAC-1 досягають вдесятеро більшого титру, ніж подібні стоки, отримані у клітинах PK-9 або MARC-145, до яких ці віруси були адаптовані. Перевірка здатності цих вірусів стимулювати секрецію IFN-α клітинами PBMC виявила, що за одним виключенням (клон C ізоляту P3412), дуже мала кількість (80 %) на IFN-α відповідь клітин PBMC на дію TGEv. Був також проведений аналіз групи вірусних стоків, отриманих від інфекційного клону кДНК (pCMV-S-P129-PK17-FL), що містив повнорозмірний вірус P129-PK-FL та кілька генетично модифікованих мутантів з делецією. Як видно з Таблиці 3, якщо порівнювати з сильною інгібіторною дією (95 %) ізоляту P129 батьківського дикого типу (пасаж 1), то вірус P129-PK-FL та всі мутанти з делеціями демонструють значно зменшену здатність до інгібування індукування IFN-α клітинами PBMC у відповідь на дію TGEv. Для додаткової оцінки IFN-α фенотипу цих вірусів, наступні експерименти були спрямовані на отримання безпосередніх порівнянь вірусів P129-PK-FL та P129-PK-d43/44, батьківського штаму P129 дикого типу, та/або двох наявних у продажу модифікованих живих вакцин PRRSV від Boehringer Ingelheim (Ingelvac PRRS MLV та Ingelvac PRRS ATP). Також був перевірений додатковий рефересний ізолят NVSL-14 з невеликою кількістю пасажів. Як видно з Таблиці 4, у чотирьох незалежних експериментах, P129-PK-FL та P129-PK-d43/44 проявляють значно меншу інгібіторну дію відносно IFN-α, ніж батьківський вірус P129, два ослаблених штами від Ingelvac або референсний штам. У одному випадку, спільне інфікування з вірусами P129-PK-FL або P129-PK-d43/44 веде до очевидного підсилення IFN-α відповіді на дію TGEv. Результати, наведені у Таблиці 2 вказують на дію інгібування альфа- інтерферону вірусом PRRS дикого типу та його похідними, адаптованими до зростання у культурі клітин. Зазначені стоки вірусу PRRS зростали у клітинах ZMAC-1 та титри цих нових отриманих стоків були також визначені з застосуванням ZMAC-1 клітин. Кількість IFN-α, присутнього у культуральних супернатантах мононуклеарних клітин периферичної крові свиней, що протягом 18 годин була піддана впливу зазначеного стоку вірусу PRRS у присутності або у відсутності вірусу TGE визначили за допомогою ІФА. * - відповідь до окремо взятого вірусу TGEv. Результати, що наведені у Таблиці 3 демонструють дію інгібування альфа- інтерферону вірусом Р129 дикого типу та його генетично модифікованими похідними, адаптованими до зростання у клітинах PK-9, що експресують CD163. Кількість IFN-α, присутнього у культуральних супернатантах мононуклеарних клітин периферичної крові свиней (PBMC), що протягом 18 годин була піддана впливу зазначеного стоку вірусу PRRS у присутності або у відсутності вірусу TGE визначали за допомогою ІФА. * - відповідь до окремо взятого вірусу TGEv; na = не застосовується. Таблиця 4 демонструє понижену дію інгібування альфа - інтерферону вірусами P129-PK-FL та P129-PK-d43/44 порівняно з вірусом дикого типу P129 та вакцинами PRRS Ingelvac.), що протягом 18 годин була піддана впливу зазначеного стоку вірусу PRRS у присутності або у відсутності вірусу TGE визначали за допомогою ІФА. * - відповідь до окремо взятого вірусу TGEv; na = не застосовується. Більш, ніж достатня кількість IFN-α, виділеного клітинами PBMC у відповідь на дію TGEv. була головним чином отримана від підкласу клітин, що складали менш ніж 0.3 % від популяції PBMC. Цей підклас дуже рідкісних, але важливих клітин охоплює плазмоцитоїдні дендритні клітини (PDC), що отримали цю назву завдяки характерній плазмоцитоїдній морфології. Для додаткової перевірки IFN-α фенотипу вірусів P129-PK-FL та P129-PK-d43/44, були проведені серії експериментів, подібні до описаних вище, за винятком застосування PDC, що були нещодавно виділені з PBMC з чистотою >95 %. Як видно з Фіг. 1, ці серії експериментів підтверджують спричинення вірусами P129-PK-FL та P129-PK-d43/44 незначного інгібування індукування IFN-α вірусом TGEv. Більш того, у одному експерименті спостерігали явний підсилюючий ефект опосередкованого TGEv індукування IFN-α клітинами PDC у відповідь на дію вірусів PRRS P129-PK-FL та P129-PK-d43/44. На відміну від цього, вірус Ingelvac PRRS MLV проявляє сильну інгібіторну дію на IFN-α відповідь, як видно з Фіг. 1. Результати, що описані у експериментальній частині свідчать про те, що віруси P129-PK-FL та P129-PK-d43/44 PRRS, а також інші похідні інфекційного клону кДНК pCMV-S-P129-PK17-FL мають дуже зменшену здатність до інгібування індукування IFN-α вірусом TGEv у інфікованих клітинах PBMC або PDC. Це різко контрастує з ефектом пригнічення інтерферону, який спостерігається з вірусами PRRS дикого типу (мала кількість пасажів) з двох комерційно доступних модифікованих живих вірусних вакцин (Ingelvac PRRS MLV та Ingelvac PRRS ATP). Спостереження того, що віруси P129-PK-FL та P129-PK-d43/44 мінімальним чином пригнічують 21 UA 108902 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ці важливі функції PDC є потенційно значним, враховуючи важливу роль, яку відіграють ці клітини у опосередкуванні вродженого імунітету проти вірусних інфекцій. Також слід зазначити, що заявлений винахід стосується клінічно ефективних комерційних вакцинних вірусів, адаптованих до зростання у пермісивних клітинах, що рекомбінантним чином експресують рецептор CD163 та що ці віруси та вакцини не залежать від та ніяким чином не були розроблені згідно з попередньою технологією культивування “ мавпячої клітини ”. Докладно див. U.S Patent 7,754,464. Приклад 6. Безпечність та ефективність вакцинних кандидатів. Для оцінки безпечності та ефективності у якості вакцин проти PRRS, три віруси, отримані від інфекційного клону кДНК pCMV-S-P129-PK17-FL, P129-PK-FL (пасаж 7/24), P129-PK-d43/44 (пасаж 17/34) та P129-PK-d43/44/46 (пасаж 17/34) оцінювали з застосуванням моделі дихальної хвороби молодих свиней. Джерело цих вірусів наведено у Фіг. 8, схема експерименту (групи лікування) перелічені у Таблиці 5. Для гетерологічного інфікування тварин у віці 7 тижнів (4 тижні після вакцинації) застосували ізолят NADC20 вірулентного PRRSV низького пасажу. До складу контрольних груп лікування входили “ макетна ” вакцина та комерційна вакцина PRRS Ingelvac MLV. Групи, що не пройшли обробку (NT) були наступними: свиней NT1 застосували в якості індикатора моніторингу стану здоров'я вихідних свиней. Їх утримували окремо та піддали розтину перед інфікуванням PRRSV. Свині NT2 були контактними контролями, яких утримували окремо у загоні, розміщеному між двох загонів з вакцинованими свинями, в цілому дві на кожну з груп лікування T02-T05. Свині NT3 були контактними контролями, яких утримували по одній на загін з вакцинованими свинями, в цілому дві на кожну з груп лікування (T01-T05). Тільки свині NT3 були призначені до групи T01. Ректальні температури вакцинованих тварин (результати наведені у Фіг.1.) вимірювали після вакцинації, порівнюючи з групою лікування T01 (макетна вакцина). Жодна з вакцин не викликала лихоманку. Середня температура у всіх групах протягом періоду спостереження сягала 104 °C. Ректальні температури свиней також вимірювали після інфікування (результати наведені у Фіг. 2). Невакциновані свині T01 страждали на стійку лихоманку з температурою, вищою, ніж 104 °C. На відміну від цього, дія кожної з трьох вакцин значно зменшила лихоманку після інфікування. Найбільш ефективною у зменшенні лихоманки була вакцина P129-PK-FL. Масу тіла тварин записували до та після вакцинації (результати наведені у Фіг. 3.) Дані маси тіла записували у -1 день (перед вакцинацією), у 10, 24, 27 (перед інфікуванням) та 37 день досліджень. У невакцинованих свиней, інфікування вірулентним вірусом NADC20 майже повністю усувало збільшення маси протягом 10 – денного періоду спостережень. Дія вакцин усувала цей ефект з різним ступенем ефективності. Легені інфікованих тварин були розглянуті при розтині після інфікування. Відсотковий вміст кожної легені, зайнятий ураженнями наведений у Фіг. 4. Для групи макетної вакцини T01 цей відсотковий вміст в середньому сягав 25.1 %. Дія вакцин зменшувала ураження леreнь з різним ступенем ефективності. Вакцина P129-PK-FL була найбільш ефективною, скоротивши вміст легені, зайнятий ураженнями до 1.1 %. Ступінь тяжкості легеневих уражень оцінювали з застосуванням шкали оцінки легенів (LAS), як наведено у Фіг. 5. Дія трьох вакцин зменшувала LAS. Вакцина P129-PK-FL зменшувала середній LAS від 1.63 у групі з макетною вакциною до 0.14. Сироваткові антитіла до PRRSV були викликані як вакцинацією, так і інфікуванням. Співвідношення S/P для ІФА від IDEXX (де P - кількість зразків, що дали позитивний результат у тест-системі, S - загальна кількість досліджених позитивних зразків) вимірювали на 27 та 37 день досліджень. Результати наведені у Фіг. 6. Вакцинація з P129-PK-FL індукувала найвищий рівень анти- PRRS антитіл. Віремію у сироватці інфікованих свиней титрували у клітинах PAM. Результати (ЦПД50/мл) наведені у Фіг. 7. Вакцина P129-PK-FL була найбільш ефективною у зменшенні віремії, що виникала після інфікування. Хоча винахід описано тут з посиланням на вищенаведені Приклади та додаткові матеріали, де повний зміст кожного з них є включеним сюди шляхом посилання, треба розуміти, що суть та обсяг винаходу також охоплює різні модифікації та варіанти. Відповідно, винахід обмежується тільки наступною Формулою Винаходу. Приклад 7. Отримання інфекційного клону кДНК PCMV-S-P129-PK17-FL від інфекційного клону кДНК PCMV-S-P129. 22 UA 108902 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Інфекційний клон кДНК PRRSV заявленого винаходу pCMV-S-P129-PK17-FL може легко бути отриманий будь-яким пересічним фахівцем від попередньо описаного інфекційного клону кДНК PRRSV pCMV-S-P129 за допомогою способу сайт-спрямованого мутагенезу. Інфекційний клон кДНК PRRSV pCMV-S-P129 описаний у U.S. Pat. No. 6,500,662 та зберігається у ATCC під інвентарним номером 203489. Послідовність ДНК геному PRRSV цього клону також є в наявності у базі даних Genbank (NCBI) під інвентарним номером AF494042. Набори для сайтспрямованого мутагенезу є наявними у продажу від багатьох постачальників та здатні утворювати численні одночасні нуклеотидні заміщення у кількох місцях великих плазмід. Подібні набори охоплюють, але без обмеження, Change-IT™ Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit (Affymetrix / USB), QuikChange Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies-Stratagene Products) та AMAP Multi Site-directed Mutagenesis Kit (MBL International). Перелік змінень нуклеотидів у інфекційному клоні кДНК PRRSV pCMV-S-P129 (є у наявності від ATCC) та у інфекційному клоні кДНК PRRSV заявленого винаходу pCMV-S-P129-PK17-FL наведений у Таблиці 8. Всі ці змінення знаходяться у ділянках геному, що кодують білок. Взагалі існують 74 нуклеотидних змінення, які можуть бути введені до інфекційного клону pCMV-S-P129 з застосуванням 74 мутагенних праймерів та численних послідовних реакцій з наявними у продажу наборами для сайт-спрямованого мутагенезу з отриманням плазмідних молекул, ідентичних у послідовності до описаної тут pCMV-S-P129-PK17-FL. Насправді можна отримати той же результат з меншою кількістю мутагенних праймерів, оскільки кластери мутацій у межах приблизно 50-60 нуклеотидів один від одного можна змінити з застосуванням одиничного мутагенного праймера. Наприклад, нуклеотиди 735, 750, та 756 можуть бути змінені за допомогою одиничного мутагенного праймера, як і нуклеотиди 965, 992 та 1009. Отже, кількість праймерів зменшується приблизно до 60. Більшість нуклеотидних заміщень (42 з 74) є синонімічними або “ тихими ”, тобто вони кодують ту ж саму амінокислоту. Ці нуклеотидні заміщення навряд чи здійснюють будь-яку прийнятний для вимірювання вплив на індукування інтерферону або інгібування вірусного фенотипу. Позосталі 32 нуклеотидних заміщення є несинонімічними або “ не тихими ” та ведуть до появи амінокислотних заміщень вірусних білків. Вважається, що ці 32 нуклеотидних заміщення безпосередньо відповідають за фенотип вірусу відносно індукування / інгібування інтерферону та повинні бути змінені для перетворення вірусу, що кодується інфекційним клоном pCMV-S-P129 на такий саме фенотип вірусу відносно індукування / інгібування інтерферону, який демонструє вірус, що кодується інфекційним клоном pCMV-S-P129-PK17-FL. Для такого заміщення потрібно буде щонайменш 32 мутагенних праймера та ще менше, якщо враховувати кластеризацію відповідних нуклеотидів. Приклад 8. Синтез de novo інфекційного клону кДНК рCMV-S-P129-PK17-FL. У якості альтернативи сайт-спрямованому мутагенезу, вірусний геном PRRS заявленого винаходу може бути хімічно синтезований de novo, з відповідними 5" та 3" адапторними послідовностями та клонованій у базовій плазміді, що була застосована для інфекційного клону кДНК PRRS pCMV-S-P129 (наявного у ATCC під інвентарним номером 203489) або у подібній базовій плазміді. Звичайний синтез генів розміром більш, ніж 50 тисяч пар основ у довжину (геном PRRSV дорівнює приблизно 15.5 тисяч пар основ) є в наявності у вигляді комерційних послуг від численних постачальників, в тому числі (але не обмежуючись ними) від GenScript, DNA 2.0 та Bio Basic Inc. Синтетичний вірусний геном безпосередньо клонують у вектор pCMV-S шляхом заміщення вірусного геному інфекційного клону pCMV-S-P129 з застосуванням фланкуючих геном сайтів рестрикції 5" PacI та 3" SpeI. Для розрізання синтетичного геному, на його 5" – кінці будують 24 - нуклеотидне подовження (5’-gcagagctc gttaattaaaccgtc- геном -3", що містить підкреслений сайт рестрикції PacI) та на його 3" – кінці будують 83- нуклеотидне подовження (5’геном – aaaaaaaaaaaaaaa aaaaaatgcatatttaa atcccaagccgaattccagcacactggcggccgttactagtg agcggccgc-3", що містить підкреслений сайт рестрикції SpeI). Після розрізання плазміди та синтетичного геному у сайтах PacI та SpeI, відповідні фрагменти очищують, зшивають за допомогою ДНК - лігази та трансформують ними Escherichia coli для поширення та відбору з застосуванням стандартних добре відомих фахівцям процедур клонування. Наступні біологічні матеріали (див. U.S Patent No. 6,500,662) зберігаються у Американській колекції типових культур (ATCC) з адресою: 10801 University Blvd., Manassas, Virginia, 201102209, USA з 19.11.1998 під відповідними інвентарними номерами. Інвентарний номер плазміди pT7P129A – 203488. Інвентарний номер плазміди pCMV-S-P129 – 203489. Повний текст та зміст 23 UA 108902 C2 патентів США U.S. 6,500,662, та U. S 7,618,797 включений тут у повному обсязі шляхом посилання. Таблиця 1 Інфекційний клон pCMV-S-P129-PK17-FL pCMV-S-P129-PK17-d43/44 pCMV-S-P129-PK17-d43/44/46 pCMV-S-P129-PK17-nsp2 pCMV-S-P129-PK17-nsp2-d43/44/46 pCMV-S-P129-PK17-nsp2-d43/44/46 Вірус P129-PK-FL P129-PK-d43/44 P129-PK-d43/44/46 P129-PK-nsp2 P129-PK-nsp2-d43/44 P129-PK-nsp2-d43/44/46 Таблиця 2 Титр вірусу IFN-α Інгібу Обчислений PRRS (нг/мл) IFN-α (нг/мл) вання титр вірусу (ЦПД50) у Пасаж / клітин клітин PBMC IFN-α Стік Клон PRRS стоках вірусу Зразок тип клітин PBMC у у відповідь відповіді PRRSv (ЦПД50) у PRRS, відповідь на на оригіналь отриманого у на один PRRSv+TGEv TGEv ному стоці клітинах PRRSv (%) ZMAC-1 5 1 P3412 wt 0 (сиров.) nd 10 < 0.04 < 0.04 99 3 3 2 P3412 A 41/PK 10 10 < 0.04 1.166 93 3 3 3 P3412 C 41/PK 10 10 0.464 3.376 81 5 6 4 P3412 A 43/FK 10 10 < 0.04 < 0.04 99 5 5 5 P3412 B 43/FK 10 10 < 0.04 1.86 89 7 6 P129 wt 0 (сиров.) nd 10 < 0.04 0.327 98 4 8 7 P129 A 63/PK 10 10 < 0.04 < 0.04 99 4 8 8 P129 B 63/PK 10 10 < 0.04 2.3 87 5 6 9 P129 A 60/FK 10 10 0.05 2.151 88 5 6 10 P129 B 60/FK 10 10 < 0.04 < 0.04 99 5 8 11 P129 A-1 51/MARC 10 10 < 0.04 0.686 96 5 8 12 P129 A-1 151/MARC 10 10 < 0.04 0.04 99 7 13 NADC20 wt 0 (сиров.) nd 10 < 0.04 < 0.04 99 7 14 IND5 wt 0 (сиров.) nd 10 < 0.04 < 0.04 99 Mock na na 0 17.54* Na wt – дикий тип, nd – не встановлено, Mock – макетна вакцина, na – дані відсутні. 5 Таблиця 3 IFN-α (нг/мл) вироблений Стік вірусу PRRS Експеримент клітинами PBMC у відповідь на один PRRSv P129 0.09 P129-PK-FL 0.53 P129-PK-d43/44 0.85 P129-PK1.01 d43/44/46 1 P129-PK1.34 dnsp2d43/44 P129-PK0.38 dnsp2d43/44/46 P129-PK-dnsp2 0.04 Mock na 24 IFN-α (нг/мл) вироблений клітинами PBMC у відповідь на PRRSv+TGEv 0.64 7.37 8.59 Інгібування IFN-α відповіді, викликаної TGEv (%) 95 38 28 7.65 36 10.28 24 8.28 31 4.86 12.16* 60 na UA 108902 C2 Таблиця 4 Експеримент 1 2 3 4 IFN-α (нг/мл) IFN-α (нг/мл) вироблений вироблений Стік вірусу PRRS клітинами PBMC у клітинами PBMC у відповідь на один відповідь на PRRSv PRRSv+TGEv P129 0.04 9.75 P129-PK-FL 0.07 60.22 P129-PK-d43/44 0.13 70.10 Ingelvac PRRS 0.04 13.05 Ingelvac PRRS 0.04 9.10 ATP NVSL-14 0.01 13.35 Mock na 50.06* P129-PK-FL 0.126 13.52 P129-PK-d43/44 0.127 17.18 Ingelvac PRRS 0.04 3.09 Ingelvac PRRS 0.04 3.11 ATP Mock na 18.21* P129-PK-FL 0.04 8.28 P129-PK-d43/44 0.06 8.26 Ingelvac PRRS 0.04 3.56 Ingelvac PRRS 0.04 4.15 ATP Mock na 8.84* P129-PK-FL 0.05 12.97 P129-PK-d43/44 0.05 13.57 Ingelvac PRRS 0.04 6.07 Ingelvac PRRS 0.04 5.30 ATP Mock na 13.95* Інгібування IFN-α відповіді, викликаної TGEv (%) 81 0 0 74 82 74 na 26 6 83 83 na 6 6 60 53 na 7 3 57 62 na Таблиця 5 Група досліджень NT1* NT2* NT3* Т01 Т02 Т03 Т04 Т05 Вакцинний препарат NA NA NA Mock P129-PKd43/44 P129-PKd43/44/46 P129-PK-FL BI (Ingelvac MLV) № пасажу або серії NA NA NA NA Клітинна лінія NA NA NA NA Схема прийому NA NA NA 0 доба Об'єм / дозу (ІМ) NA NA NA 2 мл Кількість свиней 3 8 10 12 17/34 0 доба 2 мл 12 17/34 РК9 0 доба 2 мл 12 7/24 NA РК9 РК9 клітини нирок мавпи 0 доба 2 мл 12 0 доба 2 мл 12 ІМ - внутрішньом'язово 25 UA 108902 C2 Таблиця 6 Положення у геномі 407 612 735 750 756 992 1009 1096 1215 1620 1786 1793 1808 1841 2106 2164 2185 2318 2403 2591 2804 3019 3074 3167 3214 3563 3740 4154 4477 4643 4705 4736 5231 5324 5393 5498 5851 5855 5909 5917 5985 6505 6644 6653 7419 8032 8074 8200 8593 8831 8911 9160 Нуклеотид 0 пасажу C C G A G A G C C G C C T C A T T A G G C A T C G C A T A A T C C C G A C T C G C C T T G A C A T G T A Нуклеотид 17 пасажу T T A G A T A A T A A T C T G G C G T A T G C T A T G C C G C T T T A G A C T A A T C C A G T G C A C G Змінений вірусний білок Nsp1a Nsp1a Nsp1b Nsp1b Nsp1b Nsp1b Nsp1b Nsp1b Nsp1b Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp3 Nsp3 Nsp3 Nsp3 Nsp3 Nsp3 Nsp3 Nsp3 Nsp4 Nsp4 Nsp4 Nsp4 Nsp4 Nsp5 Nsp5 Nsp5 Nsp7 Nsp9 Nsp9 Nsp9 Nsp9 Nsp9 Nsp9 Nsp9 26 Aміно Амінокис Амінокислота кислотне лота 0 пасажу положення 17 пасажу 72 P P 141 H Y 2 D N 7 S G 9 D N 87 E D 93 C Y 122 P H 162 L L 94 A T 149 T K 151 G G 156 D D 167 C C 256 I V 275 M R 282 M T 326 S S 355 V L 417 L L 488 D D 560 Y C 578 S S 609 D D 625 R K 741 I I 800 A A 938 C C 72 K T 127 V V 148 V A 158 P P 323 I I 354 L L 377 L L 412 L L 84 A E 85 D D 103 V V 106 S N 129 L I 98 A V 144 F F 147 R R 217 D N 162 A A 176 G G 218 G G 349 P P 429 V I 455 N N 538 E E UA 108902 C2 Таблиця 6 Положення у геномі 9568 9714 10,271 10,627 11,265 11,512 11,913 12,487 12,876 12,949 13,575 13,857 13,869 13,872 14,102 14,143 14,257 14,287 14,379 14,546 14,578 14,780 14,932 14,973 15,124 15,288 Нуклеотид 0 пасажу A T C T G T T A C A G T A C G C G C T T A C T G T G Нуклеотид 17 пасажу G C T C A C C T T G A G G G A T A T C C G T C A C A Змінений вірусний білок Nsp9 Nsp10 Nsp10 Nsp10 Nsp11 Nsp11 Nsp12 ORF2a ORF3 ORF3 ORF4 ORF5 ORF5 ORF5 ORF5 ORF5 ORF5 ORF5 ORF6 ORF6 ORF6 ORF6 ORF7 ORF7 ORF7 3’UTR Aміно Амінокис Амінокислота кислотне лота 0 пасажу положення 17 пасажу 674 L L 38 I T 224 L L 342 V V 114 G E 196 S S 107 I T 144 E V 66 A V 90 L L 117 V V 29 V G 33 N S 34 T S 111 V I 124 V V 162 E E 172 N N 7 D D 63 V A 74 T A 141 T I 20 N N 34 S N 84 N N Таблиця 7 ORF або nsp Nsp1a Nsp1b Nsp2 Nsp3 Nsp4 Nsp5 Nsp6 Nsp7 Nsp8 Nsp9 Nsp10 Nsp11 Nsp12 ORF2a ORF2b ORF3 ORF4 ORF5 ORF6 ORF7 Нуклеотидні відмінності Амінокислотні відмінності 2 7 19 8 5 3 0 1 0 8 3 2 1 1 0 2 1 7 4 3 1 6 8 2 3 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 4 3 1 27 Неконсервативні амінокислотні відмінності 1 5 5 1 2 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 2 2 1 UA 108902 C2 Таблиця 8 Нуклеотид 10 пасажу у Положення у клітинах геномі MARC-145 407 612 735 750 756 965 992 1009 1096 1215 1376 1395 1871 2185 2235 2403 2731 2804 2918 3019 3067 3074 3214 3256 3563 3740 4154 4477 4643 4705 4736 4784 5231 5324 5498 5855 5862 5985 6155 6505 6776 7419 7521 8032 8074 8200 8263 8485 8593 8831 8911 C C G A G T A G C C A T A T G G A C T A G T G T C A T A A T C C C C A T G C T C A G T A C A T T T G T Нуклеотид 17 пасажу у клітинах PK-9 T T A G A C T A A T G C G C A T G T C G A C A C T G C C G C T T T T G C A A C T G A C G T G C C C A C Вірусний білок, підданий впливу Nsp1a Nsp1a Nsp1b Nsp1b Nsp1b Nsp1b Nsp1b Nsp1b Nsp1b Nsp1b Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp2 Nsp3 Nsp3 Nsp3 Nsp3 Nsp3 Nsp3 Nsp3 Nsp3 Nsp4 Nsp4 Nsp4 Nsp4 Nsp5 Nsp7 Nsp7 Nsp7 Nsp9 Nsp9 Nsp9 Nsp9 Nsp9 Nsp9 Nsp9 Nsp9 28 Амінокис лота 10 Амінокислотне пасажу у положення клітинах MARC-145 72 P 141 H 2 D 7 S 9 D 78 G 87 E 93 C 122 P 162 L 12 A 19 C 177 L 282 M 299 D 355 V 464 Y 488 D 526 S 560 Y 576 G 578 S 625 R 639 L 741 I 800 A 938 C 72 K 127 V 148 V 158 P 174 V 323 I 354 L 412 L 85 D 88 A 129 L 185 D 98 A 2 L 217 D 251 S 162 A 176 G 218 G 239 S 313 H 349 P 429 V 455 N Амінокис лота 17 пасажу у клітинах PK-9 P Y N G N G D Y H L A R L T N L C D S C E S K S I A C T V A P V I L L D T I D V L N P A G G S H P I N
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюNorth american porcine reproductive and respiratory syndrome (prrs) virus and uses thereof
Автори англійськоюWelch, Siao-Kun Wan, Calvert, Jay Gregore, Slade, David Ewell
Автори російськоюВелч Сайо-Кун Ван, Кальверт Джэй Грегори, Слэйд Дэвид Ивелл
МПК / Мітки
МПК: A61K 39/12, C07K 14/08, C12N 7/08
Мітки: синдрому, репродуктивного, респіраторного, свиней, prrs, північноамериканського, вірус, застосування
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/93-108902-virus-pivnichnoamerikanskogo-reproduktivnogo-ta-respiratornogo-sindromu-svinejj-prrs-ta-jjogo-zastosuvannya.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Вірус північноамериканського репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (prrs) та його застосування</a>
Попередній патент: Катетер у зборі з удосконаленим запобіжним пристроєм
Наступний патент: Спосіб комплексного лікування періодонтитів фронтальної групи зубів ендодонто-ендоосальними імплантатами
Випадковий патент: Спосіб одержання розчинів гідроксиду цезію