Віруси репродуктивно-респіраторного синдрому свиней, їх інфекційні клони та мутанти та способи застосування

1. Інфекційний полінуклеотид, що містить нуклеотидну послідовність, яка має щонайменше 88% 2 (19) 1 3 95778 4 1G), SEQ ID NO: 8 (Фіг. 1H), SEQ ID NO: 9 (Фіг. 1I), SEQ ID NO: 10 (Фіг. 1J), SEQ ID NO: 11 (Фіг. 1K), SEQ ID NO: 12 (Фіг. 1L), або SEQ ID NO: 13 (Фіг. 1М). 16. Nsp2 поліпептид, кодований інфекційним полінуклеотидом, що містить нуклеотидну послідов ність SEQ ID NO: 7 (Фіг. 1G), SEQ ID NO: 8 (Фіг. 1Н), SEQ ID NO: 9 (Фіг. 1I), SEQ ID NO: 10 (Фіг. 1J), SEQ ID NO: 11 (Фіг. 1K), SEQ ID NO: 12 (Фіг. 1L) або SEQ ID NO: 13 (Фіг. 1M). Посилання на пріоритетну заявку У цій заявці заявлено перевагу тимчасової заявки США із серійним № 60/694,021, поданої 24 липня 2005 p., що включена до цієї заявки шляхом посилання. Передумови створення винаходу Вірус репродуктивно-респираторного синдрому свиней (РРСС) є збудником хвороби, що характеризується респіраторними розладами у молодих свиней та репродуктивною недостатністю у свиноматок (Benfield et al., J. Vet. Diagn. Invest, 4:127133 (1992); Collins et al., J. Vet. Diagn. Invest, 4:117126 (1992); Wensvoort et al., Vet Q., 13:121-130 (1991)), та на даний час є ендемічною хворобою у більшості країн. Цей синдром був вперше визнаний як "таємнича свиняча хвороба" у Сполучених Штатах Америки у 1987 р. та був відкритий в Європі у 1990 р. Два прототипні вірусні штами (Лелістад та VR-2332) відрізняються у нуклеотидній послідовності на, приблизно, 40%, та являють собою два окремі генотипи, що мають назву Європейський (EU або Тип 1, Лелістад; Meulenberg et al., Virology, 192:62-72 (1993)) та Північноамериканський (ΝΑ або Тип 2, VR-2332; Nelsen et al., J. Virol, 73:270-80 (1999)) штами (Fang et al., Virus Res., 100:229-235 (2004); Mardassi et al., J. Gen. Virol., 75:681-5 (1994); Meng et al., Arch. Virol., 140:745-55 (1995); Ropp et al., J. Virol., 78:3684-3703 (2004)). Також хвороба має назву синдрому Вабаша, таємничої свинячої хвороби, репродуктивнореспіраторного синдрому свиней, свинячої чуми, епідемічного абортно-респіраторного синдрому свиней, епізоотичного пізнього аборту свиней, хвороби синього вуха, блакитного аборту, та "seuchenhafter spatabort der schweine". Хвороба характеризується репродуктивною недостатністю у вагітних свиноматок та респіраторними проблемами у свиней у будь-якому віці. Хвороба має значний негативний вплив на виробництво свинини. Вірус РРСС є оболонковим вірусом, представленим позитивно-полярною РНК, що належить до сімейства Arteriviridae ряду Nidovirales (Cavanagh, Arch. Virol., 142:629:633 (1997)). Геном вірусу РРСС може мати довжину у 15,1-15,5 kb (Meuienberg et al., Virology, 192:62-72 (1993); Nelsen et al., J. Virol., 73:270-80 (1999)). Перші 75% геному кодують поліпротеїн реплікази, необхідний для вірусної реплікації, та складаються з двох великих відкритих рамок зчитування (ORF) (1а та 1b), що обробляються вірусно кодованими протеазами шляхом сумісної трансдукції у більш малі білки (Snijder et al., J. Gen. Virol., 79:961-79 (1998)). Структурні білки кодовані сьома нижчими ORF та трансльовані від 3'-котермінального гніздового набору субгеномних ІРНК (сгіРНК) (Meuienberg et al., Virology, 192:62-72 (1993); Pattnaik et al., Cell, 69:1011-1020 (1992)). У штамі VR-2332, кодуюча ділянка геному (15 411 основ) фланкована 5' та 3' нетрансльованими ділянками нуклеотидів 189 та 151, відповідно. Штам вірусу РРСС VR-2332 був добре охарактеризований у показниках його повної геномної послідовності (Pattnaik et al., Cell, 69:1011-1020 (1992)), здатності вірусу РРСС до конститутивного продукування дефектних субгеномних РНК видів, що мають назву гетероклітів (з латинської: форми, що рідко зустрічаються) (Yuan et al., Virology, 275:158-169 (2000)); Yuan et al., Virus Research, 105:75-87(2004)), та його властивостей зростати in vitro також, як in vivo (Murtaugh et al., Vet. Immunol. Immunopathol., 102:105-349 (2004)). Додатково, інфекційний клон цього 15,4 kb NA РРСС вірусного геному був одержаний та досліджений щодо його здатності викликати хвороби у свиней (pVR-HN; Nielsen et al., J. Virol., 77:3702- 3711 (2003)). Вірус РРСС продовжує спричиняти високі економічні втрати по всьому світові. Вакцини наявні, але вони засновані на одному штамі вірусу РРСС, хоча вже є докази того, що штами вірусу РРСС розрізнюються на антигенному та генному рівнях. Крім того, оскільки вірус був ідентифікований в Європі та у Сполучених Штатах, продовжують виникати нові фенотипи хвороби. Стислий опис винаходу У попередніх звітах припускалось, що делеції та/або мутації будь-якого зі штамів вірусу РРСС часто були надзвичайно шкідливими для росту вірусу. Конкретно, в окремих лабораторіях були здійснені мутації на 3' термінусі вірусу, та результуючий вірус був або нестійким, або швидко повертався у послідовність дикого типу, або дуже погано зростав чи не зростав зовсім (Lee et al., Virol., 331 :47-62 (2005); Choi et al., J. Virol., 80:723-736 (2006); Lee et al., Virolog., 346:238-250 (2005)). Таким чином, порівняння із нуклеотидними послідовностями Європейського (генотип Типу 1) та VR2332 (генотип Типу 2), в яких би відбулися мутації у VR-2332 NSP2, що не були надзвичайно шкідливими, не були відомі. Проте, було розпочато вирівнювання повних геномних послідовностей вірусів РРСС нового Типу 2 з VR-2332 з метою прояснення того, яким чином можна створити життєздатних мутантів. Додатковий делеційний мутагенез показав, що ділянка між nsp2 амінокислотами 324-813 не була необхідною для росту in vitro. Даний винахід забезпечує ізольований інфекційний полінуклеотид, нуклеотидна послідовність якого має, щонайменше, 88% ідентичність до SEQ ID №:1, та делецію, щонайменше, 39 суміжних нуклеотидів, вибраних з нуклеотиду 2062 до нук 5 леотиду 3864 SEQ ID №: 1. Також забезпечується ізольований інфекційний полінуклеотид, нуклеотидна послідовність якого має, щонайменше, 88% ідентичність до SEQ ID №:14, та делецію, щонайменше, 39 послідовних нуклеотидів, вибраних з нуклеотиду 2061 до нуклеотиду 3545 SEQ ID №: 14. Ізольований полінуклеотид може бути присутній у векторі, в ізольованій вірусній частці, що присутня у клітині, або у їх комбінації. Коли він присутній у векторі, то промотор РНК полімерази може бути функціонально зв'язаний із полінуклеотидом. Ізольованим полінуклеотидом може бути РНК. Ізольований полінуклеотид може включати 2 чи більше делецій, та кожна делеція може являти собою, незалежно, щонайменше, 37 послідовних нуклеотидів. Ізольований полінуклеотид може додатково містити екзогенний полінуклеотид, присутній у делеції, причому екзогенний полінуклеотид може кодувати поліпептид, такий, як детектовний маркер. Даний винахід також забезпечує ізольований полінуклеотид, нуклеотидна послідовність якого має, щонайменше, 88% ідентичність до SEQ ID №:1 та, щонайменше, делецію, щонайменше, 39 суміжних нуклеотидів, вибраних з нуклеотиду 2062 до нуклеотиду 3864 SEQ ID №:1, де полінуклеотид реплікує та продукує частки інфекційного вірусу при введенні у клітину. Також забезпечується ізольований полінуклеотид, нуклеотидна послідовність якого має, щонайменше, 88% ідентичність до SEQ ID №: 14 та, щонайменше, делецію, щонайменше, 39 суміжних нуклеотидів, вибраних з нуклеотиду 2061 до нуклеотиду 3545 SEQ ID №: 14, де полінуклеотид реплікує та продукує частки інфекційного вірусу при введенні у клітину. Ізольований полінуклеотид може бути присутній у векторі, ізольованій частці вірусу, що присутня у клітині, або у їх комбінації. У разі присутності у векторі, промотор РНК полімерази може бути функціонально зв'язаний із полінуклеотидом. Ізольований полінуклеотид може бути РНК. Ізольований полінуклеотид може мати 2 чи більше делецій, та кожна делеція може являти собою, незалежно, щонайменше, 37 послідовних нуклеотидів. Ізольований полінуклеотид може додатково містити екзогенний полінуклеотид, присутній у делеції, причому екзогенний полінуклеотид може кодувати поліпептид, такий, як детектовний маркер. Даний винахід додатково забезпечує інфекційний клон, що містить полінукеотид, нуклеотидна послідовність якого має, щонайменше, 88% ідентичність до SEQ ID №: 1 та, щонайменше, делецію, щонайменше, 39 суміжних нуклеотидів, вибраних з нуклеотиду 2062 до нуклеотиду 3864 SEQ ID №:1. Також забезпечується інфекційний клон, що містить полінуклеотид, нуклеотидна послідовність якого має, щонайменше, 88% ідентичність до SEQ ID №: 14 та, щонайменше, делецію, щонайменше, 39 суміжних нуклеотидів, вибраних з нуклеотиду 2061 до нуклеотиду 3545 SEQ ID №: 14. Інфекційний клон може бути присутній у клітині. Промотор РНК полімерази може бути функціонально зв'язаний із полінуклеотидом. Інфекційний клон може мати 2 чи більше делецій, та кожна делеція являє собою, незалежно, щонайменше, 37 95778 6 послідовних нуклеотидів. Ізольований полінуклеотид може додатково містити екзогенний полінуклеотид, присутній у делеції, причому екзогенний полінуклеотид може кодувати поліпептид, такий, як детектовний маркер. Також даний винахід забезпечує ізольований інфекційний полінуклеотид, що містить нуклеотидну послідовність SEQ ID №:1, SEQ ID №:2, SEQ ID №:3, SEQ ID №:4, SEQ ID №:5, SEQ ID №:6, SEQ ID №:7, SEQ ID №:8, SEQ ID №:9, SEQ ID №:10, SEQ ID №:11, SEQ ID №:12, або SEQ ID №:13, та поліпептид nsp2, кодований інфекційним полінуклеотидом, що містить нуклеотидну послідовність SEQ ID №:7, SEQ ID №:8, SEQ ID №:9, SEQ ID №: 10, SEQ ID №:11, SEQ ID №:12 або SEQ ID №:13. Терміни "містить" та їх варіанти не мають обмеженого значення там, де ці терміни вживаються в описі та формулі винаходу. Якщо не вказано інше, то термін "щонайменше, один" означає один чи більш, ніж один. Стислий опис фігур Фігура 1. А. Нуклеотидна послідовність (SEQ ID №:1) інфекційного полінуклеотиду VR-V7 (що також у цій заявці має назву V6G7475A). В. Нуклеотидна послідовність (SEQ ID №:2) інфекційного полінуклеотиду VR-V5. С Нуклеотидна послідовність (SEQ ID №:3) інфекційного полінуклеотиду VR-V5G7475A. D. Нуклеотидна послідовність (SEQ ID №:4) інфекційного полінуклеотиду VR-V6. Е. Нуклеотидна послідовність (SEQ ID №:5) інфекційного полінуклеотиду MN184A. F. Нуклеотидна послідовність (SEQ ID №:6) інфекційного полінуклеотиду MN184B. G. Нуклеотидна послідовність (SEQ ID №:7) інфекційного полінуклеотиду Nsp2 324-434. Η. Нуклеотидна послідовність (SEQ ID №:8) інфекційного полінуклеотиду Nsp2 324-523. І. Нуклеотидна послідовність (SEQ ID №:9) інфекційного полінуклеотиду Nsp2 543-632. J. Нуклеотидна послідовність (SEQ ID №: 10) інфекційного полінуклеотиду Nsp2 633-726. L. Нуклеотидна послідовність (SEQ ID №:11) інфекційного полінуклеотиду Nsp2 543-726. L. Нуклеотидна послідовність (SEQ ID №:12) інфекційного полінуклеотиду Nsp2 727-813. Μ. Нуклеотидна послідовність (SEQ ID №: 13) інфекційного полінуклеотиду Nsp2 324-726. Фігура 2. Зборка повновагомих клонів штаму VR-2332 вірусу РРСС. Геном 15.4 був ампліфікований у чотирьох розділах (І-IV), що включали унікальні сайти розщеплення рестриктаз, що були присутні у вірусній кДНК (Fsel, Avrll, BsrGI), або були додані у послідовність вірусу РРСС на 5' та 3' термінусах шляхом інсерції мутагенезу (Sphl, Рас І відповідно). Промотор полімерази Т7 та 2 нематричні G залишки та Τ залишок передували вірусній послідовності. Вектор рОKІ2 (24) був модифікований таким чином, щоб включати Расl сайт та гепатитний дельта рибозим, розташований нижче поліадензінового хвоста, що складається з 50 нуклеотидів. Фігура 3. Зображення схеми нуклеотидних змін інфекційних клонів або свинячого потомства. Наведена діаграма геномної організації вірусу РРСС, під якою представлені повні геномні порівняння. Передбачувані неструктурні протеїнові розщеп 7 лення, зображені над ORF1a та 1b, позначені стрілками, направленими униз. Характерні фрагменти ідентифіковані під ORF1a та 1b, а стрілки, направлені наверх, вказують їх положення у геномі вірусу РРСС [папаїн-подібна цистеїн протеаза  та  (РСР, ΡCΡ); цистеїн протеаза (СР); серін/3 С протеаза (SP/3CP); полімераза (POL); цистеїн/гістидин збагачений (С/Н); геліказа (Hel); Xenopus laevis гомолог полі(U)-специфічна ендорібонуклеаза (XendoU); Ivanov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101:12694-12699 (2004); Ziebuhr et al., J. Gen. Virol., 81 :853-879 (2000)]. Нуклеотидні відмінності представлені у вигляді вертикальних панелей. 1. wt штам VR-2332 (U87392) порівняно із VR-2332-позідною вакциною (Ingelvac MLV або RespPRRS, AF066183). 2. wt штам VR-2332 порівняно із pVR-V6G7475A. 3. pVR- V5 порівняно із пасивованим in vivo V5-1-P3 (Sw612). 4. wt штам VR-2332 порівняно із Sw612. Детальні нуклеотидні зміни наведені у Таблицях 4 та 5. Фігура 4. Сероконверсія свині після інфікування вірусом РРСС. Зростаючі свині були інфіковані нативним wt штамом VR-2332 (D), Ingelvac MLV (x), V5-1 P3 (О) або їх залишали неінфікованими ( ). У визначені дні були взяті проби сироватки, які аналізували за допомогою IDEXX Elisa для індикації сероконверсії анти-РРСС вірусними антитілами до нуклеокапсидного білка. Фігура 5. А. Аналіз плям потомства P3 (перша лінія) усіх інфекційних клонів, а також wt штаму VR-2332 виявив, що розміри плям відрізнялись. В. Потомство V5-1 Р3 після зростання у свиней (Sw612) продукувало плями, аналогічні wt штаму VR-2332. Фігура 6. А. Аналіз плям потомства P3 (друга лінія) усіх інфекційних клонів, а також wt штаму VR-2332 виявив розміри плям, що відрізнялись від вірусних препаратів першої лінії. В. Титри вірусу Р4 були свідченням того, що потомство інфекційного клону, що не було репліковано як wt штам VR-2332 або Sw612 вірус, замість того, щоб мати подібні розміри плям. Фігура 7. А. Кінетику зростання потомства P3 wt штаму (), Sw612 (▲), pVR-HN ( pVR-V5 (), ), pVR-V5G7475A(), pVR-V6 (), pVR-V6G7475A (Ο) досліджували одночасно в одну стадію, як описано у Прикладі 1. wt штам вірусів VR-2332 та Sw612 репліковані до титрів, які у, приблизно, 10 разів вищі за титри в усі моменти часу. pVR-V6G7475A, без амінокислотних змін від нативного вірусу або вакцини, продукував вірус, що був реплікований до більш високого титру в усі моменти часу, ніж усе інше потомство інфекційного клону. Кінцеві титри для кожного вірусного препарату наведені у таблиці, що додається. Фігура 8. Аналіз Норзерн-блоттінг різних пасажів потомства pVR-V6G7475A, a також Sw612 та вихідна транскрипція in vitro виявили гетерокліти, продуковані ще Р1 та, разом із геномним РНК, більш розповсюджені за допомогою пасажів. Проте, транскрипційна РНК (Тх) не містить видів гетероклітів, що можуть бути легко виявлені. Фігура 9. А. Представлення геному вірусу РРСС у вигляді діаграми. Передбачувані неструктурні протеїнові розщеплення, наведені вище 95778 8 ORF1a та 1b, позначені стрілками, направленими униз. Характерні фрагменти (підпису), визначені нижче ORF1a та 1b, що вказує на їх розташування у вірусному РРСС геномі [папаїн-подібна цистеїн протеаза  та  (PL1); цистеїн протеаза (PL2); серін/3С протеаза (3CL); полімераза (RdRp); геліказа (Hel); Xenopus laevis гомолог полі(U)-специфічна ендорібонуклеаза (N); Ziebuhr et al., 2000; Ivanov et al., 2004; Gorbalenya et al., 2006]. В. Схематична діаграма порівняння ORF1 білку (реплікази) MN184A та MN184B та передбачуваний процесінг. Виродженість, що спостерігалась у nsp2, включена у порівняння. С. Схематична діаграма порівняння ORF2-7 білків MN184A та MN184B. Фігура 10. Вирівнювання ORF5 амінокислотної послідовності дивергентного вірусу РРСС. Темносірі блоки вказують на високу консервативність амінокислот (>80%; між 16 та 19 залишками - ідентичні), помірно сірі (>60%; між 12 та 15 залишками ідентичні), світло-сірі (>40%; між 8 та 11 залишками ідентичні) та незаштриховані (5000 ізолятів) University of Minnesota Veterinary Diagnostic Laboratory, виявив, що ці ізоляти відносились до лінії Типу 2, проте значною мірою відрізнялись від попередніх ізолятів. Додатково, вони були найбільш близько зв'язані із ізолятами, що раніше були виявлені у Канаді на початку 1990 pp. (Mardassi et al., J. Gen. Virol., 75:681-685 (1994)) та у штаті Міннесота у 1998 р. Аналіз поліморфізму довжини фрагментів рестрикції (RFLP) ORF5 також показав, що вони належать до тієї ж групи вірусів, що й більш ранні випадки, відомі як 1-8-4 ізоляти (Wesley et al., J. Vet. Diagn. Invest, 10:140-144 (1998)), які через це одержали назву ізоляти MN184. Через дивовижну відмінність між майже усіма попередньо ізольованими MN ізолятами вірусу РРСС, два з цих нових ізолятів були ампліфіковані лише однократно у 51 свинячих альвеолярних макрофагах (РАМ), клітині-хазяїні, та був проведений аналіз повновагомих геномів вірусів, позначених як MN184 А та MN184B. Ці два ізоляти збирали у різний час на двох окремих фермах. Матеріали та способи Для секвенування MN184 ізолятів, вірусну РНК (вРНК) екстрагували з інфікованої вірусом РРСС клітинної надосадової рідини за допомогою набору QIAmp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)) та здійснювали ЗТ-ПЦР (Qiagen OneStep RT-ПЦР Kit). Праймери (доступні за вимогою) розробляли, виходячи з опублікованих послідовностей різних штамів вірусу РРСС, депозитованих у GenBank, а також знову одержаної MN184 послідовності. Нуклеотидну послідовність 5' двох ізолятів вірусу РРСС одержували з використанням набору 5'-Full RACE Core Kit (TaKaRa Bio, Madison, Wl). 3'-RACE здійснювали за допомогою набору SMARTtm RACE cDNA Amplification Kit (Clontech, Mountain View, CA). ЗТ-ПЦР продукти були очищені за допомогою гель-електрофорезу (QIAquick, Qiagen), клоновані у вектор pGEM-T (Promega, Madison, Wl), а клони 3-5 для кожного ЗТ-ПЦР продукту обирали для секвенування. Визначення нуклеотидної послідовності проводили в обох напрямках за допомогою ПЦР специфічних праймерів або вектору, кодованого SP6 та Т7 промоторними праймерами. Продукти були надані до Advanced Genetic Analysis Center at the University of Minnesota для визначення послідовностей за допомогою автоматичного аналізатора фрагментів ДНК АВІ 377. Одержували якісну послідовність, що представляла, щонайменше, трикратне геномне покриття. Дані щодо послідовності збирали та аналізували за допомогою програми аналізу послідовностей GeneTool (BioTools Inc., Edmonton, Alberta CA) та Lasergene (DNA STAR, Madison, Wis.). Множинне вирівнювання послідовностей здійснювали за допомогою прогорам CLUSTALX (Thompson et al., Nucleic Acids Res., 24:4876-4882 (1997)) або Wisconsin Package Version 10.3 (Accelrys Inc., San Diego, CA). Повновагомі РРСС вірусні послідовності вирівнювали з використанням ClustalX (версія 1.83.1; IUB ДНК вагова матриця, штраф за відкриття гепу 15,00, штраф за продовження гепу 6,66). Результуюче вирівнювання додатково аналізували за допомогою програми Wisconsin Package Version 10.3 Distances Program (метод розрахунку еволюційних дистанцій ДжуксаКантора, частковий збіг був викликаний врахуванням вироджених символів). Для Фігури 10, послідовності вирівнювали за допомогою програми Pileup програмного пакету Wisconsin Package (Blosum62 матриця замін, вага гепу = 8, вага відрізку = 2, зважені кінці). Вирівнювання оцінювали на надмірність та забарвлювали для визначення відсоткової ідентичності за допомогою Jalview (Clamp et al., Bioinformatics, 12:426-427 (2004)), а потім 95778 52 експортували до Adobe Photoshop CS, версія 8.0, для перетворення у шкалу сірого. Для Фігури 11, послідовності вирівнювали за допомогою програми Pileup програмного пакету Wisconsin Package (Blosum62 матриця замін, вага гепу = 8, вага відрізку = 2, зважені кінці). Для Фігури 12 був передбачений сигнальний пептид, з використанням SignalP серверу (Bendtsen et al., J. Mol. ВіоІ., 340:783-795 (2004)). Трансмембранні ділянки одержували за допомогою PHDhtm (Rost et al., Protein Sd., 5:1704-1718 (1996)), а можливі сайти Nглікозилування визначали за допомогою PROSITE (Bairoch et al., Nucleic Acids Res., 25:217-221 (1997)) з використанням серверу PredictProtein server (Rost et al., Nucleic Acids Res., 32:W321W326 (2003)). Послідовності вирівнювали за допомогою програми Pileup програмного пакету Wisconsin Package (Blosum62 матриця замін, вага гепу = 8, вага відрізку = 2, зважені кінці). Результати Геномне вирівнювання продемонструвало, що ці два віруси РРССповністю відрізняються (>14,5% нуклеотидної відмінності) від інших повновагомих секвенованих геномів Північноамериканського Типу 2, навіть порівняння із повновагомими послідовностями Типу 1 (Європейський) підтвердило, що ізоляти мали генотипне походження лише від Типу 2, оскільки вони були лише приблизно на 59% подібні на нуклеотидному рівні як штаму ЄвроРРСС, так і штаму Лелістад. Що дивовижно, ці ізоляти MN184 Типу 2 представляли найкоротші геноми вірусу РРСС, детектовані на сьогодні (15019 нуклеотидів, не включених у полі(А)-хвіст). Крім того, не було визначено конкретної зони, що дало підстави передбачати, що ці ізоляти були одержані у результаті вірусної рекомбінації штамів Типу 1 та Типу 2. Аналіз повновагомої послідовності виявив, що два ізоляти MN184 були дійсно генетично різними. Вони мали нуклеотидну подібність у 98,0%, або відмінність у 2%. Цей відсоток або відмінність були неочікуваними через те, що вони несподівано одночасно спостерігались у Міннесоті, без чіткого останнього родинного ізоляту, що був виявлений на той час у нашій базі даних вірусів РРСС. У Таблиці 6 представлено детальне нуклеотидне та амінокислотне вирівнювання двох ізолятів, а на Фігурі 9 описані амінокислотні відмінності, що спостерігались між цими двома штамами. Обидва ці ізоляти мали нуклеотидну виродженість у декількох ділянках геному, головним чином, у передбачуваній nsp2 ділянці ORF1 (Таблиця 6). Той факт, що у цих ізолятах була виявлена нуклеотидна виродженість, надає підстави припускати, що вірус РРСС може складатись з декількох окремих видів, та часто має назву скупчення пов'язаних, але окремих вірусних послідовностей в інфікованих тваринах. 53 Для більш точного визначення окремих ділянок цих MN184 ізолятів, що проявляли найбільшу відмінність від інших штамів вірусу РРСС та для визначення ділянки (ділянок), що відповідають за відмінність довжин вірусних геномів Типу 2, ці два ізоляти порівняли із послідовністю прототипу Типу 2 штаму VR-2332. Відмінності між двома ізолятами могли бути визначені знов, причому ізолят MN184B мав незначно вищу подібність до штаму VR-2332, ніж ізолят MN184A. Нуклеотидні та амінокислотні порівняння із VR-2332 виявили окремі ділянки MN184 ізолятів, у діапазоні між 81,5-94,7% та 78,4-100%, відповідно, але ділянки, що відповідали ORF5 (86,4-86,7% та 87,0-87,5%, відповідно) передбачали nsp1  (83,8-84,0% та 84.8-85.4%, відповідно, a nsp2 (81,5-85,5% та 78,4-79,5%, відповідно) була найбільш варіабельною. Найбільш цікавим було те, що лише у передбачуваній геномній ділянці nsp2 було виявлено відмінності у нуклеотидній довжині, а обидва MN184 ізоляти мали таку ж саму nsp2 делецію, детально описану нижче. Порівняння також виявило, що 5' та 3' UTR були найбільш консервативними ділянками геному 95778 54 (94,7% та 94,0%, відповідно), що вказує на консервативність послідовності у ділянках, важливих для вірусної реплікації та транскрипції. ORF5 кодує гетерогенний структурний білок вірусу РРСС (GP5) та його часто використовують для діагностичного визначення вірусу РРСС (Kapur et al., J. Gen. Virol, 77:1271-1276 (1996)). GP5 є передбачуваним три-трансмембранним білком, що містить ендодомен та ектодомен. Ектодомен з 30 амінокислот складається з короткого висококонсервативного домену, що зазвичай містить, щонайменше, два сайти N-глікозилування, зв'язані двома гіперваріабельними ділянками. Було показано, що висококонсервативний домен, що складається з цих 30 амінокислот, кодує епітоп приєднання вірусу у штамах Типу 2 (Plagemann, Virology, 290:11-20 (2001); Ostrowski et al., J. Virol., 76:4241-4250 (2002); Plagemann et al., Arch. Virol., 147:2327-2347 (2002)). Були вирівняні (Фіг. 10) GP5 з того ж набору повновагомих геномів, а також оригінальні RFLP184 ізоляти, ідентифіковані у Канаді (IAF-93-653, IAF-ΚΙοp) та у 1998-1999 pp. у Міннесоті (98-3298, 98-3403, 99-3584). Вирівню 55 вання GP 5 вірусу РРСС виявило амінокислотні ідентичності у діапазоні від 82,5% до 87,7% між новими MN184 ізолятами та іншими не-RFLPI 84 штамами Типу 2. Цікаво, що амінокислотні відмінності між новими MN184 ізолятами та більш пізніми RFLP184 ізолятами були достатньо значними (5,7%-12,2%) і тому ми не детектували чіткого джерела вірусу RFLP184. Обмежене вирівнювання виявило, що більшість амінокислотних відмінностей, що спостерігались, були знайдені у гіперваріабельних ділянках (Фіг. 10). Два консервативні сайти N-глікозилування зберігались у MN184 ізолятах, за винятком детектованої нуклеотидної виродженості, що кодувала амінокислоту 44 в ізоляті MN184 В. Nsp1  кодує папаїн-подібну цистеїн протеазу (den Boon et al., J. Virol., 69:4500-4505 (1995)). Було проведено амінокислотне вирівнювання ізолятів MN184 за допомогою не-дубльованого набору наявних послідовностей nsp1  Типу 2, а також вірусних штамів ЄвроРРСС та Лелістад Типу 1 (Фіг. 11). Білок nsp1  містить ряд повністю консервативних амінокислот, а запропоновані каталітичні залишки зберігались в усіх секвенованих геномах (den Boon et al., J. Virol, 69:4500-4505 (1995)). Вирівнювання, впорядковане амінокислотною подібністю, вказало, що ізоляти MN184 є більш подібними до штамів Типу 1, ніж інші секвеновані повновагомі послідовності Типу 2. Зокрема, п'ять амінокислот (поміщені у рамки на Фіг. 11) є безпосередніми міметиками штамів Типу 1. Проте, амінокислоти, що були консервативними в інших недубльованих послідовностях Типу 2 були також майже усі консервативні в ізолятах MN184, але окремі амінокислоти та амінокислотна подібність (84,8-85,4%) виявили більш дивиргентний білок Типу 2, наявність якого на сьогодні доведена. Таким чином, вирівнювання додатково визначає залишки nsp1 , що залишились, які можуть бути критичними для циклу реплікації вірусу РРСС. Амінокислотне вирівнювання не-дубльованих послідовностей nsp2, впорядкованих за парною ідентичністю, наведене на Фігурі 12. Домен висококонсервативної химотрипсін-подібної цистеїн протеази (PL2), наявний у N-термінусі, був попередньо передбачений шляхом вирівнювання nsp2 з кінським вірусом артеріту (EAV) (Snijder et al., J. Gen. Virol., 79:961- 979 (1998); Ziebuhr et al., J. Gen. Virol., 81:853-879 (2000)). 3-4 передбачувані трансмембранні домени розташовані близько до С-термінусу цього білку (McGuffin et al., Bioinformatics, 16:404-405 (2000)), проте точний сайт С-термінального розщеплення не був виявлений емпірично. Було запропоновано два прогнози щодо сайту С-термінального розщеплення, один - GG в амінокислоті 980 nsp2 VR-2332 (Allende et al., J. Gen. Virol., 80:307-315 (1999)) та інший в амінокислоті 1197 (Ziebuhr et al., J. Gen. Virol., 81 :853-879 (2000)), проте у межах цього білку існують декілька повністю консервативних GG дублетів (амінокислоти 646, 980, 1116, 1196, 1197 nsp2 VR-23332; стрілки, направлені униз на Фіг. 12). У попередніх працях також було показано, що передбачуваний nsp2 білок, збагачений проліном, та містить множинні можливі В-клітинні епіто 95778 56 пи (Oleksiewicz et al., J. Virol., 75:3277-3290 (2001); Fang et al., Virus Res., 100:229-235 (2004); Ropp et al., J. Virol., 78:3684-3703 (2004)). Велика середня ділянка nsp2 вірусу РРСС (амінокислоти nsp2 148880VR-2332) не має визначеної функції, але є високоваріабельною у довжину. Додатково, різниця між довжинами секвенованих штамів вірусу РРСС Типу 1 та Типу 2 була відображена у цій варіабельній середній ділянці nsp2 (Фіг. 12). До теперішнього часу, було показано, що секвеновані геноми Типу 1 є 313-364 основами, більш короткими, ніж більшість вірусів РРСС Типу 2 (Meulenberg et al., Virology, 192:62-72 (1993); Fang et al., Virus Res., 100:229-235 (2004), Ropp et al., J. Virol., 78:36843703 (2004)). Проте, множинні вирівнювання послідовностей встановили, що геном MN184 містить найбільш коротку передбачувану nsp2 на теперішній час (2547bp), 393bp є більш короткою, ніж прототип ний штам VR-2332 Типу 2. Додатково, він містив три дискретні делеції у трансльованому білку, де розміри делецій становили 111, 1 та 19 амінокислот, відповідно, що відповідає амінокислотним положенням у штамі VR-2332 вірусу РРСС nsp2 324-434, 486 та 505-523, відповідно (Фіг. 12). Три делеції призводили до втрати декількох залишків проліну та передбачуваних В-клітинних епітопів. Окрім цих делецій, спостерігались також значні зміни в амінокислотній послідовності nsp2 порівняно із іншими штамами Типу 2, що подекуди відповідали амінокислоті Типу 1, виявленій у такому самому відносному положенні (Фіг. 12). Порівняння передбачуваного білку nsp2 двох генотипів вірусу РРСС показало, що амінокислотна ідентичність у межах вірусів Типу 2 знаходилась у діапазоні від 66% до 99%, та становила 88-90% у межах вірусів Типу 1, але дуже відрізнялась між генотипами (