Антитіло, яке специфічно зв’язується з нейропіліном-1 (nrp1)

Реферат: Винахід належить до антитіла, яке специфічно зв’язується з нейропіліном-1 (NRP1), та являє собою антитіло, позначене як YW64.3. Винахід також належить до полінуклеотиду, що кодує дане антитіло, способу одержання антитіла, фармацевтичної композиції, що його містить, набору для діагностування та лікування, способу інгібування зв’язування NRP1 із семафорином, способу виявлення білка NRP1 в зразку та застосування антитіла для приготування лікарського засобу, призначеного для лікування або попередження порушення, асоційованого з патологічним ангіогенезом у ссавця. UA 98585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Дана заявка являє собою непопередню заявку, що згідно 35 U.S.C. 119(е) посягає на пріоритет попередніх заявок сер. № 60/734798, поданої 8 листопада 2005 p., і сер. № 60/820561, поданої 27 липня 2006 p., повний зміст яких включено в даний опис як посилання. Даний винахід відноситься в цілому до композицій і способів, які впливають на різні види активності нейропіліну (NRP). Більше конкретно винахід відноситься до композицій і способів модуляції утворення й підтримки судин, опосередковуваної рецептором нейропіліну-1 (NRP1). Даний винахід відноситься також до способів скринінгу терапевтичних субстанций, які можна застосовувати для попередження або лікування станів і захворювань, асоційованих з ангіогенезом. Розвиток судинної системи є основною умовою для багатьох фізіологічних і патологічних процесів. Для активно зростаючих тканин, таких як тканини ембріонів і пухлин, потрібне відповідне постачання кров'ю. Для задоволення цієї потреби в них продукуються проангіогенні фактори, які підсилюють формування й підтримку нових судин за допомогою процесу, що звичайно називають ангіогенезом. Формування судин являє собою складний, але впорядкований біологічний процес, що включає всі або деякі з наступних стадій: а) проліферацію ендотеліальних клітин (ЕК) на основі існуючих ЕК або їх диференцировка із клітин-попередників; б) міграцію й злипання ЕК з утворенням структур, що мають форму тяжів; в) наступне утворення трубок (тубулогенез) із судинних струн з формуванням судин, що мають центральну порожнину, г) утворення відростків від існуючих тяжів або судин с формуванням вторинних судин; д) додаткове ремоделювання й реструктурування первинного судинного сплетіння; і є) рекрутмент пери-ендотеліальних клітин для оточення зовні (упакування) ендотеліальних трубок, що забезпечує підтримку судин і їхні модуляторні функції; такими клітинами є перицити для невеликих капілярів, гладеньком'язові клітини для великих судин і міокардіальні клітини у серці (Hanahan D. Science 277, 1997, cc. 48-50; Hogan В. L. I Kolodziej P. A. Nature Reviews Genetics. 3, 2002, cc. 513-523; Lubarsky В. і Krasnow M. A. Cell. 112, 2003, cc. 19-28). У цей час установлено, що ангіогенез бере участь у патогенезі різних порушень. До них відносяться щільні пухлини й метастази, атеросклероз, ретролентальна фіброплазія, гемангіоми, хронічне запалення, внутріочні неоваскулярні хвороби, такі як проліферативні ретинопатії, наприклад, пов'язана з діабетом ретинопатія, пов'язана з віком дегенерація жовтої плями (AMD), неоваскулярна глаукома, імунне відторгнення трансплантованої рогівкової тканини й інших тканин, ревматоїдний артрит і псоріаз (Folkman і ін., J. Biol. Chem., 267, 1992, cc. 10931-10934; Klagsbrun і ін., Annu. Rev. Physiol. 53, 1991, cc. 217-239 і Gamer A., "Vascular diseases", в: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, під ред. Garner A., Klintworth GK., 2-oi изд., з Marcel Dekker, NY, 1994, cc. 1625-1710). У випадку росту пухлини ангіогенез, імовірно, має вирішальне значення для переходу від гіперплазії до неоплазії й для забезпечення харчування, необхідного для росту й метастазування пухлини (Folkman і ін., Nature 339, 1989, с. 58). Неоваскуляризація дозволяє здобувати пухлини перевагу з позицій росту й проліферативну автономію в порівнянні зі здоровими клітинами. Пухлина, як правило, починається з однієї аномальної клітини й у результаті проліферації може збільшуватися в розмірі тільки до декількох кубічних міліметрів через далекість від доступного капілярного ложа й може залишатися "дрімаючою" без подальшого росту й дисемінації протягом тривалого періоду часу. Деякі пухлинні клітини потім перемикається на ангіогенний фенотип, що приводить до активації ендотеліальних клітин, які розростаються й дозрівають із утворенням нових капілярних кровоносних судин. Ці кровоносні судини, що знову утворилися, не тільки забезпечують продовження росту первинної пухлини, але також і дисемінацію, і повторну колонізацію метастатичних пухлинних клітин. Так, виявлена кореляція між щільністю мікросудин у зрізах пухлини молочної залози й виживанням пацієнтів, що страждають зазначеним видом раку, а також деякими іншими пухлинами (Weidner і ін., N. Engl. J. Med 324, 1991, cc. 1-6; Horak і ін., Lancet 340, 1992, cc. 1120-1124; Macchiarini і ін., Lancet 340, 1992, cc.145-146). Точний механізм, що контролює перемикання ангіогенезу, поки недостатньо вивчений, але можна припустити, що неоваскуляризація маси пухлини є результатом чистого балансу безлічі стимуляторів і інгібіторів ангіогенезу (Folkman, Nat Med 1(1), 1995, cc. 27-31). Процес розвитку судини чітко регулюється. До теперішнього часу виявлений цілий ряд молекул, більшість із яких являють собою секретуємі фактори, продуковані навколишніми клітинами, які беруть участь у регуляції диференцировки, проліферації, міграції й злипанні ЕК з утворенням структур, що мають форму тяжів. Наприклад, установлено, що судинний ендотеліальний фактор росту (VEGF) є фактором, що має вирішальне значення, що бере участь у стимуляції ангіогенезу й в індукції проникності судин (Ferrara і ін., Endocr. Rev. 18, 1997, 1 UA 98585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 cc. 4-25). Дані про те, що втрата навіть одного алеля VEGF приводить до загибелі ембріонів, свідчать про ту незамінну роль, що грає цей фактор в розвитку й диференціюванні судинної системи. Крім того, установлено, що VEGF є ключовим медіатором неоваскуляризації, асоційованої з пухлинами й внутріочними порушеннями (Ferrara і ін., Endocr. Rev., вище). Для мРНК VEGF характерна надекспресія в більшості вивчених типів пухлин людини (Berkman і ін., J Clin Invest 91, 1993, сс. 153-159; Brown і ін., Human Pathol. 26, 1995, cc. 86-91; Brown і ін., Cancer Res. 53, 1993, сс. 4727-4735; Mattern і ін., Brit. J. Cancer. 73, 1996, cc. 931-934; і Dvorak і ін., Am J. Pathol. 146, 1995, cc. 1029-1039). Крім того, концентрація VEGF у рідинах ока добре корелює з наявністю активної проліферації кровоносних судин у пацієнтів, що страждають діабетом і іншими пов'язаними з ішемією ретинопатіями (Aiello і ін., N. Engl. J. Med. 331, 1994, сс. 1480-1487). Крім того, у сучасних дослідженнях установлено, що VEGF локалізовано в хороїдальних неоваскулярних мембранах пацієнтів, що страждають AMD (Lopez і ін., Invest. Ophtalmo. Vis. Sci. 37, 1996, cc. 855-868). Нейтралізуючі антитіла до VEGF придушують рост різних людських ліній пухлинних клітин у безтимусних мишей (Кіт і ін., Nature 362, 1993, сс. 841-844; Warren J. Clin. Invest. 95, 1995, cc. 1789-1797; Borgstrom і ін., Cancer Res. 56, 1996, cc. 4032-4039; і Melnyk і ін., Cancer Res. 56, 1996, cc. 921-924), а також інгібують внутріочний ангіогенез на моделях ішемічних порушень сітківки (Adamis і ін., Arch. Ophthalmol. 114, 1996, сс. 66-71). Таким чином, моноклональні антитіла до VEGF або інші інгібітори дії VEGF є перспективними кандидатами для лікування пухлин і різних внутріочних пов'язаних з неоваскуляризацією порушень. Такі антитіла описані, наприклад, в ЕР 817648, опублікованої 14 січня 1998 р. і в WO 98/45331 і WO 98/45332, опублікованих 15 жовтня 1998 р. Одне з антитіл до VEGF, бевасизумаб, дозволено FDA для застосування в сполученні з хіміотерапевтичною обробкою для лікування метастатичного колоректального раку (CRC) і недрібноклітинного раку легеней (NSCLC). Бевасизумаб проходить вивчення в багатьох, що проводяться в цей час клінічних дослідах з погляду лікування різних пов'язаних з раком показань. У процесі розвитку нервової системи від нейронів відходять нитьоподібні аксони, які мігрують на більші відстані для досягнення своїх мішеней (див. огляд Carmeliet і Tessier-Lavigne, Nature 436, 2005, cc. 193-200). На провідній верхівці зростаючого аксона перебуває сенсорна структура, що володіє великою рухливістю, що називають точкою росту. Завдяки динамічним циклам розпрямлення й стиску філоподіальних виростів точка росту постійно сприймає й оцінює безліч забезпечуючих спрямованість (керівних) сигналів у навколишньому просторі й точно вибирає правильний шлях поширення до кінцевої мішені. В останні десятиліття досягнуто помітний прогрес у розумінні механізмів, що забезпечують спрямованість аксонів (див. огляд Dickson, Science 298, 2002, cc. 1959-1964). Сигнали, що забезпечують спрямованість, можна розділяти на 4 типи: атрактанти й репеленти; вони можуть діяти або в невеликому діапазоні (тобто в межах клітини або матрикса), або в більше широкому діапазоні (тобто мають здатність до поширення). До теперішнього часу ідентифіковано 4 основних класів молекул аксонів, що забезпечують спрямованість: нетрини, семафорний, ефріни й "слити" (slit) (див. огляд Huber і ін., Annu Rev Neurosci 26, 2003, cc. 509-563). Семафорний (Sema), які називають також колапсинами, належать до великого сімейства філогенетично консервативних секретованих і асоційованих з мембраною білків. Представники сімейства семафоринів мають здатність опосередковувати зв'язані як з відштовхуванням, так і із залученням (атрактивністю) процесів, що забезпечують спрямованість, при розвиткові нейрона (Raper, Curr Opin Neurobiol 10, 2000, cc. 88-94). До теперішнього часу ідентифіковано більше 30 семафоринів, які всі характеризуються наявністю консервативного N-кінцевого домена Sema, що складається приблизно з 500 амінокислот. Представників семафоринів розділяють на 8 підродин залежно від їхньої структурної подібності й видів, з яких вони отримані. Більше докладну інформацію про уніфіковану номенклатуру семафоринів можна знайти в: Semaphorin Nomenclature Committee, Cell 97, 1999, cc. 551-552. Сімейство нейропіліну (NRP) складається із двох гомологічних білків нейропіліну-1 (NRP1) і нейропіліну-2 (NRP2). NRP1 був уперше ідентифікований як трансмембранний глікопротеїн типу І масою 130 кДа, що експресується в точках росту зростаючих аксонів. Потім за допомогою експресійного клонування був ідентифікований NRP2 (Fujisawa і Kitsukawa, Curr Opin Neurobiol 8, 1998, cc. 587-592). Установлено, що NRP являють собою рецептори для підгрупи семафоринів, а саме класу 3 семафоринів. Існує припущення про те, що NRP функціонують у якості не передавальних сигнали корецепторів поряд з іншим сімейством семафоринових рецепторів, таких як плексини. 2 UA 98585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Хоча NRP уперше описані як медіатори, що забезпечують спрямованість аксонів, установлено також, що вони відіграють основну роль у розвитку судин (Carmeliet і TessierLavigne, 2005). Вони ідентифіковані в якості специфічного для конкретної ізоформи рецептора VEGF, що експресується на пухлинні й ендотеліальних клітинах, що обумовлює проведення великих досліджень, спрямованих на з'ясування ролі NRP у біології судин і пухлин (Soker і ін., Cell 92, 1998, сс. 735-745; Klagsbrun і ін., Adv Exp Med Biol 515, 2002, сс. 33-48). Генетичні дослідження дозволили точно довести, що Nrp1 необхідно для судинного морфогенезу. Втрата функції Nrp1 приводить до прояву пов'язаних з ремоделюванням і розгалуженістю дефектів судин, до фенотипу, що може додатково підсилюватися в результаті втрати функції Nrp2 (Kawasaki і ін., Development 126, 1999, сс. 4895-4902; Takashima і ін., Proc Natl Acad Sci USA 99, 2002, сс. 3657-3662). Ці результати дозволили припустити, що на ранній стадії розвитку Nrp1 і Nrp2 можуть мати функції, що перекриваються. Однак на більше пізніх стадіях розвитку локалізація експресії кожного Nrp стає різною, так, Nrp1 експресується, насамперед в артеріях, a Nrp2 у венах і лімфатичних судинах (Yuan і ін., Development 129, 2002, сс. 4797-4806; Herzog і ін., Mech Dev 109, 2001, сс. 115-119). Слід зазначити, що втрата тільки функції Nrp2 специфічно порушує розвиток лімфатичної системи. Оскільки під час розвитку Nrp1 експресується в багатьох інших типах клітин, роль судинного Nrp1 проявляється за допомогою створення ЕКспецифічного "вимикання" (knock-out, КО), що приводить до судинних дефектів, аналогічним виявленим при алелі, що мовчить (Gu і ін., Dev Cell 5, 2003, cc. 45-57). Важливо відзначити, що в цьому дослідженні встановлено також, що для розвитку судин не потрібне зв'язування Sema3A з NRP1. В іншім дослідженні були виявлені дефекти в забезпеченні спрямованості ендотеліальних верхівкових клітин при розвитку ромбоподібного мозку в Nrp1 - КО-ембріонів (Gerhardt і ін., Dev Dyn 231,2004, cc. 503-509). Не дивлячись на широке вивчення ролі NRP1 у розвитку судин, залишається неясним чи проявляє NRP1 свою функцію в судинах тільки через шлях VEGF-рецептор 2 VEGF (VEGFR2) як підсилювач зв'язування VEGF з VEGFR2, і тим самим, підсилюючи передачу VEGFR2сигналу, або через шлях передачі сигналу, що не залежить від VEGFR2, або шляхом сполучення зазначених шляхів. Моноклональні антитіла можна одержувати на основі технології рекомбінантної ДНК. Широке застосування одержали створені моноклональні антитіла, зокрема, отримані з організму гризунів, однак антитіла з організму, крім людини, часто є антигенними для людини. У даній галузі були початі спроби перебороти цю проблему шляхом конструювання "химерних" антитіл, у яких антигензв'язуючий центр антитіла з організму крім людини зшивають із людською константною ділянкою (Cabilly і ін., US 4816567). Ізотип людської константної ділянки можна вибирати з метою зміни здатності антитіла брати участь в антитіло-обумовленій клітиннозалежної цитотоксичности (ADCC) і комплементзалежної цитотоксичности. Ще однією спробою зниження антигензв'язуючих функцій антитіл і мінімізації застосування гетерологічних послідовностей у людських антитілах, було створення гуманізованих антитіл до різних антигенів, у яких ділянки, що значно уступають по розміру інтактної людської варіабельної ділянки, були замінені на відповідну послідовність із організмів крім людини. Наприклад, залишки з організму гризунів були замінені на відповідні сегменти людського антитіла. На практиці гуманізовані антитіла, як правило, являють собою людські антитіла, у яких деякі залишки гіперваріабельних ділянок (CDR) і можливо деякі залишки каркасної ділянки (FR) замінені залишками аналогічних доменів антитіл гризунів (Jones і ін., Nature 321, 1986, cc. 522525; Riechmann і ін., Nature 332, 1988, сc. 323-32; Verhoeyen і ін., Science 239, 1988, cc. 15341536). Перед введенням людині терапевтичного антитіла, як правило, проводять доклінічні досліди на ссавцях крім людини для оцінки ефективності й/або токсичності антитіла. В ідеальному варіанті антитіла, які піддають таким дослідженням, мають здатність розпізнавати й взаємодіяти з високою ефективністю з антигеном-мішенню, що є ендогенним для тварини-хазяїна, такого як миша або примат, крім людини. Фагова дисплейна технологія являє собою ефективний інструмент створення й відбору нових білків, які зв'язуються з лігандом, таким як антиген. За допомогою методу фагової презентації можна створювати великі бібліотеки варіантів білків і швидко вибирати в них ті послідовності, які зв'язуються з високою аффінністю з антигеном-мішенню. Нуклеїнові кислоти, що кодують варіанти поліпептидів, зливають із нуклеотидною послідовністю, що кодує вірусний оболонковий білок, такий як білок, кодуємий геном III, або білок, кодуємий геном VIII. Створені моновалентні фагові дисплейні системи, у яких нуклеотидну послідовність, що кодує білок або поліпептид, зливають із нуклеотидною послідовністю, що кодує частину білка, кодуємого геном III (Bas, S., Proteins 8, 1990, с. 309; Lowman i Wells, Methods: A Companion to Methods in 3 UA 98585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Enzymology 3, 1991, с. 205). При використанні моновалентної фагової дисплейної системи здійснюють експресію з невисокими рівнями генного злиття й експресують також білки, кодуємі геном III дикого типу, у результаті чого зберігається інфективність часток. Методи створення пептидних бібліотек і скринінгу зазначених бібліотек описані в цілому ряді патентів (див., наприклад, U.S. 5723286, U.S. 5432018, U.S. 5580717, U.S. 5427908 і U.S. 5498530). Важливою для створення фагових дисплейних бібліотек антитіл є демонстрація експресії пептидів на поверхні нитьового фага й експресія функціонально активних фрагментів антитіл у периплазмі Е. coli (Smith і ін., Science 228, 1985, с. 1315; Skerra і Pluckthun, Science 240, 1988, с. 1038). Бібліотеки антитіл або антигензв'язуючих поліпептидів створювали численними шляхами, у тому числі шляхом зміни індивідуального гена шляхом вбудовування довільних послідовностей ДНК або шляхом клонування сімейства родинних генів. Методи презентації антитіл або антигензв'язуючих фрагментів з використанням фагової дисплейної бібліотеки описані в U.S. 5750373, 5733743, 5837242, 5969108, 6172197, 5580717 і 5658727. Потім бібліотеку піддають скринінгу відносно експресії антитіл або антигензв'язуючих білків з необхідними характеристиками. Фагова дисплейна технологія має кілька переваг у порівнянні із загальноприйнятими методами одержання антитіл з необхідними характеристиками на основі гібридом або рекомбінантної ДНК. Ця технологія дозволяє створювати великі бібліотеки антитіл із широкою розмаїтістю послідовностей у більше короткий час і без використання тварин. Для одержання гібридом або одержання гуманізованих антитіл може знадобитися навіть кілька місяців. Крім того, оскільки для створення фагових дисплейних бібліотек не потрібна імунізація, їх можна створювати для антигенів, які є токсичними або мають низку антигенність (Hogenboom, Immunotechniques 4, 1988, cc. 1-20). Фагові бібліотеки антитіл можна застосовувати також для створення й ідентифікації нових терапевтичних антитіл. Фагові дисплейні бібліотеки застосовували для створення людських антитіл з імунізованих, неімунізованих людей, послідовностей зародкової лінії або популяції Ig інтактних (несенсибілізованих) В-клітин (Barbas і Burton, Trends Biotech 14, 1996, с. 230; Griffiths і ін., EMBO J. 13, 1994, с 3245; Vaughan і ін., Nat. Biotech. 14, 1996, с. 309; Winter, ЕР 0368684В1). Були створені інтактні або неімунні антигензв'язуючі бібліотеки з використанням різних лімфоїдних тканин. Деякі з таких бібліотек надходять у продаж, наприклад, створені на фірмі Cambridge Antibody Technology and Morphosys (Vaughan і ін., Nature Biotech 14, 1996, с 309; Knappik і ін., J. Моl. Biol. 296, 1999, с. 57). Однак багато які із зазначених бібліотек мають обмежену розмаїтість. Можливість ідентифікувати й виділяти високоафінні антитіла з фагової дисплейної бібліотеки є важливою для виділення нових антитіл, призначених для терапевтичного застосування. Виділення високоафінних антитіл з бібліотеки залежить від розміру бібліотеки, ефективності їхнього одержання в бактеріальних клітинах і розмаїтості бібліотеки (див, наприклад, Knappik і ін., J. Моl. Biol. 296, 1999, с 57). Розмір бібліотеки зменшується в результаті неефективного виробництва через неправильне укладання антитіла або антигензв'язуючого білка й присутності стоп-кодонів. Експресія в бактеріальних клітинах може інгібуватися при неправильному укладанні антитіла або антигензв'язуючого центра. Експресію можна підвищувати шляхом заміни залишків у вигинах поверхні розділу варіабельної/константної ділянки або відібраних залишків в CDR (Deng і ін., J. Віоl. Chem. 269, 1994, с. 9533, Ulrich і ін., PNAS, 92, 1995, сс. 11907-11911; Forsberg і ін., J. Biol. Chem. 272, 1997, с. 12430). Послідовність каркасної ділянки являє собою фактор, що бере участь у забезпеченні правильного укладання, коли фагові бібліотеки антитіл продукують у бактеріальних клітинах. Для виділення високоафінних антитіл важливо також створення бібліотеки антитіл або антигензв'язуючих білків з високою розмаїтістю. Бібліотеки з розмаїтістю в обмежених CDR були створені з використанням різних підходів (див., наприклад, Tomlinson, Nature Biotech. 18, 2000, сс. 989-994). CDR3-ділянки становлять інтерес у цьому плані, оскільки вони часто беруть участь у зв'язуванні антигену. CDR3-ділянки важкого ланцюга значно варіюються по розмірі, послідовності й структурній конформації. Інші підходи урізноманітнення передбачають рандомізацію CDR-ділянок варіабельних ділянок важких і легких ланцюгів з використанням всіх 20 амінокислот у кожному положенні. Установлено, що застосування всіх 20 амінокислот може приводити до широкої розмаїтості послідовностей варіантів антитіл і підвищувати шанс ідентифікації нових антитіл (Barbas, PNAS 91, 1994, с. 3809; Yelton D.E, J. Immunology 155, 1995, с. 1994; Jackson J.R., J. Immunology 154, 1995, с. 3310 і Hawkins RE, J. Моl. Biology 226, 1992, с. 889). Даний винахід відноситься до нових антитіл до NRP1, що володіє здатністю модулювати щонайменше один опосередковуваний нейропіліном вид біологічної активності. Переважно 4 UA 98585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитіла до NRP1 являють собою антагоністичні антитіла, які мають здатність інгібувати щонайменше один опосередковуваний нейропіліном вид біологічної активності. Більш конкретно, у даному винаході запропоновані способи одержання антитіл до NRP1 зі створеної фагової бібліотеки людських синтетичних антитіл і додання антитілам до NRP1 нової функції, що блокує. Антитіла до NRP1, пропоновані у винаході, можна розділяти на два класи залежно A від типу їхнього зв'язування з NRP1: антитіла до NRP1 (включаючи YW64.3 і його варіанти), які B зв'язуються з CUB-доменами (ala2) NRP1; і антитіла до NRP1 (включаючи YW 107.4 і його варіанти), які зв'язуються з доменами фактора коагуляції V/VIII (b1b2) NRP1. A Согласно одному з об'єктів винаходу антитіла до NRP1 , пропоновані у винаході, можна вибирати із клонів антитіла "YW64", представлених у таблиці III, які мають ідентифіковані часткові послідовності CDR і афінність до зв'язування з мишачими й людськими NRP1. Антитіло A до NRP1 , пропоноване у винаході, переважно містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що несе наступні амінокислотні послідовності CDR: CDRL1 (RASQSISSYLA; SEQ ID NO:123), CDRL2 (GASSRAS; SEQ ID NO:124) і CDRL3 (QQYMSVPIT; SEQ ID NO:125). Наприклад, A антитіло до NRP1 містить послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, що A представлена в SEQ ID NO:3. Антитіло до NRP1 , пропоноване у винаході, переважно містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що несе наступні амінокислотні послідовності CDR: CDRH1 (GFSFSSEPIS; SEQ ID NO:126), CDRH2 (SSITGKNGYTYYADSVKG; SEQ ID NO:127) і A CDRH3 (WGKKVYGMDV; SEQ ID NO:128). Наприклад, антитіло до NRP1 містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, що представлена в SEQ ID NO:4. Більше краще антитіло A до NRP1 , пропоноване у винаході, являє собою антитіло YW64.3, що містить послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, що представлена в SEQ ID NO:3, і послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, що представлена в SEQ ID NO:4. B Відповідно до наступного об'єкта винаходу антитіла до NRP1 , пропоновані у винаході, можна вибирати із клонів антитіла "YW107.4", представлених у таблиці IV, які мають ідентифіковані часткові послідовності CDR і афінність до зв'язування з мишачими й людськими NRP1. Антитіло до NRP1, пропоноване у винаході, переважно містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що несе наступні амінокислотні послідовності CDR: CDRL1 (RASQYFSSYLA; SEQ ID NO:129), CDRL2 (GASSRAS; SEQ ID NO:130) і CDRL3 (QQYLGSPPT; SEQ ID NO:131). B Наприклад, антитіло до NRP1 містить послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, що представлена в SEQ ID NO:5. Антитіло до NRP1, пропоноване у винаході, переважно містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що несе наступні амінокислотні послідовності CDR: CDRH1 (GFTFSSYAMS; SEQ ID NO:132), CDRH2 (SQISPAGGYTNYADSVKG; SEQ ID NO:133) і B CDRH3 (ELPYYRMSKVMDV; SEQ ID NO:134). Наприклад, антитіло до NRP1 містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, що представлена в SEQ ID NO:6. Більше B краще антитіло до NRP1 , пропоноване у винаході, являє собою антитіло YW107.4.87, що містить послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, що представлена в SEQ ID NO:5, і послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, що представлена в SEQ ID NO:6. У даному винаході запропоноване також застосування антитіл до NRP1 для лікування асоційованих з ангіогенезом порушень, таких як рак. В одному із кращих варіантів здійснення винаходу антитіла до NRP1, пропоновані у винаході, застосовують у сполученні з антитілом до VEGF. Краще антитіло до VEGF має здатність до зв'язування з тим же епітопом VEGF, що й антитіло А4.6.1. Більше краще антитіло до VEGF являє собою бевасизумаб або ранибизумаб. На кресленнях показано: на фіг. 1 - специфічність до зв'язування антитіл до NRP1. (1А) Антитіла до NRP1 зв'язуються специфічно з людським і мишачим NRP1. Специфічність до зв'язування антитіл до NRP1 YW64.3 і YW107.4 виді Ig (10 мкг/мл) оцінювали по зв'язуванню з лунками, сенсибілізованими hNRP1, mNRP1, hNRP2, mNRP2, Erb2-ECD або БСА, і зв'язані Ig виявляли за допомогою кон'югатів антитіла до людського Ig з HRP. (1Б) Результати FACS-аналізу антитіл до NRP1 YW64.3 і YW 107.4 у вигляді Ig, що свідчать про здатності антитіл зв'язуватися з білком, що перебуває на клітинній поверхні, NRP1 (HUVEC); на фіг. 2 - дані про здатності до зв'язування антитіла до NRP1 YW107.4 і його варіанти з B дозрілої аффінністю YW107.4.87 (анти-NRP1 ). (2А) Результати кінетичного BIAcore-аналізу варіанта з дозрілої аффінністю YW107.4.87. (2Б) Результати FACS-аналізу YW107.4 і YW107.4.87 у вигляді Ig, що свідчать про підвищену здатність до зв'язування варіанта з дозрілої аффінністю YW107.4.87 с білком, що перебуває на клітинній поверхні, NRP1 (HUVEC); A на фіг. 3 - послідовності варіабельних ділянок YW 64.3 (анти-NRP1 ) і YW107.4.87 (антиB NRP1 ) і послідовності h4D5, наведені для порівняння. Нумерація основ проведена по базі даних Кебота. Послідовності CDR перебувають у позначеної прямокутником ділянці. (3А) Послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга h4D5 (SEQ ID NO:1), YW 64.3 (SEQ ID 5 UA 98585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 NO:3) і YW107.4.87 (SEQ ID NO:5). (3Б) Послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга h4D5 (SEQ ID NO:2), YW 64.3 (SEQ ID NO:4) і YW107.4.87 (SEQ ID NO:6); на фіг. 4 - дані, що свідчать про блокування антитілами до NRP1 зв'язування VEGF 165 з NRP1; на фіг. 5 - результати кількісної оцінки індукованого Sema3A колапси DRG (ганглії спинного A корінця) (5А) і індукованого Sema3F-колапси гіпокампа (5Б). Показано, що aнти-NRP1 специфічно блокує індукований Sema3A колапс точки росту нейрона DRG, але не блокує індукований Sema3F колапс точки росту нейрона гіпокампа; на фіг. 6 - дані, що свідчать про те, що антитіла до NRP1 мають здатність інгібувати індуковану VEGF міграцію клітин лінії HUVEC і утворення відростків in vitro. (6A) Результати -11 кількісного аналізу міграції (n = 6 для кожного варіанта). *р = 0.00003; **р=9,9×10 ; критерій Ст'юдента. (6Б) Результати кількісного аналізу утворення відростків від гранули, n = 12-14 гранул на кожний варіант; на фіг. 7 - дані, що свідчать про інгібуючу дію in vivo антитіл до NRP1 на ремоделювання судин у сітківці, що розвивається, мишей. (7А) - Проілюстрований розвиток судин, починаючи від дня 5 після народження (Р5) до Р8. Судини подовжуються за концентричною схемою до краю сітківки. Диск зорового нерва (ONH) локалізований у центрі сітківки; (7Б) - проілюстровано, що ремоделювання судин поблизу ONH відбувається між Р5 і Р8; (7У) - проілюстроване проникнення судинних відростків у більше глибокі шари сітківки. Відростки від судин простираються в зовнішній плексиформний шар (OPL) і утворюють сплетіння. Пізніше відростки проникають у шари між NFL (шари нервового волокна) і OPL шарами, досягаючи зрештою внутрішнього плексиформного шару (IPL); (7M) - результати кількісної оцінки щільності судин; загальна кількість елементів зображення одержують на основі 12 репрезентативних зображень, отриманих для кожного варіанта для 4 оброблених ситківок, *р = 0,006; **р < 0,0001; критерій Ст'юдента; (7Д) - результати кількісної оцінки подовження судин, оцінене по співвідношенню відстані від ONH до кінця судинної мережі й відстані від ONH до кінця чаші сітківки. Представлено дані 12 репрезентативних оцінок 4 оброблених ситківок; на фіг. 8 - дані про вплив антитіл до NRP1 на індуковану VEGF проникність судин, проліферацію HUVEC, фосфорилювання VEGFR2 і передачу сигналів у прямому напрямку від VEGFR2. (8А) - результати аналізів по кількісній оцінці проникності судин шкіри мишей. Представлено середні значення, отримані в 6 незалежних експериментах (р=0,69 для aнтиA B NRP1 і р=0,989 для анти-NRP1 ); (8Б) - дані кількісної оцінки проліферації HUVEC у присутності VEGF або без нього (n=5 для кожного варіанта); (8У) - дані про рівень фосфорилювання VEGFR2 в HUVEC, отримані за допомогою ELISA з використанням антитіл, які розпізнають повний VEGFR2 або VEGFR2 з фосфорильованим тірозином. Рівень A фосфорилювання VEGFR2 у клітинах, оброблених анти-NRP1 , не відрізнявся вірогідно від = контрольної групи (р=0,133). *р =0.00017; критерій Ст'юдента; (8М) - результати аналізу методом імуноблотингу лизатів HUVEC. Клітини обробляли зазначеними антитілами з наступною інкубацією з VEGF; на фіг. 9 - дані про інгібуючу рост пухлин дію антитіл до NRP1 (або індивідуально, або в сполученні з антитілом до VEGF) на різних моделях ксенотрансплантатів пухлини, (93) - дані про середній обсяг трансплантатів модельних пухлин SK-MES-1, Н1299 і Fo5 відповідно, (9М) графік Каплана-Мейера (Kaplan-Meier) для моделі пухлини SK-MES-1; на фіг. 10 - дані про вплив на судини антитіл до NRP1 (або індивідуально, або в сполученні з антитілом до VEGF) на моделі пухлини Fo5, (10A) - середні значення щільності судин (обмірюваної за допомогою перфузії лектина); загальна кількість елементів зображення, отримана для 3-4 оброблених пухлин для кожного варіанта, (10Б) середня щільність перицитів (оцінена за допомогою фарбування PDGFR(), (10У) - співвідношення перицитів/судин, оцінене по відносному перицелюларному покриттю; на фіг. 11 - дані, що свідчать про адитивну дію інгібування NRP1 і VEGF на ремоделювання судин, 11А - модель, з якої видно, що блокада функції NRP1 у судинах, що знову утворяться, інгібує ремоделювання й наступне дозрівання судин, що приводить до залежності виживання судин від VEGF, на 11Б - дані про зміну щільності судин у неонатальній сітківці мишей у В присутності анти-NRP1 , антитіла до VEGF або їхньої комбінації. Даний винахід відноситься до нових композицій і способів модуляції опосередковуваних NRP видів біологічної активності. Визначення Поняття "нейропілін" або NRP відноситься в цілому до нейропіліну-1 (NRP1), нейропіліну-2 (NRP2) і їх ізоформам і варіантам, описаним в Rossignol і ін., Genomics 70, 2000, сс. 211-222. Нейропіліни являють собою нетірозинкіназні рецептори масою 120-130 кДа. Існує безліч 6 UA 98585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 отриманих у результаті сплайсинга варіантів NRP-1 і NRP-2 і розчинних ізоформ. Основна структура нейропіліну складається з 5 доменов: три позаклітинних домена (ala2, b1b2 і с), трансмембранний домен і цитоплазматичний (с) домен. Домен ala2 гомологичен компонентам комплементу С1r і C1s (CUB), які в цілому містять чотири цистеїнових залишки, що утворять два дисульфідних містки. Домен b1b2 гомологичен факторам коагуляції V і VIII. Центральну частину с-домена позначають як МАМ через її гомологію з меприном, А5 і (-білками тірозинфосфотазного рецептора. Домени ala2 і b1b2 відповідальні за зв'язування з лігандом, а с-домен має вирішальне значення для гомодимеризації або гетеродимеризації (Gu і ін., J. Biol. Chem. 277, 2002, сс. 18069-18076; Не і Tessier-Lavigne, Cell 90, 1997, сс. 739-751). Поняття "опосередковувана нейропіліном біологічна активність" відноситься в цілому до фізіологічних або патологічних подій, у яких нейропілін-1 і/або нейропілін-2 відіграє помітну роль. Види активності являють собою (але, не обмежуючись ними) таку активність, як забезпечення спрямованості аксона в процесі ембріонального розвитку нервової системи або регенерації нейронів, ангіогенез (включаючи моделювання судин), онкогенез і метастазування пухлин. Поняття "антитіло" у даному описі використається в найбільш широкому смислі й, зокрема, відноситься до моноклональних антитіл (включаючи повнорозмерні (зрілі) моноклональні антитіла), поліклональним антитілам, мультиспецифічним антитілам (наприклад биспецифічним антитілам) і фрагментам антитіл, у тому випадку, якщо вони мають необхідну біологічну активність. Поняття "моноклональне антитіло" у контексті даного опису відноситься до антитіла, отриманого з популяції практично гомогенних антитіл, тобто вхідні в популяцію індивідуальні антитіла ідентичні за винятком можливих мутацій, що зустрічаються в природних умовах, які можуть бути присутнім у невеликих кількостях. Моноклональні антитіла є високоспецифічними і являють собою антитіла до одного антигенного сайту. Крім того, на противагу препаратам загальноприйнятих антитіл (поліклональних), які включають різні антитіла до різних детермінантів (епітопам), мішенню кожного моноклонального антитіла є тільки одного детермінанта антигену. Прикметник "моноклональне" свідчить про те, що антитіло отримане із практично гомогенної популяції антитіл, при цьому не передбачається, що воно повинне бути отримане за допомогою якого-небудь конкретного методу. Наприклад, моноклональні антитіла, які можна застосовувати згідно із даним винаходом, можна одержувати за допомогою методу на основі гібридом, уперше описаного Kohler і ін., Nature, 256, 1975, с. 495, або їх можна конструювати методами рекомбінантної ДНК (див. наприклад, US 4816567). "Моноклональні антитіла" можна виділяти також з фагових бібліотек антитіл за допомогою методик, описаних, наприклад, в Clackson і ін., Nature, 352, 1991, сс. 624-628 і в Marks і ін., J. Моl. Віоl, 222, 1991, сс. 581-597. Моноклональні антитіла в контексті даного опису включають, зокрема "химерні" антитіла (імуноглобуліни), у яких частина важкого й/або легкого ланцюга ідентична або гомологична відповідним послідовностям антитіл, отриманим з конкретних видів, або належить до конкретних класів або підкласів антитіл, а інша ділянка ланцюга (ів) ідентична або гомологична відповідним послідовностям антитіл, отриманим з інших видів, або належить до інших класів або підкласів антитіл, включаючи фрагменти таких антитіл, у випадку, якщо вони мають необхідну біологічну активність (US 4816567; і Morrison і ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 1984, сс. 6851-6855). "Гуманізовані" форми антитіл тварин крім людини (наприклад, миші) являють собою химерні антитіла, які включають мінімальну послідовність, отриману з імуноглобуліну тварини крім людини. Основна частина гуманізованих антитіл представлена людськими імуноглобулінами (антитіло-реципієнт), у яких залишки з гіперваріабельної ділянки реципієнта замінені залишками з гіперваріабельної ділянки інших видів крім людини (антитіло-донор), таких як миша, щур, кролик або примати крім людини, що володіють необхідною специфічністю, афінністю й потенціалом. У деяких випадках залишки каркасної ділянки (FR) людського імуноглобуліну заміняють відповідними залишками з інших видів крім людини. Крім того, гуманізовані антитіла можуть включати залишки, які не присутні в антитілі-реципієнті або в антитілі-донорі. Ці модифікації здійснюють із метою додаткового вдосконалення характеристик антитіла. У цілому, гуманізоване антитіло повинне включати практично повністю щонайменше одну, а, як правило дві, варіабельних ділянки, у яких всі або практично всі гіперваріабельні петлі відповідають петлям зазначених імуноглобулінів інших тварин крім людини, а всі або практично всі FR відповідають послідовності імуноглобуліну людини. Гуманізоване антитіло необов'язково може включати також щонайменше частину константної ділянки (Fc) імуноглобуліну, як правило, людського імуноглобуліну. Додаткові більше докладні дані див. в Jones і ін., Nature, 321, 1986, 7 UA 98585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сс. 522-525; Reichmann і ін., Nature, 332, 1988, сс. 323-329 і в Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2, 1992, cc. 593-596. "Залежне від виду антитіло" являє собою антитіло, що володіє більше вираженою аффінністю до зв'язування з антигеном з одних видів ссавців, чим з гомологом антигену з інших видів ссавців. Як правило, антитіло, що залежить від виду, "зв'язується специфічно" з людським антигеном (тобто характеризується аффінністю до зв'язування (значення Kd), не вище, ніж -7 -8 приблизно 1×10 М, переважно не вище, ніж приблизно 1×10 і більш переважно не більш ніж -9 приблизно їх 10 М), але характеризується аффінністю до зв'язування з гомологом антигену з інших видів ссавців крім людини щонайменше приблизно в 50 разів або щонайменше приблизно в 500 разів або щонайменше приблизно в 1000 разів більше слабкої в порівнянні з аффінністю до зв'язування з людським антигеном. Залежне від виду антитіло може ставитися до кожного із зазначених вище типів антитіл, але переважно являє собою гуманізоване або людське антитіло. В контексті даного опису поняття "мутант антитіла, мутантне антитіло" або "варіант антитіла" відноситься до варіанта амінокислотної послідовності залежного від виду антитіла, у якому модифікований один або кілька амінокислотних залишків залежного від виду антитіла. Для таких мутантів обов'язково характерна менш чим 100 % ідентичність або подібність послідовності з послідовністю залежні від виду антитіла. У кращому варіанті здійснення винаходу амінокислотна послідовності мутанта антитіла щонайменше на 75 % ідентична або подібна амінокислотної послідовності варіабельної ділянки важкого або легкого ланцюга залежного від виду антитіла, більш переважно щонайменше на 80 %, більш переважно щонайменше на 85 %, більш переважно щонайменше на 90 % і найбільше переважно щонайменше на 95 %. Ідентичність або подібність щодо зазначеної послідовності визначають у контексті даного опису як відсоток амінокислотних залишків у розглянутій послідовності (кандидат-кандидатові-кандидату-послідовності-кандидаті), ідентичних (тобто цей же залишок) або подібних (тобто амінокислотний залишок із цієї ж групи з позицій загальних властивостей бічного ланцюга, див. нижче) залишкам залежні від виду антитіла, після лінеаризації послідовностей і інтродукції при необхідності проломів для досягнення максимального відсотка ідентичності послідовності. Ні N-кінцеві, ні С-кінцеві, ні внутрішні подовження, делеції або інсерції в послідовності антитіла поза варіабельної ділянки не повинні розглядатися як впливають на ідентичність чи подібність послідовності. "Виділене антитіло" являє собою антитіло, що ідентифіковане й відділено від і/або виділено з компонента його природного оточення. Забруднювачами в його природному оточенні є продукти, які можуть робити вплив при діагностичному або терапевтичному застосуванні антитіла, і вони можуть включати ферменти, гормони й інші, білкові або небілкові розчинені речовини. У кращих варіантах здійснення винаходу антитіло повинне бути очищене до (1) більше 95 % у перерахуванні на масу антитіла, що визначають методом Лоурі, і найбільше переважно більше 99 мас. %, до (2) ступеня, достатньої для одержання щонайменше 15 залишків N-кінцевої або внутрішньої амінокислотної послідовності за допомогою секвинатора з обертовою чашкою або до (3) гомогенного стану по даним ДСН-ПААГ у що відновлюють або не відновлюють умовах при фарбуванні кумасси брильянтовим блакитним або переважно при фарбуванні сріблом. До виділеного антитіла відноситься антитіло, що перебуває in situ у рекомбінантної клітині, якщо в ній не є присутнім жоден компонент природного оточення антитіла. Однак, як правило, виділене антитіло повинне бути отримане з використанням щонайменше однієї стадії очищення. В контексті даного опису поняття "варіабельна ділянка антитіла" відноситься до частин легких і важких ланцюгів молекул антитіла, які включають амінокислотні послідовності гіперваріабельних ділянок (Complementarity Determining Regions) (CDR; тобто CDR1, CDR2 і CDR3) і каркасних ділянок (Framework Regions) (FR). V H позначає варіабельну ділянку важкого ланцюга. VL позначає варіабельну ділянку легкого ланцюга. Відповідно до способів, пропонованим у даному винаході, амінокислотні положення, які відносяться до CDR і FR, можна визначати згідно Кеботу (Kabat і ін., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-oi изд., з Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 і 1991). Нумерацію амінокислот антитіл або антигензв'язуючих фрагментів також здійснюють по Кеботу. У контексті даного опису поняття "гіперваріабельні ділянки" (CDR; тобто CDR1, CDR2 і CDR3) відноситься до амінокислотних залишків варіабельної ділянки антитіла, присутність яких необхідно для зв'язування антигену. Кожна варіабельна ділянка, як правило, містить три CDRділянки, позначених як CDR1, CDR2 і CDR3. Кожна гіперваріабельні ділянка може містити амінокислотні залишки з "гіперваріабельної ділянки", як він визначений у Кебота (тобто приблизно залишки 24-34 (L1), 50-56 (L2) і 89-97 (L3) у варіабельної ділянки легкого ланцюга й 8 UA 98585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 31-35 (Н1), 50-65 (Н2) і 95-102 (Н3) у варіабельної ділянки важкого ланцюга (Kabat і ін., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-oi изд., з Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991) і/або залишки з "гіперваріабельной петлі" (тобто приблизно залишки 26-32 (L1), 50-52 (L2) і 91-96 (L3) у варіабельної ділянки легкого ланцюга й 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) і 96-101 (Н3) у варіабельної ділянки важкого ланцюга (Chothia і Lesk, J. Моl. Віоl. 196, 1987, сс. 901-917). У деяких випадках гіперваріабельна ділянка може включати як амінокислоти CDR-ділянки згідно Кеботу, так і амінокислоти гіперваріабельної петлі. Наприклад, CDRH1 важкого ланцюга антитіла 4D5 включає амінокислоти від 26 до 35. "Каркасні ділянки" (далі позначені як FR) являють собою залишки варіабельної ділянки, відмінні від залишків CDR. Кожна варіабельна ділянка, як правило, містить чотири FR, позначених як FR1, FR2, FR3 і FR4. Якщо CDR визначають згідно Кеботу, то залишки FR легкого ланцюга являють собою залишки, що приблизно відповідають положенням 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) і 98-107 (LCFR4), залишки FR важкого ланцюга являють собою залишки, що приблизно відповідають положенням у важкому ланцюзі 1-30 (HCFR1), 3649 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) і 103-113 (HCFR4). Якщо CDR містять амінокислотні залишки з гіперваріабельних петель, то залишки FR являють собою залишки, що приблизно відповідають положенням у легкому ланцюзі 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3) і 97-107 (LCFR4), і залишки FR у важкому ланцюзі являють собою залишки, що приблизно відповідають положенням у важкому ланцюзі 1-25 (HCFR1), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) і 102-113 (HCFR4). У деяких випадках, коли CDR містять як амінокислотні залишки CDR, що відповідають визначенню Кебота, так і амінокислотні залишки гіперваріабельної петлі, то залишки FR повинні бути відповідним чином скоректовані. Наприклад, коли CDRH1 включає амінокислоти Н26-Н35, то залишки FR1 важкого ланцюга відповідають положенням 1-25, а залишки FR2 положенням 36-49. У контексті даного опису поняття "набір кодонів" відноситься до набору різних послідовностей нуклеотидних триплетів, застосовуваних для кодування необхідних варіантів амінокислот. Набір олігонуклеотидів який можна синтезувати, наприклад, за допомогою твердофазного синтезу, може включати послідовності, які представляють всі можливі комбінації нуклеотидних триплетів, одержуваних за допомогою набору кодонів, і які повинні кодувати необхідну групу амінокислот. Стандартною формою позначення кодона є код IUB, що відомий у даній області й представлений у даному описі. Набір кодонів, як правило, позначають 3 заголовними буквами, написаними курсивом, наприклад, NNK, NNS, XYZ, DVK і т.п. Таким чином, поняття "невипадковий набір кодонів" у контексті даного опису відноситься до набору кодонів, що кодує відібрані амінокислоти, які частково, переважно повністю, задовольняють критеріям відбору амінокислот, представленим у даному описі. Синтез олігонуклеотидів з відібраної "виродженістью" нуклеотидів у певних положеннях, добре відомий у даній області, наприклад, можна використати TRIM-підхід (Knappek і ін., J. Моl. Віоl. 296, 1999, сс. 57-86); Garrard і Henner, Gene 128, 1993, с. 103). Такі набори олігонуклеотидів, що мають певні набори кодонів, можна синтезувати з використанням наявних у продажі синтезаторів нуклеїнових кислот (наприклад, що надходять у продаж від фірми Applied Biosystems, Фостер Сіті, шт. Каліфорнія), або їх можна створювати на комерційних умовах (наприклад, на фірмі Life Technologies, Роквилл, шт. Мериленд). При цьому синтезований набір олігонуклеотидів, що мають конкретний набір кодонів, повинен, як правило, включати безліч олігонуклеотидів з різними послідовностями, розходженнями, створеними за допомогою набору кодонів у повній послідовності. Олігонуклеотиди, застосовувані відповідно до винаходу, мають послідовності, які придатні для гібридизації з матрицею, що представляє собою нуклеїнову кислоту варіабельної ділянки, і можуть включати також, але не обов'язково, сайти, розпізнавані рестриктазами, придатні, наприклад, для цілей клонування. "Fv-фрагмент" являє собою мінімальний фрагмент антитіла, що містить повний сайт розпізнавання антигену й антигензв'язуючий центр антитіла. Цей фрагмент складається з димера, що включає одну варіабельну ділянку важкого ланцюга й одну варіабельну ділянку легкого ланцюга, які пов'язані з допомогою міцної асоціації, що по свій природі може бути ковалентним зв'язком, як, наприклад, у випадку scFv. Саме в цій конфігурації три CDR кожної варіабельної ділянки взаємодіють із певним антигензв'язуючим центром на поверхні V L-VHдимера. Усього шість CDR або їх пыднабор обумовлюють специфічність антитіла відносно зв'язування з антигеном. Однак навіть одна варіабельна ділянка (або половина Fv, що включає тільки три CDR, специфічних відносно антигену) має здатність розпізнавати антиген і зв'язуватися з ним, хоча й з більше низької аффінністю в порівнянні з повним єднальним сайтом. 9 UA 98585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "Fab-фрагмент" містить варіабельну й константну ділянку легкого ланцюга й варіабельну ділянку, і першу константну ділянку (СН1) важкого ланцюга. F(ab') 2. фрагменти антитіла містять пари Fab'-фрагментів, які, як правило, ковалентно зв'язані між собою поблизу їх карбоксильних кінців залишками цистеїну шарнірної ділянки. У даній галузі відомі також інші хімічні зв'язки фрагментів антитіл. "Одноланцюгові Fv»- або "sсFv»-фрагменти антитіла включають VH- и VL-області антитіла, де ці області присутні у вигляді однолінцюгового поліпептидного ланцюга. Як правило, Fvполипептид додатково включає поліпептидний линкер між VH- і VL-областями, що надає scFvфрагменту будова, необхідна для зв'язування з антигеном. Огляд даних, дотичних scFv, див. в Pluckthin в: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, тім 113, під ред. Rosenbrug i Moore, з Springer-Verlag, New York, cc. 269-315, 1994. Поняття "подвійні антитіла" відноситься до невеликих фрагментів антитіл із двома антигензв'язуючими центрами, ці фрагменти містять варіабельну ділянку важкого ланцюга (V H), пов'язану з варіабельною ділянкою легкого ланцюга (VL) в одному і том же поліпептидному ланцюзі (VH-VL). За допомогою лінкера, що є занадто коротким, щоб дозволити відбуватися спарюванню між двома ділянками одному ланцюзі, відбувається примусове спарювання ділянок з комплементарними ділянками іншого ланцюга й створюються два антигензв'язуючих центри. Подвійні антитіла більш докладно описані, наприклад, в ЕР 404097; WO 93/11161 і в Hollinger і ін, Ргос. Nail. Acad. Sci., Поняття "лінійні антитіла" відноситься до антитіл, описаним в Zapata і ін., Protein Eng, 8(10), 1995, cc. 1057-1062. У цілому, ці антитіла містять пари розташованих у вигляді тандема Fd-сегментів (VH-CH1-VH-СН1), які в сполученні з комплементарними поліпептидами легкого ланцюга утворять пари антигензв'язуючих ділянок. Лінійні антитіла можуть бути биспецифічними або моноспецифічними. У контексті даного опису поняття "бібліотека" відноситься до безлічі послідовностей антитіл або фрагментів антитіл (наприклад, поліпептидів, пропонованих у винаході) або інших нуклеїнових кислот, які кодують ці послідовності, послідовності розрізняються по комбінації варіантів амінокислот, які інтродукують у зазначені послідовності за допомогою способів, пропонованих у винаході. "Фагова презентація" являє собою метод, при використанні якого варіанти поліпептидів презентують у вигляді білків, злитих щонайменше із частину оболочечного білка, на поверхні фага, наприклад, натчатого фага, часток. Можливість застосування фагової презентації заснована на тім факті, що більші бібліотеки рандомізованих варіантів білків можна швидко й ефективно сортувати відносно послідовностей, які зв'язуються з високої аффінністю з антигеном-мішенню. Презентацію пептидних і фагових бібліотек можна використати для скринінгу мільйонів поліпептидів відносно їх здатності до специфічного зв'язування. Методи, засновані на використанні полівалентних фагових дисплейних бібліотек, застосовували для презентації невеликих довільних пептидів і невеликих білків за допомогою злиттів або з геном III, або геном VIII нитчатого фага (див. Wells і Lowman, Curr. Opin. Struct. Biol. 3, 1992, cc. 355362 і процитовані в цій публікації посилання). При використанні презентації моновалентними фагами бібліотеку білків або пептидів зливають із геном III або його фрагментом і експресують при невисоком рівні в присутності білка гена III дикого типу, у результаті чого фагові частки презентують одну копію злитих білків або не презентують ні однієї копії. Пов'язані з авидностью ефекти знижуються в порівнянні з варіантом, заснованому на застосуванні полівалентного фага, оскільки сортування проводять на основі властивої ліганду афінності й застосовують фагмідні вектори, які полегшують маніпуляцію із ДНК (Lowman і Wells, Methods: A companion to Methods in Enzymology 3, 1991, cc. 205-0216). "Фагміда" являє собою плазмідний вектор, що має бактеріальний сайт ініціації реплікації, наприклад, Со1Е1, і копію интергенной області бактеріофага. Фагміду можна застосовувати з будь-яким відомим бактеріофагом, включаючи нитковий бактеріофаг і лямбдоїдний бактеріофаг. Плазміда, як правило, містить також селектуємий маркер для здійснення відбору по ознаці стійкості до антибіотиків. Сегменти ДНК, клоновані в таких векторах, можна розмножувати у вигляді плазмід. Коли клітини, що несуть зазначені вектори, постачені всіма генами, які необхідні для виробництва фагових часток, механізм реплікації плазміди змінюється на круговий цикл для створення копій одного ланцюга плазмідной ДНК і впакування фагових часток. Фагміди можуть утворювати інфекційні або неінфекційні фагові частки. Під це поняття підпадають фагміди, які містять ген фагового оболочечного білка або його фрагмент, пов'язаний з геном гетерологичного поліпептиду у вигляді генного злиття, у результаті чого гетерологічний поліпептид презентується на поверхні фагової частки. Поняття "фаговий вектор" відноситься до двухлінцюгової репликативної форми бактеріофага, що містить гетерологічний ген і володіє здатністю до реплікації. Фаговий вектор 10 UA 98585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 несе фаговий сайт ініціації реплікації, що забезпечує реплікацію фага й формування фагових часток. Фаг переважно являє собою нитковий бактеріофаг, такий як фаг М13, f1, fd, Pf3 або їхні похідні або лямбдоїдний фаг, такий як фаг лямбда, 21, phi80, phi81, 82, 424, 434 і т.д. або їхні похідні. У контексті даного опису поняття "доступне для розчинника положення" відноситься до положення амінокислотного залишку варіабельних ділянок важких і легких ланцюгів вихідного антитіла або антигензв'язуючого фрагмента, що визначають на основі структури, ансамблю структур і/або змодельованої структури антитіла або антигензв'язуючого фрагмента, у якості потенційно доступного для розчинника й/або контакту з молекулою, такий як специфічний для антитіла антиген. Ці положення як правило, присутні в CDR і на зовнішній частині білка. Доступні для розчинника положення антитіла або антигензв'язуючого фрагмента, як вони представлені в даному описі, можна визначати за допомогою кожного із цілого ряду алгоритмів, відомих у даній області. Переважно доступні для розчинника положення визначають із використанням координат тривимірної моделі антитіла, переважно за допомогою комп'ютерної програми, такий як програма Insightll (фірма Accelrys, Сан-Дієго, шт. Каліфорнія). Доступні для розчинника положення можна визначати також за допомогою відомих у даній області алгоритмів (наприклад, Lee і Richards, J. Моl. Віоl. 55, 1971, с 379 і Connolly, J. Appl. Cryst. 16, 1983, с. 548). Визначення доступних для розчинника положень можна здійснювати за допомогою програмного забезпечення, придатного для моделювання білків, і отриманої інформації про тривимірну структуру антитіла. Програмне забезпечення, яке можна застосовувати для цих цілей, включає програмне забезпечення SYBYL Biopolymer Module (фірма Tripos Associates). Як правило й переважно, для роботи алгоритму (програми) необхідно, щоб користувач увів параметр розміру, "розмір" зонда, що використають для розрахунку, установлюють на рівні приблизно 1,4 А або менший радіуси. Крім того, описане визначення доступних для розчинника положень і група методів з використанням програмного забезпечення, які можна здійснювати за допомогою персональних комп'ютерів (Pacios, Comput. Chem. 18(4), 1994, cc. 377-386). "Ангіогенний фактор або агент" являє собою фактора росту, що стимулює розвиток кровоносних судин, наприклад, підсилює ангіогенез, ріст ендотеліальних клітин, підвищує стабільність кровоносних судин і/або підсилює утворення й розвиток судин і т.д. Наприклад, до ангіогенних факторів відносяться (але, не обмежуючись ними) VEGF і представники сімейства VEGF, P1GF, сімейство PDGF, сімейство факторів росту фібробластів (FGF), ліганди TIE (ангіопоетини), ефрини, Del-1, фактори росту фібробластів: кислотний (aFGF) і лужний (bFGF), фоллистатин, колонієутворюючий фактор гранулоцитів (G-CSF), фактор росту гепатоцитів (HGF) /фактор розсіювання (SF), інтерлейкін-8 (IL-8), лептин, мидкин, нейропіліни, плацентарний фактор росту, отриманий із тромбоцитів фактор росту епітеліальних клітин (PDECGF), тромбоцитарний фактор росту, насамперед, PDGF-BB або PDGFR-бета, плейотрофин (PTN), програнулин, проліферин, фактор-альфа росту, що трансформує (TGF-альфа), факторбета росту, що трансформує (TGF-бета), фактор-альфа некрозу пухлини (TNF-альфа) і т.д. До них відносяться також фактори, що підсилюють загоєння ран, такі як гормон росту, інсуліноподібний фактор-І росту (IGF-I), VIGF, епідермальний фактор росту (EGF), CTGF і представники цього сімейства й TGF-альфа й TGF-бета (див., наприклад, Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol. 53, 1991, cc. 217-239; Streit і Detmar, Oncogene 22, 2002, cc. 31723179; Ferrara і Alitalo, Nature Medicine 5(12), 1999, cc. 1359-1364; Tonini і ін., Oncogene 22, 2003, cc. 6549-6556 (наприклад, у таблиці 1 перераховані відомі ангіогенні фактори); і Sato, Int. J. Clin. Oncol. 8, 2003, cc. 200-206). Поняття "антиангіогенний агент" або "інгібітор ангіогенезу" відноситься до низькомолекулярної субстанції, полинуклеотиду, поліпептиду, виділеному білку, рекомбинантному білку, антитілу або конъюгатам або злитим білкам, які інгібують або безпосередньо, або побічно ангіогенез, утворення й розвиток судин або небажану проникність судин. Варто розуміти, що до антиангіогенних агентів відносяться агенти, які зв'язую й блокують ангіогенную активність ангіогенного фактора або його рецептора. Наприклад, антиангіогенний агент являє собою антитіло або іншого антагоніста ангіогенного агента, як він визначений вище, наприклад, антитіла до VEGF-A або рецептора VEGF-A (наприклад, KDR-рецептору або Flt-1TM рецептору), антитіла-інгібітори PDGFR, такі як Gleevec (имитиніба мезилат). До антиангіогенних агентів відносяться також нативні інгібітори ангіогенезу, наприклад, ангіостатин, ендостатитн і т.д. (див., наприклад, Klagsbrun і D'Amore, Annu. Rev. Physiol. 53, 1991, cc. 217239; Streit і Detmar, Oncogene 22, 2003, cc. 3172-3179 (наприклад, у таблиці 3 представлені дані про антиангіогенной терапії злоякісної меланоми; Ferrara и Alitalo, Nature Medicine 5(12), 1999, cc. 1359-1364; Tonini і ін., Oncogene 22, 2003, cc. 6549-6556 (наприклад, у таблиці 2 11 UA 98585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 перераховані відомі антиангіогенні фактори) і Sato, Int. J. Clin. Oncol. 8, 2003, cc. 200-206 (наприклад, у таблиці 1 перераховані антиангіогенні агенти, застосовувані в клінічних випробуваннях). Поняття "VEGF" і "VEGF-A" у контексті даного опису відносяться до фактора, що складається з 165 амінокислот, росту судинних ендотеліальних клітин і родинним складають із 121, 189 і 206 амінокислот факторам росту судинних ендотеліальних клітин, як описано в Leung і ін., Science, 246, 1989, с. 1306 і в Houck і ін., Моl. Endocrin., 5, 1991, с. 1806, а також до встречающимся в природних умовах його аллельним і процессованим формам. Поняття "VEGF" відноситься також до VEGF з видів крім людини, таким як миші, щури або примати. Іноді VEGF з конкретних видів позначають як hVEGF у випадку людського VEGF, mVEGF у випадку мишачого VEGF і т.д. Поняття "VEGF" відноситься також до вкорочених форм поліпептиду, що містить амінокислоти 8-109 або 1-109 з 165 амінокислот людського фактора росту судинних ендотеліальних клітин. У контексті даного опису можна ідентифікувати будь-які такі форми VEGF, які при посиланні на них позначають, наприклад, як "VEGF (8-109)», "VEGF (1-109)» або "VEGF165". Амінокислотні положення в "укороченому" нативном VEGF нумерують згідно нативной послідовності VEGF. Наприклад, амінокислоту в положенні 17 (метіонін) в укороченому нативном VEGF позначають також як амінокислоту в положенні 17 (метіонін) у нативном VEGF. Зкорочений нативний VEGF володіє аффінністю до зв'язування з KDR- і Flt-1рецепторами, порівнянної з нативним VEGF. "Антитіло до VEGF" позначає антитіло, що зв'язується з VEGF з достатньої аффінністю й специфічністю. Краще антитіло до VEGF, пропоноване у винаході, можна застосовувати як терапевтичний агент, мішенню якого є VEGF і який впливає на захворювання або стани, пов'язані з активністю VEGF. Як правило, антитіло до VEGF не повинне зв'язуватися з іншими гомологами VEGF, такими як VEGF-B або VEGF-C, а також з іншими факторами росту, такими як P1GF, PDGF або bFGF. Кращим антитілом до VEGF є моноклональне антитіло, що зв'язується з тим же епітопом, що й моноклональне антитіло до VEGF A4.6.1, що продукується гибридомой АТСС НВ 10709. Більше краще антитіло до VEGF являє собою рекомбинантное гуманізоване моноклональне антитіло до VEGF, створене відповідно до методу, описаному в Presta і ін., Cancer Res. 57, 1997, cc. 4593-4599, включаючи (але, не обмежуючись їм) антитіло, відоме за назвою бевацизумаб (bevacizumab, BV; Avastin®). Антитіло до VEGF "бевацизумаб (BV)", відоме також як "rhuМАт VEGF" або "Avastin®», являє собою рекомбинантное гуманізоване моноклональне антитіло до VEGF, створене відповідно до методу, описаному в Presta і ін., Cancer Res. 57, 1997, cc. 4593-4599. Воно містить мутантні каркасні ділянки людського Ig1 і антигензв'язуючі гіперваріабельні ділянки мишачого моноклонального антитіла до hVEGF A.4.6.1, що блокує зв'язування людського VEGF з його рецепторами. Приблизно 93 % амінокислотної послідовності бевацизумаба, включаючи більшу частину каркасних ділянок, одержують із людського Ig1, a приблизно 7 % послідовності одержують із мишачого антитіла А4.6.1. Бевацизумаб має молекулярну масу приблизно 149000 Та і є глікозильованим. Поняття "антагоніст VEGF" відноситься до молекули, що має здатність нейтралізувати, блокувати, інгібувати, анулювати, знижувати або впливати на види активності VEGF, включаючи зв'язування з одним або декількома рецепторами VEGF. Антагоністи VEGF являють собою антитіла до VEGF і їх антигензв'язуючі фрагменти, молекули рецепторів і похідні, які специфічно зв'язуються з VEGF, перешкоджаючи його зв'язуванню з одним або декількома рецепторами, антитіла до рецепторів VEGF і антагоністи рецепторів VEGF, такі як низькомолекулярні інгібітори тірозинкіназа VEGFR. Поняття "лікування" відноситься як до терапевтичного лікування, так і до профілактичних або превентивних мір. Пацієнти, які мають потребу в лікуванні, включають пацієнтів, які вже мають порушення, і тих, у яких варто попереджати появу порушення. Поняття "порушення" означає будь-який стан, яке можна полегшувати за допомогою лікування антитілом. Наприклад, воно застосовно до стану ссавців, у яких виявлений аномальний ангіогенез (надлишковий, невідповідний або неконтрольований ангіогенез) або проникність судин або до стану, що має потребу в профілактиці. До нього відносяться хронічні й гострі порушення або захворювання, включаючи такі патологічні стани, які провокують розвиток у ссавця розглянутого порушення. У контексті даного опису прикладами підлягаючому лікуванню порушень є (але, не обмежуючись ними) злоякісні й доброякісні пухлини; нелейкозні й лімфоїдні злоякісні захворювання; порушення, що зачіпають нейрони, глію, астроцити, гіпоталамус і інші залози, макрофаги, епітелій, строму й бластодерму; і запальні, ангіогенні й імунологічні порушення. 12 UA 98585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Аномальний ангіогенез має місце, коли ріст нових кровоносних судин є або надлишковим, або недостатнім, або невідповідним (наприклад, локалізація, час або початок ангіогенезу є небажаними з медичний позицій), при хворобливому стані або стані, що приводить до хворобливого стану. Надлишковий, недостатній або неконтрольований ангіогенез має місце, коли відбувається ріст нових кровоносних судин, що приводить до погіршення хворобливого стану або викликає хворобливий стан, наприклад, при раку, насамперед при васкуляризованих щільних пухлинах і метастатичних пухлинах (включаючи рак ободочной кишки, рак легені (насамперед недрібноклітинний рак легені) або рак передміхурової залози), при захворюваннях, які викликаються неоваскуляризацією ока, насамперед при пов'язаній з діабетом сліпоті, ретинопатіях, насамперед при діабетичній ретинопатії або пов'язаної з віком дегенерації жовтої плями (AMD), псоріазі, псориатическом артриті, гемангіобластоми, такий як гемангіома; при запальних хворобах бруньок, таких як гломерулонефрит, насамперед мезангіопроліферативний гломерулонефрит, гемолитический уремічний синдром, діабетична нефропатія або гіпертензивний нефросклероз; при різних запальних захворюваннях, таких як артрит, насамперед ревматоїдний артрит, запальне захворювання кишечнику, псоріаз, саркоидоз, артеріальний артеріосклероз, і при захворюваннях, виникаючих після трансплантації, ендометріозі або хронічній астмі, і при більш ніж 70 інших станах. Нові кровоносні судини можуть живити уражені хворобою тканини, руйнувати здорову тканину, а у випадку раку нові судини можуть дозволяти пухлинним клітинам проникати в кровоток і заселяти інші органи (метастази пухлини). Недостатній ангіогенез має місце, коли відбувається неадекватний ріст кровоносних судин, що приводить до погіршення хворобливого стану, наприклад, при таких захворюваннях, як захворювання коронарної артерії, "удар" і вповільнене загоєння ран. Крім того, виразки, "удари" і серцеві приступи можуть бути результатом відсутності ангіогенезу, необхідного в нормі для природного загоєння ран. Даний винахід відноситься до лікування пацієнтів, які мають ризик розвитку вищевказаних захворювань. Інші пацієнти, які є кандидатами для лікування антитілами або поліпептидами, пропонованими у винаході, страждають або мають ризик розвитку таких станів, як аномальна проліферація фиброваскулярной тканини, рожеві вугри, сидром придбаного імунодефіциту, закупорка артерій, атопческий кератит, пов'язані з бактеріями виразки, хвороба Бехчета, стерпні кров'ю пухлини, обструктивне захворювання сонної артерії, хороїдальна неоваскуляризація, хронічне запалення, хронічне відшарування сітківки, хронічний увеит, хронічне запалення склоподібного тіла (витрит), стан, пов'язане із тривалим носінням контактних лінз, відторгнення трансплантата роговиці, неоваскуляризація роговиці, неоваскуляризація трансплантата роговиці, хвороба Крона, хвороба Илза, епідемічний кератоконъюнктивит, пов'язані із грибами виразки, інфекції, пов'язані з герпесом простим, інфекції, пов'язані із що оперізує герпесом, синдроми гіперв'язкості, саркома Капоши, лейкоз, ліпідна дегенерація, хвороба Дайма, крайовий кератолиз, виразка Мурена, пов'язані з мікробами інфекції, відмінні від витівки, міопія, хвороба ока, пов'язана з неовасуляризацией, уроджені ямки на диску зорового нерва, синдром Ослера-Вебера (хвороба Рандю-Вебера Ослера), остеоартрит, хвороба Педжета, запалення ресничного кружка (pars plana), пемфигоид, филектенулез, поліартрит, ускладнення після лазерного опромінення, інфекції, викликувані найпростішими, захворювання, викликуване Pseudoxanthoma elasticum, сухий кератит птеригия, радіальна кератотомія, неоваскуляризація сітківки, ретинопатія немовлят, ретрорентальна фіброплазія, саркоїд склерит, анемія серпоподібних еритроцитів, синдром Шегрена, щільні пухлини, хвороба Штаргардта, хвороба Стивенса-Джонсона, верхній лимбический кератит, сифіліс, системна червона волчанка, крайова дегенерація Терри, токсоплазмоз, травма, пухлини саркоми Юинга, пухлини необластоми, пухлини остеосаркоми, пухлини ретинобластоми, пухлини рабдоміосаркоми, неспецифічний виразковий коліт, закупорка вен, дефіцит вітаміну А і саркоїдоз Вегенера, небажаний ангіогенез, асоційований з діабетом, паразитарними хворобами, аномальним загоєнням ран, гіпертрофією після хірургічного втручання, ушкодження або травми, інгібуванням росту волось, інгібуванням овуляції й формуванням жовтого тіла, інгібуванням імплантації й інгібуванням розвитку ембріона в матці. Терапію з використанням антиангіогенних агентів можна застосовувати в цілому для лікування відторгнення трансплантата, запалення легеней, нефротического синдрому, преекламсії, перикардіального випота, наприклад, асоційованого з перікардитом, і плеврального випоту, захворювань і порушень, що характеризуються небажаною проникністю судин, наприклад, набряку, асоційованого з пухлинами головного мозку, асцитів, асоційованих зі злоякісним захворюванням, синдромом Мейгса, запаленням легені, нефротичним синдромом, перикардіальним випотом, плевральним випотом, проникністю, асоційованою з серцевосудинними захворюваннями, такими як стан після інфаркту міокарда й "удару" і т.п. 13 UA 98585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Інші залежні від ангіогенезу захворювання, до яких відноситься даний винахід, являють собою ангіофіброму (аномальний стан кровоносних судин, що характеризується схильністю до кровотечі), неовасулярну глаукому (розростання кровоносних судин в оці), артеріовенозні мальформації (аномальна взаємодія між артеріями й венами), переломи, що не зростаються (переломи, які не гояться), атеросклеротичні бляшки (затвердіння артерій), піогену гранулому (загальне ушкодження шкіри, що складає із кровоносних судин), склеродерму (форма захворювання сполучної тканини), гемангіому (пухлина, що складається із кровоносних судин), трахому (основна причина сліпоти в країнах третього миру), гемофілічні суглоби, судинні адгезії й гіпертрофічні фляки (аномальне формування рубця). Поняття "рак" і "злоякісний" відносяться або описують фізіологічний стан у ссавців, що, як правило, характеризується неконтрольованим ростом клітин. Приклади раку включають (але, не обмежуючись ними) карциному, лімфому, бластому, саркому й лейкоз. Більше конкретні приклади таких видів раку включають рак лускатих клітин, рак легеней (включаючи дрібноклітинний рак легені, недрібноклітинний рак легені, аденокарциному легеней й плоскоклітинний рак легеней), перітонеальний рак, рак клітин печінки, рак шлунка (включаючи шлунково-кишковий рак), рак підшлункової залози, гліобластому, рак шийки матки, рак яєчника, рак печінки, рак сечового міхура, гепатому, рак молочної залози, рак ободочной кишки, ректальний рак, колоректальний рак, карциному ендометрия або матки, карциному слинних залоз, рак почки або ренальний рак, рак печінки, рак передміхурової залози, вульвальний рак, рак щитовидної залози, печіночну карциному й різні типи раку голови й шиї, а також В-клітинну лімфому (включаючи низкою ступеня злоякісності/фолікулярну не-ходжкінську лімфому; NHL малих лімфоцитів (SL); середнього ступеня злоякісності /фолікулярну NHL; середнього ступеня злоякісності дифузійну NHL; високозлоякісну імунобластную NHL; високозлоякісну лімфобластную NHL; високозлоякісну дрібноклітинну небластомерну NHL; масову NHL; лімфому клітин мантії; зв'язану зі СНІДом лімфому; і Вальденстрема макроглобулінемічну пурпуру; хронічний ліфоїдний лейкоз (CLL); гострий лімфобластний лейкоз (ALL); лейкоз волосяних клітин; хронічний мієлобластний лейкоз; і посттрансплантаційний лімфопроліферативний синдром (PTLD), а також аномальну проліферацію судин, асоційовану з факоматозом, набряком (наприклад, асоційованим з пухлинами головного мозку), і синдром Мейгса. Поняття "антинеопластична композиція" відноситься до композиції, яку можна застосовувати для лікування раку, що містить щонайменше одну терапевтичну діючу речовину, наприклад, "протираковий" агент. Прикладами терапевтичних агентів (протиракових агентів) є (але, не обмежуючись ними), наприклад, хіміотерапевтичні агенти, інгібітори росту, цитотоксичні агенти, агенти, застосовувані в променевій терапії, антиангіогенні агенти, апоптозні агенти, антитубулінові агенти й інші агенти, призначені для лікування раку, такі як антитіла до HER-2, антитіла до CD20, антагоніст епідермального фактора росту (EGFR) (наприклад, інгібітор тірозинкінази), інгібітор HER1/EGFR (наприклад, ерлотиніб (Tarceva™), інгібітори тромбоцитарного фактора росту (наприклад, Gleevec™ (іматиніба мезилат)), інгібітор СОХ-2 (наприклад, целекоксиб), інтерферони, цитокіни, антагоністи (наприклад, антитіла, що нейтралізують), які зв'язуються з однієї або декількома з наступних мішеней: Erb2-, Erb3-, Erb4-, PDGFR-бета-, Bly-, APRIL-, BCMA- або VEGF-рецептор(и), TRAIL/Apo2, і інші біологічно активні й органічні хімічні агенти й т.д. Під обсяг винаходу підпадають також їхні комбінації. Поняття "цитотоксичний агент" у контексті даного опису відноситься до субстанції, що інгібує або перешкоджає функції клітин і/або викликає руйнування клітин. Мається на увазі, що поняття 131 125 186 включає радіоактивні ізотопи (наприклад, І , I , Y і Re ), хіміотерапевтичні агенти й токсини, такі, що володіють ферментативною активністю, як токсини бактеріального, грибкового, рослинного або тваринного походження, або їхні фрагменти. "Хіміотерапевтичний агент" являє собою хімічну сполуку, що застосовують для лікування раку. Приклади хіміотерапевтичних агентів включають алкілуючі агенти, такі як тіотепу й циклофосфамід CYTOXAN®; алкилсульфонати, такі як бусульфан, імпросульфан і пипосульфан; азиридини, такі як бензодопа, карбохуон, метуредопа й уредопа; етиленімини й метиламеламіни, включаючи алтретамін, триетиленмеламін, триетиленфосфорамід, триетилентиофосфорамід і триметилоломеламін; ацетогеніни (насамперед буллатацин і буллатацинон); камптотецин (включаючи синтетичний аналог топотекан); бріостатин; каллистатин; СС-1065 (включаючи його синтетичні аналоги адозелесин, карзелесин і бизелесин); криптофіцини (насамперед криптофицин 1 і криптофіцин 8); доластатин; дуокарміцин (включаючи синтетичні аналоги KW-2189 і СВ1-ТМ1); елеутеробін; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотні аналоги гірчичного газу, такі як хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамід, естрамустин, ифосфамід, мехлоретамін, гідрохлорид оксиду мехлорметаміна, 14 UA 98585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамід, урациловий аналог гірчичного газу; нітрозсечовини, такі як кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин і ранимустин; антибіотики, такі як енедиїнові антибіотики (наприклад, калихеаміцин, насамперед калихеаміцин гама II і калихеаміцин омега 1 (див., наприклад, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33, 1994, cc. 183-186); динеміцин, включаючи динеміцин А; біфосфонати, такі як хлодронат; еспераміцин; а також неокарциностатиновий кремофор і родинні хромопротеїнові енедиїнові хромофори, що володіють антибіотичними властивостями), аклациномізини, актиноміцин, аутраміцин, азасерин, блеоміцини, кактиноміцин, карабіцин, карминоміцин, карзинофилин, хромоміцини, дактиноміцин, даунорубіцин, деторубіцин, 6-диаза-5-оксо-Lнорлейцин, доксорубіцин ADRIAMYCIN® (включаючи морфолинодоксорубіцин, цианморфолинодоксорубіцин, 2-пирролодоксорубіцин і дезоксидоксорубіцин), епірубіцин, езорубіцин, ідарубіцин, марцелломіцин, митоміцини, такі як митоміцин С, мікофєнольную кислоту, ногаламіцин, оливоміцини, пепломіцин, потфироміцин, пуроміцин, хеломіцин, родорубіцин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубіцин; антиметаболіти, такі як метотрексат і 5-фторурацил (5-ФУ); аналоги фолієвої кислоти, такі як деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; пуринові аналоги, такі як флударабин, 6меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; пирімідинові аналоги, такі як анцитабін, азацитидин, 6азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуредин, доксифлуридин, еноцитабін, флоксуридин; андрогени, такі як калустерон, дромостанолонпропионат, епітіостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадренергетики, такі як аміноглутетімід, митотан, трилостан; замінник фолієвої кислоти, такий як фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамідглікозид; амінолевулинову кислоту; енилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; едатраксат; дефофамін; демеколцин; діазихон; елфорнитин; елиптинію ацетат; епотилон; етоглюцид; галію нітрат; гідроксисечовину; лентинан; лонидаїнін; майтансиноїди, такі як майтансин і ансамитоцини; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраерин; пентостатин; фенамет; пирарубіцин; лосоксантрон; подофиллинову кислоту; 2-етилгидразид; прокарбазин; полісахаридний комплекс PSK® (фірма JHS Natural Products, Еуген, шт. Орегон); разоксан; ризоксин; сизофиран; спірогерманий; тенуазонову кислоту; тріазихон; 2,2',2"-трихлортриетиламін; трихотецени (насамперед токсин Т2, верракурин А, роридин А и ангуїдин); уретан; виндесин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид ("Ara-С"); циклофосфамід; тиотепа; таксоиди, наприклад, паклитаксел TAXOL® (фірма Bristol-Myers Squibb Oncology, Принстон, шт. Нью-Джерсі), ABRAXANETM (не утримуюча кремофор створена на основі альбуміну композиція паклитаксела з розмірами часток порядку нанометра) (фірма American Pharmaceutical Partners, Шаумберг, шт. Іллінойс) і доцетаксел TAXOTERE® (фірма RhonePoulenc Rorer, Ентони, Франція); хлоранбуцил; гемцитабин GEMZAR®; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платини, такі як цисплатин і карбоплатин; винбластин; платину; етопозид (VP-16); ифосфамід; митоксантрон; винкристин; винорелбин NAVELBINE®; новантрон; тенипозид; едатрексат; дауноміцин; аміноптерин; кселоду; ібандронат; іринотекан (Camptosar, СРТ-11) (включаючи схему лікування іринотеканом у сполученні с 5-ФУ й леуковорином); інгібітор топоізомерази RFS-2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноїди, такі як ретиноєва кислота; капецитабин; комбрестатин; леуковорин (LV); оксалиплатин (включаючи схему лікування оксалиплатином (FOLFOX, схема лікування з використанням оксалиплатина в сполученні з 5-ФУ й лейкововином); інгібітори РКС-альфа, Raf, H-Ras, EGFR (наприклад, ерлотиніб (Tarceva™)) і VEGF-A, які знижують клітинну проліферацію, і фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні кожного із зазначених вище сполук. Под це визначення підпадають також антигормональні агенти, які мають здатність регулювати або інгібувати дії гормонів на пухлині, їхніми прикладами є антиестрогени й селективні модулятори рецептора естрогену (SERM), включаючи, наприклад, тамоксифен (у тому числі тамоксифен NOLVADEX®), ралоксифен, дролоксифен, 4-гідрокситамоксифен, тріоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон і торемифен FARESTON®; інгібітори ароматази, які інгібують фермент ароматазу, що регулює продукування естрогена в наднирниках, такі, наприклад, як 4(5) - імідазоли, аміноглутетімід, мегестерола ацетат MEGASE®, Ексеместан AROMASIN®, форместан, фадрозол, ворозол RIVISOR®, летрозол FEMARA® і анастрозол ARIMIDEX®; а також анти-андрогени, такі як флутамід, нилутамід, бикалутамід, леупролід і гозерелін; а також троксацитабін (1,3-диоксолановий аналог нуклеозиду цитозину); антисмислові олігонуклеотиди, насамперед інгібуючі експресію генів шляхів передачі сигналу, які беруть участь у проліферації прикріплених клітин, таких, наприклад, як РКС-альфа, Raf і НRas; рібозими, такі як інгібітор експресії VEGF (наприклад, рібозим ANGIOZYME®) і інгібітор експресії HER2; вакцини, такі як застосовувані в генній терапії, наприклад, вакцина ALLOVECTIN®, вакцина LEUVECTIN® і вакцина VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; інгібітор 15 UA 98585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 топоізомерази 1 LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; вінорелбін і еспераміцини (див. U.S. 4675187); і фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні кожного з перерахованих агентів. Поняття "проліки" у контексті даного опису означає попередник або похідне фармацевтично активної субстанції, які менш цитотоксичні для пухлинних клітин у порівнянні з вихідним лікарським засобом і мають здатність активуватися або перетворюватися в більше активну в порівнянні з вихідною форму за допомогою ферментів (див., наприклад, Wilman в: "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", Biochemicals Society Transactions, 14, 615-ий симпозіум у Белфасті, 1986, cc. 375-382; і Stella і ін. в: "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, під ред. Borchardt і ін., з Humana Press, 1985, cc. 247-267). Проліки, пропоновані у винаході, включають (але, не обмежуючись ними) фосфатвміщуючі проліки, тиофосфатвміщуючі проліки, сульфатвміщуючі проліки, пептидвміщуючі проліки, модифіковані D-амінокислотою проліки, глікозильовані проліки, лактамвміщуючі проліки, проліки, що містять необов'язково заміщений феноксиацетамід, або проліки, що містять необов'язково заміщений фенилацетамід, 5-фторцитозин- і інші 5-фторуридинвміщуючі проліки, які можуть перетворюватися в більше активну цитотоксическую вільну лікарську форму. Приклади цитотоксических лікарських засобів, які можуть утворювати похідні у вигляді проліки для застосування відповідно до винаходу, включають (але, не обмежуючись ними) описані вище хіміотерапевтичні агенти. "Виділена" молекула нуклеїновою кислоти являє собою молекулу нуклеїновою кислоти, що ідентифікована й відділена щонайменше від однієї молекули нуклеїновою кислоти-домішки, з якої вона звичайно зв'язана в природному джерелі нуклеїновою кислоти антитіла. Виділена молекула нуклеїновою кислоти відрізняється від тієї форми або набору, у яких вона перебуває в природних умовах. Таким чином, виділені молекули нуклеїновою кислоти відрізняються від молекул нуклеїновою кислоти, що існують у клітинах у природних умовах. Однак виділена молекула нуклеїновою кислоти включає молекулу нуклеїновою кислоти, що перебуває в клітинах, у яких у нормі відбувається експресія антитіла, наприклад, у випадку, якщо молекула нуклеїновою кислоти має локалізацію в хромосомі, відмінну від її локалізації в клітинах у природних умовах. Вираження "контролюючі послідовності" відноситься до послідовностей ДНК, необхідним для експресії функціонально зв'язаної послідовності, що кодує, у певному організмі-хазяїні. Придатні для прокаріот контролюючі послідовності являють собою, наприклад, промотор, необов'язково операторную послідовність і сайт зв'язування рибосоми. Як відомо, в еукаріотичних клітинах присутні промотори, сигнали поліаденилювання й енхансери. Нуклеиновая кислота "функціонально зв'язана", якщо вона перебуває у функціональному зв'язку з інший нуклеотидной послідовністю. Наприклад, ДНК, що кодує предпослідовність або секреторну лідерну послідовність, функціонально пов'язана із ДНК, що кодує поліпептид, якщо вона експресується у вигляді предбелка, що бере участь у секреції поліпептиду; промотор або енхансер функціонально пов'язаний з послідовністю, що кодує, якщо він впливає на транскрипцію послідовності; сайт зв'язування рибосоми функціонально пов'язаний з послідовністю, що кодує, якщо він розташований так, що може полегшувати трансляцію. Як правило, "функціонально зв'язаний" позначає, що зв'язані послідовності ДНК є суміжними, а у випадку секреторної лидерной послідовності є суміжними й перебувають у фазі зчитування. Однак енхансери не обов'язково повинні бути суміжними. Зв'язування здійснюється шляхом вбудовування лигированием у придатні сайти рестрикції. Якщо такі сайти не існують, то відповідно до відомої практики застосовують синтетичні олігонуклеотидні адаптори або лінкери. У контексті даного опису поняття "клітина", "клітинна лінія" і "клітинна культура" використають взаємозамінно, і вони всі включають також потомство. Таким чином, поняття "трансформанти" і "трансформовані клітини" включають, насамперед, клітини, які є об'єктом винаходу, і виведені з них культури поза залежністю від кількості переносів. Варто розуміти також, що все потомство може не є точно ідентичним по складу ДНК через навмисні або випадкові мутації. Під обсяг винаходу підпадає мутантне потомство, що має такою ж функцію або біологічною активність, які відібрані в процесі скринінгу для вихідної трансформованої клітини. З контексту даного опису повинні бути очевидні варіанти, для яких можливі інші визначення. Варіанти здійснення винаходу Виробництво антитіл до NRP1 Даний винахід відноситься до нових антитіл до NRP1. У наступних розділах більш докладно описані приклади методів створення антитіл. Нові антитіла до NRP1 одержують із використанням антигену NRP1, отриманого з різних видів ссавців. Переважно антиген являє собою людський NRP1 (hNRP1). Однак як антиген 16 UA 98585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мішень можна використати NRP з інших видів, таких як мишачий NRP1 (mNRP1). Антигени NRP з різних видів ссавців можна виділяти із природних джерел. В інших варіантах здійснення винаходу антиген створюють рекомбинантно або одержують за допомогою інших методів синтезу, відомих у даній області. Відібрані антитіла, як правило, повинні володіти досить вираженої аффінністю до зв'язування з антигеном NRP1. Наприклад, зв'язування антитіла з hNRP1 може характеризуватися значенням Kd не більш ніж приблизно 5 нМ, переважно не більш ніж приблизно 2 нМ і більш переважно не більш ніж приблизно 500 пМ. Афінність антитіл можна визначати, наприклад, на основі аналізу резонансу поверхневого плазмона (такого як BIAcoreаналіз, описаний у прикладах); твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA); і конкурентних аналізів (наприклад, РІА). Крім того, біологічну активність антитіла можна визначати за допомогою інших аналізів, наприклад, призначених для оцінки ефективності як терапевтичних агентів. Такі аналізи відомі в даній області й залежать від антигену-мішені й призначення антитіла. їхніми прикладами є аналіз інгібування HUVEC (ендотеліальні клітини пупочной вени людини) (описаний нижче в прикладах); аналізи інгібування росту пухлинних клітин (описані, наприклад, в WO 89/06692); аналізи антитіло-обумовленої клітиннозалежної цитотоксичності (ADCC) і комплементзалежної цитотоксичності (CDC) (US 5500362); і аналізи агоністичної активності або гематопоезу (див. WO 95/27062). Для скринінгу антитіл, які зв'язуються з конкретним епітопом антигену, що представляє інтерес, можна застосовувати загальноприйнятий аналіз перехресного блокування, описаний наприклад в: Antibodies, A Laboratory Manual, під ред. Harlow і David Lane, з Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. В альтернативному варіанті для рішення питання про те, чи зв'язується антитіло із являючим інтерес епітопом, можна використати епітопне картування, наприклад, описане в Champe і ін., J. Biol. Chem. 270, 1995, сс. 1388-1394. Створення нових антитіл до NRP1 з фагових бібліотек синтетичних антитіл Кращим варіантом здійснення винаходу є спосіб одержання й відбору нових антитіл до NRP1 за допомогою підходу, заснованого на використанні унікальної фагової дисплейної бібліотеки (фагової презентації). Цей підхід передбачає створення фагових бібліотек синтетичних антитіл з використанням як матриця однієї каркасної ділянки, створення достатньої розмаїтості у варіабельних ділянках, презентацію поліпептидів з різноманітними варіабельними дялінками, відбір перспективних антитіл (антитіл-кандидатів), які володіють високої аффінністю до антигену-мішені, тобто NRP1, і виділення відібраних антитіл. Більше докладний опис методу фагової презентації можна виявити, наприклад, WO 03/102157, опублікованої 11 грудня 2003 р. Відповідно до одного з об'єктів винаходу бібліотеки антитіл, застосовувані у винаході, можна одержувати шляхом мутації доступних для розчинника й/або положень, що характеризуються високою розмаїтістю, щонайменше в одному з CDR варіабельної ділянки антитіла. Можна змінювати шляхом мутації деякі або всі CDR за допомогою способів, представлених у даному описі. Відповідно до деяких варіантів здійснення винаходів може виявитися кращим створювати розмаїтість бібліотек антитіл шляхом мутацій положень в CDRH1, CDRH2 і CDRH3 з одержанням однієї бібліотеки або шляхом мутацій положень в CDRL3 і CDRH3 з одержанням одної бібліотеки, або шляхом мутацій положень CDRL3 і CDRH1, CDRH2 і CDRH3 з одержанням однієї бібліотеки. Можна створювати бібліотеку варіабельних ділянок антитіла, наприклад, що має мутації доступних для розчинника й/або положень, що характеризуються високою розмаїтістю, в CDRH1, CDRH2 і CDRH3. Можна створювати іншу бібліотеку, що має мутації в CDRL1, CDRL2 і CDRL3. Ці бібліотеки можна застосовувати в сполученні один з одним для створення єднальних агентів, що володіють необхідної аффінністю. Наприклад, після одного або декількох циклів селекції бібліотек важких ланцюгів відносно зв'язування з антигеном-мішенню, бібліотекою легких ланцюгів можна заміщати популяцію агентів, що зв'язуються, важких ланцюгів з метою підвищення афінності сполучних агентів. Переважно бібліотеку створюють шляхом заміни вихідних амінокислот на варіанти амінокислот в CDRH3 -ділянці варіабельної ділянки послідовності важкого ланцюга. Отримана бібліотека може містити безліч послідовностей антитіл, де розмаїтість послідовностей насамперед характерно для CDRH3-ділянки послідовності важкого ланцюга. Відповідно до одного з об'єктів винаходу бібліотеку створюють у контексті послідовності гуманізованого антитіла 4D5 або послідовності амінокислот каркасної ділянки послідовності гуманізованого антитіла 4D5. Переважно бібліотеку створюють шляхом заміни щонайменше амінокислотних залишків (ак) 95-100 важкого ланцюга на амінокислоти, кодуємі набором кодонів DVK, де набір 17 UA 98585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кодонів DVK застосовують для кодування набору варіантів амінокислот для кожного із зазначених положень. Прикладом олігонуклеотидного набору, якому можна застосовувати для створення зазначених замін, є послідовність (DVK)7. У деяких варіантах здійснення винаходу бібліотеку створюють шляхом заміни залишків 95-100 ак на амінокислоти, кодуємі наборами кодонів DVK і NNK. Прикладом олігонуклеотидного набору, який можна застосовувати для створення зазначених замін, є послідовність (DVK)6 (NNK). В іншому варіанті здійснення винаходу бібліотеку створюють шляхом заміни залишків 95-100 ак на амінокислоти, кодуємі наборами кодонів як DVK, так і NNK. Прикладом олігонуклеотидного набору, який можна застосовувати для створення зазначених замін, є послідовність (DVK)5 (NNK). Іншим прикладом олігонуклеотидного набору, який можна застосовувати для створення зазначених замін, є послідовність (NNK)6. Інші приклади придатних олігонуклеотидних послідовностей фахівець у даній галузі може визначити на основі представлених у даному описі критеріїв. В іншому варіанті здійснення винаходу різні конструкції CDRH3 застосовують для виділення високоафінних сполучних агентів і для виділення сполучних агентів для різних епітопів. Довжина CDRH3, створеного в цієї бібліотеки становить від 11 до 13 амінокислот, хоча можна створювати ділянки, довжина яких відрізняється від зазначеної. Розмаїтість Н3 можна розширювати за допомогою наборів кодонів NNK, DVK і NVK, а також у вигляді більше обмеженої розмаїтості на N і/або С-кінці. Розмаїтість можна створювати в CDRH1 і CDRH2. Розмаїтість CDR-H1 і Н2 створюють за допомогою описаної стратегії, що забезпечує спрямований перенос до популяції миметиків антитіл, що зустрічаються в природних умовах, з модифікацією, що складається в тім, що фокус розмаїтості більш точно відповідає розмаїтості, що зустрічається в природних умовах, у порівнянні з раніше описаним підходом. Для урізноманітнення в CDRH3 можна конструювати безліч бібліотек з різною довжиною Н3 і потім поєднувати їх для пошуку сполучних агентів до антигенів-мішеней. Безліч бібліотек можна поєднувати й сортувати з використанням відбору на твердій підкладці й методів сортування в розчині, як це описано раніше й буде представлено нижче в даному описі. Можна застосовувати цілий ряд стратегій сортування. Наприклад, одним з варіантів є сортування на мішені, пов'язаної із твердою підкладкою з наступним сортуванням у відношенні мітки, що може бути присутнім на злитому поліпептиді (наприклад, мітка анти-g) і потім здійснювати наступне сортування на мішені, пов'язаної із твердою підкладкою. В іншому варіанті бібліотеки можна сортувати спочатку на мішені, пов'язаної із твердою поверхнею, потім елюйовані сполучні агенти сортувати на основі зв'язування в рідкій фазі (фазі розчину) з концентраціями, що знижуються, антигену-мішені. Застосування комбінацій різних методів сортування сприяє мінімізації відбору тільки володіють високим рівнем експресії послідовностей і сприяє відбору ряду різних високоафінних клонів. З бібліотек можна виділяти сполучні агенти, що володіють високої аффінністю до антигенумішені, тобто NRP1. Обмежуюча розмаїтість в Н1/Н2-ділянці знижує виродженість приблизно в 4 5 10 -10 разів і дозволяє одержувати більшу розмаїтість Н3 для створення володіючих більше високої аффінністю сполучних агентів. Застосування бібліотек з різним типом розмаїтості в CDRH3 (наприклад, з використанням DVK або NVT) забезпечує виділення сполучних агентів, які можуть зв'язуватися з різними епітопами антигенів-мішені. Афінність зв'язувальних речовин, виділених з об'єднаних описаних вище бібліотек, можна додатково підвищувати шляхом створення обмеженої розмаїтості в легкому ланцюзі. Відповідно до цього варіанта здійснення винаходу розмаїтість легкого ланцюга створюють за допомогою: в CDRL1 - амінокислоту в положенні 28 кодують RDT; амінокислоту в положенні 29 кодують RKT; амінокислоту в положенні 30 кодують RVW; амінокислоту в положенні 31 кодують ANW; амінокислоту в положенні 32 кодують ТНТ; необов'язково амінокислоту в положенні 33 кодують CTG; в CDRL2 - амінокислоту в положенні 50 кодують KBG; амінокислоту в положенні 53 кодують AVC; і необов'язково амінокислоту в положенні 55 кодують GMA; в CDRL3 амінокислоту в положенні 91 кодують ТМТ або SRT або ними обома; амінокислоту в положенні 92 кодують DMC; амінокислоту в положенні 93 кодують RVT; амінокислоту в положенні 94 кодують NHT; і амінокислоту в положенні 96 кодують TWT або YKG або обома. В іншому варіанті здійснення винаходу створюють бібліотеку або бібліотеки з розмаїтістю в CDRH1-, CDRH2- і CDRH3-ділянках. У цьому варіанті здійснення винаходу розмаїтість в CDRH3 створюють із використанням Н3-ділянок різної довжини й з використанням насамперед наборів кодонів XYZ і NNK або NNS. Бібліотеки можна створювати з використанням індивідуальних або згрупованих олігонуклеотидів або олігонуклеотиди можна поєднувати з одержанням піднабору бібліотек. Відповідно до цього варіанта здійснення винаходу бібліотеки можна сортувати відносно мішені, пов'язаної із твердою підкладкою. Клони, виділені в результаті декількох циклів 18 UA 98585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 сортування, можна піддавати скринінгу відносно специфічності й афінності за допомогою ELISA. Для оцінки специфічності клони можна піддавати скринінгу відносно необхідних антигенівмішеней, а також інших, що не представляють собою мішень антигенів. Агенти, що зв'язуються з антигеном-мішенню NRP1, потім можна піддавати скринінгу у відношенні афінності з використанням оцінки конкурентного зв'язування в розчині за допомогою ELISA або за допомогою конкурентного спот-аналізу. Сполучні агенти, що характеризуються високою аффінністю, можна виділяти з бібліотеки за допомогою наборів кодонів XYZ, одержання яких описане вище. Зазначені сполучні агенти можна легко з високим виходом одержувати у вигляді антитіл або антигензв'язуючих фрагментів антитіл у клітинній культурі. У деяких варіантах здійснення винаходу може вимагатися створення бібліотек з більше широкою розмаїтістю довжин CDRH3-ділянки. Наприклад, може виявитися бажаним створення бібліотек, у яких CDRH3-ділянки складаються приблизно з 7-19 амінокислот. Відповідно до зазначених варіантів здійснення винаходу, сполучні агенти, що характеризуються високою аффінністю, виділені із зазначених бібліотек, легко одержувати з високим виходом у культурах бактеріальних і еукаріотичних клітин. Можна створювати вектори, призначені для простого видалення послідовностей, таких як gD-мітки, компоненти послідовності вірусного оболонкового білка, і/або для додавання послідовностей константних ділянок для забезпечення одержання з високим виходом повнорозмірних антитіл або антигензв'язуючих фрагментів. Бібліотеку, що несе мутації в CDRH3, можна поєднувати з бібліотекою, що містить варіантні версії інших CDR, наприклад, CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1 і/або CDRH2. Так, наприклад, в одному з варіантів здійснення винаходу бібліотеку CDRH3 поєднують із бібліотекою CDRL3, створеної в контексті послідовності гуманізованого антитіла 4D5, що має варіанти амінокислот у положеннях 28, 29, 30, 31 і/або 32, з використанням попередньо певних наборів кодонів. В іншому варіанті здійснення винаходу бібліотеку, що несе мутації в CDRH3, можна поєднувати з бібліотекою, що містить варіанти CDRH1 і/або CDRH2 варіабельних ділянок важкого ланцюга. В одному з варіантів здійснення винаходу бібліотеку CDRH1 створюють за допомогою послідовності гуманізованого антитіла 4D5, що має варіанти амінокислот у положеннях 28, 30, 31, 32 і 33. Бібліотеку CDRH2 можна створювати за допомогою послідовності гуманізованого антитіла 4D5, що має варіанти амінокислот у положеннях 50, 52, 53, 54, 56 і 58, з використанням попередньо визначених наборів кодонів. Мутантні антитіла до NRP1 Нове антитіло до NRP1, створене на основі фагових бібліотек, можна додатково модифікувати для одержання мутантних антитіл, що володіють поліпшеними фізичними, хімічними або біологічними властивостями в порівнянні з батьківським антитілом. Якщо застосовуваний аналіз являє собою аналіз біологічної активності, то мутантне антитіло переважно має біологічну активність в обраному аналізі, що щонайменше в 10 разів перевищує, переважно щонайменше в 50 перевищує й іноді щонайменше в 100 або 200 разів перевищує біологічну активність батьківського антитіла, установлену за допомогою такого ж аналізу. Наприклад, мутантне антитіло до NRP1 переважно володіє аффінністю до зв'язування з NRP1, щонайменше в 10 разів більше сильної, переважно щонайменше в 20 разів більше сильної, більш переважно щонайменше в 50 разів більше сильної й іноді щонайменше в 100 або 200 разів більше сильної, чим афінність до зв'язування батьківського антитіла до NRP1. Для створення мутантного антитіла інтродукують одну або кілька амінокислотних змін (наприклад, замін) у гіперваріабельні ділянки батьківського антитіла. В альтернативному або додатковому варіанті в батьківське антитіло можна інтродукувати одну або кілька змін (наприклад, замін) залишків каркасної ділянки, що приводить до поліпшення афінності до зв'язування мутантного антитіла з антигеном з інших видів ссавців. Прикладами залишків каркасної ділянки, придатних для модифікації, є залишки, які нековалентно безпосередньо зв'язуються з антигеном (Amit і ін., Science 233, 1986, сс. 747-753); взаємодіють/впливають на конформацію CDR (Chothia і ін., J. Моl. Віоl. 196, 1987, сс. 901-917); і/або беруть участь в області контакту VL-VH (ЕР 239400В1). У конкретних варіантах здійснення винаходу модифікація одного або декількох зазначених залишків каркасної ділянки приводить до підвищення афінності до зв'язування антитіла з антигеном з інших видів ссавців. Наприклад, у зазначеному варіанті здійснення винаходу можна змінювати від приблизно 1 до приблизно 5 залишків каркасної ділянки. Іноді це може виявитися достатнім для одержання мутантного антитіла, придатного для застосування в доклінічних дослідах, навіть без зміни якої-небудь гіперваріабельної ділянки. Однак, як правило, мутантне антитіло повинне містити також зміна(и) гіперваріабельної ділянки. Залишки гіперваріабельної ділянки, які змінюють, можна змінювати 19 UA 98585 C2 5 10 15 довільно, особливо, коли вихідна афінність до зв'язування батьківського антитіла є такою, що довільно отримане мутантне антитіло можна легко відбирати шляхом скринінгу. Однією з коштовних процедур одержання мутантів антитіл є "мутагенез на основі сканування аланіну" (Cunningham і Wells, Sciente, 244, 1989, сс. 1081-1085). Відповідно до цього методу один або кілька залишків гіперваріабельної ділянки заміняють на залишок(і) аланіну або поліаланіну, роблячи тим самим вплив на взаємозв'язок амінокислот з антигеном з іншого виду ссавця. Той(ті) залишок(і) амінокислот гіперваріабельної ділянки, для яких установлена функціональна чутливість до замін, потім піддають удосконаленню шляхом інтродукції додаткових або інших мутацій у сайтах, у яких роблять заміну. Таким чином, у той час як сайт, у який інтродукують варіант амінокислотної послідовності, є визначеним, не потрібно, щоб природа мутації per se була визначена. Несучі аіа мутанти, отримані таким чином, піддають скринінгу у відношенні їхньої біологічної активності з використанням представленого в даному описі аналізу. Як правило, інтродукцію змін варто починати з консервативної заміни, такій як представлена нижче під заголовком "кращі заміни". Якщо такі заміни приводять до зміни біологічної активності (наприклад, афінності до зв'язування), то потім інтродукують більше істотні заміни, позначені як "приклади замін" у наведеній нижче таблиці, або інші заміни, описані нижче при посиланні на клас амінокислот, і потім продукти піддають скринінгу. Кращі заміни Вихідний залишок Ala (A) Arg (R) Asn (N) Asp (D) Cys (С) Gln (Q) Glu (E) Gly (G) His (H) He (I) Leu (L) Lys (K) Met (M) Phe (F) Pro (P) Ser(S) Thr (T) Trp (W) Tyr (Y) Val (V) Приклади замін Кращі заміни val; leu; ile lys; gln; asn gln; his; asp; lys; arg glu; ser; ala asn; glu asp; gln ala asn; gin; lys; arg leu; val; met; ala; phe; норлейцин норлейцин; ile; val; met; ala; phe arg; phe; ile leu; phe; ile leu; val; ile; ala; tyr ala thr ser tyr; phe trp; phe; thr; ser ile; leu; met; phe; ala; норлейцин val lys gln glu ser asn asp ala arg leu ile arg leu tyr ala thr ser tyr phe leu 20 25 30 Для досягнення ще більш істотних модифікацій біологічних властивостей антитіл здійснюють вибір замін, які в значній мірі розрізняються по їхньому впливу на підтримку (а) структури каркаса поліпептиду в області заміни, наприклад, складчастої або спіральної конформації, (б) заряду або гідрофобности молекули в сайті-мішені або (в) розміру бічного ланцюга. Залишки, що зустрічаються в природних умовах, підрозділяють на групи на основі загальних властивостей бічних ланцюгів: (1) гідрофобні: норлейцин, met, ala, val, leu, ile; (2) нейтральні гідрофільні: cys, ser, thr, asn, gln; (3) кислі: asp, glu; (4) основні: his, lys, arg; (5) залишки, які впливають на орієнтацію ланцюга: gly, pro; і (6) ароматичні: trp, tyr, phe. Неконсервативні заміни передбачають заміну представника одного із цих класів на представника іншого класу. 20 UA 98585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В іншому варіанті здійснення винаходу сайти, обрані для модифікації, піддавали дозріванню афінності за допомогою фагової презентації (див. вище). Молекули нуклеїнових кислот, що кодують мутантні амінокислотні послідовності, одержують за допомогою різних методів, відомих у даній галузі. Ці методи являють собою (але, не обмежуючись ними) мутагенез із використанням олігонуклеотидів (або сайтспрямований), ПЦРмутагенез і касетний мутагенез раніше отриманої мутантної або немутантної версії батьківського антитіла. Кращим методом одержання мутантів є сайтспрямований мутагенез (див., наприклад, Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1985, c.488). У конкретних варіантах здійснення винаходу в мутанта антитіла повинен бути заміщений тільки один залишок гіперваріабельної ділянки. В інших варіантах здійснення винаходу заміщені двоє або більша кількості залишків гіперваріабельної ділянки батьківського антитіла, наприклад зроблене від приблизно 2 до приблизно 10 замін залишків гіперваріабельної ділянки. Як правило, мутант антитіла з поліпшеними біологічними характеристиками повинен мати амінокислотну послідовність, що щонайменше на 75 % ідентична або подібна амінокислотної послідовності варіабельної ділянки важкого або легкого ланцюга батьківського антитіла, більш переважно щонайменше на 80 %, більш переважно щонайменше на 85 %, більш переважно щонайменше на 90 % і найбільше переважно щонайменше на 95 %. Ідентичність або подібність щодо зазначеної послідовності визначають як відсоток амінокислотних залишків у розглянутій послідовності (послідовності-кандидаті), ідентичних (тобто цей же залишок) або подібних (тобто амінокислотний залишок із цієї ж групи з позицій загальних властивостей бічного ланцюга, див. вище) залишкам батьківського антитіла, після лінеаризації послідовностей і інтродукції при необхідності проломів для досягнення максимального відсотка ідентичності послідовності. Ні Nкінцеві, ні С-кінцеві, ні внутрішні подовження, делеції або інсерції в послідовності антитіла поза варіабельної ділянки не повинні розглядатися як такі, що впливають на ідентичність або подібність послідовності. Після одержання мутанта антитіла визначають біологічну активність молекули щодо батьківського антитіла. Як відзначалося вище, цей метод може включати визначення афінності до зв'язування й/або інших видів біологічної активності антитіла. У кращому варіанті здійснення винаходу панель мутантів антитіла одержують і піддають скринінгу у відношенні афінності до зв'язування з антигеном, таким як NRP1 або його фрагмент. Одне або кілька мутантних антитіл, обраних за допомогою такого початкового скринінгу, необов'язково піддають одному або декільком додатковим аналізам біологічної активності для підтвердження того, що мутантне(і) антитіло(а) з підвищеної аффінністю до зв'язування можна дійсно застосовувати, наприклад, для доклінічних досліджень. Відібраний(і) у такий спосіб мутант(и) антитіла можна піддавати додатковим модифікаціям, що, як правило, залежить від передбачуваного застосування антитіла. Такі модифікації можуть являти собою додаткову зміну амінокислотної послідовності, злиття з гетерологічним(ми) поліпептидом(ами) і/або ковалентні модифікації, описані нижче. Відносно змін амінокислотної послідовності, то приклади її модифікацій наведені вище. Наприклад, кожної із залишків цистеїну, що не беруть участі у підтримці відповідної конформації мутантного антитіла, також може бути замінений, як правило серином, з метою підвищення стійкості молекули до окислювання й попередження аномального перехресного зшивання. І навпаки, цистеїновий(і) зв'язок(і) можна вводити в антитіло для підвищення його стабільності (особливо, якщо антитіло являє собою фрагмент антитіла, такий як Fv-фрагмент). Інший тип амінокислотного мутанта має змінену схему глікозилювання. Для досягнення цього можна вилучати шляхом делеції один або декілько вуглеводних фрагментів, що є присутнім в антитілі, і/або додавати один або декілько сайтів глікозилювання, які в нормі не присутні в антитілі. Глікозилювання антитіл, як правило, відбувається за допомогою або N-зв'язування, або Про-зв'язування. N-зв'язування передбачає приєднання вуглеводного фрагмента до бічного ланцюга залишку аспарагіну. Трипептидні послідовності аспарагін-х-серин і аспарагін-х-треонін, де X позначає будь-яку амінокислоту крім проліну, являють собою розпізнавані послідовності, призначені для ферментативного приєднання вуглеводного фрагмента до бічного ланцюга аспарагіну. Так, присутність будь-який їх цих трипептидних послідовностей у поліпептиді створює потенційний сайт глікозилювання. Озв'язане глікозилювання передбачає приєднання одного із цукрів, таких як Nацетилгалактозамін, галактоза або ксилоза, до гідроксиамінокислоті, найбільше часто до серіну або треоніну, хоча можна застосовувати також 5-гідроксипролін або 5-гідроксилізин. Введення додаткових сайтів глікозилювання в антитіло можна здійснювати шляхом такої зміни амінокислотної послідовності, що приводить до того, що вона містить одну або декілька описаних вище трипептидних послідовностей (для сайту N-глікозилювання). Зміна також може 21 UA 98585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 являти собою додавання або заміну одного або декількох залишків серіну або треоніну в послідовності вихідного антитіла (для сайтів О-глікозилювання). Вектори, клітини-хазяї й методи рекомбінації Антитіло до NRP1, пропоноване у винаході, можна одержувати рекомбинантно з використанням загальнодоступних методів і матеріалів. Для рекомбінантного одержання антитіла до NRP1 кодуючу його нуклеїнову кислоту виділяють і вбудовують у реплікований вектор для додаткового клонування (ампліфікація ДНК) або для експресії. ДНК, що кодує антитіло, легко виділяти або синтезувати за допомогою загальноприйнятих методик (наприклад, з використанням олігонуклеотидних зондів, які мають здатність специфічно зв'язуватися із ДНК, що кодують важкі й легкі ланцюги антитіла). Доступним є цілий ряд векторів. Вектори звичайно містять (але, не обмежуючись ними) один або декілька з наступних компонентів: сигнальну послідовність, сайт ініціації реплікації, один або кілька маркерних генів, енхансерний елемент, промотор і послідовність термінатора транскрипції. (І) Компонент, що представляє собою сигнальну послідовність Антитіло, пропоноване у винаході, можна одержувати за допомогою рекомбінації не тільки індивідуально, але також у вигляді поліпептиду, злитого з гетерологічним поліпептидом, що переважно являє собою сигнальну послідовність або інший поліпептид, що несе специфічний сайт розщеплення на N-кінці зрілого білка або поліпептиду. Обрана гетерологічна сигнальна послідовність переважно являє собою послідовність, що розпізнається й процесується (тобто розщеплюється сигнальною пептидазою) клітиною-хазяїном. Для прокаріотичної клітинихазяїна, що не розпізнає й не процесує нативну сигнальну послідовність антитіла, сигнальну послідовність заміняють сигнальною послідовністю прокаріотичного організму, обраної, наприклад, із групи, що включає лідерні послідовності лужної фосфатази, пеніцилінази, Ірр або термостабильного ентеротоксину II. Для секреції із дріжджів нативну сигнальну послідовність можна заміняти, наприклад, на лідерну послідовність інвертази дріжджів, лідерну послідовність -фактора (включаючи лідерні послідовності -фактора Saccharomyces і Kluyveromyces) або лідерну послідовність лужної фосфатази, лідерну послідовність глюкоамілази С. albicans) або сигнальну послідовність, описану в WO 90/13646. Для експресії в клітинах ссавців можна застосовувати сигнальні послідовності ссавців, а також вірусні секреторні лідерні послідовності, наприклад, сигнальну послідовність g вірусу герпеса простого. ДНК такої ділянки-попередника лігують у рамці зчитування із ДНК, що кодує антитіло. (II) Компонент, що представляє собою сайт ініціації реплікації Як експресійні, так і клонуючі вектори містять нуклеотидну послідовність, що дозволяє вектору реплікуватися в одній або декількох обраних клітинах-хазяїнах. Як правило, у клонуючих векторах така послідовність являє собою послідовність, що дозволяє вектору реплікувати незалежно від хромосомної ДНК хазяїна, і вона включає сайти ініціації реплікації або автономно репліковані послідовності. Такі послідовності добре відомі для різних бактерій, дріжджів і вірусів. Сайт ініціації реплікації із плазміди pBR322 придатний для більшості грамнегативних бактерій, сайт ініціації плазміди 2 придатний для дріжджів, а різні вірусні сайти ініціації реплікації (ОВ40, вірусу поліоми, аденовірусу, VSV (вірус везикулярного стоматиту) або BPV (вірус папіломи великої рогатої худоби)) придатні для клонуючих векторів у клітинах ссавців. Як правило, компонент, що представляє собою сайт ініціації реплікації, не потрібно для експресійних векторів на основі послідовностей ссавців (як правило, можна застосовувати сайт ініціації ОВ40, оскільки він містить ранній промотор). (III) Компонент, що представляє собою селектуємий ген Експресійні й клонуючі вектори, як правило, можуть містити селектуємий ген, також позначуваний як селектуємий маркер. Як правило, селектуємі гени кодують білки, які (а) обумовлюють стійкість до антибіотиків або інших токсинів, таким як ампіцилін, неоміцин, метотрексат або тетрациклін, (б) доповнюють дефіцит ауксотрофності або (в) поповнюють живильні речовини, що мають вирішальне значення, які не надходять із комплексних середовищ, наприклад ген, що кодує D-аланінрацемазу для Bacilli. Одним із прикладів схеми селекції є застосування лікарського засобу для припинення росту клітини-хазяїна. Ті клітини, які успішно трансформовані гетерологічним геном, продукують білок, що надає стійкість до лікарського засобу, і в результаті виживають при використанні такого режиму селекції. Прикладами лікарських засобів, застосовуваних для такої домінантної селекції, є неоміцин, мікофєнольна кислота й гигроміцин. Іншими прикладами прийнятних селектуємих маркерів для клітин ссавців є маркери, які дозволяють ідентифікувати клітини, компетентні відносно здатності поглинати нуклеїнову кислоту, що кодує антитіло, такі як DHFR (дигідрофолатредуктаза), тімідинкіназаа, 22 UA 98585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 металотіонеїн-І і -II, переважно гени металотіонеїну приматів, аденозиндеаміназа, орнитиндекарбоксилаза й т.д. Наприклад, клітини, трансформовані селектуємим геном DHFR, спочатку ідентифікують шляхом культивування всіх трансформантів у культуральному середовищі, що містить метотрексакт (Mtx), конкурентний антагоніст DHFR. Прийнятною клітиною-хазяїном, коли застосовують DHFR дикого типу, є лінія клітин яєчника китайського хом'ячка (СНО) з дефіцитом активності DHFR. В іншому варіанті клітини-хазяї (насамперед хазяї дикого типу, які містять ендогенну DHFR), трансформовані або котрансформовані послідовностями ДНК, що кодують антитіло, білок DHFR дикого типу й інший селектуємий маркер, такий як аміноглікозид-З'-фосфотрансфераза (АРН), можна відбирати по росту клітин у середовищі, що містить селектуючий агент для селектуємого маркера, наприклад, аміноглікозидний антибіотик, такий як, канаміцин, неоміцин або G418 (див. U.S. 4965199). Прийнятний для застосування в дріжджах селектуючий ген являє собою ген trp1, що є присутнім в отриманій із дріжджів плазміді YRp7 (Stinchcomb і ін., Nature, 282, 1979). Ген trp1 є селектуючим маркером для мутантного штаму дріжджів, позбавленого здатності рости в середовищі з додаванням триптофану, наприклад штаму АТСС 44076 або РЕР4-1 (Jones, Genetics, 85, 1977, с. 12). У результаті цього наявність пов'язаного з trp1 ушкодження генома дріжджового клітину-хазяїна забезпечує ефективне оточення для виявлення трансформації по росту у відсутності триптофану. Аналогічно цьому штами дріжджів з дефіцитом Leul (АТСС 20,622 або 38,626) доповнюються відомими плазмідами, що несуть ген Leu2. Крім того, вектори, отримані з кільцевої плазміди pKD1 розміром 1,6 мкм, можна застосовувати для трансформації дріжджів p. Kluyveromyces. Крім того, для К. lacti описана Ееспресійна система для напівпромислового одержання рекомбінантного телячого хімозину (Van den Berg, Bio/Technology 8, 1990, с. 135). Описані також мультикопійні експресійні вектори для секреції зрілого рекомбінантного людського сироваткового альбуміну за допомогою промислових штамів Kluyveromyces (Fleer і ін., Bio/Technology 9, 1991, сс. 968-975). IV Компонент, що представляє собою промотор Експресійні й клонуючі вектори, як правило, містять промотор, що розпізнається організмомхазяїном і функціонально пов'язаною з нуклеїновою кислотою, що кодує антитіло. Промотори, які придатні для застосування в прокаріотичних клітинах-хазяїнах, являють собою промотор pho, промоторні системи -лактамази й лактози, промоторні системи лужної фосфатази, триптофану (trp) і гібридні промотори, такі як промотор tac. Однак можна застосовувати також інші відомі бактеріальні промотори. Промотори, призначені для застосування в бактеріальних системах, містять також послідовність Шайна-Дальгарно (S.D.), функціонально пов'язану із ДНК, що кодує антитіло. Відомі також промоторні послідовності, придатні для еукаріот. Фактично всі гени еукаріотичних організмів мають багату AT ділянку, локалізовану на відстані приблизно 25-30 пар основ проти ходу транскрипції від сайту ініціації транскрипції. Виявлена також інша послідовність, розташована на відстані 70-80 основ від сайту початку транскрипції багатьох генів, що представляє собою CNCAAT-ділянку, у якій N може означає будь-який нуклеотид. На 3'-кінці більшості генів еукаріотичних організмів перебуває послідовність ААТААА, що може являти собою сигнал для додавання полі-А-хвоста до 3'-кінцю послідовності, що кодує. Всі ці послідовності можна вбудовувати в еукаріотичні експресійні вектори. Приклади промоторних послідовностей, які можна застосовувати в дріжджових клітинаххазяїнах, включають промотори 3-фосфогліцераткінази або інших гліколітичних ферментів, таких як єнолаза, гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназа, гексокіназа, піруватдекарбоксилаза, фосфофруктокіназаа, глюкозо-6-фосфатізомераза, 3-фосфогліцератмутаза, піруваткіназа, тріозофосфатізомераза, фосфоглюкозоізомераза й глюкокіназа. Інші промотори дріжджів, які являють собою індуцибельні промотори, що мають додаткову перевагу, пов'язані із транскрипцією, що контролюється умовами росту, є промоторні діялнки алкогольдегідрогенази 2, ізоцитохрома С, кислої фосфатази, ферментів, що розщеплюють, пов'язаних з метаболізмом азоту, металтіонеїну, гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази й ферментів, відповідальних за утилізацію мальтози й галактози. Крім того, прийнятні вектори й промотори, які можна застосовувати при експресії в дріжджах, описані в ЕР 73657. У сполученні із промоторами дріжджів доцільно застосовувати також енхансери дріжджів. Транскрипцію антитіла з векторів у клітинах ссавцях-хазяїнах контролює, наприклад за допомогою промоторів, отриманих з геномів вірусів, таких як вірус поліоми, вірус віспи птахів, аденовірус (такий як аденовірус 2), вірус папіломи великої рогатої худоби, вірус саркоми птахів, цитомегаловірус, ретровірус, вірус гепатиту В и найбільше переважно вакуолізуючий мавпячий 23 UA 98585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вірус 40 (ОВ40), з гетерологічних промоторів ссавців, наприклад промотору актину або промотору імуноглобуліну, і із промоторів теплового шоку за умови, що такі промотори сумісні із системами клітини-хазяїна. Ранній і пізній промотори вірусу ОВ40 легко одержувати у вигляді рестрикційного ОВ40фрагмента, що містить також сайт ініціації реплікації вірусу OB40. Негайно-ранній промотор людського цитомегаловіруса легко одержувати у вигляді рестрикційногоо Hindlll Е-фрагмента. Система, призначена для експресії ДНК у хазяїв-ссавців за допомогою бичачого вірусу папіломи, описана в U.S. 4419446. Модифікація цієї системи описана в U.S. 4601978 (див. також в Reyes і ін., Nature 297, 1982, сс. 598-601 дані про експресію кДНК людського -інтерферону в мишачих клітинах під контролем промотору тімідинкінази вірусу герпеса простого). В іншому варіанті як промотор можна застосовувати довгий кінцевий повтор вірусу саркоми Рауса. (V) Компонент, що представляє собою енхансер Транскрипцію ДНК, що кодує антитіло, пропоноване в даному винаході, у вищих еукаріотичних організмах часто підвищують шляхом вбудовування у вектор енхансерної послідовності. Відомі багато які енхансерні послідовності генів ссавців (генів глобіну, еластази, альбуміну, -фетопротеїну й інсуліну). Однак, як правило, застосовують енхансер вірусу еукаріотичної клітини. Прикладами є енхансер ОВ40, розташований на вилученій стороні сайту ініціації реплікації (пари основ 100-270), енхансер раннього промотору цитомегаловіруса, енхансер поліоми, розташований на вилученій стороні сайту ініціації реплікації, і енхансери аденовірусів (див. також в Yaniv, Nature 297, 1982, сс. 17-18 відомості про енхансерні елементи, призначені для активації еукаріотичних промоторів). Енхансер можна вбудовувати шляхом сплайсинга у вектор в 5'- або 3'- положення щодо послідовності, що кодує, антитіла, але переважно його поміщають у сайт, розташований в 5'-напрямку щодо промотору. (VI) Компонент, що представляє собою термінатор транскрипції Експресійні вектори, використовувані в еукаріотичних клітинах-хазяїнах (клітини дріжджів, грибів, комах, рослин, тварин, людей або вміщуюче ядро клітини інших багатоклітинних організмів), повинні містити також послідовності, необхідні для терминації транскрипції й стабілізації мРНК. Такі послідовності звичайно одержують із 5'- і іноді з 3'-нетрансльованих ділянок еукаріотичних або вірусних ДНК або кДНК. Ці ділянки містять нуклеотидні сегменти, транскрибовані у вигляді поліаденильованих фрагментів у нетрансльованій ділянці мРНК, що кодує антитіло. Одним із придатних як термінатор транскрипції компонентів є ділянка поліаденилювання бичачого гормону росту (див. WO94/11026 і описаний у ній експресійний вектор). (VII) Селекція й трансформація клітин-хазяїв Згідно із даним описом прийнятними клітинами-хазяями для клонування або експресії ДНК у векторах, є описані вище клітини прокаріот, дріжджів або вищих еукаріот. Прийнятними для цієї мети прокаріотами є (але, не обмежуючись ними) еукаріотичні бактерії (еубактерии), такі як грамнегативні або грампозитивні організми, наприклад, сім. Enterobacteriaceae, такі як Escherichia, наприклад, Е. соlі, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, наприклад, Salmonella typhimurium, Serratia, наприклад, Serratia marcescans, і Shigella, а також Bacilli, такі як В. subtilis і В. licheniformis (наприклад, штам В. licheniformis 41P, описаний в DD 266710, опублікованої 12 квітня 1989 p.), Pseudomonas, такі як P. aeruginosa, і Streptomyces. Одним із кращих для клонування хазяїном є штам Е. соlі 294 (АТСС 31,446), хоча можна застосовувати й інші штами, такі як Е. соlі В, Е. соlі Х1776 (АТСС 31,537) і Е. соlі W3110 (АТСС 27,325). Ці приклади дані з метою ілюстрації і їх не слід розглядати, як обмежуючі обсяг винаходу. Крім прокаріотичних організмів як хазяїнів для клонування або експресії векторів, які кодують антитіла, можна використати еукаріотичні мікроорганізми, такі як нитчаті гриби або дріжджі. Найбільш часто застосовуваним нижчим еукаріотичним мікроорганізмом-хазяїном є Saccharomyces cerevisiae або звичайні пекарські дріжджі. Однак широко доступні багато представників інших родів, видів і штамів, такі як Schizosaccharomyces pombe; хазяї із сем. Kluyveromyces, такі, наприклад, як К. lactis, К. fragilis (АТСС 12,424), К. bulgaricus (АТСС 16,045), К. wickeramii (АТСС 24,178), К. waltii (АТСС 56,500), К. drosophilarum (АТСС 36,906); К. thermotolerans і К. marxianus; Yarrowia (ЕР 402226); Pichia pastor is (EP 183070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, такі як Schwanniomyces occidentalis; і нитчаті гриби, такі, наприклад, як Neurospora, Penicillium, Tolypocladium і хазяї p. Aspergillus, такі як А. nidulans і A. niger, і їх можна застосовувати згідно із даним винаходом. Клітини-хазяї, які можна використати для експресії глікозильованого антитіла, одержують із багатоклітинних організмів. Прикладами клітин безхребетних є клітини комах, а також можна застосовувати клітини рослин. Були виявлені численні бакуловірусні штами і їхні варіанти й відповідні придатні для них як хазяїнів клітини комах-хазяїв, таких як Spodoptera frugiperda 24 UA 98585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (гусениця), Aedes aegipti (комар), Aedes albopictus (комар), Drosophila melanogaster (плодова муха) і Bombyx mori (шовковичний хробак). Широко відомі різноманітні штами вірусів, які можна використати для трансфекції, наприклад варіант L-1 NPV Autographa californica і штам NPV Bombyx mori Bm-5, і такі віруси можна застосовувати згідно із даним винаходом як віруси, насамперед для трансфекції клітин Spodoptera frugiperda. Як хазяїнів можна використати культури рослинних клітин бавовнику, кукурудзи, картоплі, сої, петунії, томатів і тютюну. Проте, найбільший інтерес представляють клітини хребетних і в цей час розмноження клітин хребетних у культурі (культура тканини) стало стандартною процедурою. Прикладами придатних як хазяїнів ліній клітин ссавців є лінія клітин почки мавпи CV1, трансформована за допомогою ОВ40 (COS-7, АТСС CRL 1651); лінія клітин почки ембріона людини (293 або клітини лінії 293, субклоновані з метою вирощування в суспензійній культурі, Graham і ін., J. Gen. Virol., 36, 1977, с. 59); клітини почки дитинчати хом'ячка (ВНК, АТСС CCL 10); клітини яєчника китайського хом'ячка/-DHFR (СНО, Urlaub і ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 1980, с. 4216); клітини Сертоли миші (ТМ4, Mather, Biol. Reprod., 23, 1980, сс. 243-251); клітини почки мавпи (CV1, АТСС CCL 70); клітини почки африканської зеленої мавпи (VERO-76, АТСС CRL-1587); клітини карциноми шейки матки людини (HELA, АТСС CCL 2); клітини почки собаки (MDCK, АТСС CCL 34); клітини печінки бичачого щура (BRL 3А, АТСС CRL 1442); клітини легкої людини (W138, АТСС CCL 75); клітини печінки людини (Hep G2, НВ 8065); клітини пухлини молочної залози миші (ММТ 060562, АТСС CCL51); клітини TRI (Mather і ін., Ann als N.Y. Acad. Sci., 383, 1982, cc. 44-68); клітини MRC 5; клітини FS4 і лінія клітин гепатоми людини (Hep G2). Клітини-хазяї трансформують за допомогою описаних вище експресійних або клонуючих векторів з метою виробництва антитіла й культивують у придатних живильних середовищах відповідним чином модифікованих для вбудовування індукуючих промоторів, відбору трансформантів або ампліфікації генів, що кодують необхідні послідовності. (VIII) Культивування клітин-хазяїв Клітини-хазяї, які використають для одержання антитіла, пропонованого в даному винаході, можна культивувати в різних середовищах. Для культивування клітин-хазяїв можна використати наявні в продажі середовища, такі як середовище Хама F10 (фірма Sigma), мінімальне підтримуюче середовище (MEM, фірма Sigma), RPMI-1640 (фірма Sigma) і модифіковане по методу Дульбекко середовище Голка (DMEM, фірма Sigma). Крім того, як середовища для культивування клітин-хазяїв можна використати будь-які із середовищ, які описані в Ham і ін., Meth. Enz., 58, 1979, с. 44; Barnes і ін., Anal. Biochem., 102, 1980, с. 255; в U.S. 4767704, 4657866, 4927762, 4560655 або 5122468; в WO 90/03430, WO 87/00195; або в U.S. Re. 30985. Кожне із цих середовищ при необхідності можна доповнювати гормонами й/або іншими факторами росту (такими як інсулін, трансферин або епідермальний фактор росту), солями (такими як хлорид натрію, кальцій, магній і фосфат), буферами (такими як HEPES), нуклеотидами (такими як аденозин і тімідин), антибіотиками (такими як лікарський засіб гентаміцин (GENTAMYCIN™)), мікроелементами (тобто неорганічними сполуками, які звичайно присутні в кінцевих концентраціях, що перебувають у мікромолярному діапазоні) і глюкозою або еквівалентним джерелом енергії. Фахівцеві в даній галузі повинно бути очевидно, що можна включати також будь-які інші необхідні добавки у відповідних концентраціях. Умови культивування, такі як температура, значення рН і т.п., являють собою умови, які використалися раніше для клітин-хазяїв, відібраних для експресії, і вони повинні бути очевидні фахівцеві в даній галузі. (IX) Очищення антитіл При використанні методів рекомбінації антитіло може продукуватися усередині клітини, у периплазматичному просторі або безпосередньо виділятися в середовище. Якщо антитіло продукується усередині клітини, то на першій стадії видаляють, наприклад, за допомогою центрифугування або ультрафільтрації, що складає з окремих часток дебрис, або з клітинхазяїв, або з лізованих фрагментів. В Carter і ін., Bio/Technology, 10, 1992, сс. 163-167 описаний метод виділення антитіл, секретованих у периплазматичний простір Е. соlі. У цілому, метод полягає в наступному: клітинну масу у вигляді пасти піддають відтаванню приблизно протягом 30 хв у присутності ацетату натрію (рН 3,5), ЕДТК і фенил метил сульфоніл фториду (ФМСФ). Клітинний дебрис можна видаляти центрифугуванням. Якщо антитіло секретується в середовище, супернатанти таких експресійних систем, як правило, спочатку концентрують за допомогою наявного в продажі фільтра для концентрування білків, наприклад пристрою для ультрафільтрації типу Amicon або Millipore Pellicon. На кожній з попередніх стадій для інгібування протеолізу можна додавати інгібітор протеази, такий як ФМСФ, а для попередження збільшення небажаних домішок можна додавати антибіотики. 25 UA 98585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Композицію антитіла, отриману із клітин, можна очищати, наприклад, хроматографією на гідроксилапатиті, гель-електрофоезом, діалізом і афінною хроматографією, при цьому кращим методом очищення є афінна хроматографія. Можливість застосування протешу А в якості аффінного ліганда залежить від виду й ізотипа будь-якого Fc-фрагмента імуноглобуліну, що присутствуют в антитілі. Протеїн А можна використати для очищення антитіл, основою яких є людські важкі 1-, 2- або 4-ланцюга (Lindmark і ін., J. Immunol. Meth., 62, 1983, cc. 1-13). Протеїн G рекомендується для застосування для всіх мишачих ізотипов і для людського  3ланцюга (Guss і ін., ЕМВО J., 5, 1986, сс. 1567-1575). Як матриця, з якої зв'язується афінний ліганд, найбільше часто застосовують агарозу, однак можна використати й інші матриці. Стійкі до механічних впливів матриці, такі як стекло або полі(стиролдивініл)бензол з певним розміром пор, дозволяють досягати більше високих швидкостей потоку й більше короткого часу процесу в порівнянні з характеристиками, що досягають при використанні агарози. Якщо антитіло містить СH3-домен, то для очищення можна використати смолу типу Bakerbond ABX™ (фірма J.T. Baker, Филлипсбург, шт. Нью-Джерсі). Залежно від антитіла, що підлягає виділенню, можна застосовувати також інші методи очищення білка, такі як фракціонування на іонообмінінй колонці, осадження етанолом, РХВР зі зверненою фазою, хроматографія на силікагелі, хроматографія на гепарині-SEPHAROSE™, хроматографія на аніоно- або катионообмінній смолі (наприклад на колонку з поліаспартамовою кислотою), хроматофокусування, ДСН-ПААГ і осадження сульфатом амонію. Після кожної з попередніх стадій очищення суміш, що містить антитіло, що представляє інтерес, і домішки, можна піддавати хроматографії, заснованої на гідрофобній взаємодії, при низькому значенні рН із використанням буфера для елюції, що має значення рН приблизно від 2,5 до 4,5, хроматографію переважно здійснюють при низьких концентраціях солей (наприклад, з використанням приблизно 0-0,25М солей). Фармацевтичні композиції Терапевтичні композиції антитіла наготовлюють із метою їхнього зберігання шляхом змішання антитіла, що має необхідний ступінь чистоти, з необов'язковими фармацевтично прийнятними носіями, ексципієнтами або стабілізаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences, під ред. A. Osol, 1980) у формі лліофілізованих композицій або водних розчинів. Прийнятні носії, ексципієнти або стабілізатори повинні бути нетоксичними для реципієнтів у використовуваних дозах і концентраціях, вони включають буфери, такі як фосфатний, цитратний буфери, а також буфери на основі інших органічних кислот; антиоксиданти, включаючи аскорбінову кислоту й метіонін; консерванти (такі як хлорид октадецилдиметил бензил амонію; хлорид гексаметонію; хлорид бензалконію; хлорид бензетонію; фенол; бутиловий або бензиловий спирт; алкілпарабени, такі як метил- або пропілпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3пентанол і мета-крезол); поліпептиди з низькою молекулярною масою (що містять менш приблизно 10 залишків); білки, такі як сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, такі як поливінілпиролідон; амінокислоти, такі як гліцин, глутамін, аспарагін, гістидин, аргінін або лізин; моносахариди, дисахариди й інші вуглеводи, включаючи глюкозу, манозу або декстрини; хелатуючі агенти, такі як ЕДТК; цукри, такі як сахароза, маніт, трегалоза або сорбіт; солеутворюючі протиіони, такі як натрій; вміщуючі метал комплекси (наприклад, комплекси Zn-білок); і/або неионогенні поверхнево-активні речовини, такі як TWEEN®, PLURONICS® або полиетиленгліколь (ПЕГ). Композиції, пропоновані у винаході, можуть містити також більше однієї діючої речовини, якщо це необхідно для конкретного підлягаючого лікуванню показання, переважно речовини з додатковими видами активності, які не роблять негативного впливу один на одного. Наприклад, може виявитися бажаним додатково включати імунодепресант. Такі молекули повинні бути присутніми у комбінації в кількостях, ефективних для рішення поставленого завдання. Діючі речовини можна включати також у мікрокапсули, наприклад, отримані за допомогою методів коацервації або межфазної полімеризації, наприклад у гідроксипропілметилцелюлозні або желатинові мікрокапсули й поли(метилметакрилатні) мікрокапсули відповідно, у колоїдні системи введення лікарського засобу (наприклад у ліпосоми, альбумінові мікросфери, мікроемульсії, наночастинки й нанокапсули) або в макроемульсії. Такі методи описані в Remington's Pharmaceutical Sciences, під ред. A. Osol, 1980. Композиції, призначені для застосування in vivo, повинні бути стерильними. Це легко може бути досягнуте шляхом фільтрації через стерильні фільтруючі мембрани. Можна наготовлювати композиції із пролонгованим вивільненням. Прийнятними прикладами композицій із пролонгованим вивільненням є напівпроникні матриці із твердих гідрофобних полімерів, що містять антитіло, при цьому матриці можуть являти собою продукт, що має певну форму, наприклад, плівки або мікрокапсули. Приклади матриць, які можна використати для 26 UA 98585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пролонгованого вивільнення, включають поліефіри, гідрогелі (наприклад, полі(2гідроксиетилметакрилат) або поли(вініловий спирт), полілактиди (U.S. 3773919), співполімери Lглутамінової кислоти й -етил-L-глутамату, співполімери етилену й вінілацетату, що не піддаються розкладанню, співполімери молочної кислоти й гліколевої кислоти, що розкладаються, такі як LUPRON DEPOT® (призначені для ін'єкції мікросфери, що складаються із співполімера молочної кислоти й гліколевої кислоти й ацетату леупроліду), і полі-D-(-)-3гідроксимасляну кислоту. У той час як такі полімери як співполімери етилену й вінілацетату й молочної кислоти-гліколевої кислоти, можуть забезпечувати вивільнення молекули протягом 100 днів, певні гідрогелі вивільняють білки протягом більше короткого проміжку часу. Коли капсульовані антитіла зберігаються в організмі протягом тривалого часу, може відбуватися їхня денатурація або агрегація в результаті того, що вони піддаються дії вологості при температурі 37 °C, що приводить до зниження біологічної активності й може приводити до зміни імуногенності. Можна створювати раціональні стратегії для стабілізації залежно від механізму цього процесу. Наприклад, якщо має місце механізм агрегації, що, як установлено, обумовлений утворенням межмолекулярного S-S-зв'язку через тіо-дисульфідну заміну, то для досягнення стабілізації можна модифікувати сульфгідрильні залишки, здійснювати ліофілізацію з кислих розчинів, контролювати вміст вологи за допомогою відповідних добавок і створювати специфічні композиції полімерних матриць. Терапевтичне застосування Мається на увазі, що антитіло, пропоноване в даному винаході, можна застосовувати для лікування ссавця. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу антитіло вводять ссавцеві крім людини, наприклад, для одержання даних доклінічних дослідів. Прикладами ссавців крім людини, яких можна піддавати обробці, є примати крім людини, собаки, кішки, гризуни й інші ссавці, яких використають при здійсненні доклінічних дослідів. З використанням зазначених ссавців можна здійснювати моделювання на тваринні захворювання, що підлягає лікуванню за допомогою антитіла, що представляє інтерес. У кожному із зазначених варіантів здійснення винаходу на ссавці можна проводити дослідження з використанням зростаючих доз. Якщо антитіло являє собою антитіло до NRP1, то його можна вводити, наприклад, хазяїновігризунові, в організмі якого створена модель щільної пухлини. У додатковому або альтернативному варіанті антитіло застосовують для лікування людини, наприклад, пацієнта, що страждає захворюванням або порушенням, на яке введення антитіла може робити сприятливу дію. Даний винахід відноситься до антиангіогенної ракової терапії, нової стратегії лікуванні раку, спрямованої на інгібування розвитку кровоносних судин пухлини, що необхідно для доставки живильних речовин, які необхідні для підтримки росту пухлини. Оскільки ангіогенез бере участь, як у первинному рості пухлини, так і в її метастазуванні, антиангіогенне лікування, пропоноване у винаході, може інгібувати неопластичний ріст пухлини, попереджати також розвиток метастазів пухлини у вторинні ділянці, що дозволяє руйнувати пухлини за допомогою інших терапевтичних агентів. Прикладами раку, що підлягає лікуванню, є (але, не обмежуючись ними) карцинома, лімфома, бластома, саркома й лейкоз. Більше конкретні приклади таких видів раку включають рак лускатих клітин, рак легені (включаючи дрібноклітинний рак легені, недрібноклітинний рак легені, аденокарциному легені й плоскоклітинний рак легені), перітонеальний рак, рак клітин печінки, рак шлунка (включаючи шлунково-кишковий рак), рак підшлункової залози, гліобластому, рак шийки матки, рак яєчника, рак печінки, рак сечового міхура, гепатому, рак молочної залози, рак ободочної кишки, ректальний рак, колоректальний рак, карциному ендометрію або матки, карциному слинних залоз, рак почки або ренальний рак, рак печінки, рак передміхурової залози, вульвальний рак, рак щитовидної залози, печіночну карциному й різні типи раку голови й шиї, а також В-клітинну лімфому (включаючи низкою ступеня злоякісності /фолікулярну не-ходжкінську лімфому; NHL малих лімфоцитів (SL); середнього ступеня злоякісності /фолікулярну NHL; середнього ступеня злоякісності дифузійну NHL; високозлоякісну імунобластну NHL; високозлоякісну лімфобластную NHL; високозлоякісну дрібноклітинну небластомерну NHL; масову NHL; лімфому клітин мантії; зв'язану зі СНІДом лімфому; і Вальденстрема макроглобулінемічну пурпуру; хронічний ліфоїдний лейкоз (CLL); гострий лімфобластний лейкоз (ALL); лейкоз волоскових клітин; хронічний мієлобластний лейкоз; і посттрансплантаційний лімфопроліферативний синдром (PTLD), а також аномальну проліферацію судин, асоційовану з факоматозом, набряком (наприклад, асоційованим з пухлинами головного мозку) і синдром Мейгса. Більш конкретно, типи раку, які можна лікувати в допомогою антитіл, пропонованих у винаході, являють собою рак молочної залози, колоректальний рак, ректальний рак, недрібноклітинний рак легені, не-ходжкінську лімфому, рак почкових клітин, рак передміхуровий залози, рак печінки, рак підшлункової залози, саркому 27 UA 98585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Капоши, карциноїдну пухлину, рак голови й шиї, меланому, рак яєчника, мезотеліому й розсіяну миєлому. Найбільше переважно спосіб, пропонований у винаході, застосовують для лікування в людей колоректального раку. Мається на увазі, що при застосуванні для лікування різних захворювань, таких як пухлини, антитіла, пропоновані у винаході, можна поєднувати з іншими терапевтичними агентами, придатними для лікування таких же або аналогічних захворювань. При застосуванні для лікування раку антитіла, пропоновані в даному винаході, можна сполучити із загальноприйнятими протираковими шляхами лікування, такими як хірургічне втручання, променева терапія, хіміотерапія або їхні комбінації. У конкретних об'єктах винаходу інші терапевтичні агенти, які можна застосовувати для спільної терапії раку в сполученні з антитілом, пропонованим у винаході, включають антиангіогенні агенти. Ідентифіковано цілий ряд антиангіогенних агентів, вони відомі в даній галузі й включають агенти, перераховані в Carmeliet і Jain, 2000. В одному з об'єктів винаходу антитіло, пропоноване у винаході, застосовують у сполученні з антагоністом VEGF або антагоністом рецептора VEGF, такими як антитіла до VEGF, варіанти VEGF, фрагменти розчинного рецептора VEGF, аптамери, здатні блокувати VEGF або VEGFR, що нейтралізують антитіла до VEGFR, інгібітори тірозинкінази VEGFR і їхньої комбінації. В альтернативному або додатковому варіанті пацієнтові можна вводити спільно два або більшу A кількості антитіла до NRP1. У більше кращому варіанті здійснення винаходу антитіло до NRP1 B або антитіло до NRP , пропоноване у винаході, застосовують у сполученні з антитілом до VEGF для одержання адитивної або синергетичної дії. Кращими антитілами до VEGF є антитіла, які зв'язуються з тим же епітопом, що й антитіло до hVEGF A4.6.1. Більше краще антитіло до VEGF являє собою бевасизумаб або ранибизумаб. У деяких об'єктах винаходу інші терапевтичні агенти, які застосовують у сполученні з антитілом, пропонованим у винаході, являють собою агонист інших факторів, що беруть участь у рості пухлини, таких як EGFR, Еrb2 (який називають також Неr2) Еrb3, Еrb4 або TNF. Краще антитіло до NRP1, пропоноване у винаході, можна застосовувати в сполученні з низькомолекулярними інгібіторами тірозинкіназних рецепторів (RTKI), мішенню яких є один або декілька тірозинкіназних рецепторів, таких як рецептори VEGF, рецептори FGF, рецептори EGF і рецептори PDGF. У даній галузі відома значна кількість низькомолекулярних RTKI, що мають терапевтичне значення, включаючи (але, не обмежуючись ними) ваталаниб (РТК787), ерлотиніб (TARCEVA®), OSI-7904, ZD6474 (ZACTIMA®), ZD6126 (ANG453), ZD 1839, субинитиніб (SUTENT®), семаксаниб (SU5416), AMG706, AG 013736, імитиніб (GLEEVEC®), MLN-518, СЕР701, РКС-412, лапатиніб (GSK572016), VELCADE®, AZD2171, сорафеніб (NEXAVAR®), XL880 і CHIR-265. Антитіло до NRP1, пропоноване у винаході, або індивідуально, або в сполученні із другим терапевтичним агентом (таким як антитіло до VEGF) можна застосовувати також у сполученні з одним або декількома хіміотерапевтичними агентами. У пропоновані у винаході способах комбінованої терапії можна застосовувати різні хіміотерапевтичні агенти. Наведений як приклад і не обмежуючий обсяг винаходу перелік хіміотерапевтичних агентів наведений у даному описі в розділі "Визначення". Коли антитіло до NRP1 спільно вводять із другим терапевтичним агентом, то другий терапевтичний агент можна вводити першим перед антитілом до NRP1. Однак можна застосовувати також одночасне введення й уводити спочатку антитіло до NRP. Прийнятними дозами терапевтичного агента є дози, у яких його застосовують у цей час, або завдяки спільній дії (синергізм) можна знижувати дози агента й антитіла до NRP1. Для профілактики або лікування хвороби відповідні дози антитіла повинні залежати від типу захворювання, що підлягає лікуванню, серйозності й перебігу хвороби, від того, чи вводять антитіло в превентивних або лікувальних цілях, що передує терапії, історії хвороби пацієнта й відповіді на антитіло, і вони призначаються лікарем. Антитіло можна вводити пацієнтові в процесі однієї або декількох серій лікування. Залежно від типу й серйозності захворювання в якості початкової можливої дози антитіла для введення пацієнтові застосовують дозу приблизно від 1 мкг/кг до 50 мг/кг (наприклад, від 0,1 до 20 мг/кг), що використають, наприклад, у вигляді однократної дози або у вигляді декількох роздільних доз, або вводять шляхом безперервної інфузії. Типова добова доза може варіюватися від приблизно 1 мкг/кг до приблизно 100 мг/кг залежно від зазначених вище факторів. У випадку повторних введень протягом декількох днів або більше тривалого періоду часу залежно від стану лікування продовжують до досягнення необхідного рівня супрессії симптомів хвороби. Однак можна використати інші схеми введення лікарського засобу. У кращому варіанті антитіло, пропоноване у винаході, уводять кожні 2-3 тижня в дозі, що 28