Спосіб мікроклонального розмноження капусти головчастої і огірка

Реферат: UA 98586 C2 (12) UA 98586 C2 Винахід належить до способу мікроклонального розмноження сільськогосподарських видів рослин, таких як капуста головчаста і огірок, на середовищі Мурасіге-Скуга, що додатково містить сполуки, які мають цитокінінову дію, причому соматичний ембріогенез індукують шляхом застосування композиції, що містить аква N-окис 2-метилпіридинмарганець(ІІ) хлорид та суміш сульфатів цинку, заліза та міді у співвідношенні 1:1:1. Спосіб дозволяє значно підвищити індукцію соматичного ембріогенезу в культурі меристематичних клітин in vitro розмножуваних рослин. UA 98586 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 На теперішній час у провідних селекційних установах України і зарубіжжя активно використовується біотехнологічний метод клонального мікророзмноження селекційно-цінних форм овочевих рослин. Метод ґрунтується на експериментальній можливості ініціювати численне формування de novo генетично однорідних рослин в культурі in vitro первинних експлантів тканин, які мають у своїй структурі шари клітин апікальної, латеральної меристеми або спочиваючі бруньки. Основним суттєвим фактором, який обмежує регенераційну здатність введених в культуру клітин меристеми є реакція генотипу рослин на застосовані гормональні компоненти живильних середовищ [1]. Тому для підвищення ефективності клонального мікророзмноження доцільно постійно проводити пошукові роботи з тестування нових біологічноактивних речовин в культурі in vitro, які мають кращі регуляторні властивості на відміну від існуючих фітогормонів та їх синтетичних аналогів. Численними дослідженнями було доведено, що формування рослин-регенерантів з меристематичних тканин в культурі in vitro проходить під впливом регуляторів цитокінінової дії [2-5]. За таких умов можлива реалізація двох програм морфогенезу рослин in vitro - органогенезу та ембріогенезу [3]. Регенерація рослин шляхом органогенезу передбачає проходження декількох послідовних у часі стадій формоутворення: - поява калюсних новоутворень з меристематичних клітин на первинних експлантах; - індукція адвентивних пагонів з калюсу меристематичних клітин; - укорінення сформованих адвентивних пагонів, яка завершує формування повноцінних для подальшого дорощування in vivo пробіркових рослини-регенерантів. На практиці клональне мікророзмноження сільськогосподарських видів рослин, в якому регенерація рослин відбувається шляхом органогенезу потребує, як мінімум, одного додаткового циклу пересадки пробіркового матеріалу, пов'язаного з відокремленням адвентивних пагонів від вихідного експланту та їх переносом на живильне середовище для укоріненням з вмістом ауксинів. Регенерація рослин шляхом ембріогенезу проходить у часі за дещо "скороченим сценарієм", оскільки формування фізіологічних полюсів, апікального і базипетального, у проембріональних новоутвореннях проходить одночасно і, як наслідок, за один цикл культивування вихідних експлантів меристематичних тканин може створюватися повноцінна пробіркова рослина, яка не потребуватиме додаткового етапу дорощування на живильному середовищі для формування коренів [3]. Виходячи з вищевказаної проблематики завданням цього винаходу є пошук сполук, що мають цитокінінову дію і які здатні підвищити ефективність біотехнології клонального мікророзмноження овочевих видів рослин за рахунок кращої реалізації генетичного потенціалу меристематичних клітин щодо формування рос-лин-регенерантів in vitro. Поставлена мета досягається за рахунок отримання композиційної суміші похідних N-окису піридину та сірчанокислих солей біогенних елементів. Найближчим аналогом по дії є регулятор цитокінінової дії - бензиламінопурин (БАП). Приклад 1 Спосіб отримання композиційної суміші аква N-окису 2-метилпіридинмарганець(II)хлориду і сульфатних солей біогенних елементів. В фарфоровій ступці ретельно змішують цинк сірчанокислий семиводний, марганець сірчанокислий семиводний, залізо сірчанокисле семиводне і мідь сірчанокислу п'ятиводну в співвідношенні 1:1:1:1. Композиційну суміш солей висипають, відважують в цю ж ступку по 50,0 г приготовленої композиційної суміші солей та аква N-окису 2-метилпіридинмарганець (II) хлориду, переметують і використовують за призначенням. Приклад 2 Спосіб отримання композиційної суміші ді-(N-окису 2-метилпіридин)цинк(ІІ)хлориду і сульфатних солей біогенних елементів, до якої додають ді-(N-окис 2-метилпіридин) цинк(ІІ) хлорид, перемелюють і використовують за призначенням. Приклад 3 Вивчення цитокінінової дії синтезованих біологічно-активних речовин в культурі меристематичних тканин капусти головчастої і огірка. Приготування рослинного матеріалу і методика проведення біотестів на капусті головчастій. Для проведення біотестів в культурі in vitro було відібрано дві композиції: сульфатні солі біогенних елементів та ді-(N-окису 2-метилпіридин)цинк(ІІ)хлориду (Композиція № 1) або аква N-окис 2-метилпіридинмарганець(II)хлориду (Композиція № 2). Для визначення цитокінінової дії вищевказані композиції вивчалися на тканинному рівні з використанням культури експлантів гіпокотилів капусти головчастої і огірка in vitro. Цей вид рослинної тканини вміщує у своїй структурі клітини латеральної меристеми, з якої під впливом еталонного цитокініну БАП формуються адвентивні пагони [3, 6]. 1 UA 98586 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Як рослинні об'єкти досліджень у біотестах були відібрані пізньостиглі сорти капусти білоголової Харківська зимова, Ярославна, сорт капусти червоноголової Палета, сорт огірка Джерело, гібрид огірка Самородок F1 вітчизняної селекції. Для приготування рослинного матеріалу насіння вищевказаних сортів і гібридів капусти головчастої і огірка поверхнево стерилізували в асептичних умовах послідовним зануренням спочатку у 70 % розчин етанолу (1 хв.), а потім у розчин гіпохлориду кальцію з 30 г/л активного хлору (10 хв.), що вміщував ОД % Tween 20. Далі насіння тричі відмивали у стерильній дистильованій воді протягом 10-20 хв. та висаджували на безгормональному живильному середовищі МС (Мурасіге і Скуга, 1962) в асептичних умовах і розміщували у темряві в умовах термостату при +25 °C. Протягом 7-9 діб культивування пророщене насіння формувало стерильні рослини з надмірно подовженими етіольованими гіпокотилями. Гіпокотилі капусти з пророщеної розсади розрізали на сегменти довжиною 5-7 мм і висаджували на середовище МС, доповнені еталонним та аналізованими біологічно-активними речовинами. Для одного варіанту досліду 10 експлантів гіпокотилів одного сорту капусти розміщували на одну чашку Петрі з живильним середовищем об'ємом 20 мл. Культивування експлантів проводили в умовах 16-годинного фотоперіоду на розсіяному світлі з низькою інтенсивністю (500 люкс) і при постійній температурі повітря +25 °C. Гіпокотилі огірка з пророщеної розсади розрізали на сегменти довжиною 5-7 мм і висаджували на середовище В5 (Гамборга, 1975), доповненні еталонним та аналізованими біологічно-активними речовинами. Для одного варіанту досліду використовувалося 10 експлантів гіпокотилів сорту чи-то гібриду огірка. При цьому один експлант висаджували на живильне середовище В5 об'ємом 5 мл у скляних бюксах розміром 2×3 см, закритих фольгою при контрольованих умовах освітлення (500 люкс) з фотоперіодом 16 год. та температурою +25 °C. Фенологічні спостереження за розвитком культури проводились щодобово, а підрахунок кількості сформованих адвентивних пагонів після 2-х місяців культивування. Для вивчення регенераційних властивостей кожен аналізований препарат випробували у концентрації 3 мг/л. Як еталон використовувався цитокініновий регулятор БАЛ. При проведенні біотестів використовувався показник формування вегетативного потомства - коефіцієнт розмноження (КР), який розраховували як кількість утворених адвентивних пагонів на один культивований експлант гіпокотилів. Стерилізацію живильних середовищ з вмістом як еталонних, так речовин, що аналізувалися проводили шляхом автоклавування, відповідно загальноприйнятим методичним рекомендаціям [7]. Порівняльний аналіз біотестів еталонного і аналізованих речовин на капусті головчастій. Результати досліду на присутність цитокінінового ефекту у випробуваних біологічноактивних речовин зведені в таблицю 1. Як свідчать отримані дані, регенерація рослин спостерігалась на середовищі МС, яке містило еталонний регулятор БАП та композицію № 1 та композицію № 2. Характеризуючи сортову реакцію рослин капусти білоголової на застосовані цитокінінові регулятори, слід відзначити такі особливості. Для всіх відібраних сортів ці композиції виявили цитокініновий ефект по індукції адвентивних пагонів без інгібіторного впливу на розтягнення міжвузіль їхніх стебел (у порівнянні з варіантом по застосуванню БАП). В таблиці 1 жирним шрифтом виділені значення показника КР для тих біологічно-активних речовин, які індукували формування de novo меристематичних клонів в культурі експлантів гіпокотилів капусти головчастої як на рівні еталонного цитокініну БАП, так і з позитивною тенденцією щодо зростання показника КР в межах похибки контрольного досліду (випробування еталонного регулятора БАП). Зокрема, композиція № 1 та № 2 при застосуванні у випробуваній концентрації 3 мг/л на середовищі МС стимулювали утворення адвентивних пагонів на рівні дії регулятору БАЛ. При цьому композиція № 2 виявила статистично достовірно більшу ефективність щодо формування вегетативного потомства, ніж еталонний регулятор БАЛ в 1,37 разу при застосуванні в культурі експлантів гіпокотилів сорту капусти білоголової Українська осінь. У досліді виявлений ефект формування рослин-регенерантів з меристематичного калюсу, похідного з тканин експлантів гіпокотилів шляхом соматичного ембріогенезу індукованого дією композиції № 1 та № 2. При цьому вищевказані препарати індукували частково як стебловий, так і соматичний морфогенез (табл. 1). Найбільш ефективним в плані регуляторної дії щодо формування рослин-регенерантів з соматичних ембріоїдів виявилась композиція № 2. 60 2 UA 98586 C2 Таблиця 1 Результати біотестів біологічно-активних речовин на індукцію морфогенезу в культурі експлантів гіпокотилів сортів капусти головчастої Назва препарату БАП (контроль) Композиція № 1 Композиція № 2 сорт Харківська зимова БАП (контроль) Композиція № 1 Композиція № 2 НІР0,05 Морфогенетичний прояв Коефіцієнт розмноження (КР): адвентивні пагони (зр.) соматичні ембріоїди (зр.) сорт Українська осінь 4,12±0,71 41 0 4,05±1,11 38 2 5,63±0,67 51 5 4,04±0,48 3,42±0,99 4,81±0,60 0,33 40 29 44 0 5 4 47 39 47 0 3 6 51 38 47 0 0 2 сорт Ярославна БАП (контроль) Композиція № 1 Композиція № 2 НІР0,05 4,72±1,12 3,91±1,34 5,33±1,44 0,27 БАП (контроль) Композиція № 1 Композиція № 2 НІР0,05 5,05±0,39 3,78±1,08 4,85±1,02 0,31 сорт Полета 5 10 15 20 25 При її застосуванні було відмічено часткове формування рослин-регенерантів шляхом соматичного ембріогенезу у всіх задіяних у біотестах сортових генотипах капусти головчастої. За своїм ембріогенним потенціалом сорти капусти головчастої розподілилися наступним чином: Харківська зимова (9 ембріоїдів), Українська осінь (7 ембріоїдів), Ярославна (6 ембріоїдів) і Палета (2 ембріоїди). Порівняльний аналіз біотестів еталонного і аналізованих композицій на огірку. Характеризуючи реакцію генотипів огірка на застосовані біологічно-активні речовини, слід відзначити такі особливості. Усі проаналізовані препарати виявили цитокініновий ефект по індукції адвентивних пагонів. В таблиці 2 жирним шрифтом виділені значення статистичного показника "коефіцієнт розмноження", для тих препаратів, які ініціювали формування de novo меристематичних клонів в культурі експлантів гіпокотилів як на рівні еталонного цитокініну БАЛ, так і с позитивною тенденцією щодо зростання показника КР в межах похибки контрольного варіанту досліду. Зокрема, композиція № 2 при випробуванні в культурі експлантів гіпокотилів сорту Джерело стимулював утворення адвентивних пагонів на рівні дії регулятору БАЛ. Високу ефективність виявили композиція № 1 та композиція № 2 в культурі експлантів гіпокотилів гібриду огірка Самородок F1. За показником КР обидва препарати перевищували морфогенетичний потенціал регулятору БАЛ, композиції № 1 в 1,44 разу, композиції № 2 в 1,11 разу. У досліді був виявлений ефект формування рослин-регенерантів з меристематичного калюсу шляхом соматичного ембріогенезу ініційованого дією композиція № 1 та 2. Тобто ці препарати індукували частково як стебловий морфогенез, так і соматичний ембріогенез (дані табл. 2). Найбільш ефективним в плані регуляторної дії щодо формування рослин-регенерантів з соматичних ембріоїдів виявилась композиція № 2 (частота утворення ембріоїдів становила 0,2 для сорту Джерело, 0,45 для гібриду Самородок F1). При застосуванні композиції № 1 частота утворення ембріоїдів у сорту Джерело становила 0,15, для гібриду Самородок F1-0,35. 3 UA 98586 C2 Таблиця 2 Результати біотестів регуляторної активності синтезованих біологічно-активних речовин на індукцію морфогенезу в культурі експлантів гіпокотилів сортів і гібридів огірка Назва препарату Коефіцієнт розмноження (КР): сорт Джерело БАП (контроль) ДПР-77 ДПР-82 НІР0,05 Гібрид Самородок F1 БАП (контроль) ДПР-77 ДПР-82 НІР0,05 5 10 15 20 Кількість сформованих: адвентивних пагонів (зр.) соматичних ембріоїдів (зр.) 2,32±0,43 1,99±1,10 2,26±0,55 0,14 15 8 14 0 3 4 4,11±0,64 5,91±1,08 4,57±0,99 0,35 29 33 32 0 7 9 Джерела інформації:: 1. Основы сельскохозяйственной биотехнологии / Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г., Тихоненко Т.И. - М.: Агропромиздат.-1990.-384 с. 2. Биотехнология растений: культура клеток / Под ред. Бутенко Р.Г. - М.: Агропромиздат.1989.-280 с. 3. Моисеева Н.А. Молекулярные и клеточные механизмы морфогенеза в культуре клеток растений // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. - М.: Наука, 1992 - С. 166-185. 4. Способ размножения растений. Патент на изобретение. Россия. МКИ 5 А01Н 4/00 / С.А. Корнацкий, В.А. Высоцкий, В.Г. Трушечкин - № 2013946; Заявл. 06.08.1990; Опубл. 15.06.1994.1994, Бюл. № 11. 5. Способ выращивания растительных культур in vitro и питательная среда для его осуществления. Патент на изобретение. Россия. МКИ 6 А01Н 4/00 / В.А. Высоцкий - № 2063681; Заявл. 01.10.1992; Опубл. 20.07.1996.-1996, Бюл. № 20. 6. Кондратенко С.И. Теоретическое обоснование для разработки экспериментальных подходов по устранению витрификации растений-регенерантов белокочанной капусты in vitro // Овочівництво і баштанництво. - Харків, 2002. - ВИП. 47. - с. 54-63. 7. Методика досліджень в культуры ізольованих тканин овочевих рослин / Мірошніченко В.П., Сергієнко О.Ф., Івченко Т.В., Гончарова С.А., Кондратенко C.I. - Мерефа: ІОБ УААН, 2004.25 с. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 25 30 Спосіб мікроклонального розмноження сільськогосподарських видів рослин, таких як капуста головчаста і огірок, на середовищі Мурасіге-Скуга, що додатково містить сполуки, які мають цитокінінову дію, який відрізняється тим, що соматичний ембріогенез індукують шляхом застосування композиції, що містить аква N-окис 2-метилпіридинмарганець(ІІ)хлориду та суміш сульфатів цинку, заліза та міді у співвідношенні 1:1:1. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4