Ізольоване антитіло людини, яке специфічно зв’язується з ангіопоетинподібним білком 3 людини (hаngptl3), та його застосування

Реферат: Винахід належить до ізольованого антитіла людини або його антигензв’язувального фрагмента, яке специфічно зв’язується з ангіопоетинподібним білком 3 людини (hANGPTL3) і нейтралізує, скорочує як мінімум одну з функцій hANGPTL3 або перешкоджає їй, ізольованої молекули нуклеїнової кислоти, вектора експресії, способу отримання даного антитіла, а також фармацевтичної композиції, що його містить. Винахід також належить до застосування вказаної фармацевтичної композиції для лікування захворювання або порушення, яке може бути попереджене, купіроване, полегшене або інгібоване шляхом скорочення або інгібування функції ANGPTL3. UA 114891 C2 (12) UA 114891 C2 UA 114891 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ Даний винахід стосується антитіл людини і антигензв’язувальних фрагментів антитіл людини, які специфічно зв'язують ангіопоетин-подібний білок 3 (hANGPTL3) людини, і терапевтичних методів застосування вказаних антитіл. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Ген ангіопоетин-подібного білка 3 (ANGPTL3) був ідентифікований в базі даних EST по сигнальних послідовностях і амфіпатичних спіралях, а потім з бібліотеки кДНК ембріона печінки/селезінки людини була виділена повна послідовність кДНК ANGPTL3 (див. Conklin et al., 1999, Genomics 62: 477-482). Прогнозований білок hANGPTL3 з 460 амінокислот містить на 76% ідентичну мишачому ANGPTL3 амінокислотну послідовність і має характерну структуру ангіопоетинів; тобто сигнальний пептид, протяжний спіральний домен, який прогнозовано утворює димерні або тримерні суперспірали, короткий пептидний лінкер і глобулярний фібриноген-гомологічний домен (FD) (див. Conklin et al., 1999, supra). ANGPTL3 містить 4 консервативні цистеїнові залишки залучених у внутрішньомолекулярних дисульфідних зв'язках в FD; при цьому ANGPTL3 не містить ні двох додаткових цистеїнів, ні характерного зв'язувального кальцій мотиву, присутнього в FD ангіопоетинів (ANG; тобто ANG1, ANG2 і ANG4) (див. Conklin et al., 1999, supra), які є білковими факторами росту, сприяючими ангіогенезу. Крім того, на відміну від ANG, ANGPTL3 не зв'язується з Tie2; проте, можливо, що він також індукує ангіогенез, зв'язуючись з інтегріном αvβ3 через його С-термінальний FD (див. Camenisch et al., 2002, J Biol Chem 277:17281-17290). Повні дані in vivo були отримані в рамках моделі аутбредних мишей КК, які відрізняються помірним ожирінням з аномально високими рівнями інсуліну, глюкози і ліпідів в плазмі, подібно цукровому діабету 2 типу у людини (див. Koishi et al., 2002, Nature Genetics 30:151-157). При цьому у однієї з субліній мишей, KK/San, були виявлені аномально низькі рівні ліпідів в плазмі (гіполіпідемія), які успадковувалися як рецесивні по Менделю. Локус був локалізований на хромосомі 4 і в результаті був ідентифікований як ген, що кодує ANGPTL3, який в екзоні 6 містив вставку нуклеотидної послідовності з 4 пн (див. Koishi et al., 2002, supra). Навпаки, рівні ліпідів в плазмі збільшувалися після опосередкованого аденовірусом перенесення гена ANGPTL3 або після введення рекомбінантного людського ANGPTL3 мишам KK/San. Такий ефект не був викликаний змінами в генах, що беруть участь в синтезі холестерину, кліренсі ліпопротеїнів або окисненні NEFA (див. Koishi et al., 2002, supra). Крім того, аналіз in vitro рекомбінантного білка показав, що ANGPTL3 напряму інгібує активність ліпопротеїнліпази (LPL), що свідчить про те, що він є модулятором метаболізму ліпідів, регулюючим рівні тригліцеридів ліпопротеїнів дуже низької густини (ЛДНГ) за рахунок інгібування активності LPL (див. Shimizugawa et al., 2002, J Biol Chem 277(37):33742-33748). Продемонстровано, що Nтермінальний суперспіральний домен, особливо залишки 17-165 N-термінальної області, а не С-термінальний FD ANGPTL3, визначають його активність відносно збільшення рівнів тригліцеридів в плазмі у мишей (див. Ono et al., 2003, J Biol Chem 278:41804-41809). Послідовності нуклеїнових кислот і амінокислотні послідовності для ANGPTL3 людини приведені в послідовностях SEQ ID №: 161 і 162, відповідно. Антитіла до ANGPTL3 розкриваються, наприклад, в WO2008/073300 і патенті США 7,935,796. КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ У першому аспекту винаходу пропонуються повністю людські моноклональні антитіла (mAb) і їх антигензв’язувальні фрагменти, які специфічно зв'язуються і нейтралізували, інгібують, блокують, анулюють, знижують принаймні один аспект активності людського ANGTPL3, зокрема, людського ANGTPL3 (SEQ ID №: 161), або перешкоджають йому. Активність ANGPTL3, яку можна нейтралізувати, інгібувати, блокувати, анулювати, знижувати або якій можна перешкоджати за допомогою антитіл даного винаходу або їх фрагментів, включає, серед іншого, інгібування активності ЛПЛ, індукування ангіогенезу та ін. У одному з здійснень антитіло даного винаходу або його фрагмент може нейтралізувати, інгібувати, блокувати, анулювати, знижувати активність hANGPTL3 або перешкоджати їй, зв'язуючись з епітопом hANGPTL3, який напряму задіяний в цільовій активності hANGPTL3. У іншому здійсненні антитіло даного винаходу або його фрагмент може нейтралізувати, інгібувати, блокувати, анулювати, знижувати активність hANGPTL3 або перешкоджати їй, зв'язуючись з епітопом hANGPTL3, який напряму не задіяний в цільовій активності hANGPTL3, але зв’язування з ним антитіла або фрагмента стерично або конформаційно інгібує, блокує, анулює, знижує цільову активність hANGPTL3 або перешкоджає їй. У ще одному здійсненні антитіло даного винаходу або його фрагмент зв'язується з епітопом hANGPTL3, який напряму не задіяний в цільовій активності (наприклад, інгібуванні активності ЛПЛ, включаючи ангіогенез і ін.) hANGPTL3 (тобто неблокуюче антитіло), 1 UA 114891 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 але зв’язування з ним антитіла або фрагмента приводить до підвищення кліренсу hANGPTL3 з кровообігу в порівнянні з кліренсом hANGPTL3 у відсутність антитіла або його фрагмента, а означає, опосередковано інгібує, блокує, анулює, знижує активність hANGPTL3 або перешкоджає їй. Кліренс hANGPTL3 з кровообігу може помітно підвищуватися за рахунок поєднання двох або більше різних неблокуючих антитіл, які не конкурують один з одним в процесі специфічного зв’язування з hANGPTL3. Антитіла (Abs) можуть бути повнорозмірними (наприклад, антитіло IgG1 або IgG4) або включати тільки антигензв’язувальну частину (наприклад, фрагмент Fab, F(ab')2 або scFv) і можуть бути модифіковані з метою впливати на функціональність, наприклад, видаляти залишкові ефекторні функції (Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925-1933). У одному здійсненні даний винахід включає антитіло або антигензв’язувальний фрагмент антитіла, що містять варіабельну область важкого ланцюга (HCVR), вибирану з групи, що включає SEQ ID №: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146 і 180, або її істотно аналогічну послідовність з гомологією, що має ідентичність послідовності не менше ніж 90%, не менше ніж 95%, не менше ніж 98% або не менше ніж 99%. У іншому здійсненні антитіло або антигензв’язувальний фрагмент антитіла містить HCVR з амінокислотною послідовністю, вибираною з групи, що включає SEQ ID №: 2, 18, 34, 66, 82, 114 і 180. У іншому здійсненні антитіло або антигензв’язувальний фрагмент антитіла містить HCVR з амінокислотною послідовністю SEQ ID №: 66. У одному здійсненні антитіло або антигензв’язувальний фрагмент антитіла включає варіабельну область легкого ланцюга (LCVR), вибирану з групи, що включає SEQ ID №: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154 і 188, або її істотно аналогічну послідовність з гомологією, що має ідентичність послідовності не меншу ніж 90%, не меншу ніж 95%, не меншу ніж 98% або не меншу ніж 99%. У іншому здійсненні антитіло або антигензв’язувальний фрагмент антитіла включає LCVR з амінокислотною послідовністю, вибираною з групи, що включає SEQ ID №: 10, 26, 42, 74, 90, 122 і 188. У іншому здійсненні антитіло або антигензв’язувальний фрагмент антитіла містить LCVR з амінокислотною послідовністю SEQ ID №: 74. У подальших здійсненнях антитіло або фрагмент антитіла включає пару послідовностей HCVR і LCVR (HCVR/LCVR), вибирану з групи, що включає SEQ ID №: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154 і 180/188. У одному здійсненні антитіло або фрагмент антитіла включає пару послідовностей HCVR і LCVR, вибирану з групи, що включає SEQ ID №: 2/10, 18/26, 34/42, 66/74, 82/90, 114/122 і 180/188. Ще в одному здійсненні антитіло або фрагмент антитіла включає пару послідовностей HCVR і LCVR, що включає SEQ ID №: 66/74. У другому аспекті даного винаходу приводиться антитіло або антигензв’язувальний фрагмент антитіла, що містить амінокислотну послідовність визначальної комплементарної області 3 важкого ланцюга (HCDR3), вибирану з групи, що включає SEQ ID №: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152 і 186, або її істотно аналогічну послідовність з ідентичністю послідовності не менше ніж 90%, не менше ніж 95%, не менше ніж 98% або не менше ніж 99%; і амінокислотну послідовність легкого ланцюга CDR3 (LCDR3), вибирану з групи, що включає SEQ ID №: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160 і 194, або їх істотно аналогічні послідовності з ідентичністю послідовності не менше ніж 90%, не менше ніж 95%, не менше ніж 98% або не менше ніж 99%. У одному здійсненні антитіло або його фрагмент містить пару амінокислотних послідовностей HCDR3/LCDR3, що включає SEQ ID №: 8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 72/80, 88/96, 104/112, 120/128, 136/144, 152/160 або 186/194. У ще одному здійсненні антитіло або його фрагмент містить пару амінокислотних послідовностей HCDR3/LCDR3, що включає SEQ ID №: 8/16, 24/32, 40/48, 72/80, 88/96, 120/128 або 186/194. Ще в одному здійсненні антитіло або фрагмент антитіла включає пару амінокислотних послідовностей HCDR3/LCDR3, що включає SEQ ID №: 72/80. У подальшому здійсненні антитіло або його фрагмент містить амінокислотну послідовність важкого ланцюга CDR1 (HCDR1), вибирану з групи, що включає SEQ ID №: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148 і 182, або його істотно аналогічну послідовність, що має ідентичність послідовності не меншу ніж 90%, не меншу ніж 95%, не меншу ніж 98% або не меншу ніж 99%; і амінокислотну послідовність важкого ланцюга CDR2 (HCDR2), вибирану з групи, що включає SEQ ID №: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150 і 184, або його істотно аналогічну послідовність, що має ідентичність послідовності не меншу ніж 90%, не меншу ніж 95%, не меншу ніж 98% або не меншу ніж 99%; і може також містити амінокислотну послідовність легкого ланцюга CDR1 (LCDR1), що включає SEQ ID №: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156 і 190, або її істотно аналогічну послідовність, що має ідентичність послідовності не меншу ніж 90%, не меншу ніж 95%, не меншу ніж 98% або не меншу ніж 99%; і/або амінокислотну 2 UA 114891 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовність легкого ланцюга CDR2 (LCDR2), вибирану з групи, що включає SEQ ID №: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158 і 192, або її істотно аналогічну послідовність, що має ідентичність послідовності не меншу ніж 90%, не меншу ніж 95%, не меншу ніж 98% або не меншу ніж 99%. У альтернативному варіанті даний винахід описує антитіло або антигензв’язувальний фрагмент антитіла, що містить поєднання послідовностей важкого ланцюга HCDR1/HCDR2/HCDR3, вибиране з групи, яка включає SEQ ID №: 4/6/8, 20/22/24, 36/38/40, 52/54/56, 68/70/72, 84/86/88, 100/102/104, 116/118/120, 132/134/136, 148/150/152 і 182/184/186; і/або поєднання послідовностей легкого ланцюга LCDR1/LCDR2/LCDR3, вибиране з групи, що включає SEQ ID №: 12/14/16, 28/30/32, 44/46/48, 60/62/64, 76/78/80, 92/94/96, 108/110/112, 124/126/128, 140/142/144, 156/158/160 і 190/192/194. У одному здійсненні амінокислотні послідовності важких і легких ланцюгів CDR складають поєднання послідовностей CDR, вибиране з групи, що включає SEQ ID №: 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/46/48, 52/54/56/60/62/64, 68/70/72/76/78/80, 84/86/88/92/94/96, 100/102/104/108/110/112, 116/118/120/124/126/128, 132/134/136/140/142/144, 148/150/152/156/158/160 і 182/184/186/190/192/194. У одному здійсненні амінокислотні послідовності важких і легких ланцюгів CDR складають поєднання послідовностей CDR, вибиране з групи, яка включає SEQ ID №: 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/46/48, 68/70/72/76/78/80, 84/86/88/92/94/96, 116/118/120/124/126/128 або 182/184/186/190/192/194. У ще одному здійсненні амінокислотні послідовності важких і легких ланцюгів CDR складають поєднання послідовностей CDR, що включає SEQ ID №: 68/70/72/76/78/80. У пов'язаному здійсненні даного винаходу приводиться антитіло або антигензв’язувальний фрагмент антитіла, які специфічно зв'язує hANGPTL3, де антитіло або його фрагмент містить домени важкого і легкого ланцюгів CDR, що містяться в парах послідовностей HCVR/LCVR, вибираних з групи, що включає SEQ ID №: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154 і 180/188. Методи і способи ідентифікації CDR в амінокислотних послідовностях HCVR і LCVR відомі фахівцям і можуть застосовуватися для ідентифікації CDR у вказаних амінокислотних послідовностях HCVR або LCVR, що розкриваються в цьому документі. Для визначення меж CDR можуть використовуватися загальноприйняті визначення, в тому числі, визначення по Кабату, визначення по Чотіа і визначення AbM. У загальних рисах, визначення по Кабату спирається на варіабельність послідовності, визначення по Чотіа основане на локалізації структурних петльових областей, а визначення AbM являє собою щось середнє між підходами Кабата і Чотіа. Див., наприклад, Kabat, “Sequences of Proteins of Immunological Interest, " National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); і Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). Для ідентифікації послідовностей CDR в антитілі також доступні відкриті бази даних. У одному здійсненні антитіло або фрагмент антитіла включає послідовності CDR, що містяться в парі HCVR і LCVR, що включає SEQ ID №: 2/10, 18/26, 34/42, 66/74, 82/90, 114/122 і 180/188. Ще в одному здійсненні антитіло або фрагмент антитіла включає послідовності CDR, що містяться в парі HCVR і LCVR, що включає SEQ ID №: 66/74. У ще одному пов'язаному здійсненні даного винаходу представлене антитіло або антигензв’язувальний фрагмент антитіла, які конкурують за специфічне зв’язування з hANGPTL3 з антитілом або фрагментом антитіла, що містить послідовності важкого і легкого ланцюгів CDR, які містяться в парі послідовностей HCVR/LCVR, вибираних з групи, яка включає SEQ ID №: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154 і 180/188. У ще одному здійсненні антитіло або антигензв’язувальний фрагмент антитіла даного винаходу конкурує за специфічне зв’язування з hANGPTL3 з антитілом або його фрагментом, що містить пару послідовностей HCVR/LCVR, вибираних з групи, яка включає SEQ ID №: 66/74. У ще одному здійсненні антитіло або антигензв’язувальний фрагмент антитіла даного винаходу конкурує за специфічне зв’язування з hANGPTL3 з антитілом або його фрагментом, що містить поєднання послідовностей важкого і легкого ланцюгів CDR, вибиране з групи, що включає SEQ ID №: 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/46/48, 52/54/56/60/62/64, 68/70/72/76/78/80, 84/86/88/92/94/96, 100/102/104/108/110/112, 116/118/120/124/126/128, 132/134/136/140/142/144, 148/150/152/156/158/160 і 182/184/186/190/192/194. У одному здійсненні антитіло або антигензв’язувальний фрагмент антитіла даного винаходу конкурує за специфічне зв’язування з hANGPTL3 з антитілом або його фрагментом, що містить поєднання послідовностей важкого і легкого ланцюгів CDR, вибиране з групи, що включає SEQ ID №: 68/70/72/76/78/80. У ще одному пов'язаному здійсненні даного винаходу представлене антитіло або його антигензв’язувальний фрагмент, що зв'язується з тим же епітопом на hANGPTL3, який ідентифікується антитілом або його фрагментом, що містить послідовності важкого і легкого 3 UA 114891 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ланцюгів CDR з пари послідовностей HCVR/LCVR, вибираних з групи, що включає SEQ ID №: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154 або 180/188. У одному здійсненні антитіло або антигензв’язувальний фрагмент антитіла даного винаходу зв'язується з тим же епітопом на hANGPTL3, який ідентифікується антитілом або його фрагментом, що містить пару послідовностей HCVR/LCVR, вибираних з групи, що включає SEQ ID №: 66/74. У одному здійсненні антитіло або фрагмент антитіла даного винаходу зв'язується з тим же епітопом на hANGPTL3, який ідентифікується антитілом або його фрагментом, що містить поєднання послідовностей важкого і легкого ланцюгів CDR, вибиране з групи, що включає 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/46/48, 52/54/56/60/62/64, 68/70/72/76/78/80, 84/86/88/92/94/96, 100/102/104/108/110/112, 116/118/120/124/126/128, 132/134/136/140/142/144, 148/150/152/156/158/160 і 182/184/186/190/192/194. У одному здійсненні такий епітоп ідентифікується антитілом або його фрагментом, що містить поєднання послідовностей важкого і легкого ланцюгів CDR, вибиране з групи, що включає SEQ ID №: 68/70/72/76/78/80. У третьому аспекті даного винаходу представлене ізольоване антитіло анти-hANGPTL3 або його антигензв’язувальний фрагмент, які зв'язуються з епітопом, розташованим в Nтермінальній суперспіральній області в залишках 17 - 209 послідовності SEQ ID №: 161, і нейтралізує, інгібує, анулює, скорочує як мінімум одну з функцій hANGPTL3 або перешкоджає їй. У ще одному здійсненні даного винаходу представлене ізольоване антитіло або антигензв’язувальний фрагмент антитіла, які специфічно зв'язуються з епітопом, розташованим в N-термінальній суперспіральній області hANGPTL3 (SEQ ID №: 161), і нейтралізує, інгібує, анулює, скорочує як мінімум одну з функцій hANGPTL3 або перешкоджає їй, при умові, що антитіло або його фрагмент не зв'язується з пептидом ANGPTL3 з SEQ ID №: 170 (відповідає залишкам з Glu32 по Leu57 hANGPTL3 з SEQ ID №: 161). У одному здійсненні антитіло або фрагмент антитіла даного винаходу специфічно зв'язується з епітопом в залишках 17 200, 17 100, 17 70, 17 65, 17 60, 17 57 або 17 50 hANGPTL3 (SEQ ID №: 161), можливо, при умові, що антитіло або його фрагмент не зв'язується з пептидом ANGPTL3 з SEQ ID №: 170. У ще одному здійсненні антитіло або його фрагмент специфічно зв'язується з епітопом в залишках 40 200, 40 100, 40 70, 50 200, 50 100, 50 70, 58 200, 58 100, 58 70, 58 68 або 61 66 hANGPTL3 (SEQ ID №: 161), можливо, при умові, що антитіло або його фрагмент не зв'язується з пептидом ANGPTL3 з SEQ ID №: 170. У деяких здійсненнях антитіло або його фрагмент зв'язується з епітопом, можливо, за участю більше ніж одного пронумерованого епітопа або залишку в N-термінальній суперспіральній області hANGPTL3, можливо, при умові, що антитіло або його фрагмент не зв'язується з пептидом ANGPTL3 з SEQ ID №: 170. У четвертому аспекті даного винаходу приводяться молекули нуклеїнової кислоти, що кодують антитіла анти-ANGPTL3 або їх фрагменти, зокрема, будь-які з описаних вище. Даний винахід також охоплює рекомбінантні вектори експресії, несучі нуклеїнові кислоти даного винаходу, і клітина-хазяїн, наприклад, бактеріальні клітини, такі як Е. coli, або клітини ссавців, такі як клітини CHO, в які включаються такі вектори, а також методи приготування антитіл шляхом культивування клітин-хазяїнів в умовах, що допускають виробництво антитіл і отримання виробленим таким чином антитіл. У одному здійсненні даного винаходу приводиться антитіло або його фрагмент, які містять HCVR, що кодується послідовністю нуклеїнової кислоти, вибираною з групи, що включає SEQ ID №: 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145 і 179, або істотно аналогічну послідовність з гомологією не менше ніж 90%, не менше ніж 95%, не менше ніж 98% або не менше ніж 99%. У ще одному здійсненні антитіло або його фрагмент містить HCVR, що кодується послідовністю нуклеїнової кислоти, яка вибирається з групи, що включає SEQ ID №: 1, 17, 33, 65, 81, 113 або 179. У ще одному здійсненні антитіло або його фрагмент містить HCVR, що кодується послідовністю нуклеїнової кислоти SEQ ID №: 65. У одному здійсненні антитіло або його антигензв’язувальний фрагмент містить LCVR, що кодується послідовністю нуклеїнової кислоти, що вибирається з групи, яка включає SEQ ID №: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153 і 187, або істотно аналогічну послідовність з гомологією не менше ніж 90%, не менше ніж 95%, не менше ніж 98% або не менше ніж 99%. У ще одному здійсненні антитіло або його фрагмент містить LCVR, що кодується послідовністю нуклеїнової кислоти, що вибирається з групи, яка включає SEQ ID №: 9, 25, 41, 73, 89, 121 або 187. У ще одному здійсненні антитіло або його фрагмент містить LCVR, що кодується послідовністю нуклеїнової кислоти SEQ ID №: 73. У подальших здійсненнях антитіло або фрагмент антитіла включає пару послідовностей HCVR і LCVR (HCVR/LCVR), що кодується парою послідовностей нуклеїнової кислоти, що вибирається з групи, яка включає SEQ ID №: 1/9, 17/25, 33/41, 49/57, 65/73, 81/89, 97/105, 113/121, 129/137, 145/153 і 179/187. У одному здійсненні антитіло або його фрагмент містить 4 UA 114891 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пару послідовностей HCVR/LCVR, що кодується парою послідовностей нуклеїнової кислоти SEQ ID №: 1/9, 17/25, 33/41, 65/73, 81/89, 113/121 або 179/187. У ще одному здійсненні антитіло або його фрагмент містить пару послідовностей HCVR/LCVR, що кодується парою послідовностей нуклеїнової кислоти SEQ ID №: 65/73. У одному здійсненні даного винаходу приводиться антитіло або антигензв’язувальний фрагмент антитіла, що містять домен HCDR3, що кодується нуклеотидною послідовністю, що вибирається з групи, яка включає SEQ ID №: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151 і 185, або істотно аналогічну послідовність з гомологією не менше ніж 90%, не менше ніж 95%, не менше ніж 98% або не менше ніж 99%; і домен LCDR3, що кодується нуклеотидною послідовністю, що вибирається з групи, яка включає SEQ ID №: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159 і 193, або істотно аналогічну послідовність з гомологією не менше ніж 90%, не менше ніж 95%, не менше ніж 98% або не менше ніж 99%. У одному здійсненні антитіло або його фрагмент містить пару послідовностей HCDR3 і LCDR3, що кодується парою послідовностей нуклеїнової кислоти, що вибирається з групи, яка включає SEQ ID №: 7/15, 23/31, 39/47, 55/63, 71/79, 87/95, 103/111, 119/127, 135/143, 151/159 і 185/193. У ще одному здійсненні антитіло або його фрагмент містить пару послідовностей HCDR3 і LCDR3, що кодується парою послідовностей нуклеїнової кислоти SEQ ID №: 7/15, 23/31, 39/47, 71/79, 87/95, 119/127 або 185/193. У ще одному здійсненні антитіло або його фрагмент містить пару послідовностей HCDR3 і LCDR3, що кодується парою послідовностей нуклеїнової кислоти SEQ ID №: 71/79. У ще одному здійсненні антитіло або його фрагмент далі містить домен HCDR1, що кодується нуклеотидною послідовністю, що вибирається з групи, яка включає SEQ ID №: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147 і 181, або істотно аналогічну послідовність з гомологією не меншою ніж 90%, не меншою ніж 95%, не меншою ніж 98% або не меншою ніж 99%; і домен HCDR2, що кодується нуклеотидною послідовністю, що вибирається з групи, яка включає SEQ ID №: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149 і 183, або істотно аналогічну послідовність з гомологією не меншою ніж 90%, не меншою ніж 95%, не меншою ніж 98% або не меншою ніж 99%; і може також містити домен LCDR1, що кодується нуклеотидною послідовністю, що вибирається з групи, яка включає SEQ ID №: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155 і 189, або істотно аналогічну послідовність з гомологією не меншою ніж 90%, не меншою ніж 95%, не меншою ніж 98% або не меншою ніж 99%; і/або домен LCDR2, що кодується нуклеотидною послідовністю, що вибирається з групи, яка включає SEQ ID №: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157 і 191, або істотно аналогічну послідовність з гомологією не меншою ніж 90%, не меншою ніж 95%, не меншою ніж 98% або не меншою ніж 99%. У альтернативному варіанті даний винахід містить антитіло або антигензв’язувальний фрагмент антитіла, що містить поєднання послідовностей важкого ланцюга HCDR1/HCDR2/HCDR3, що кодується поєднанням нуклеотидної послідовності, що вибирається з групи, яка включає SEQ ID №: 3/5/7, 19/21/23, 35/37/39, 51/53/55, 67/69/71, 83/85/87, 99/101/103, 115/117/119, 131/133/135, 147/149/151 і 181/183/185; і/або поєднання послідовностей легкого ланцюга LCDR1/LCDR2/LCDR3, що кодується поєднанням нуклеотидної послідовності, що вибирається з групи, яка включає SEQ ID №: 11/13/15, 27/29/31, 43/45/47, 59/61/63, 75/77/79, 91/93/95, 107/109/111, 123/125/127, 139/141/143, 155/157/159 і 189/191/193. У одному здійсненні антитіло або його фрагмент містить послідовності CDR важкого і легкого ланцюгів, послідовності, що кодуються поєднанням нуклеотидної SEQ ID №: 67/69/71/75/77/79. У п'ятому аспекті даного винаходу приводиться антитіло анти-ANGPTL3 людини або його антигензв’язувальний фрагмент, що містить варіабельну область важкого ланцюга (HCVR), що кодується сегментами нуклеотидної послідовності, отриманими з послідовностей зародкових ліній VH, DH і JH, і варіабельну область легкоголанцюга (LCVR), що кодується сегментами нуклеотидної послідовності, отриманими з послідовностей зародкових ліній VK і JK, де HCVR і LCVR кодуються сегментами нуклеотидної послідовності, отриманими з поєднання зародкових ліній, що вибирається з групи, яка включає: (i) VH3-43, DH3-3, JH3, VK1-5 і JK2; (ii) VH3-11, DH11, JH4, VK1-39 і JK4; (iii) VH3-30, DH1-7, JH6, VK1-5 і JK1; (iv) VH3-30, DH1-26, JH6, VK1-12 і JK3; (v) VH3-30, DH3-10, JH6, VK1-12 і JK3; і (vi) VH3-23, DH3-10, JH4, VK1-5 і JK1. У шостому аспекті даного винаходу приводиться антитіло або його антигензв’язувальний фрагмент, які специфічно зв'язуються з hANGPTL3 при рівноважної константою дисоціації (KD), що становить приблизно 7 нМ або менше, приблизно 6 нМ або менше, приблизно 5 нМ або менше, приблизно 4 нМ або менше, приблизно 3 нМ або менше, приблизно 2 нМ або менше або приблизно 1 нМ або менше, як показують результати вимірювання методом поверхневого плазмонного резонансу (наприклад, BIACORE™). У деяких здійсненнях антитіло даного винаходу демонструє KD, що становить приблизно 800 пМ або менше, приблизно 700 пМ або менше, приблизно 600 пМ або менше, приблизно 500 пМ або менше, приблизно 400 пМ або 5 UA 114891 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 менше, приблизно 300 пМ або менше, приблизно 200 пМ або менше, приблизно 100 пМ або менше або приблизно 50 пМ або менше. У сьомому аспекті даного винаходу приводиться антитіло анти-hANGPTL3 або його антигензв’язувальний фрагмент, які зв'язують білок hANGPTL3 послідовності SEQ ID №: 161, але не вступає в перехресну реакцію зі спорідненим білком, таким як ангіопоетин-подібний білок 4 (hANGPTL4; SEQ ID №: 164) людини, згідно з визначенням, наприклад, за допомогою ELISA, методом поверхневого плазмонного резонансу або технології LUMINEXО XMAP®, як описано в цьому документі. ANGPTL4 являє собою ще один секретований білок, здатний знижувати активність LPL і що має N-термінальну суперспіральну область і С-термінальний фібриногеноподібний домен (Ge et al., 2004, J Biol Chem 279:2038-2045; Yau et al., 2009, J Biol Chem 284:11942-11952). В пов'язаних здійсненнях даного винаходу приводиться антитіло антиhANGPTL3 або його антигензв’язувальний фрагмент, які зв'язують білок hANGPTL3 і вступає в перехресну реакцію з білком hANGPTL4, В деяких здійсненнях афінність зв’язування антитіла hANGPTL3 або фрагмента антитіла білка hANGPTL4 становить 75% або менше або 50% або менше афінності зв’язування антитіла або фрагмента з білком hANGPTL3. У ще одному пов'язаному здійсненні даного винаходу представлене антитіло антиhANGPTL3 або його антигензв’язувальний фрагмент, що не вступає в перехресну реакцію з ANGPTL3 миші (mANGPTL3; SEQ ID №: 163) або ANGPTL3 щури (rANGPTL3; SEQ ID №: 175), але вступає в перехресну реакцію з ANGPTL3 яванської макаки (Macaca fascicularis) (MfANGPTL3), наприклад, з N-термінальними залишками 17-170 SEQ ID №: 177 (часткова амінокислотна послідовність MfANGPTL3). У ще одному пов'язаному здійсненні даного винаходу представлене антитіло анти-hANGPTL3 або його фрагмент, які вступають в перехресну реакцію з MfANGPTL3, mANGPTL3 і rANGTPL3. Даний винахід включає антитіла анти-hANGPTL3 з модифікованою структурою глікозилування. У деяких додатках може виявитися корисним видалити небажані сайти глікозилування, наприклад, видалити фукозу для посилення функції антитілозалежної клітинно-зумовленої цитотоксичності (ADCC) (див. Shield et al. (2002) JBC 277:26733). У інших додатках видалення сайту N-глікозилування може скоротити небажані імунні реакції на терапевтичні антитіла або збільшити афінність антитіл. У інших додатках може здійснюватися модифікація галактозилування, з тим щоб змінити комплементзалежну цитотоксичність (CDC). У восьмому аспекті даного винаходу приводиться фармацевтичний склад, що включає рекомбінантне антитіло людини або його фрагмент, які специфічно зв'язують hANGPTL3, і фармацевтично прийнятний носій. У одному здійсненні даного винаходу представлений фармацевтичний склад, що містить одне або декілька антитіл анти-ANGPTL3 або фрагментів антитіл винаходу, які не вступають в перехресну конкуренцію один з одним, і фармацевтично прийнятний носій. У одному здійсненні фармацевтичний склад даного винаходу може містити два або більше неблокуючих антитіл, які не вступають в конкуренцію один з одним за специфічне зв’язування з hANGPTL3 і виявляють ефективність у видаленні hANGPTL3 із перетворення. Прийнятні поєднання неблокуючих антитіл включають, серед іншого, поєднання антитіл, що містить пари послідовностей HCVR і LCVR (HCVR/LCVR): (i) SEQ ID №: 82/90 і 180/188, відповідно; (ii) SEQ ID №: 114/122 і 180/188, відповідно; (iii) SEQ ID №: 82/90 і 18/26, відповідно; або (iv) SEQ ID №: 114/122 і 18/26, відповідно. У пов'язаних здійсненнях даного винаходу приводиться склад, що являє собою поєднання антитіла або антигензв’язувального фрагмента антитіла даного винаходу і другого терапевтичного агента.Як другий терапевтичний агент може виступати один або декілька агентів, таких як (1) інгібітори редуктази 3-гідрокси-3-метилглутарил-коензиму А (HMG-CoA), наприклад, церивастатин, аторвастатин, симвастатин, пітавастатин, розувастатин, флувастатин, ловастатин, правастатин і їм подібні; (2) інгібітори захоплення холестерину і/або реабсорбції жовчних кислот; (3) ніацин, який підвищує катаболізм ліпопротеїнів; (4) фібрати або амфіпатичні карбонові кислоти, які знижують рівень ліпопротеїну низької густини (ЛНГ), поліпшують рівні ліпопротеїну високої густини (ЛВГ) і TG, а також скорочують число інфарктів без смертельного результату; і (5) активатори фактора транскрипції LXR, який грає роль у видаленні холестерину, наприклад, 22-гідроксихолестерину, або фіксовані комбінації, наприклад, езетиміб плюс симвастатин; статин з секвестрантом жовчних кислот (наприклад, холестирамін, колестипол, колесевелам), фіксована комбінація ніацин плюс статин (наприклад, ніацин з ловастатином); або з іншими агентами, що знижують концентрацію ліпідів, такими як етиловий ефір омега-3 жирної кислоти (наприклад, омакор). Крім того, як другий терапевтичний агент може виступати один або декілька інших інгібіторів ANGPTL3, а також інгібітори інших молекул, такі як ANGPTL4, ANGPTL5, ANGPTL6 і пропротеїнконвертаза субтилізину/кексину типу 9 (PCSK9), які беруть участь в ліпідному метаболізмі, зокрема, в гомеостазі холестерину 6 UA 114891 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 і/або тригліцериду. До інгібіторів цих молекул належать малі молекули і антитіла, які специфічно зв'язують ці молекули і блокують їх активність. У пов'язаних здійсненнях другим лікарським препаратом може бути один або декілька протиракових препаратів, наприклад, препарати для хіміотерапії, антиангіогенні препарати, препарати інгібітори росту, цитотоксичні препарати, агенти апоптозу і інші препарати, що добре відомі фахівцям в галузі і застосовуються для лікування раку або інших проліферативних захворювань або порушень, а також інші лікарські препарати, наприклад, анальгетики, протизапальні препарати, в тому числі нестероїдні протизапальні препарати (НСПЗП), наприклад, інгібітори Сох-2 і їм подібні, з тим, щоб пом'якшити або усунути симптоми, супроводжуючі першопричинний рак/пухлину. У дев'ятому аспекті винаходу приводяться способи, що дозволяють нейтралізувати, інгібувать, блокувати, анулювати, знизити активність hANGPTL3 або перешкоджати їй з використанням одного або декількох антитіл анти-hANGPTL3 або їх антигензв’язувальних фрагментів даного винаходу. У одному здійсненні винаходу приводиться спосіб лікування, що включає введення пацієнту, потребуючому такого лікування, терапевтично ефективної кількості фармацевтичного складу, що містить одне або декілька антитіл анти-hANGPTL3 даного винаходу або їх антигензв’язувальних фрагментів і, можливо, один або декілька додаткових лікарських засобів, описаних вище. Антитіла анти-ANGPTL3 даного винаходу або їх фрагменти можуть виступати як нейтралізуючі антитіла або неблокуючих антитіл проти ANGPTL3 або ж їх поєднань. У пов'язаних здійсненнях винаходу приводиться спосіб збільшення кліренсу hANGPTL3 з кровообігу пацієнта, потребуючого такого лікування, спосіб, що включає введення пацієнту не менше двох антитіл анти-hANGPTL3 даного винаходу або їх фрагментів, які не конкурують один з одним за зв’язування з hANGPTL3 і, переважно, не блокують принаймні один з аспектів активності hANGPTL3 (тобто неблокуючі антитіла). До згаданого принаймні одного аспекту активності hANGPTL3 стосуються, серед іншого, інгібування активності LPL, в тому числі ангіогенезу, та ін. У одному із здійснень поєднання не менше ніж двох неблокуючих антитіл анти-hANGPTL3 або їх фрагментів підвищує кліренс hANGPTL3 з кровообігу не менше приблизно на 20%, приблизно на 30%, приблизно на 40%, приблизно на 50%, приблизно на 60%, приблизно на 70% або приблизно на 80% в порівнянні з кліренсом без введення антитіл або фрагментів. Рівні hANGPTL3 в кровообігу можуть вимірюватися за результатами аналізів in vitro, добре відомими фахівцями в галузі, а також описаним в цьому документі. У іншому здійсненні поєднання не менше двох неблокуючих антитіл анти-hANGPTL3 включає пари послідовностей HCVR і LCVR (HCVR/LCVR) з послідовностей (i) SEQ ID №: 82/90 і 180/188, відповідно; (ii) SEQ ID №: 114/122 і 180/188, відповідно; (iii) SEQ ID №: 82/90 і 18/26, відповідно; або (iv) SEQ ID №: 114/122 і 18/26, відповідно. До захворювань або порушень, які піддаються лікуванню за допомогою способів даного винаходу, належать будь-які захворювання або стани, при яких відмічається поліпшення, пом'якшення, пригнічення або попередження, або зниження частоти в порівнянні зі станом без лікування антитілами анти-hANGPTL3 (наприклад, ANGPTL3-опосередковані захворювання або порушення) за рахунок анулювання, інгібування, зниження активності ANGPTL3 або іншого впливу на неї. До прикладів захворювань або порушень, які піддаються лікуванню способами даного винаходу, серед інших, стосуються захворювання або порушення, пов'язані з метаболізмом ліпідів, наприклад, гіперліпідемія, гіперліпопротеїнемія і дисліпідемія, в тому числі атерогенна дисліпідемія, діабетична дисліпідемія, гіпертригліцеридемія, в тому числі гостра гіпертригліцеридемія з TG > 1000 мг/дл, гіперхолестеринемія, хіломікроенмія, змішана дисліпідемія (ожиріння, метаболічний синдром, діабет і ін.), ліподистрофія, ліпоартрофія і їм подібні, які викликаються, наприклад, зниженою активністю LPL і/або порушеннями LPL, зниженою активністю рецептора ЛНГ (LDLR) і/або порушеннями рецептора ЛНГ (наприклад, -/гомозиготна спадкова гіперхолестеринемія з LDLR ), змінами ApoC2, недоліком ApoE, підвищенням ApoB, підвищеної продукцією і/або зниженим виведенням ліпопротеїнів дуже низької густини (ЛДНГ), лікуванням певними препаратами (наприклад, дисліпідемія, викликана лікуванням глюкокортикоїдами), будь-якою генетичною схильністю, дієтою, способом життя і іш. Способи даного винаходу можуть також забезпечувати профілактику або лікування захворювань або порушень, пов'язаних або викликаних гіперліпідемією, гіперліпопротеїнемією і/ або дисліпідемією, включаючи, серед інших, серцево-судинні захворювання або порушення, наприклад, атеросклероз, аневризма, гіпертензія, стенокардія, інсульт, порушення мозкового кровообігу, застійна серцева недостатність, ішемічна хвороба серця, інфаркт міокарда, захворювання периферичних судин і їм подібні; гострий панкреатит, неалкогольний стеатогепатит (NASH); порушення вмісту цукру в крові, наприклад, діабет, ожиріння і їм подібні. 7 UA 114891 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 До інших прикладів захворювань або порушень, які піддаються лікуванню способами даного винаходу, належать рак/пухлина, а також неопухлинні пов'язані з ангіогенезом захворювання або порушення, в тому числі офтальмологічні ангіогенні захворювання, такі як вікова макулодистрофія, оклюзія центральної вени сітківки або оклюзія гілки вени сітківки, діабетична ретинопатія, ретинопатія недоношених і їм подібні, запальні захворювання, наприклад, артрит, ревматоїдний артрит (RA), псоріаз і їм подібні. Інші здійснення стануть очевидними при ознайомленні з приведеним нижче докладним описом. КОРОТКИЙ ОПИС МАЛЮНКІВ На фіг. 1 представлено вирівнювання послідовностей пептидів 1-3, що використовуються в експерименті зв’язування антитіла анти-hANGPTL3 (приклад 5) відносно відповідних ділянок послідовності hANGPTL3 (тобто по залишках з 30 до 70 SEQ ID №: 161 або GenBank #NP_055310). Пептид 1 (контроль: пептид ANGPTL4; SEQ ID №: 168); пептид 2 (пептид ANGPTL3; SEQ ID №: 169); і пептид 3 (пептид ANGPTL3; SEQ ID №: 170). На фіг. 2 приведені результати зв’язування антитіла анти-hANGPTL3 з N-термінальними суперспіральними пептидами hANGPTL3 (пептиди 2 і 3) або hANGPTL4 (пептид 1):  ізотипічний контроль; і : антитіло H4H1276S. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Перш ніж приступити до докладного опису даного винаходу, необхідно зазначити, що даний винахід не обмежується конкретними способами і викладеними експериментальними умовами, оскільки такі способи і умови можуть змінюватися. Потрібно також розуміти, що термінологія, яка використовується в цьому документі призначена виключно для опису конкретних здійснень і не носить обмежувального характеру, оскільки об’єм даного винаходу обмежується тільки прикладеною формулою винаходу. Якщо не вказано інше, всі технічні і наукові терміни, що використовуються в цьому документі, мають таке ж значення, яке загальновідомо рядовим фахівцям в галузі, до якої належить даний винахід. Хоча на практиці або при перевірці даного винаходу можуть використовуватися будь-які способи і матеріали, аналогічні або ідентичні описаним в цьому документі, нижче приводиться опис переважних способів і матеріалів. Визначення Термін «ангіопоетин-подібний білок 3 людини», або «hANGPTL3», що використовується в цьому документі, означає hANGPTL3 людини з послідовністю нуклеїнової кислоти, показаною в SEQ ID №: 162, і амінокислотну послідовність SEQ ID №: 161, або його біологічно активний фрагмент. Використовуваний в цьому документі термін «антитіло» призначений для позначення молекул імуноглобуліну, складених з чотирьох поліпептидних ланцюгів, при цьому два важкі (Н) ланцюги і два легкі (L) ланцюги зв'язуються один з одним дисульфідними зв'язками. Кожний важкий ланцюг містить варіабельну область важкого ланцюга (HCVR) і константну область важкого ланцюга (CH; що містить домени CH1, CH2 і CH3). Кожний легкий ланцюг містить варіабельну область легкого ланцюга (LCVR) і константну область легкого ланцюга CL). Області HCVR і LCVR можуть поділятися на області гіперваріабельності, які називаються визначальними комплементарність областями (CDR), що перемежаються областями з більш високим рівнем консервативності, що називаються остовними областями (FR). Кожна область HCVR і LCVR утворена трьома CDR і чотирма FR, розташованими від аміно-термінального кінця до карбокси-термінального кінця в наступному порядку: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 і FR4. Також можливе заміщення одного або декількох залишків CDR або пропускання однієї або декількох CDR. У науковій літературі описані випадки, коли для зв’язування можна обійтися без однієї або двох CDR. У роботі Padlan et al. (1995 FASEB J. 9:133-139) аналізувалися контактні області між антитілами і їх антигенами на основі опублікованих кристалічних структур, і зроблений висновок про те, що тільки приблизно третина залишків CDR насправді вступає в контакт з антигеном. У цій роботі також виявлена множина антитіл, в яких одна або дві CDR не містять амінокислот, що контактують з антигеном (див. також, Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320:415-428). Залишки CDR, що не контактують з антигеном, можна визначити на основі попередніх досліджень (наприклад, залишки H60-H65 в CDRH2 часто не потрібні), по областях CDR Кабата, що лежать поза CDR Чотіа, за допомогою молекулярного моделювання і (або) емпіричним шляхом. Якщо CDR або залишки їх пропущені, вони звичайно заміняються амінокислотами, що 8 UA 114891 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 займають відповідне положення в іншій послідовності людського антитіла, або такими консенсусними послідовностями. Положення для заміщення CDR і амінокислотами можуть також вибиратися емпірично. Емпіричні заміщення можуть бути консервативними або неконсервативними. Використовуваний в цьому документі термін «антитіло людини» призначений для позначення антитіл з варіабельною і константною областями, отриманих з імуноглобулінових послідовностей зародкових ліній людини. Моноклональні антитіла (mAbs), що описуються в даному винаході, можуть включати амінокислотні залишки, що не кодуються імуноглобуліновими послідовностями зародкових ліній людини (наприклад, мутації, викликані випадковим або сайт-специфічним мутагенезом in vitro або соматичними мутаціями in vivo), наприклад, в областях CDR, особливо в області CDR3. Однак Використовуваний в цьому документі термін «антитіло людини» не має на увазі включення mAbs, в яких на послідовності FR людини прищеплені CDR послідовності, отримані із зародкових ліній іншого виду ссавців, наприклад, миші. Повністю людські антитіла анти-hANGPTL3, що розкриваються в цьому документі, можуть включати одне або декілька амінокислотних заміщень, вставок і/або делецій в остовній області і/або CDR варіабельних доменів важкого і легкого ланцюга в порівнянні з відповідними ембріональними лініями. Такі мутації можна легко виявити при зіставленні амінокислотних послідовностей, що розкриваються в цьому документі, з ембріональними послідовностями, які доступні, наприклад, з відкритих баз даних послідовностей антитіл. Даний винахід включає антитіла і їх антигензв’язувальні фрагменти, які отримані з будь-якої амінокислотної послідовності, що розкривається в цьому документі, де одна або декілька амінокислот в одній або декількох остовних областях і/або CDR мутують у відповідний залишок (залишки) ембріональної послідовності, з якої отримане антитіло, або у відповідний залишок (залишки) іншої людської ембріональної послідовності, або із заміною консервативних амінокислот відповідного ембріонального залишку (залишків) (такі зміни послідовності в цьому документі в сукупності називаються «ембріональними мутаціями»). Спираючись на послідовності варіабельних областей важкого і легкого ланцюга, що розкриваються в цьому документі, фахівець в даній галузі може без великих зусиль отримати множину антитіл і антигензв’язувальних фрагментів, які містять одну або декілька окремих ревертуючих ембріональних мутацій або їх поєднання. У деяких здійсненнях всі залишки остовної області і/або CDR в доменах VH і/або VL ревертивним чином мутовані до залишків, присутніх у вихідній ембріональній послідовності, на основі якій було отримане антитіло. У інших здійсненнях тільки певні залишки були піддані зворотній мутації до вихідної ембріональної послідовності, наприклад, тільки мутовані залишки, присутні в перших 8 амінокислотах FR1 або останніх 8 амінокислотах FR4, або тільки мутовані залишки, присутні в CDR1, CDR2 або CDR3. У інших здійсненнях один або декілька залишків остовної області і/або CDR мутували у відповідні залишки іншої ембріональної послідовності (тобто ембріональної послідовності, яка відрізнялася від ембріональної послідовності, з якої було спочатку отримане антитіло). Крім того, антитіла даного винаходу можуть містити будь-яку комбінацію двох або більше ембріональних мутацій в остовній області і/або CDR, наприклад, таких, де певні індивідуальні залишки мутують до відповідних залишків певної ембріональної послідовності, тоді як ряд інших залишків, які відрізняються від вихідної ембріональної послідовності, зберігаються або мутують у відповідні залишки іншої ембріональної послідовності. Після отримання антитіл і антигензв’язувальних фрагментів, які містять одну або декілька ембріональних мутацій, вони можна легко протестувати на наявність однієї або декількох шуканих властивостей, наприклад, поліпшення специфічності зв’язування, підвищення афінності зв’язування, підвищення або посилення антагоністичних або агоністичних біологічних властивостей (залежно від обставин), зниження імуногенності та ін. Антитіла і антигензв’язувальні фрагменти, отримані таким загальним способом, входять в сферу охоплення даного винаходу. Даний винахід також включає антитіла анти-ANGPTL3, що містять варіанти будь-яких амінокислотних послідовностей HCVR, LCVR і/або CDR, що розкриваються в цьому документі, які мають однією або декілька консервативних заміщень. Наприклад, даний винахід включає антитіла анти-ANGPTL3, що мають амінокислотні послідовності HCVR, LCVR і/або CDR, наприклад, з 10 або менше, 8 або менше, 6 або менше, 4 або менше, 2 або 1 консервативним амінокислотним заміщенням відносно будь-якої амінокислотної послідовності HCVR, LCVR і/або CDR, що розкривається в цьому документі. У одному здійсненні HCVR містить амінокислотну послідовність SEQ ID №: 487 з 10 або менше консервативними амінокислотними заміщеннями. У ще одному здійсненні HCVR містить амінокислотну послідовність SEQ ID №: 487 з 8 або менше консервативними амінокислотними заміщеннями. У ще одному здійсненні HCVR містить 9 UA 114891 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислотну послідовність SEQ ID №: 487 з 6 або менше консервативними амінокислотними заміщеннями. У ще одному здійсненні HCVR містить амінокислотну послідовність SEQ ID №: 487 з 4 або менше консервативними амінокислотними заміщеннями. У ще одному здійсненні HCVR містить амінокислотну послідовність SEQ ID №: 487 з 2 або 1 консервативним амінокислотним заміщенням. У одному здійсненні LCVR містить амінокислотну послідовність SEQ ID №: 44 з 10 або менше консервативними амінокислотними заміщеннями. У ще одному здійсненні LCVR містить амінокислотну послідовність SEQ ID №: 44 з 8 або менш консервативними амінокислотними заміщеннями. У ще одному здійсненні LCVR містить амінокислотну послідовність SEQ ID №: 44 з 6 або менше консервативними амінокислотними заміщеннями. У ще одному здійсненні LCVR містить амінокислотну послідовність SEQ ID №: 44 з 4 або менше консервативними амінокислотними заміщеннями. У ще одному здійсненні LCVR містить амінокислотну послідовність SEQ ID №: 44 з 2 або 1 консервативним амінокислотним заміщенням. Якщо спеціально не обумовлено інакше, термін «антитіло», що використовується в цьому документі, потрібно відносити до молекул антитіл, що містять два важкі ланцюги імуноглобуліну і два легкі ланцюги імуноглобуліну (тобто «молекули повних антитіл»), а також їх антигензв’язувальні фрагменти. Термін «антигензв’язувальна частина» антитіла, «антигензв’язувальний фрагмент» антитіла і їм подібні, які використовуються в цьому документі, включає будь-які природні, отримувані ферментативним шляхом, синтетичні або генетично сконструйовані поліпептиди або глікопротеїни, які специфічно зв'язуються з антигеном з утворенням комплексу. Антигензв’язувальні фрагменти антитіла можуть бути отримані, наприклад, з повних молекул антитіл з використанням будь-яких прийнятих стандартних методик, наприклад, протеолітичного розщеплення або рекомбінантних генноінженерних технологій, що включають маніпуляції і експресію ДНК, що кодують варіабельну і (можливо) константну області антитіла. Така ДНК відома і/або легко доступна, наприклад, з комерційних джерел, бібліотек ДНК (в тому числі, наприклад, фаг-дисплей бібліотек антитіл), або може бути синтезована. Секвенування і маніпуляції з ДНК можуть проводитися хімічними методами або з використанням методик молекулярної біології, наприклад, для організації однієї або декількох варіабельних і/або константних областей у відповідну конфігурацію, або для введення кодонів, утворення цистеїнових залишків, модифікації, додавання або видалення амінокислот та ін. Серед множини прикладів антигензв’язувальних фрагментів: (i) фрагменти Fab; (ii) фрагменти F(ab')2; (iii) фрагменти Fd; (iv) фрагменти Fv; (v) одноланцюжкові молекули Fv (scFv); (vi) фрагменти dAb; і (vii) мінімальні розпізнавальні компоненти, що містять амінокислотні залишки, які відтворюють гіперваріабельну область антитіла (наприклад, окрему визначаючу комплементарність область (CDR), наприклад, пептид CDR3), або ж обмежений пептид FR3CDR3-FR4. Інші сконструйовані молекули, наприклад, домен-специфічні антитіла, однодоменні антитіла, антитіла з видаленим доменом, химерні антитіла, антитіла з CDR-вставкою, діатіла, триатіла, тетратіла, мінітіла, нанотіла (наприклад, моновалентні нанотіла, бівалентні нанотіла та ін.), малі модульні імунопрепарати (SMIP) і варіабельні області акули IgNAR, також входять в сферу охоплення виразу «антигензв’язувальний фрагмент», що використовується в цьому документі. Антигензв’язувальний фрагмент антитіла буде звичайно містити принаймні одну варіабельну область. Варіабельна область може мати будь-який розмір або амінокислотний склад і звичайно буде містити принаймні одну CDR, яка знаходиться по сусідству або знаходиться всередині рамки з однією або декількома остовними послідовностями. У антигензв’язувальних фрагментах, де домен VH пов'язаний з доменом VL, області VH і VL можуть бути структурно організовані один відносно одного будь-яким відповідним чином. Наприклад, варіабельна область може бути димерною і містити димери -VH, VH-VL або VL-VL. У альтернативному варіанті антигензв’язувальний фрагмент антитіла може містити мономерний домен VH або VL. У деяких здійсненнях антигензв’язувальний фрагмент антитіла може містити принаймні одну варіабельну область, ковалентним чином пов'язану з принаймні однією константною областю. Серед множини прикладів конфігурацій варіабельної і констатнтої областей, які виявляються в антигензв’язувальним фрагменті антитіла даного винаходу, можна перерахувати: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VLCH2-CH3; і (xiv) VL-CL. У будь-якій конфігурації варіабельної і константної областей, в тому числі в будь-якому з перерахованих вище прикладів конфігурацій, варіабельна і константна області можуть бути або безпосередньо пов'язані один з одним, або сполучатися через повний або 10 UA 114891 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 частковий шарнір, або лінкер. Шарнірна область може містити не менше ніж 2 (наприклад, 5, 10, 15, 20, 40, 60 або більше) амінокислот, що забезпечує гнучкий або напівгнучкий зв'язок між сусідніми варіабельними і/або константними областями в одній молекулі поліпептиду. Більше того, антигензв’язувальний фрагмент антитіла даного винаходу може містити гомо- або гетеродимер (або інший мультимер) будь-якої з конфігурацій варіабельної і константної областей, перерахованих вище, в нековалентний зв'язок один з одним і/або з одним або декількома мономерними областями VH або VL (наприклад, за допомогою дисульфідного зв'язку (зв'язків)). Як і у випадку молекул повних антитіл, антигензв’язувальні фрагменти можуть бути моноспецифічними або мультиспецифічними (наприклад, біспецифічними). Мультиспецифічний антигензв’язувальний фрагмент антитіла буде звичайно включати не менше двох різних варіабельних доменів, причому кожний з таких варіабельних доменів в стані специфічно зв'язуватися з індивідуальним антигеном або іншим епітопом того ж антигена. Будь-який формат мультиспецифічного антитіла, включаючи приклади форматів біспецифічних антитіл, що розкриваються в даному винаході, може бути адаптований для використання в контексті антигензв’язувального фрагмента антитіла даного винаходу із застосуванням стандартних методик, відомих фахівцям в галузі. У деяких здійсненнях антитіло або фрагменти антитіла даного винаходу можуть бути кон’юговані з терапевтичним агентом («імунокон’югат»), наприклад, цитотоксином, хіміотерапевтичним препаратом, імунодепресантом або радіоактивним ізотопом. Термін «специфічно зв'язуються» або йому подібні означає, що антитіло або його антигензв’язувальний фрагмент утворює комплекс з антигеном, який порівняно стабільний в фізіологічних умовах. Специфічне зв’язування може характеризуватися рівноважною -6 константою дисоціації (KD), щодорівнює приблизно 1×10 M або менше (тобто менша KD означає більш міцне зв’язування). Методи визначення специфічного зв’язування молекул відомі фахівцям в галузі і включають, наприклад, рівноважний діаліз, поверхневий плазмонний резонанс та ін. Ізольоване антитіло, яке специфічним чином зв'язує hANGPTL3, проте може виявляти перехресну реактивність до іншим антигенам, наприклад, молекулам ANGPTL3 з інших видів, наприклад, ANGPTL3 яванської макаки, ANGPTL3 миші, ANGPTL3 щура і/або hANGPTL4 з амінокислотною послідовністю SEQ ID №: 164. Крім того, мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні), які зв'язуються з hANGPTL3 і одним або декількома додатковими антигенами, проте, розглядаються як антитіла, які «специфічно зв'язують» hANGPTL3 відповідно до термінології цього документа. Використовуваний в цьому документі термін «антитіло високої афінності» стосується антитіл, що мають афінність зв’язування з hANGPTL3, що виражається через KD, приблизно -9 -9 -9 2×10 M або менше, приблизно 1,5×10 M або менше, приблизно 1×10 M або менше, -9 -9 -10 приблизно 0,5×10 M або менше, приблизно 0,25×10 M або менше, приблизно 1×10 M або -10 менше, або приблизно 0,5×10 M або менше, як показують результати вимірювання методом поверхневого плазмонного резонансу, наприклад, BIACORE™, або результати вимірювання афінності в розчині методом імуноферментного аналізу (ELISA). Використовуваний в цьому документі термін «K D» призначений для позначення рівноважної константи дисоціації конкретної взаємодії антитіло-антиген. Під використовуваним в цьому документі терміном «повільне дисоціююче», під «Koff"» або «kd» мається на увазі антитіло, комплекс якого з hANGPTL3 дисоціює з константою швидкості -3 -1 -3 -1 -3 -1 -3 -1 4×10 сек або нижче, 3×10 сек або нижче, 2×10 сек або нижче, 1×10 сек або нижче, 1×10 4 -1 сек або нижче, за результатами вимірювання методом поверхневого плазмонного резонансу, наприклад, BIACORE™. Під терміном «константа внутрішньої афінності», або «ka», мається на увазі антитіло, 3 -1 -1 комплекс якого з hANGPTL3 асоціює з константою швидкості 1×10 M сек або вище, за результатами вимірювання методом поверхневого плазмонного резонансу, наприклад, BIACORE™. Використовуваний в цьому документі термін «ізольоване антитіло» призначений для позначення антитіла, істотно вільного від інших mAbs, що мають іншу антигенну специфічність (наприклад, ізольоване антитіло, яке специфічно зв'язує hANGPTL3, істотно вільне від mAbs, які специфічно зв'язують антигени, відмінні від hANGPTL3). Ізольоване антитіло, яке специфічно зв'язує hANGPTL3, проте може виявляти перехресну реактивність до інших антигенів, наприклад, молекул ANGPTL3 з інших видів, наприклад, яванської макаки, миші, щура і/або до інших пов'язаних білок, наприклад, ANGPTL4 людини. Використовуваний в цьому документі термін «нейтралізуюче», «блокуюче» або «анулююче» антитіло (або антитіло, яке «нейтралізує», «блокує» або «анулює» функцію ANGPTL3) 11 UA 114891 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 призначений для позначення антитіла, зв’язування якого з ANGPTL3 приводить до безпосереднього інгібування як мінімум однієї біологічної активності ANGPTL3, згідно з оцінкою за допомогою стандартних методів аналізу in vitro, відомих фахівцям (див. приклади нижче). Терміни «нейтралізувати», «інгібувати», «блокувати» і «анулювати» можуть використовуватися рівнозначно в цьому документі. Термін «неблокуюче» антитіло стосується антитіла, зв’язування якого з ANGPTL3 напряму не блокує цільову активність ANGPTL3, що оцінюється по стандартному аналізу in vitro, але проте може бути «інтерферуючим» антитілом, зв’язування якого з ANGPTL3 приводить до непрямого інгібування, зниження, пом'якшення або іншого впливу принаймні на один аспект біологічної активності ANGPTL3 in vivo, наприклад, за рахунок підвищення кліренсу ANGPTL3 з кровообігу. Кліренс ANGPTL3 з кровообігу може особливо посилюватися за рахунок поєднання не менше, ніж двох неблокуючих антитіл. Нейтралізація, інгібування, анулювання, скорочення, пригнічення або порушення біологічної активності ANGPTL3 може бути оцінене шляхом вимірювання одного або більше показників біологічної активності ANGPTL3 за допомогою одного або декількох стандартних методів аналізу in vitro або in vivo, відомі фахівцям (див. приклади нижче). Використовуваний в цьому документі термін «поверхневий плазмонний резонанс» стосується оптичного явища, яке дозволяє провести аналіз біоспецифічних взаємодій в реальному часі за рахунок детектування змін концентрацій білка в біосенсорній матриці, наприклад, за допомогою системи BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.). Термін «епітоп» означає область антигена, в якій відбувається зв’язування з антитілом. Епітопи можуть бути структурними або функціональними. Функціональні епітопи звичайно являють собою субпопуляцію структурних епітопів і містять такі залишки, які безпосередньо сприяють афінності взаємодії. Епітопи також можуть бути конформаційними, що тобто складаються з розгалужених амінокислот. У ряді здійснень епітопи можуть включати детермінанти, що являють собою хімічно активні поверхневі угрупування молекул, такі як амінокислоти, бічні ланцюги цукру, фосфорильні групи або сульфонільні групи, і в ряді здійснень можуть мати специфічні тривимірні структурні характеристики і (або) специфічні зарядові характеристики. Термін «істотна ідентичність» або «по суті ідентичні» відносно нуклеїнової кислоти або її фрагмента означає, що при оптимальному зіставленні з іншою нуклеїновою кислотою (або її комплементарним ланцюгом) з відповідними додатками або делеціями спостерігається ідентичність нуклеотидної послідовності не менше ніж приблизно 90% і більш переважно не менше ніж 95%, 96%, 97%, 98% або 99% основ нуклеотидів, що вимірюється за допомогою будь-якого відомого алгоритму ідентичності послідовностей, наприклад, FASTA, BLAST або GAP, які обговорюються нижче. Застосовуваний відносно поліпептидів термін «істотна схожість» або «по суті подібні» означає, що дві пептидні послідовності при їх оптимальному зіставленні, наприклад, за допомогою програм GAP або BESTFIT з урахуванням параметрів за умовчанням внеску пропусків демонструють ідентичність послідовностей не менше ніж 90%, і ще більш переважно, не менше ніж 95%, 98% або 99%. Переважно положення неідентичних залишків відрізняється консервативним заміщенням амінокислот. «Консервативне заміщення амінокислот» це таке заміщення, при якому один амінокислотний залишок заміняється іншим амінокислотним залишком, що має бічний ланцюг (групу R) з аналогічними хімічними властивостями (наприклад, заряд або гідрофобність). У загальному випадку консервативне заміщення амінокислот не буде приводити до істотних змін функціональних властивостей білка. У випадку якщо дві або більше амінокислотні послідовності відрізняються одна від одної консервативними заміщеннями, процент або міра аналогічності може коректуватися у бік збільшення, з тим щоб врахувати консервативний характер заміщення. Способи такого коректування добре відомі фахівцям в даній галузі. Див. наприклад, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. До прикладів груп амінокислот, що мають бічні ланцюги з аналогічними хімічними властивостями, стосуються 1) аліфатичні бічні ланцюги: гліцин, аланін, валін, лейцин і ізолейцин; 2) аліфатичні гідроксильні бічні ланцюги: серин і треонин; 3) бічні ланцюги з амідною групою: аспарагін і глутамін; 4) ароматичні бічні ланцюги: фенілаланін, тирозин і триптофан; 5) бічні ланцюги з властивостями основи: лізин, аргінін і гістидин; 6) бічні ланцюги з властивостями кислоти: аспартат і глутамат; і 7) сірковмісні бічні ланцюги: цистеїн і метіонін. Переважними групами для консервативного заміщення амінокислот є: валін-лейцин-ізолейцин, фенілаланін-тирозин, лізин-аргінін, аланін-валін, глутамат-аспартат і аспарагін-глутамін. У альтернативному варіанті консервативне заміщення являє собою будь-яку зміну, що приводить до позитивного значення в логарифмічній матриці правдоподібності PAM250, описаній в роботі Gonnet et al. (1992) 12 UA 114891 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Science 256: 1443 45. «Помірно консервативним» заміщенням називається будь-яка зміна, що приводить до ненегативного значення в логарифмічній матриці правдоподібності PAM250. Подібність послідовностей поліпептидів звичайно визначають за допомогою програмного забезпечення для аналізу послідовності. Програма для аналізу білків зіставляє подібні послідовності з використанням показників аналогічності, що задаються для різних заміщень, делецій і інших модифікацій, в тому числі для консервативного заміщення амінокислот. Наприклад, програмне забезпечення GCG містить такі програми як GAP і BESTFIT, які можуть використовуватися з параметрами за умовчанням для визначення гомології або ідентичності послідовності між близькоспорідненими поліпептидами, наприклад, гомологічними поліпептидами різних видів організмів або між вихідним білком і його мутантом. Див., наприклад, GCG Віри. 6.1. Поліпептидні послідовності можуть також зіставлятися за допомогою FASTA програми, включеною в GCG Віри. 6.1, з використанням параметрів за умовчанням або параметрів, що рекомендуються. FASTA (наприклад, FASTA2 і FASTA3) забезпечує зіставлення і визначає процент ідентичності послідовностей в областях з найбільшим перекриттям між заданою і досліджуваною послідовностями (див. вище за Pearson (2000)). Іншим переважним алгоритмом зіставлення послідовності даного винаходу з базою даних, що містить велике число послідовностей різних організмів, є комп'ютерна програма BLAST, особливо BLASTP АБО TBLASTN, яка використовує параметри за умовчанням. Див., наприклад, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410 і Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 402. Визначення «терапевтично ефективну кількість» означає кількість, яка надає бажаний ефект впливу, для досягнення якого вона вводиться. Точна кількість буде залежати від цілей лікування, від віку і розмірів об'єкта, одержуючого лікування, способу введення та ін., і може бути встановлене фахівцем в галузі на основі відомих методик (див., наприклад, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding). Отримання антитіл людини Способи формування людських антитіл у трансгенних мишей добре відомі фахівцям в галузі. Будь-які подібні відомі способи можуть використовуватися в контексті даного винаходу для приготування людських антитіл, які специфічно зв'язуються з ANGPTL3. За допомогою технології VELOCIMMUNE™ або іншого відомого способу отримання моноклональних антитіл спочатку отримували химерні антитіла з високої афінністю до ANGPTL3, що мають варіабельну область людини і константну область миші. Як описано в розділі прикладів нижче, антитіла характеризуються і вибираються по потрібних властивостях, в тому числі по афінності, селективності, епітопу і т. п. У загальному випадку антитіла даного винаходу мають високу афінність, як правило маючи -12 -9 KD від приблизно 10 M до приблизно 10 M, якщо її вимірювати по зв’язуванню з антигеном, що іммобілізується на твердій підкладці або аналізується в розчині. Константні області миші замінюються бажаними константними областями людини, з тим щоб отримати повні антитіла людини, описані в даному винаході, наприклад, вихідним IgG1 або IgG4 або модифікованим IgG1 або IgG4. Вибрана константна область може змінюватися залежно від конкретного здійснення, а властивості високої афінності антиген-зв’язування і необхідна специфічність антитіл визначаються варіабельної областю. Епітопне картування і пов'язані з ним технології Для скрінінгу антитіл, які зв'язуються з конкретним епітопом, можна провести стандартний епітоп перехресний конкурентний аналіз, подібно до описаного в Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY). До інших методів стосуються отримання мутантів скануванням аланіном, пептидний блотинг (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:44363), і аналіз розщеплення пептидів. Крім того, можуть використовуватися такі методи, як вирізування епітопа, екстракція епітопа і хімічна модифікація антигенів (Tomer (2000) Protein Science:487-496). Використовуваний в цьому документі термін «епітоп» стосується сайту антигена, на який реагують В і (або) Т клітини. Епітопи В-клітин можуть бути утворені як безперервною послідовністю амінокислот, так і розділеними амінокислотами, що виявилися рядом внаслідок фолдингу білка в третинну структуру. Епітопи, утворені безперервною послідовністю амінокислот, як правило, зберігаються при впливі денатуруючих розчинників, тоді як епітопи, що виникли в результаті фолдингу білка в третинну структуру, руйнуються при обробці денатуруючими розчинників. Епітоп, як правило, формується не менше ніж трьома, а звичайно не менше ніж п'ятьма або 8-10 амінокислотами у повністю конкретній просторовій конформації. Визначення профілю за допомогою модифікації (MAP), також відоме як визначення профілю антитіл на основі структури антигена (ASAP) являє собою метод класифікації великого числа моноклональних антитіл (mAbs) до одного і того ж антигену відповідно до схожості профілю 13 UA 114891 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв’язування кожного антитіла з хімічно або ензиматично модифікованими антигенними поверхнями (US 2004/0101920). Кожна категорія може відображати унікальний епітоп, який або чітко відрізняється від епітопа, представленого в будь-якій іншій категорії, або частково перекривається з ним. Подібна технологія дозволяє швидко відділяти генетично ідентичні mAbs, так що їх ідентифікація може бути сконцентрована на генетично відмінних mAbs. У випадку застосування для скринінгу гібридоми, MAP може сприяти ідентифікації рідких клонів гібридоми, виробляючих mAbs з потрібними характеристиками. MAP може використовуватися для сортування mAbs анти-ANGPTL3 даного винаходу в групи mAbs, зв'язувальні різні епітопи. ANGPTL3 містить аміно-термінальну суперспіральний домен і карбоксил-термінальну фібриногеноподібний домен (FD), причому протеїн ANGPTL3 формує олігомер за відсутності міжмолекулярних дисульфідних зв'язків (Ge et al., 2005, J Lipid Res 46:1484-1490). Відомо, що N-термінальний суперспіральний домен грає важливу роль в інгібуванні активності LPL (Ono et al., 2003, J Biol Chem 278:41804-41809). Таким чином, в деяких здійсненнях антитіло антиhANGPTL3 або антигензв’язувальний фрагмент антитіла зв'язується з епітопом, розташованим в N-термінальному суперспіральному домені (залишки 17-209) hANGPTL3 (SEQ ID №: 161), і нейтралізує як мінімум одну з функцій hANGPTL3 (наприклад, інгібування активності LPL). У ще одному здійсненні антитіло анти-hANGPTL3 або його антигензв’язувальний фрагмент зв'язується з епітопом, розташованим в N-термінальному суперспіральному домені hANGPTL3, і нейтралізує як мінімум одну з функцій hANGPTL3, при умові, що антитіло або його фрагмент не зв'язується з пептидом ANGPTL3 з SEQ ID №: 170. У одному здійсненні антитіло або його фрагмент специфічно зв'язується з епітопом в залишках 17 200, 17 100, 17 70, 17 65, 17 60, 17 57, 17 55, 17 50, 17 45, 17 40 або 17 35 hANGPTL3 (SEQ ID №: 161), можливо, при умові, що антитіло або його фрагмент не зв'язується з пептидом ANGPTL3 з SEQ ID №: 170. У ще одному здійсненні антитіло або його фрагмент специфічно зв'язується з епітопом в залишках 40 200, 40 100, 40 70, 50 200, 50 100, 50 70, 58 200, 58 100, 58 70, 58 68 або 61 66 (відомим як «гепаринзв’язувальний мотив») hANGPTL3 (SEQ ID №: 161), можливо, при умові, що антитіло або його фрагмент не зв'язується з пептидом ANGPTL3 з SEQ ID №: 170. У деяких здійсненнях антитіло або його фрагмент зв'язується з епітопом, можливо, за участю більше ніж одного пронумерованого епітопа або залишку в N-термінальній суперспіральній області hANGPTL3, можливо, при умові, що антитіло або його фрагмент не зв'язується з пептидом ANGPTL3 з SEQ ID №: 170. У інших здійсненнях антитіло hANGPTL3 або його фрагмент зв'язується з одним або декількома фрагментами hANGPTL3, наприклад, з фрагментом не менше ніж 5 залишків, не менше ніж 7 залишків, не менше ніж 10 залишків, не менше ніж 20 залишків, не менше ніж 30 залишків, не менше ніж 50 залишків, не менше ніж 70 залишків, не менше ніж 100 залишків, не менше ніж 150 залишків або не менше ніж 200 залишків hANGPTL3 (SEQ ID №: 161), можливо, при умові, що антитіло або його фрагмент не зв'язується з пептидом ANGPTL3 з SEQ ID №: 170. Даний винахід включає антитіла hANGPTL3, які зв'язуються з тим же епітопом, що і будьякий з конкретних прикладів антитіл, описаних в цьому документі. Аналогічним чином даний винахід також включає антитіла анти-hANGPTL3, які конкурують за зв’язування з hANGPTL3 або з фрагментом hANGPTL3 з будь-яким з конкретних прикладів антитіл, описаних в цьому документі. Легко встановити, чи зв'язується те або інше антитіло з тим же епітопом, що і контрольне антитіло анти-hANGPTL3, або конкурує за зв’язування з ним, скориставшись стандартними методами, відомими фахівцям в галузі. Наприклад, щоб визначити, чи зв'язується випробуване антитіло з тим же епітопом, що і контрольне антитіло анти-hANGPTL3 даного винаходу, контрольному антитілу дозволяють зв'язатися з білком або пептидом hANGPTL3 в умовах насичення. Потім оцінюється здатність випробуваного антитіла зв'язуватися з молекулою hANGPTL3. Якщо випробуване антитіло здатний зв'язуватися з hANGPTL3 після зв’язування в умовах насичення з контрольним антитілом анти-hANGPTL3, можна зробити висновок про те, що випробуване антитіло зв'язується з епітопом відмінним від контрольного антитіла антиhANGPTL3. З іншого боку, якщо випробуване антитіло не здатне зв'язуватися з молекулою hANGPTL3 після зв’язування в умовах насичення з контрольним антитілом анти-hANGPTL3, тоді випробуване антитіло може зв'язуватися з тим же епітопом, що і епітоп, пов'язаний з контрольним антитілом анти-hANGPTL3 даного винаходу. Щоб визначити, чи конкурує антитіло при зв’язуванні з контрольним антитілом антиhANGPTL3, представлена вищим методологія зв’язування використовувалася в двох варіантах: У першому випадку контрольному антитілу дозволяли зв'язуватися з молекулою hANGPTL3 в умовах насичення з подальшою оцінкою зв’язування контрольного антитіла з молекулою 14 UA 114891 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 hANGPTL3. У другому випадку випробуваному антитілу давали зв'язуватися з молекулою hANGPTL3 в умовах насичення з подальшою оцінкою зв’язування контрольного антитіла з молекулою ANGPTL3. Якщо в обох випадках тільки перше (що насичує) антитіло здатний зв'язуватися з молекулою ANGPTL3, то можна вважати, що випробуване антитіло і контрольне антитіло конкурують за зв’язування з hANGPTL3. Рядовому фахівцеві в галузі буде очевидно, що антитіло, яке конкурує за зв’язування з контрольним антитілом, необов'язково буде зв'язуватися з тим же епітопом, що і контрольне антитіло, але може стерично блокувати зв’язування контрольного антитіла за допомогою зв’язування з епітопом, що перекривається або знаходиться по сусудству. Два антитіла зв'язуються з одним і тим же епітопом, якщо кожне конкурентно інгібує (блокує) зв’язування іншого антитіла з антигеном. Тобто 1-, 5-, 10-, 20- або 100-кратний надлишок одного антитіла інгібує зв’язування іншого не менше ніж на 50%, але переважно, на 75%, 90% або навіть 99% за результатами аналізу конкурентного зв’язування (див., наприклад, Junghans et al., Cancer Res, 1990:50:1495-1502). Як альтернатива, два антитіла мають один і той же епітоп, якщо по суті всі амінокислотні мутації в антигені, які знижують або блокують зв’язування одного антитіла, також знижують або блокують зв’язування іншого. Два антитіла мають епітопи, що перекриваються, якщо деякі амінокислотні мутації, які знижують або блокують зв’язування одного антитіла, також знижують або блокують зв’язування іншого. Додаткові стандартні експерименти (наприклад, пептидна мутація або аналіз зв’язування) можна проводити, щоб підтвердити, чи викликана, насправді, відсутність зв’язування випробуваного антитіла, що спостерігається, зі зв’язуванням того ж епітопа, що і для контрольного антитіла, або ж стеричне блокування (або інше явище) визначає відсутність зв’язування, що спостерігається. Експерименти такого роду можуть проводитися з використанням ELISA, RIA, поверхневого плазмонного резонансу, проточної цитометрії або будь-якого іншого кількісного або якісного аналізу зв’язування антитіл, доступного фахівцям в галузі. Імунокон'югати У сферу охоплення даного винаходу входить моноклональное антитіло анти-ANGPTL3 людини, кон’юговане з терапевтичним агентом («імунокон’югат»), наприклад, цитотоксином, хіміотерапевтичний препарат, імунодепресант або радіоактивний ізотоп. До цитотоксичним агентів стосуються будь-які речовини, які надають руйнівний вплив на клітини. Приклади прийнятних для застосування цитотоксичних агентів і хіміотерапевтичних агентів для утворення імунокон’югатів відомі фахівцям в галузі, див., наприклад, WO 05/103081. Біспецифічність Антитіла даного винаходу можуть бути моноспецифічними, біспецифічними або мультиспецифічними. Мультиспецифічні mAbs можуть бути специфічні відносно різних епітопів одного цільового поліпептиду або можуть містити антиген-зв'язувальні домени, специфічні відносно декількох цільових поліпептидів. Див., наприклад, Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147:6069. mAbs анти-hANGPTL3 людини можуть бути пов'язані з іншою функціональною молекулою або експресуватися одночасно з нею, наприклад, з іншим пептидом або білком. Наприклад, антитіло або його фрагмент можуть бути функціональне пов'язані (наприклад, хімічним зв'язком, генетичним злиттям, нековалентною асоціацією або іншим чином) з однією або декількома молекулярними структурами, наприклад, з іншим антитілом або фрагментом антитіла, з утворенням біспецифічного або мультиспецифічного антитіла з додатковою специфічністю зв’язування. Прикладом формату біспецифічного антитіла, яке може використовуватися в контексті даного винаходу, є використання першого домена імуноглобуліну (Ig) CH3 і другого домена Ig CH3, де перший і другий домени Ig CH3 відрізняються один від одного принаймні однією амінокислотою і де така відмінність на принаймні одну амінокислоту зменшує зв’язування біспецифічного антитіла з білком А в порівнянні з біспецифічним антитілом, в якому така амінокислотна відмінність відсутня. У одному з здійснень перший домен Ig CH3 зв'язується з білком А, а другий домен Ig CH3 містить мутацію, яка зменшує або блокує зв’язування білка А, наприклад, модифікацію H95R (по номенклатурі екзонів IMGT; H435R по номенклатурі ЄС). Другий CH3 може також містити модифікацію Y96F (по IMGT; Y436F по ЄС). У другому модулі CH3 можуть бути присутнім додаткові модифікації: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M і V82I (по IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M і V422I по ЄС) у випадку антитіл IgG1; N44S, K52N і V82I (IMGT; N384S, K392N і V422I по ЄС) у випадку антитіл IgG2; і Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q і V82I (по IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q і V422I по ЄС) у випадку антитіл IgG4. Варіації по формату біспецифічних антитіл, описані вище, стосуються сфери охоплення даного винаходу. 15 UA 114891 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Біоеквіваленти Антитіла анти-hANGPTL3 і фрагменти антитіл даного винаходу включають білки, що містять амінокислотні послідовності, які відрізняються від амінокислотних послідовностей, що є в описаних mAb, але зберігають здатність зв'язувати ANGPTL3 людини. Такі варіантні mAb і фрагменти антитіл містять один або декілька додатків, делецій або заміщень амінокислот, якщо зіставити з материнською послідовністю, але виявляють біологічну активність, яка в значній мірі еквівалентна описаної для mAbs. Аналогічним чином, послідовності ДНК, що кодують антитіла анти-hANGPTL3 даного винаходу, включають послідовності, які містять один або декілька додатків, делецій або заміщень нуклеотидів, якщо зіставити з послідовністю, що розкривається, однак вони кодують антитіло анти-hANGPTL3 або фрагмент антитіла, яке в значній мірі біоеквівалентні антитілу анти-hANGPTL3 або фрагменту антитіла даного винаходу. Приклади таких варіантних амінокислотних послідовностей і послідовностей ДНК обговорюються вище. Два антигензв’язувальні білки або антитіла вважаються біоеквівалентними, якщо, наприклад, вони є фармацевтичними еквівалентами або фармацевтичними альтернативами, для яких швидкості і міра абсорбції не виявляють істотних відмінностей при введенні в однакових молярних дозах в аналогічних експериментальних умовах, як при разовому дозуванні, так і в багаторазових дозах. Деякі антитіла будуть вважатися еквівалентними або фармацевтичними альтернативами, якщо вони еквівалентні по мірі своєї абсорбції, але не по швидкості такої абсорбції, але проте можуть розглядатися як біоеквівалентні, оскільки такі відмінності в швидкості абсорбції вносяться навмисно і відображені на маркіровці, не є істотними для досягнення ефективних концентрацій ліків в організмі при, наприклад, періодичному застосуванні і вважаються незначними з медичної точки зору для конкретного лікарського препараті, що досліджується. У одному здійсненні два антигензв’язувальні білки є біоеквівалентними, якщо для них відсутні значущі клінічні відмінності в плані безпеки, чистоти і активності впливу. У одному здійсненні два антигензв’язувальні білки є біоеквівалентними, якщо пацієнта можна переводити один або декілька разів з контрольного продукту на біологічний продукт і назад без очікуваного наростання ризику побічних ефектів, в тому числі клінічних значущих змін в імуногенності або зниження ефективності, в порівнянні з продовженням терапії без такого перекладу. У одному з здійснень два антигензв’язувальні білки є біоеквівалентними, якщо вони обидва діють по однаковому механізму або механізмам дії при умові або умовах застосування в тій мірі, в якій такі механізми відомі. Біоеквівалентність може бути продемонстрована і методиками in vivo і in vitro. До методів вимірювання біоеквівалентності стосуються, наприклад, (a) випробування in vivo на людині або інших ссавцях, при яких концентрація антитіла або його метаболітів вимірюється в крові, плазмі, сироватці або іншій біологічній рідині залежно від часу; (b) випробування in vitro, які корельовані з даними біодоступності для людини in vivo і з обґрунтованою мірою достовірності передбачають їх; (с) випробування in vivo на людині або інших ссавцях, в яких відповідний гострий фармакологічний ефект антитіла (або його мішені) вимірюються залежно від часу; і (d) клінічні випробування, що суворо контролюються, в ході яких встановлюється безпека, ефективність впливу, біодоступність або біоеквівалентність антитіла. Біоеквівалентні варіанти антитіл анти-hANGPTL3 даного винаходу можуть конструюватися, наприклад, за допомогою введення різних заміщень залишків або послідовностей, або делецій термінальних або внутрішніх залишків або послідовностей, не потрібного для біологічної активності. Наприклад, залишки цистеїну, що не мають істотного значення для біологічної активності, можуть віддалятися або замінятися іншими амінокислотами, щоб уникнути утворення непотрібних або неправильних внутрішньомолекулярний дисульфідних містків в ході ренатурації. Терапевтичне застосування і склади препаратів У винаході приводяться терапевтичні препарати, що включають антитіла анти-hANGPTL3 або їх антиген-зв'язувальні фрагменти, що входять в сферу охоплення даного винаходу, і терапевтичні методи їх застосування. Введення терапевтичних препаратів відповідно до даного винаходу буде здійснюватися у відповідних носіях, наповнювачах і інших речовинах, які включаються до складу препаратів, щоб забезпечити більш ефективне перенесення, доставку, переносимість та ін. Множину відповідних складів можна знайти в формулярі, відомому всім фахівцям в галузі фармацевтичної хімії: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. До таких препаратів стосуються, наприклад, порошки, пасти, мазі, желе, воски, масла, ліпіди, ліпід-вмісні (катіонні або аніонні) везикули (наприклад, LIPOFECTIN™), 16 UA 114891 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кон’югати ДНК, безводні абсорбційні пасти, емульсії масла у воді і води в маслі, емульсії Carbowax (поліетиленгліколі різної молекулярної ваги), напівтверді гелі і напівтверді суміші, що містять Carbowax. Див. також в Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol. 52:238-311. Доза може змінюватися залежно від віку і ваги пацієнта, одержуючого лікування, захворювання, ціліше за лікування, умови, спосіб введення та ін. При використанні антитіла даного винаходу для лікування різних хвороб і захворювань, прямо або опосередковані пов'язаних з ANGPTL3, включаючи гіперхолестеринемію, розлади, пов'язані з ліпопротеїном низької густини (ЛНГ) і аполіпопротеїном В, і порушення ліпідного метаболізму і т. п., у дорослих пацієнтів доцільно вводити внутрішньовенно або підшкірно антитіло даного винаходу в разовій дозі приблизно від 0,01 до 20 мг на кг масу тіла, більш переважно приблизно від 0,02 до 7 мг, приблизно від 0,03 до 5 мг, або приблизно від 0,05 до 3 мг на кг масу тіла. Залежно від тяжкості захворювання можна коректувати частоту і тривалість лікування. У деяких здійсненнях антитіло або антигензв’язувальний фрагмент антитіла даного винаходу можуть вводитися в початковій дозі від не менше ніж 0,1 мг до приблизно 800 мг, від 1 до приблизно 500 мг, від 5 до приблизно 300 мг або від 10 до приблизно 200 мг, до приблизно 100 мг або до приблизно 50 мг. У деяких здійсненнях після початкової дози може слідувати введення ще однієї або множини подальших доз антитіла або його антигензв’язувального фрагмента в кількостях, які можуть бути співпадати або бути менші початкової дози, при цьому такі подальші дози розділені за часом на період не менш 1 дні до 3 днів; не менше ніж один тиждень, не менше ніж 2 тижнів; не менше ніж 3 тижнів; не менше ніж 4 тижнів; не менше ніж 5 тижнів; не менше ніж 6 тижнів; не менше ніж 7 тижнів; не менше ніж 8 тижнів; не менше ніж 9 тижнів; не менше ніж 10 тижнів; не менше ніж 12 тижнів; або не менше ніж 14 тижнів. Відомі різні системи доставки, і вони можуть використовуватися для введення фармацевтичного складу даного винаходу, наприклад, інкапсуляція в ліпосоми, мікрочастинки, мікрокапсули, рекомбінантні клітини, здатні експресувати мутантні віруси, опосередкований рецепторами ендоцитоз (див., наприклад, Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432). До методів введення, серед інших, стосуються черезшкірний, внутрішньом'язовий, внутрішньоочеревинний, внутрішньовенний, підшкірний, інтраназальний, епідуральний і пероральний. Препарат може вводитися будь-яким відповідним способом, наприклад, вливанням або болюсною ін'єкцією, абсорбцією через епіталіальні або шкірно-слизові оболонки (наприклад, слизову ротової порожнини, слизову прямої кишки і кишечнику та ін.) і може застосовуватися спільно з іншими біологічно-активними агентами. Введення може бути системним або локальним. Фармацевтичний склад може також доставлятися у везикулі, зокрема, в ліпосомі (див. Langer (1990) Science 249:1527-1533; Treat et al. (1989) в Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, сс. 353-365; LopezBerestein, там же, сс. 317-327; див. загалом там же). У певних ситуаціях фармацевтичний склад може доставлятися в системі контрольованого вивільнення. У одному з здійснень може використовуватися насос (див. Langer; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). У іншому здійсненні можуть використовуватися полімерні матеріали; див. Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974). У ще одному здійсненні система контрольованого вивільнення може розташовуватися в безпосередній близькості від мети препарату, а тому буде потрібна лише мала частка від системної дози (див., наприклад, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138, 1984). До ін'єкційних препаратів можуть належати форми дозування для внутрішньовенних, підшкірних, черезшкірних і внутрішньом'язових ін'єкцій, краплинних вливань та ін. Такі ін'єкційні препарати можна приготувати за допомогою відомих методів. Наприклад, ін'єкційні препарати можна приготувати, зокрема, за допомогою розчинення, суспендування або емульгування описаного вище антитіла або його солі в стерильному водному середовищі або в масляному середовищі, які звичайно застосовуються для ін'єкцій. Як водне середовище для ін'єкцій пропонуються, наприклад, фізіологічний розчин, ізотонічний розчин, що містить глюкозу, і інші допоміжні речовини та ін., які можуть використовуватися в поєднанні з відповідним солюбілізуючим агентом, наприклад, спиртом (зокрема, етанолом), багатосновним спиртом (наприклад, пропіленгліколем, поліетиленгліколем), неіоногенною поверхнево-активною сполукою [наприклад, полісорбатом 80, НСО-50 (аддукт поліоксіетилену (50 моль) і гідрогенізованої рицинової олії] та ін. Як масляне середовище використовуються, наприклад, кунжутна олія, соєва олія та ін., які можуть застосовуватися в поєднанні з солюбілізуючим агентом, наприклад, бензилбензоатом, бензиловим спиртом та ін. Приготовану таким чином 17 UA 114891 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 препарат для ін'єкцій переважно фасувати у відповідні ампули. Фармацевтичний склад даного винаходу може вводитися підшкірно або внутрішньовенно за допомогою стандартної голки і шприца. Крім того, що стосується підшкірного введення, у випадку застосування фармацевтичного складу даного винаходу можна використовувати шприц-ручку. Такий шприцручка може бути багаторазового або одноразового використання. В багаторазовому шприціручці звичайно використовується змінний картридж, який містить фармацевтичний склад. Після того як весь фармацевтичний склад всередині картриджа був введений, і картридж пустий, відпрацьований картридж можна легко викинути і замінити його на новий картридж, в якому міститься фармацевтичний склад. Після цього шприц-ручка може використовуватися повторно. В разовому шприцу-ручці змінний картридж не передбачений. Навпаки, разовий шприц-ручка постачається вже заповненим фармацевтичним складом, який вміщується в резервуарі всередині пристрою. Після того як резервуарі не залишається фармацевтичного складу, весь пристрій викидають. Для підшкірного введення фармацевтичного складу даного винаходу можуть застосовуватися самі різні конструкції багаторазових шприців-ручок і пристроїв для автоматичної ін'єкції. Приклади включають, без обмеження, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC™ pen (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25™ pen, HUMALOG™ pen, HUMALIN 70/30™ pen (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II and III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD™ pen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™, і OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Germany). До прикладів разових шприців-ручок, які можуть застосовуватися для підшкірного введення фармацевтичного складу даного винаходу, серед інших, стосуються шприц-ручка SOLOSTAR™ (sanofi-aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) і KWIKPEN™ (Eli Lilly). Фармацевтичні склади для перорального або парентерального введення, описані вище, переважно готувати в лікарських формах з разовою дозою, що підбирається відповідно до дозування активних інгредієнтів. До таких лікарських форм з разовою дозою стосуються, наприклад, таблетки, пілюлі, капсули, ін'єкції (ампули), супозиторії та ін. Кількість вказаного антитіла, що міститься в разовій дозі, звичайно складає від 0,1 до 800 мг на лікарську форму; особливо у вигляді ін'єкції переважно, щоб кількість вказаного антитіла складала приблизно від 1 до приблизно 500 мг, приблизно від 5 до приблизно 300 мг, приблизно від 8 до приблизно 200 мг і приблизно від 10 до приблизно 100 мг у випадку інших лікарських форм. Комбінована терапія У винаході також приводяться терапевтичні способи лікування захворювань або порушень, які безпосередньо або опосередковано пов'язані з hANGPTL3, за допомогою введення антитіла hANGPTL3 даного винаходу або його фрагмента в поєднанні одним або декількома терапевтичними агентами. Як додатковий терапевтичний агент може виступати один або декілька агентів, які з позитивним ефектом поєднуються з одним або декількома антитілами або фрагментами антитіла даного винаходу, включаючи інгібітори редуктази HMG-CoA, наприклад, церовастатин, аторвастатин, симвастатин, пітавастатин, розувастатин, флувастатин, ловастатин, правастатин і їм подібні; ніацин; різні фібрати, наприклад, фенофібрат, безафібрат, ципрофібрат, клофібрат, гемфіброзил і їм подібні; активатори фактора транскрипції LXR і їм подібні. Крім того, антитіло hANGPTL3 або фрагмент антитіла даного винаходу може вводитися одночасно з іншими інгібіторами ANGPTL3, а також інгібіторами інших молекул, такими як ANGPTL4, ANGPTL5, ANGPTL6 і пропротеїнконвертаза субтилізину/кексину типу 9 (PCSK9), які беруть участь в ліпідному метаболізмі, зокрема, в гомеостазі холестерину і/або тригліцериду. До інгібіторам цих молекул стосуються малі молекули і антитіла, які специфічно зв'язують ці молекули і блокують їх активність див., наприклад, антитіла анти-PCSK9, що розкривається в патенті U.S. 2010/0166768 A1). Крім того, додатковими терапевтичними агентами можуть бути один або декілька протиракових агентів, наприклад, препарати хіміотерапії, антиангіогенні препарати, препарати інгібітори росту, цитотоксичні препарати, агенти апоптозу і інші препарати, добре відомі фахівцям в галузі, що застосовуються для лікування рака або інших проліферативних захворювань або порушень. До прикладів протиракових агентів стосуються, серед інших, антимітотичний агент, наприклад, доцетаксел, паклітаксел і їм подібні; сполуки для хіміотерапії на основі платини, наприклад, цисплатин, карбоплатин, іпроплатин, оксаліплатин і їм подібні; або інший звичайний цитотоксичний агент, наприклад, 5-фторурацил, капецитабін, іринотекан, лейковорин, гемцитабін і їм подібні; антиангіогенні агенти, в тому числі антагоністи ендотеліального фактора росту судин (VEGF), такі як антитіла анти-VEGF, наприклад, бевацизумаб (AVASTIN®, Genentech) і блокатори VEGF на основі рецепторів, наприклад, 18 UA 114891 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 «пастка VEGF», описана в патенті США № 7,070,959, антагоністи дельта-подібного ліганду 4 (Dll4), наприклад, антитіла анти-Dll4, описані в патентній заявці США № 2008/0181899, і злитий білок, що містить позаклітинну домен Dll4, наприклад, Dll4-Fc, описаний в патентній заявці США № 2008/0107648; інгібітори рецепторних тирозинкіназ і/або ангіогенезу, в тому числі сорафеніб (NEXAVAR® ВИРОБНИЦТВА Bayer Pharmaceuticals Corp.), сунитиніб (SUTENT® ВИРОБНИЦТВА Pfizer), пазопаніб (VOTRIENT™ ВИРОБНИЦТВА GlaxoSmithKline), тоцераніб (PALLADIA™ виробництва Pfizer), вандетаніб (ZACTIMA™ виробництва AstraZeneca), цедираніб (RECENTIN® виробництва AstraZeneca), регорафеніб (BAY 73-4506 виробництва Bayer), акситиніб (AG013736 by Pfizer), лестауртиніб (CEP-701 by Cephalon), ерлотиніб (TARCEVA® виробництва Genentech), гефітиніб (IRESSA™ виробництва AstraZeneca), BIBW 2992 (TOVOK™ виробництва Boehringer Ingelheim), лапатиніб (TYKERB® виробництва GlaxoSmithKline), нератиніб (HKI-272 виробництва Wyeth/Pfizer) і їм подібні і фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні будь-якого з перерахованих вище агентів. Крім того, і інші терапевтичні агенти, наприклад, анальгетики, протизапальні препарати, в тому числі нестероїдні протизапальні препарати (НПЗП), такі як інгібітори Сох-2, і їм подібні, можуть також вводитися в поєднанні з антитілом hANGPTL3 даного винаходу або його фрагментом, так щоб пом'якшити і/або полегшити симптоми, супроводжуючі першопричинний рак/пухлину. Антитіло hANGPTL3 даного винаходу або його фрагмент і додатковий терапевтичний агент (агенти) можуть вводитися разом або окремо. При використанні роздільного дозування препаратів антитіло даного винаходу або його фрагмент і додаткові агенти можуть вводитися одночасно або окремо з розбиттям за часом, наприклад, послідовно, в потрібній черговості. Діагностичне використання антитіл Антитіла анти-ANGPTL3 даного винаходу можуть також використовуватися для виявлення і/або оцінки ANGPTL3 в пробі, наприклад, для цілей діагностики. Наприклад, анти-ANGPTL3 Ab або його фрагмент можуть використовуватися для діагностики розладу або захворювання, що характеризується аберантною експресією (тобто надекспресією, недостатньою експресією, відсутністю експресії та ін.) ANGPTL3. Приклади діагностичних аналізів на ANGPTL3 можуть включати, наприклад, взаємодію проби, взятої у пацієнта, з анти-ANGPTL3 Ab даного винаходу, де таке антитіло анти-ANGPTL3 мічено детектованою міткою або репортерною молекулою, або використовується для селективного захоплення і виділення білка ANGPTL3 з проб пацієнта. У альтернативному варіанті немічене анти-ANGPTL3 Ab може використовуватися в діагностиці в поєднанні з допоміжним антитілом, яке саме по собі несе детектовану мітку. Як детектована 3 14 32 мітка або репортерна молекула може виступати радіоактивний ізотоп, наприклад, H, C, P, 35 131 125 S, I або I; флуоресцентний або хемілюмінесцентний агент, наприклад, флуоресцеїнізотіоціанат або родамін; або фермент, наприклад, лужна фосфатаза, βгалактозидаза, пероксидаза з хріну або люцифераза. Серед методик аналізу, які можуть використовуватися для детектування або вимірювання ANGPTL3 в зразку, можна перерахувати твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA), радіоімуноаналіз (RIA), клітинне сортування з активацією флуоресценції (FACS) і їм подібні. ПРИКЛАДИ Приведені нижче приклади покликані дати рядовим фахівцям в галузі повну інформацію і опис того, як слід формулювати і використовувати способи і препарати даного винаходу, і не покликані обмежувати сферу охоплення того, що винахідники розглядають як предмет свого винаходу. Робилися спроби добитися точності відносно показників, що використовуються, але при цьому необхідно враховувати ряд експериментальних помилок і відхилень. Якщо не указано інакше, під молекулярною вагою розуміється усереднена молекулярна вага, температура приводиться в градусах Цельсія, а тиск знаходиться на рівні атмосферного або близько до цього рівня. Приклад 1. Отримання антитіл людини до ANGPTL3 людини Мишей VELOCIMMUNE™ імунізували ANGPTL3 людини, і імунну відповідь антитіл відстежували з допомогою антигенспецифічного імуноаналізу з використанням сироватки, взятою у таких мишей. В-клітини, експресуючі анти-hANGPTL3, взяті з селезінки імунізованих мишей, які демонстрували підвищені титри антитіл анти-hANGPTL3, зливали з клітинами мишачої мієломи з утворенням гібридом. Гибридоми проходили скринінг і селекцію для ідентифікації тих ліній кліток, які експресують hANGPTL3-специфічні антитіла, використовуючи аналізи, описані нижче. Аналізи дозволили ідентифікувати декілька клітинних ліній, які продукують химерні антитіла анти-hANGPTL3, наприклад, H1M896N. ANGPTL3-специфічні антитіла людини також виділяли напряму з антиген-імунізованих Вклітин без злиття з клітинами мієломи, як описано в патенті США 2007/0280945 A1. Варіабельні 19 UA 114891 C2 5 10 області важкого і легкого ланцюгів клонували, щоб отримати повністю людські антитіла антиhANGPTL3, що означаються як H4H1248P, H4H1250P, H4H1263S, H4H1268S, H4H1276S, H4H1279P, H4H1282P, H4H1292P, H4H1295P і H4H1296P. Були встановлені стабільні рекомбінантні клітинні лінії CHO, експресуючі такі антитіла. Приклад 2. Аналіз використання генів по варіабельних областях Для аналізу структури продукованих антитіл клонували і секвенували нуклеїнові кислоти, що кодують варіабельні області антитіл. На основі послідовності нуклеїнової кислоти і амінокислотній послідовності антитіл, що прогнозується для кожної варіабельної області важкого ланцюга (HCVR) і варіабельної області легкого ланцюга (LCVR) визначали міру використання генів. У таблиці 1 показано використання генів деяких антитіл відповідно до даного винаходу. Таблиця 1 Антитіло HCVR LCVR VH VK JK 3-30 3-30 3-30 1-26 1-7 3-10 6 6 6 1-12 1-5 1-12 3 1 3 H4H1268S H4H1276S H4H1279P H4H1282P H4H1292P H4H1295P 6-1 3-43 3-11 1-18 3-11 1-18 6-6 3-3 1-1 3-10 1-1 6-25 4 3 4 4 4 4 1-5 1-5 1-39 1-9 1-39 2-30 1 2 4 4 4 2 H4H1296P H1M896N 20 JH H4H1248P H4H1250P H4H1263S 15 DH 3-11 3-23 1-1 3-10 4 4 1-39 1-5 4 1 У таблиці 2 приведені пари амінокислотних послідовностей важкого і легкого ланцюга варіабельної області вибраних антитіл анти-hANGPTL3 і їх відповідні ідентифікатори антитіл. Позначення N, Р і S стосуються антитіл, що мають важкий і легкий ланцюги з ідентичними послідовностями CDR, але з варіаціями послідовностей в областях, які виходять за межі послідовностей CDR (наприклад, в остовних областях). Таким чином, варіанти N, Р і S того або іншого конкретного антитіла відрізняються ідентичними послідовностями CDR в своїх варіабельних областях важкого і легкого ланцюга, але містять модифікації всередині остовних областей. Таблиця 2 Назва H4H1248P H4H1250P H4H1263S H4H1268S H4H1276S H1M896N 25 30 HCVR/LCVR SEQ ID № 2/10 18/26 34/42 50/58 66/74 180/188 Назва H4H1279P H4H1282P H4H1292P H4H1295P H4H1296P HCVR/LCVR SEQ ID № 82/90 98/106 114/122 130/138 146/154 Приклад 3. Кінетичні параметри зв’язування антитіл анти-hANGPTL3 з ANGPTL3 Всі експерименти по кінетичному зв’язуванню проводили при 25°C або 37°C за допомогою приладу по дослідженню молекулярної взаємодії без використання мітки BIACORE™ T200 (GE Healthcare) з використанням сенсорного чіпу CM5. Коротко кажучи, поверхня для зв’язування антигена готували за допомогою ковалентного зв’язування антимишачого IgG-специфічного антитіла (анти-mFc; GE Healthcare; № по кат. BR-1008-38) або антипентагістидин-специфічного антитіла (Qiagen; № по кат. 34660) з поверхнею сенсорного чіпу CM5 з використанням стандартного методу амінного зв’язування. Використовуючи HBS-EP (10 мM HEPES, 150 мM 20 UA 114891 C2 5 10 15 20 25 30 NaCl, 3 мM EDTA, 0,05% ПАР P20, pH 7,4) або PBSP (10 мM фосфат натрію, 2,7 мM KCl, 137 мM NaCl, 0,025% ПАР P20, pH 7,2 або 5,75) як рухомий буфер, фіксували людські і видові варіанти ANGPTL3 з олігогістидиновими мітками на антипентагістидин-пов'язаній поверхні до досягнення фактора зв’язування 4,4- 46,5 RU. Серед рекомбінантних білків, що фіксуються: зрілий людський ANGPTL3 повної довжини (тобто амінокислотні залишки 17-460 послідовності SEQ ID №: 161) з С-термінальною декагістидиновою міткою [hANGPTL3(17-460)-His]; R&D Systems, штат Міннесота; № по кат. 3829- AN], N-термінальним суперспіральним доменом hANGPTL3 (тобто амінокислотні залишки 17-170 послідовності SEQ ID №: 161), що містять Стермінальну декагістидинову мітку [hANGPTL3(17-170)-His], N-термінальним суперспіральним доменом ANGPTL3 Macaca fascicularis [тобто амінокислотні залишки 17-170 послідовності SEQ ID №: 177 (часткова послідовність Macaca fascicularis ANGPTL3)], що містять myc-mycгексагістидинову мітку [MfANGPTL3(17-170)- mmH; SEQ ID №: 167], зрілий людський ANGPTL3 повної довжини Mus musculus (тобто амінокислотні залишки 17-455 послідовності SEQ ID №: 163) з С-термінальною декагістидиновою міткою [mANGPTL3(17-455)-His]; R&D Systems, штат Міннесота; № по кат. 136- AN], N-термінальним суперспіральним доменом ANGPTL3 Mus musculus (тобто амінокислотні залишки 17-240 послідовності SEQ ID №: 163), що містить гексагістидинову мітку [mANGPTL3(17-240)-His]; SEQ ID №: 166], а також N-термінальний суперспіральний домен ANGPTL3 Rattus norvegicus (тобто амінокислотні залишки 17-240 послідовності SEQ ID №: 175), що містить myc-myc-гексагістидинову мітку [кANGPTL3(17-240)mmH; SEQ ID №: 176]. Крім того, N-термінальний суперспіральний домен hANGPTL3 (тобто амінокислотні залишки 17-169 послідовності SEQ ID №: 161), що містить С-термінальний мишачий злитий Fc [hANGPTL3(17-169)-mFc; SEQ ID №: 165] фіксували на поверхні, пов'язаній з анти-mFc, до досягнення фактора зв’язування 24,8 ± 1.5 RU. Для вимірювання швидкостей зв’язування і дисоціації при утворенні комплексу антитіло/антиген використовували одну (таблиці 3 і 7) або декілька (таблиці 4-6) концентрацій антитіла, що наносяться на поверхню фіксованого білка зі швидкістю 50 мкл/хв протягом 3 хвилин, і дисоціацію комплексу відстежували протягом 20 хвилин. Дані зв’язування обробляли і підганяли по моделі зв’язування 1:1 з масоперенесенням з використанням ПО Scrubber версія 2.0 а (BioLogic Software). Кінетичний період напіврозпад комплексу (t1/2) розраховували по константі швидкості дисоціації, kd. У таблиці 3 приводяться параметри зв’язування різних антитіл анти-ANGPTL3 з hANGPTL3 при 25°C, pH 7,4 в буфері HBS-EP. Таблиця 3 Клони Ab -1 -1 -1 Білок ka (M сек ) kd (сек ) KD (nM) t½ (хв) hANGPTL3(17-169)-mFc 4,57E+05 2,72E-03 5,95 4 hANGPTL3(17-460)-His 4,40E+05 2,47E-03 5,62 5 hANGPTL3(17-169)-mFc 1,25E+06 6,51E-04 0,519 18 hANGPTL3(17-460)-His 9,04E+05 6,57E-04 0,726 18 hANGPTL3(17-169)-mFc 6,77E+05 4,22E-03 6,23 3 hANGPTL3(17-460)-His 5,08E+05 1,26E-03 2,47 9 hANGPTL3(17-169)-mFc 1,16E+06 8,35E-04 0,721 14 hANGPTL3(17-460)-His 1,29E+06 1,89E-03 1,47 6 hANGPTL3(17-169)-mFc 5,82E+05 3,83E-04 0,659 30 hANGPTL3(17-460)-His 3,44E+05 4,64E-04 1,35 25 hANGPTL3(17-169)-mFc 6,58E+05 5,53E-06 0,00841 2088 hANGPTL3(17-460)-His 2,88E+05 1,14E-04 0,394 102 H4H1248P H4H1250P H4H1263S H4H1268S H4H1276S H4H1279P 21 UA 114891 C2 hANGPTL3(17-169)-mFc 1,28E+06 5,92E-05 0,0463 195 hANGPTL3(17-460)-His 9,57E+05 9,26E-05 0,0968 125 hANGPTL3(17-169)-mFc 6,86E+05 1,77E-04 0,257 65 hANGPTL3(17-460)-His 3,41E+05 2,48E-04 0,727 47 hANGPTL3(17-169)-mFc 3,52E+05 7,95E-05 0,226 145 hANGPTL3(17-460)-His 3,73E+05 7,35E-05 0,197 157 hANGPTL3(17-169)-mFc 6,41E+05 3,92E-05 0,0611 295 hANGPTL3(17-460)-His 3,01E+05 4,12E-05 0,137 280 H4H1282P H4H1292P H4H1295P H4H1296P 5 10 Як показано в таблиці 3, антитіла анти-hANGPLT3 зв'язувалися з повним білком з Стермінальною декагістидиновою міткою [hANGPTL3(17-460)-His] з розрахованими рівноважними константами дисоціації (KD = kd/ka) від 96,8 пM до 5,62 нM і з N-термінальним суперспіральним доменом з С-термінальним злитим білком Fc [hANGPTL3(17-169)-mFc] з KDs в інтервалі від 8,41 пM до 6,23 нM. У таблицях 4 і 5 представлені дані про міжвидове зв’язування H4H1276S до ANGPTL3 при 25°C і 37°C, відповідно, при pH 7,4, в буфері HBS-EP. У таблиці 6 приводяться параметри зв’язування H4H1276S з ANGPTL3 людини і яванської макаки, при 25°C або 37°C, при pH 5,75 або pH 7,2, в буфері PBSP. Таблиця 4 o Клон Ab Білок H4H1276S hANGPTL3(17-170)-His hANGPTL3(17-460)-His MfANGPTL3(17-170)-mmH mANGPTL3(17-240)-His mANGPTL3(17-455)-His rANGPTL3(17-240)-mmH -1 -1 ka (M сек ) 9,73E+05 5,88E+05 1,35E+06 6,70E+05 1,29E+06 1,35E+06 25 C -1 kd (сек ) 9,12E-04 2,89E-04 5,35E-04 3,07E-04 3,46E-04 7,18E-04 KD (nM) 0,938 0,491 0,396 0,458 0,268 0,530 t½ (хв) 12,7 40,0 21,6 37,6 33,4 16,1 Таблиця 5 o Клон Ab Білок H4H1276S hANGPTL3(17-170)-His hANGPTL3(17-460)-His MfANGPTL3(17-170)-mmH mANGPTL3(17-240)-His mANGPTL3(17-455)-His rANGPTL3(17-240)-mmH -1 -1 ka (M сек ) 1,59E+06 6,32E+05 1,87E+06 8,19E+05 1,94E+06 2,05E+06 22 37 C -1 kd (сек ) 2,41E-03 8,12E-04 1,17E-03 9,64E-04 7,91E-04 1,93E-03 KD (nM) 1,52 1,29 0,625 1,18 0,408 0,940 t½ (хв) 4,8 14,2 9,9 12,0 14,6 6,0 UA 114891 C2 Таблиця 6 Клон Ab H4H1276S pH 7.2 o 25 C H4H1276S pH 5.75 o 25 C H4H1276S pH 7.2 o 37 C H4H1276S pH 5.75 o 37 C 5 Білок hANGPTL3(17-170)-His hANGPTL3(17-460)-His MfANGPTL3(17-170)-mmH hANGPTL3(17-170)-His hANGPTL3(17-460)-His MfANGPTL3(17-170)-mmH hANGPTL3(17-170)-His hANGPTL3(17-460)-His MfANGPTL3(17-170)-mmH hANGPTL3(17-170)-His hANGPTL3(17-460)-His MfANGPTL3(17-170)-mmH -1 -1 ka (M сек ) 1,00E+06 5,99E+05 1,45E+06 2,80E+05 7,32E+04 2,06E+05 1,57E+06 6,67E+05 1,94E+06 1,22E+06 4,71E+04 2,78E+05 -1 kd (сек ) 1,10E-03 4,02E-04 5,38E-04 6,72E-03 4,94E-03 4,32E-03 2,73E-03 1,18E-03 1,36E-03 3,24E-02 1,07E-02 5,21E-03 KD (nM) 1,09 0,670 0,370 24,0 67,5 21,0 1,74 1,76 0,700 26,7 227 18,8 t½ (хв) 10,5 28,8 21,5 1,7 2,3 2,7 4,2 9,8 8,5 0,4 1,1 2,2 Як показано в таблицях 4-6, антитіло демонструвало H4H1276S зв’язування з ANGPTL3 мавпи, миші і щура з афінністю зв’язування і кінетичними константами, близькими до зв’язування з людським ANGPTL3. У таблиці 7 приводяться параметри зв’язування деяких антитіл анти-ANGPTL3 з hANGPTL3 при 37°C, pH 7,4 в буфері HBS-EP. НС: не пов'язано. Таблиця 7 Клони Ab H1M896N H4H1248P H4H1250P H4H1263S H4H1279P H4H1292P 10 15 20 25 Білок hANGPTL3(17-460)-His mANGPTL3(17-455)-His hANGPTL3(17-460)-His mANGPTL3(17-455)-His hANGPTL3(17-460)-His mANGPTL3(17-455)-His hANGPTL3(17-460)-His mANGPTL3(17-455)-His hANGPTL3(17-460)-His mANGPTL3(17-455)-His hANGPTL3(17-460)-His mANGPTL3(17-455)-His -1 -1 ka (M сек ) 3,36E+06 3,62E+06 1,96E+06 НС 3,50E+06 3,18E+06 4,74E+06 НС 4,74E+06 2,15E+06 1,89E+06 3,92E+06 -1 kd (сек ) 5,30E-04 2,47E-03 1,93E-03 НС 1,13E-03 1,55E-03 1,81E-03 НС 1,81E-03 3,59E-04 1,94E-03 1,49E-03 KD (nM) 1,58E-10 6,82E-10 9,86E-10 НС 3,24E-10 4,86E-10 3,81E-10 НС 3,81E-10 1,67E-10 1,02E-09 3,80E-10 t½ (хв) 22 5 6 НС 10 7 6 НС 6 32 6 8 Як показано в таблиці 7, антитіла анти-hANGPLT3 зв'язувалися з повним білком з Стермінальною декагістидиновою міткою [hANGPTL3(17-460)-His] при рН 7,4 і 37°C з розрахунковими рівноважними константами дисоціації (KD = kd/ka) від 158 пM до 1,02 нM і з мишачим ANGPTL3 [mANGPTL3(17-455)-His] з KDs в інтервалі від 167 пM до 682 пM, крім H4H1248P і H4H1263S, які не виявляли помітного зв’язування з mANGPTL3. Також приводяться значення кінетичних періодів напіврозпад (t1/2). Приклад 4. Перехресний конкурентний аналіз антитіл анти-ANGPTL3 за допомогою Biacore Експерименти по перехресному конкурентному аналізу проводили при 25°C на Biacore в основному так само, як описано вище в прикладі 3. Коротко кажучи, використовуючи HBS-EP як рухомий буфер, hANGPTL3 повної довжини (тобто амінокислотні залишки 17-460 послідовності SEQ ID №: 161) з С-термінальною декагістидиновою міткою [hANGPTL3(17-460)-His]; R&D Systems, штат Міннесота; № по кат. 3829- AN] фіксували на поверхні з антипентагістидином до фактора зв’язування 64 RU. Щоб встановити, чи здатні два антитіла одночасно зв'язуватися з фіксованим ANGPTL3, послідовно вносили пари антитіл в концентрації 167 нM, кожне зі швидкістю 4 мкл/хв протягом 15 хвилин на поверхню, і для кожного зв’язування вимірювали максимальний сигнал фактора зв’язування (RU). Результати приводяться в таблиці 8, спочатку вказаний фактор зв’язування для першого антитіла (mAb1), потім йде фактор зв’язування для другого антитіла (mAb2) на поверхні ANGPTL3, попередньо насиченій першим антитілом. Значення напівжирним шрифтом вказують, що пари антитіл можуть зв'язуватися з hANGPTL3 одночасно. Значення курсивом вказують, що пари антитіл здатні зв'язуватися з hANGPTL3 23 UA 114891 C2 одночасно при послідовному додаванні в одному порядку, але не в протилежному. Дужки означають самоконкуренцію. Таблиця 8 Клони Ab H1M896N H4H1250P H4H1279P H4H1292P Негативний контроль 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Фіксація hANGPTL3(17460)-His (RU) 64 ± 4 Фактор зв’язування 25 мкг/мл mAb1 (RU) 171 ± 1,8 210 ± 8,3 45 ± 1,8 48 ± 0,7 H1M896N [-4] -4 186 182 H4H1250P -4 [13] 213 220 H4H1279P 47 9 [-3] -3 H4H1292P 50 8 -1 [-2] 81 ± 1,8 149 187 47 48 Фактор зв’язування 25 мкг/мл mAb2 (RU) Як показано в таблиці 8, пари антитіл H1M896N/H4H1279P і H1M896N/H4H1292P здатні одночасно зв'язуватися з іммобілізованим ANGPTL3 незалежно від порядку додавання антитіл. H4H1250P зв'язувалося з ANGPTL3, попереднього зв'язаним з H4H1279P; однак якщо порядок додавання антитіл змінювався на протилежний, H4H1279P демонструвало сигнал зв’язування, який становив приблизно 24% від очікуваного максимального фактора після попереднього зв’язування ANGPTL3 з H4H1250P. Точно так само, H4H1250P зв'язувалося з ANGPTL3, попереднього зв'язаним з H4H1292P; однак якщо порядок додавання антитіл змінювався на протилежний, H4H1292P демонструвало сигнал зв’язування, який становив приблизно 20% від очікуваного максимального фактора після попереднього зв’язування ANGPTL3 з H4H1250P. Приклад 5. Зв’язування антитіла анти-hANGPTL3 з N-термінальними суперспіральними пептидами ANGPTL3 Для оцінки зв’язування анти-ANGPTL3 антитіла H4H1276S з пептидами, отриманими з Nтермінальної суперспіральної області ANGPTL3 проводили біосенсорний аналіз зв’язування ® без мітки з використанням системи OCTET RED (ForteBio, Inc.). Для іммобілізації на сенсорі пептиди позначали N-термінальною біотиновою міткою [відділеною гнучким лінкером з амінокислот «AGSSPGG» (SEQ ID №: 171), для пептиду 1 і пептиду 2; а також амінокислотами «GGGGS» (SEQ ID №: 172) для пептиду 3], або С-термінальною біотиновою міткою [відділеною гнучким лінкер з амінокислот «GPSSGAPPPK» (SEQ ID №: 173), для пептиду 1 і пептиду 2; а також амінокислотами «GGGGSK» (SEQ ID №: 174) для пептиду 3]. Аналізували наступні пептидні послідовності: пептид негативного контролю, N-термінальний пептид 1 з біотиновою міткою (SEQ ID №: 168; залишки з Arg34 до Leu66 людського ANTGPTL4 з SEQ ID №: 164], і пептиди, отримані з N-термінального суперспірального домена ANGPTL3, тобто Nтермінальний пептид 2 з біотиновою міткою (SEQ ID №: 169; залишки з Arg34 до Leu66 hANTGPTL4 з SEQ ID №: 161); С-термінальний пептид 2 з біотиновою міткою; N-термінальний пептид 3 з біотиновою міткою (SEQ ID №: 170; відповідає залишкам з Glu32 по Leu57 hANTGPTL3 з SEQ ID №: 161); і С-термінальний пептид 3 з біотиновою міткою. Пептидні послідовності також приводяться на фіг. 1. Покриті стрептавідином кінчики біосенсорів покривали біотинілованими пептидами, при цьому залежно від пептиду реєструвалося зв’язування на рівні 1,22-2,26 нМ. Покриті пептидами кінчики біосенсорів потім занурювали в ямку, що містить 1 мкм або анти-ANGPTL3 антитіла H4H1276S, або відповідну по ізотипу антитіло негативного контролю, і протягом 2,5 хвилин відстежували зв’язування. Параметри зв’язування H4H1276S і ізотипного контрольного антитіла з кожним з пептидів приводяться на фіг. 2. Було встановлено, що H4H1276S зв'язується з лінійною послідовністю ANGPTL3, що визначається пептидом 2, але з послідовністю що не перекривається, але відрізняється, що визначається пептидом 3 (див. також фіг. 1). Ізотипне контрольне антитіло також служило позитивним контролем для насичення біосенсора пептидом 1 (тобто пептидом hANGPTL4), оскільки таке ізотипне контрольне антитіло специфічно розпізнає hANGPTL4. Як показано на фіг. 2, зв’язування контрольного антитіла з пептидом 1 підтвердило, що пептид 1 нарівні з іншими пептидами був присутнім на поверхні сенсора. Приклад 6. Інгібування hANGPTL3 антитілами анти-hANGPTL3 в біопробах LPL Ліпопротеїнліпаза (LPL) грає важливу роль в метаболізмі ліпідів в організмі людини. LPLкаталізує гідроліз тригліцеридів і вивільняє жирні кислоти, які піддаються метаболізму. ANGPTL3 інгібує активність LPL, створюючи підвищений рівень ліпідів (див. Oike et al., 2005, 24 UA 114891 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Trends in Molecular Medicine 11(10):473-479). N-термінальна суперспіральна область ANGPTL3 інгібує LPL при експресуванні без С-термінальної фібриногенової області, а тому, мабуть, передає свої інгібуючі функції. Був розроблений спосіб біопроб без застосування клітин, щоб визначити здатність антитіл анти-ANGPTL3 інгібувати ANGPTL3-індуковане зниження активності LPL. Інгібування активності hANGPTL3 антитілами анти-ANGPTL3 реєстрували за допомогою стаціонарного флуоресцентного тесту ліпази CONFLUOLIP™ (Progen, Німеччина) з використанням трьох білків hANGPTL3: зрілий hANGPTL3 повної довжини (тобто амінокислотні залишки 17-460 послідовності SEQ ID №: 161) з С-термінальною декагістидиновою міткою [hANGPTL3(17-460)-His]; R&D Systems, штат Міннесота; № по кат. 3829- AN], N-термінальним суперспіральним доменом (тобто амінокислотні залишки 17-169 послідовності SEQ ID №: 161), що містить С-термінальний мишачий злитої Fc [hANGPTL3(17-169)-mFc]; SEQ ID №: 165], і Nтермінальний суперспіральний домен hANGPTL3 (тобто амінокислотні залишки 17-170 послідовності SEQ ID №: 161), що містить С-термінальну гексагістидинову мітку [hANGPTL3(17170)-His]. Коротко кажучи, попередньо змішували бичачу LPL (кінцева концентрація 2 нM), ApoCII людини (кофактор LPL, кінцева концентрація 0,23 мкM) і BSA (кінцева концентрація 2 мг/мл) в PBS. Рекомбінантні білки hANGPTL3 додавали до суміші Apo/LPL (кінцеві концентрації 80-100 нM). Суміші Apo/LPL/білка ANGPTL3 потім змішували з послідовно розбавленими антитілами анти-hANGPTL3 і інкубували при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Після інкубування 100 мкл знову розчиненого субстрат ліпази 1-тринітрофеніламінододеканоїл-2-пірендеканоїл-30-гексадецил-sn-гліцерин (LS-A, Progen) додавали до 25 мкл суміші антитіла в 96-ямковий аналітичний планшет і інкубували при 37°С протягом двох годин. Потім вимірювали інтенсивність флуоресценції на 342 нм/400 нм (збудження/випускання) за допомогою зчитувача ® мікропланшет FLEXSTATION 3 (MOLECULAR Devices, штат Каліфорнія). Інтенсивність флуоресценції прямо пропорційна активності LPL. Антитіло H4H1276S виявляло здатність пригнічувати інгібуючу активність hANGPTL3 відносно LPL. Повний аналіз залежності доза-ефект з використанням білка hANGPTL3 в аналізі LPL спочатку проводили, щоб визначити EC50 ANGPTL3 в кожному експерименті, а потім визначали IC50 для антитіла з використанням постійних концентрацій білка ANGPTL3, як показано в таблиці 8. Концентрації антитіла, необхідні для 50% максимального інгібування (IC50), виявилися рівними 9,6 нM для 80 нM hANGPTL3(17-460)-His, 2,9 нM для 100 нM hANGPTL3(17-170)-His і 21 нM для 80 нM hANGPTL3(17-169)-mFc, відповідно. Концентрації антитіла при тестуванні людських білків ANGPTL3 знаходилися в інтервалі від 0 до 300 нМ. Точно так само, тестували H4H1276S в біопробі LPL на його здатність інгібувати міжвидові ортологи: N-термінальний домен яванської макаки (амінокислотні залишки 17-170 послідовності SEQ ID №: 177), експресований з С-термінальної myc-myc-гексагістидинової мітки [MfANGPTL3(17-170)-mmH; SEQ ID №: 167], N-термінальний домен мишачого ортолога з амінокислотними залишками 17-240 з SEQ ID №: 163, що містить С-термінальну гексагістидинову мітку [mANGPTL3(17-240)-His]; SEQ ID №: 166], зрілий ANGPTL3 повної довжини Mus musculus (тобто амінокислотні залишки 17-455 послідовності SEQ ID №: 163), що містить С-термінальну гексагістидинову мітку [mANGPTL3(17-455)-His]; R&D Systems, штат Міннесота; № кат.136-AN]. IC50 виявилися рівними 10 нМ для 500 нМ постійної концентрації MfANGPTL3(17-170)-mmH, 14 нМ для 80 нМ постійної концентрації mANGPTL3(17-455)-His, а також 31 нМ для 500 нМ постійної концентрації mANGPTL3(17-240)-His. Концентрації антитіла при тестуванні білків мавпи і миші ANGPTL3 знаходилися в інтервалі від 0 до 600 нМ. Результати приводяться в табл. 9. Було також показано, що антитіла до N-термінальної області гомологічного білка ANGPTL4 блокують інгібуючу функцію ANGPTL4 відносно LPL (Lee et al., 2009, J. Biol. Chem. 284:1373513745). Тому для оцінки можливої перехресної реактивності до ANGPTL4 інгібуюче антиANGPTL3 антитіло H4H1276S також тестували проти людського ANGPTL4 в аналізі LPL ліпази, який проводили так само, як описано вище для білків ANGPTL3. Рекомбінантна форма суперспірального домена людської ANGPTL4 (залишки 26-148 of SEQ ID №: 164), що містить Стермінальний мишачий злитої IgG2a Fc [hANGPTL3(26-148)-mFc; SEQ ID №: 178] демонстрував EC50 в пробі LPL 0,2 нM (таблиця 9). H4H1276S, тестований в діапазоні концентрацій 0 - 600 нM, не блокував таке інгібування (НС: не пов'язано; в таблиці 9). 25 UA 114891 C2 Таблиця 9 EC50 (nM) Константне ANGPTL3 або 4 (nM) H4H IC50 1276S (nM) IgG4 cont. 5 10 15 20 25 ANGPTL3 (17-460)His людини 50 ANGPTL3 (17-170)His людини 91 ANGPTL3 (17-169)mFc людини 16 ANGPTL3 (17-170)mmH мавпи 625 ANGPTL3 (17-455)His миші ANGPTL3 (17-240)His миші 33 199 ANGPTL4 (26-148)mFc людини 0,2 80 100 80 500 80 500 2 9,6 2,9 21 10 14 31 НС НС НС НС НС НС НС НС Як показано вище, H4H1276S інгібувало активність людського ANGPTL3 (повна послідовність і N-термінальний домен), ANGPTL3 мавпи (N-термінальний домен) і мишачого ANGPTL3 (повна послідовність і N-термінальний домен) в порівнянній мірі в діапазоні IC50 приблизно 3-31 нM. Субпопуляцію антитіл також тестували, щоб визначити, чи здатне поєднання двох неблокуючих ANGPTL3 антитіл, що додаються одночасно, заблокувати інгібуючу LPL активність ANGPTL3. Пари антитіл тестували на інгібування N-термінальних доменів людського і мишачого ANGPTL3, тобто hANGPTL3(17-169)-mFc і mANGPTL3(17-240)-His, відповідно. У цьому аналізі білки ANGPTL3 демонстрували значення IC 50 при блокуванні LPL, що дорівнює 47 нM [для hANGPTL3(17-169)-mFc] і 341 нМ [для mANGPTL3(17-240)-His]. Перераховані нижче пари при доданні в кінцевій концентрації не менше ніж 200 нМ для кожного антитіла не блокували інгібування LPL як hANGPTL3(17-169)-mFc при 80 нМ, так і mANGPTL3(17-240)-His при 500 нМ: H1M896N + H4H1279P; H4H1250P + H4H1279P; H4H1248P + H4H1292P і H4H1263S + H4H1292P. У тому ж тесті один тільки H4H1276S блокував ті ж самі постійні концентрації людського і мишачого ANGPTL3 з IC50 на рівні 33 нМ і 64 нМ, відповідно. Приклад 7.1. Вплив антитіла анти-ANGPTL3 in vivo на рівні ліпідів в сироватці Ефект впливу анти-hANGPTL3 антитіла H4H1726S на рівні ліпідів в сироватці вивчали на мишах C57Bl/6. У мишей брали кров за 7 днів до експерименту, і для кожної тестованої дози антитіла їх розділяли на групи по шість мишей в кожній. Антитіла вводили в дозі 5 мг/кг (H4H1726S) і 10 мг/кг [H4H1726S і відповідний по ізотипу контроль hIgG4(S108P) без певної специфічності] за допомогою підшкірної ін'єкції на день 0 дослідження. У мишей брали кров через 4 години після голодування в дні 1, 4, 7 і 12 після ін'єкції антитіла і визначали рівні ліпідів в сироватці (тригліцериди, загальний холестерин, холестерин без ЛВГ, ЛНГ холестерин і ЛВГ ® холестерин) за допомогою системи ADVIA 1800 Chemistry System (Siemens). Для кожної точки за часом і кожного антитіла розраховували середні значення. Результати, представлені в формі (середнє ± стандартна похибка середнього) для концентрації ліпідів в сироватці, приводяться в таблицях 10-14. 30 Таблиця 10 Днів після ін’єкції -7 1 4 7 12 Сироватковий тригліцерид (мг/дл) Контрольний Ab H4H1276S H4H1276S (10 мг/кг) (5 мг/кг) (10 мг/кг) Середнє Станд. похибка Середнє Станд. похибка Середнє Станд. похибка середнього середнього середнього 87,83 6,18 89,83 3,65 87,17 5,062 123,16 7,02 68,00 2,84 53,83 2,52 99,66 10,15 62,16 5,82 50,67 3,51 99,83 4,57 55,83 4,95 39,67 2,55 82,00 5,75 76,83 10,56 53,00 6,51 26 UA 114891 C2 Таблиця 11 Днів після ін’єкції -7 1 4 7 12 Контрольний Ab (10 мг/кг) Середнє Станд. похибка середнього 82,50 2,11 87,83 1,87 75,00 2,58 83,50 1,77 87,83 1,82 Загальний холестерин (мг/дл) H4H1276S H4H1276S (5 мг/кг) (10 мг/кг) Середнє Станд. похибка Середнє Станд. похибка середнього середнього 80,33 1,15 81,33 2,14 71,50 5,48 63,67 3,38 59,50 3,51 51,00 2,98 67,00 1,79 61,33 2,33 83,00 4,30 69,33 3,22 Таблиця 12 Днів після ін’єції -7 1 4 7 12 Контрольний Ab (10 мг/кг) Середнє Станд. похибка середнього 41,18 0,75 42,18 0,55 36,40 1,04 40,82 0,75 41,72 0,87 Холестерин без ЛВГ (мг/дл) H4H1276S H4H1276S (5 мг/кг) (10 мг/кг) Середнє Станд. похибка Середнє Станд. похибка середнього середнього 38,78 0,81 40,23 1,18 35,75 3,05 32,70 1,94 29,63 2,16 27,55 1,78 34,67 1,83 32,02 1,68 39,85 2,21 35,13 1,47 Таблиця 13 Днів після ін’єції -7 1 4 7 12 Контрольний Ab (10 мг/кг) Середнє Станд. похибка середнього 4,68 0,35 5,40 0,41 4,80 0,45 5,38 0,46 5,67 0,59 ЛНГ холестерин (мг/дл) H4H1276S (5 мг/кг) Середнє Станд. похибка середнього 4,40 0,34 5,20 0,79 4,88 0,67 5,83 0,48 6,12 0,65 H4H1276S (10 мг/кг) Середнє Станд. похибка середнього 4,47 0,21 5,33 0,71 5,33 0,73 6,40 0,67 5,35 0,48 Таблиця 14 Днів після ін’єції -7 1 4 7 12 Контрольний Ab (10 мг/кг) Середнє Станд. похибка середнього 41,32 1,57 45,65 1,85 38,60 2,26 42,68 1,81 46,12 1,94 ЛВГ холестерин (мг/дл) H4H1276S (5 мг/кг) Середнє Станд. похибка середнього 41,55 0,90 35,75 2,54 29,87 1,62 32,33 1,25 43,15 2,52 H4H1276S (10 мг/кг) Середнє Станд. похибка середнього 41,10 1,37 30,97 2,13 23,45 1,66 29,32 1,72 34,20 1,99 5 10 Рівні H4H1726S в кровообігу (Ab сироватки) також визначали за допомогою стандартного аналізу ELISA. Коротко кажучи, планшети покривали антилюдським антитілом Fc кози (SigmaAldrich) для фіксації Ab сироватки. Потім до планшетів додавали сироватку і фіксоване людське антитіло реєстрували по хемілюмінесценції за допомогою кон’югованих з пероксидазою з хріну (HRP) антилюдських антитіл IgG кози (Sigma-Aldrich). Результати, представлені в формі (середнє ± стандартна похибка середнього), приводяться в таблиці 15. Контроль: миші, що 27 UA 114891 C2 отримували контрольне Ab відповідного ізотипу. Таблиця 15 Днів після ін’єції 1 4 7 12 5 10 15 20 Контрольний Ab (10 мг/кг) Середнє Станд. похибка середнього 65,00 59,16 58,23 41,35 8,05 4,94 6,02 9,76 Ab сироватки (мкг/мл) H4H1276S (5 мг/кг) Середнє Станд. похибка серед-нього 36,38 7,57 29,91 4,32 30,86 5,11 5,48 1,79 H4H1276S (10 мг/кг) Середнє 126,23 86,28 54,24 39,04 Станд. похибка серед-нього 9,96 6,77 8,96 7,08 Разове введення H4H1276S мишам C57Bl/6 в дозі 10 мг/кг привело до ~60% зниження рівня тригліцеридів через 7 днів після введення антитіла (в порівнянні з фзотипним контролем). Введення H4H1276S також спричинило значне зниження загального холестерину, холестерину без ЛВГ і ЛВГ холестерину, але не надало ніякого впливу на ЛНГ холестерин. Спостерігалося також зниження рівня ліпідів, але менш виражене, при рівні дози 5 мг/кг в порівнянні з 10 мг/кг; наприклад, рівень тригліцеридів в сироватці знизився на 44% (в порівнянні з ізотипним контролем) через 7 днів після введення антитіла. Приклад 7.2. Вплив антитіл анти-ANGPTL3 in vivo на рівні ліпідів в сироватці Ефект впливу анти-hANGPTL3 антитіл H4H1726S компараторного антитіла 4.9.1 на рівні ліпідів в сироватці вивчали на мишах C57Bl/6. Антитіло 4.9.1 готували на основі амінокислотних послідовностей SEQ ID №: 24 (VH) і SEQID No: 32 (VL), які розкриваються в опублікованій патентній заявці США № 2008/0177045 і являють собою ізотип мишачого IgG1. У мишей брали кров за 7 днів до експерименту і розділяли на групи по шість мишей в кожній. Антитіла H4H1276S, 4.9.1 і відповідний по ізотипу контроль (людський IgG4 і мишачий IgG1, відповідно) без певної специфічності вводили в дозі 10 мг/кг за допомогою підшкірної ін'єкції на день 0 дослідження. У мишей брали кров через 4 години після голодування в дні 1, 7, 11 і 20 після ін'єкції антитіл і визначали рівні ліпідів в сироватці (тригліцериди, загальний холестерин, ® холестерин без ЛВГ, ЛНГ холестерин і ЛВГ холестерин) за допомогою системи ADVIA 1800 Chemistry System (Siemens). Для кожної точки за часом і кожного антитіла розраховували середні значення. Результати, представлені в формі (середнє ± стандартна похибка середнього) для концентрації ліпідів в сироватці, приводяться в таблицях 16-20. 25 Таблиця 16 Днів після ін’єції -7 1 7 11 20 Контроль (IgG4) Середнє Станд. Похибка середнього 109,16 9,05 81,67 6,76 95,67 5,42 100,83 6,20 82,17 4,36 Сироватковий тригліцерид (мг/дл) H4H1276S Контроль (IgG1) Середнє Станд. Середнє Станд. Похибка похибка середнього середнього 109,16 6,44 112,80 6,87 46,00 3,59 95,20 8,92 49,67 3,86 101,80 7,55 51,00 5,89 117,00 6,00 72,67 3,47 79,40 6,59 Середнє 109,17 41,83 96,00 92,00 73,83 4.9.1 Станд. Похибка середнього 7,24 2,42 3,70 4,50 5,03 Таблиця 17 Днів після ін’єції -7 1 7 11 20 Контроль (IgG4) Середнє Станд. Похибка середнього 80,81 0,95 82,82 2,11 79,20 1,81 89,97 3,18 92,43 1,10 Загальний холестерин (мг/дл) H4H1276S Контроль (IgG1) Середнє Станд. Середнє Станд. Похибка похибка середнього середнього 80,92 3,05 80,32 2,84 67,33 3,60 82,98 2,17 63,58 3,98 85,02 7,27 69,02 2,11 83,92 2,49 80,17 3,20 87,47 2,58 28 Середнє 79,37 71,35 82,07 84,58 88,40 4.9.1 Станд. похибка середнього 2,76 1,82 4,36 1,08 2,84