Плазмідний експресуючий вектор рkсоrе 102delta, маючий послідовність днк, відповідаючу за експресію в бактеріях е.coli гібридного злитного білка pkcore вірусу гепатиту с

Винахід відноситься до розділу молекулярної біології, генної інженерії і може бути використаний при біотехнологічному синтезі білка pCore вірусу гепатиту C і в медицині, для конструювання тестсистем, придатних для виявлення антитіл до вірусу гепатиту C в сироватках крові пацієнтів. Прототипами винаходу є сімейство бактеріальних експресійних векторів типу рЕХ1-3 (Keith К Stanley and Paul Lusio, Construction of a new family of high efficienty bacterial expression vectors: Identification of cDNA clones for human liver proteins // EMBO Journal, vol.3, №6, p.1429 - 1434). Ці вектори походять від crolacZ злитних плазмід, які експресують велику кількість злитних білків під контролем Pr промотору фагу лямбда. В основу винаходу покладене завдання створити генно-інженерну конструкцію, яка забезпечить мікробіологічний синтез в E. coli элитного білка pCore вірусу гепатиту C. Суть винаходу полягає в одержанні модифікованої послідовності плазмідної ДНК, відповідаючої за синтез элитного білка pCore вірусу гепатиту C. Для цього була створена рекомбінантна плазміда pKCore 102 D яка містить наступні інсерційні фрагменти ДНК: фрагмент гену Cro, розміром 51п.о, фрагмент Lac I, розміром 114п.о., фрагмент Lac Z, розміром 1050п.о. і фрагмент ДНК, відповідаючий послідовностям білку Core вірусу гепатиту C, розміром 1314п.о. Одержаною модифікованою плазмідою трансформували клітини E. coli. Peкомбінантні клони E. coli нарощували і тестували методом імуноблотінгу, використовуючи сироватки крові людини, які утримували антитіла до структурних білків вірусу гепатиту C. Подальша модифікація плазміди складалась в одержанні делеції розміром 624п.о. в області бета-галактозідазного гена рестріктазою Hpa-1. Фізична карта одержаного плазмідного вектора приведена в додатку 1. Плазміда pKcore 102 D кодує гібридний білок молекулярною масою 49,6кД (437 амінокислот). Штам - продуцент гібридного білка (ITG-102) одержували трансформацією клітин E. coli Y1090 плазмідою pKCore 102. Клітини-продуценти ростуть добре на простих поживних середовищах при температурах 32 42°C. При рості на м'ясо-пептонному поживному агарі формують гладкі, круглі, плоскі, сірі, блискучі колонії з рівними краями. При рості на рідких поживних середовищах утворюють інтенсивну муть. Джерелом вуглеводів для клітин є вуглеводи, спирти, органічні кислоти. Клітини не споживають ацетат, аданіт, лактозу, ксилозу. Джерелом азоту з'являються пептон, амінокислоти і мінеральні солі в амонійній і нітратній формах. Клітини ростуть при pH 6,0 - 8,0, Синтез гібридного білка відбувається при вирощуванні культури E. coli ITG-102 при температурі 32 - 42°C. В оптимальних умовах ферментації рекомбінантного штама гібридний білок нагромаджується усередині клітин в нерозчиненій формі у вигляді тілець включення і по кількості складає до 10% всього білка клітин. Гликозилювання білка відсутнє. Клітини рекомбінантного штаму виявляють стійкість до ампіциліну, обумовлену рекомбінантною плазмідою pKCore 102 D.