Плазмідний експресуючий вектор рк1724, кодуючий послідовність днк, відповідаючу за експресію гібридного злитного білка gag вірусу імунодефіциту людини першого типу (gag biл-1) в бактеріях е.coli

Винахід відноситься до розділу молекулярної біології, генної інженерії і може бути використаний при біотехнологічному синтезі білка ВІЛ-1 і в медицині для конструювання тест-систем, придатних для виявлення антитіл до ВІЛ в сироватках крові пацієнтів. Прототипами винаходу е сімейство бактеріальних експресіонних векторі в типу (Keith K Stanley and Paul Luslo., Construction of a new family of high efficienty bacterial expression vectors: identification of cDNA clones for human liver proteins // EMBO Journal, v.3, N6, pp.1429 - 1434). Ці вектори походять від злитних плазмид, які експресують велику кількість злитних білків під контролем промотору фагу лямбда. У основу винаходу покладене завдання створити генноінженерну конструкцію, яка забезпечить мікробіологічний синтез в элитного білка ВІЛ-1 у склад якого входять послідовності амінокислот білків ВІЛ-1: і Суть винаходу полягає в одержанні модифікованої послідовності плазмідної ДНК, відповідаючої за синтез злитного білка в бактеріях Для цього була створена рекомбінантна плазміда яка містить наступні інсерціонні фрагменти ДНК: фрагмент гену розміром - фрагмент розміром 114н., - делетований фрагмент розміром 426н., - фрагменти ДНК, відповідаючі за послідовності білків розміром 354н., розміром 690н. розміром 222н. фрагменти ДНК з'єднували ДНК-лігазою фага і одержаним лігатом трансформували клітини Рекомбінантні клони нарощували і тестували методом імуноблотінгу, використовуючи сироватки крові людини які утримували антитіла до ВІЛ-1. Подальша модифікація плазміди складалась в одержанні делеції розміром 630н.п. в області бета-галактозідазного гена рестріктазою Фізична карта одержаного плазмидного вектора приведена в додатку 1. Плазміда кодує гібрідний білок молекулярною масою 70,376Д. Штам - продуцент гібрідного білка одержували трансформацією клітин плазмідою Клітини-продуценти ростуть добре на простих поживних середовищах при температурах 32 - 42 градуси. При рості на м'ясо-пептонному поживному агарі формують гладкі, круглі, плоскі, сірі, блискучі колонії з рівними краями. При рості на рідких поживних середовищах утворюють інтенсивну муть. Клітини не споживають ацетат, аданіт, лактозу, ксилозу. Джерелом азоту з'являються пептон, амінокислоти і мінеральні солі в амонійній і нітратній формах. Клітини ростуть при pH 5,0 - 8,0. Синтез гібрідного білка відбувається при вирощуванні культури при температурі 32 - 42 градуси В оптимальних умовах ферментації рекомбінантного штама гібрідний білок нагромаджується усередині клітин в нерозчиненій формі у вигляді тілець включення і по кількості складає до 10 - 20% всього білка клітин. Клітини рекомбінантного штамму виявляють стійкість до ампіциліну обумовлену рекомбінантною плазмідою