Плазмідний експресуючий вектор ркs 103, маючий послідовність днк, відповідаючу за експресію в бактеріях e.coli злитного білка оболонки оболонки trepanema pallidum

Винахід відноситься до розділу молекулярної біології, генної інженерії і може бути використаний при біотехнологічному синтезі білка оболонки Trepanema Pallidum і в медицині, для конструювання тест-систем, придатних для виявлення антитіл до Trepanema Pallidum в сироватках крові пацієнтів. Прототипами винаходу є сімейство бактеріальних експресійних векторів типу pEX1-3 (Keith К Stanley and Paul Lusio, Construction of a new family of high efficienty bacterial expression vectors: identification of cDNA clones for human liver proteins // EMBO Journel, vol.3, №6, p.1429 - 1434). Ці вектори походять від crolacZ элитних плазмід, які експресують велику кількість злитних білків під контролем Pr промотору фагу лямбда. В основу винаходу покладене завдання створити генно-інженерну конструкцію, яка забезпечить мікробіологічний синтез в Е. coli элитного білка оболонки Trepanema Pallidum. Суть винаходу полягає в одержанні модифікованої послідовності плазмідної ДНК, відповідаючої за синтез элитного білка оболонки Trepanema Pallidum. Для цього була створена рекомбінантна плазміда pKS 103, яка містить наступні інсерційні фрагменти ДНК: фрагмент гену Cro, розміром 51п.о, фрагмент Lac 1, розміром 114п.о., фрагмент Lac Z, розміром 1050п.о. і фрагмент ДНК, відповідаючий послідовностям білку оболонки Trepanema розміром 2649п.о. Одержаною модифікованою плазмідою трансформували клітини Е. coli. Рекомбінантні клони Е. coli нарощували і тестували методом імуноблотінгу, використовуючи сироватки крові людини, які утримували антитіла до структурних білків вірусу гепатиту C. Фізична карта одержаного плазмідного вектора приведена в додатку 1. Плазміда pKS 103 кодує гібридний білок молекулярною масою 106кД (883 амінокислоти). Штам - продуцент гібридного білка (Tp-15) одержували трансформацією клітин Е. coli Y1090 плазмідою pKS 103. Клітини-продуценти ростуть добре на простих поживних середовищах при температурах 32 42°C. При рості на м'ясо-пептонному поживному агарі формують гладкі, круглі, плоскі, сірі, блискучі колонії з рівними краями. При рості на рідких поживних середовищах утворюють інтенсивну муть. Джерелом вуглеводів для клітин е вуглеводи, спирти, органічні кислоти. Клітини не споживають ацетат, аданіт, лактозу, ксилозу. Джерелом азоту з'являються пептон, амінокислоти і мінеральні солі в амонійній і нітратній формах. Клітини ростуть при pH6,0 - 8,0. Синтез гібридного білка відбувається при вирощуванні культури Е. coli Tp-15 при температурі 32 - 42°C. В оптимальних умовах ферментації рекомбінантного штама гібридний білок нагромаджується усередині клітин в нерозчиненій формі у вигляді тілець включення і по кількості складає до 10% всього білка клітин. Гликозилювання білка відсутнє. Клітини рекомбінантного штаму виявляють стійкість до ампіциліну, обумовлену рекомбінантною плазмідою pKS 103.