Плазмідний експресуючий вектор, кодуючий послідовність днк, відповідаючу за експресію генно-інженерно модифікованого дифтерійного токсину в бактеріях е.coli.

Винахід відноситься до розділу генної інженерії, і може бути використаний в біотехнології і в медицині для одержання модифікованого дифтерійного токсину з штамів бактерій Існують аналоги плазмідних векторів, які продукують білок дифтерійного токсину різного розміру, різної молекулярної маси, з різним рівнем експресії (Шмелев В.А. Перовская О.Н. и др. Синтез, секреция и протеолитическася деградация дифтерийного токсина в Escherlchia coli // Moлек. Генет. Микроб. Вирус., 1991, №10, с.3 - 8). Інтенсивність секреції і протеоліз дифтерійного токсину при наробці бактеріальної маси залежать од довжини фрагмента ДНК, яка його кодує і наявності структурних елементів плазмидного вектора. Прототипом винаходу є експресуючий вектор плазмида гибридного білка тимозинантибіотиків (3,98т.п.н.), кодуюча синтез фактор некроза пухлин а також білков стійкості до лактамазу і хлорамфеніколацетилтрансферазу Плазміда сконструйована на основі реплікона і забезпечує конститутивний синтез гібридного білка з ранніх промоторів і бактеріофага (Коробко В.Г., Болдырева Е.Ф., Филипов С.А., Шмелев В.А. и др. Синтез искусственного гена, кодирующего тимозин и его экспрессия в составе гибридов с фактором некроза опухолей человека // Биоорган. Хим. - 1992. - Т.18. - №5. - С.646 - 659; Шмелев В.А., Бунина З.Ф., Кудрявцева Т.Ю. и др. Получение группы гибридных белков, состоящих из фактора некроза опухолей и тимозина // Молек. Генет. Микроб. Вирус. - 1995. - №1. - С.9 14). В основу винаходу покладено завдання створити генноінженерну конструкцію, яка забезпечить синтез модифікованого білка позбавленого токсичності, але зберігшого основні антигенні детермінанти для вироблення протективних антитіл. Суть винаходу полягає в одержанні модифікованої послідовності ДНК, відповідаючої за синтез переносі її в інший експресуючий вектор, з частковою модифікацією цього вектора і, таким чином, створенню нової конструкції вектора. Для конструювання використана плазміда яка містить в собі фрагмент (1,88т.п.н.) ДНК конвертуючого корінефага омега. З метою повного вилучення цитотоксичної-, АДФ-рібозілтрансферазної і зв'язаної активності була проведена делегація -кінця його -фрагменту. При цьому вилучались промотор, сайт, сигнальний пептид і -кінець -фрагмента розміром 28а.з. Делегація була проведена за рахунок гідролізу рестріктазою маючої три сайта розщеплення, два з яких знаходяться в фрагменті і один в векторній частині плазміди. Фрагмент розміром 1,1т.п.н. був елюйований з агарозного гелю після електрофорезу і використаний для лігування з експресуючим вектором. В якості експресуючого вектора була використана плазміда (3,98т.п.н.) яка кодує синтез гібридного білка - фактора некроза пухлин - тімозін (ФНГНГ), а також білків стійкості до антибіотиків лактази і хлорамфеніколацетілтрансферази З метою забезпечення максимальної експресії зменшеного варіанта було проведено його злиття з -кінцевими а.з. ФНО. Для цього було проведено делегування генів кінця і кінця При цьому зберігалися промотори і -сайт і кінець ФНП, розміром 44а.з., який не містить мажорних антигенних детермінант. Делегація була проведена за рахунок гідролізу рестріктазою яка має 3 сайти розщеплення, два з яких знаходяться в послідовності кодуючої ФНП і один в Фрагмент вектора розміром 3,34т.п.н. був елюйований після електрофорезу з агарозного геля і використаний для лігування з делетованим фрагментом Після лігування і аналізу одержаних клонів був виділений варіант плазмідної ДНК, названий розміром 4,45т.п.н., кодуючий синтез білка м.м. 46кД. Він має три мажорні антигенні детермінанти (47 - 52, 89 - 95, 118 123а.з.) і позбавлений токсичності.