Плазмідний експресуючий вектор ркnsсоrе 100, маючий послідовність днк, відповідаючу за експресію в бактеріях e.coli гібридного злитного білка ns4-pcore вірусу гепатиту с

Винахід відноситься до розділу молекулярної біології, генної інженерії і може бути використаний при біотехнологічному синтезі білка pCore вірусу гепатиту C і в медицині, для конструювання тест-систем, придатних для виявлення антитіл до вірусу гепатиту C в сироватках крові пацієнтів. Прототипами винаходу є сімейство бактеріальних експресійних векторів типу pEX1-3 (Keith K Stanley and Paul Lusio, Construction of a new family of high efficienty bacterial expression vectors: identification of cDNA clones for human liver proteins. // EMBO Journel, vol 3, № 6, pp. 1429 - 1434). Ці вектори походять від crolacZ злитних плазмід, які експресують велику кількість злитних білків під контролем Pr промотору фагу лямбда. В основу винаходу покладене завдання створити генно-інженерну конструкцію, яка забезпечить мікробіологічний синтез в E.coli злитного білка NS4-pCore вірусу гепатиту C. Суть винаходу полягає в одержанні модифікованої послідовності плазмідної ДНК, відповідаючої за синтез злитного білка NS4-pCore вірусу гепатиту C. Для цього була створена рекомбінантна плазміда pKNSCore 100, яка містить наступні інсерційні фрагменти ДНК: фрагмент гену Cro, розміром 51п.о., фрагмент Lac1, розміром 114п.о., фрагмент LacZ, розміром 1050п.о. і фрагмент ДНК, відповідаючий злитним послідовностям білків NS4 і pCore вірусу гепатиту C, розміром 1488п.о. Одержаною модифікованою плазмідою трансформували клітини E.coli. Peкомбінантні клони E.coli нарощували і тестували методом імуноблотінгу, використовуючи сироватки крові людини, які утримували антитіла до структурних білків вірусу гепатиту C. Подальша модифікація плазміди складалась в одержанні делеції розміром 624п.о. в області бета-галактозідазного гена рестріктазою Hpa-1. Фізична карта одержаного плазмідного вектора приведена на фіг.1. Плазміда pKNSCore 100 кодує гібридний білок молекулярною масою 56кД (496 амінокислот). Штам - продуцент гібридного білка (ITG-100) одержували трансформацією клітин E.coli Y1090 плазмідою pKNSCore 100. Клітини-продуценти ростуть добре на простих поживних середовищах при температурах 32 - 42°C. При рості на м'ясо-пептонному поживному агарі формують гладкі, круглі, плоскі, сірі, блискучі колонії з рівними краями. При рості на рідких поживних середовищах утворюють інтенсивну муть. Джерелом вуглеводів для клітин є вуглеводи, спирти, органічні кислоти. Клітини не споживають ацетат, аданіт, лактозу, ксилозу. Джерелом азоту з'являються пептон, амінокислоти і мінеральні солі в амонійній і нітратній формах. Клітини ростуть при pH 6,0 - 8,0. Синтез гібридного білка відбувається при вирощуванні культури E.coli ITG-100 при температурі 32 - 42°C. В оптимальних умовах ферментації рекомбінантного штама гібридний білок нагромаджується усередині клітин в нерозчиненій формі у вигляді тілець включення і по кількості складає до 10% всього білка клітин. Гликозилювання білка відсутнє. Клітини рекомбінантного штаму виявляють стійкість до ампіциліну, обумовлену рекомбінантною плазмідою pKNSCore 100.