Плазмідний експресуючий вектор рк41,кодуючий послідовність днк, відповідаючу за експресію гібридного злитного білка еnv-1 вірусу імунодефіциту людини першого типу ( env віл-1) в бактеріях e.coli

Винахід відноситься до розділу генної інженерії і може бути використаний при біотехнологічному синтезі білка Env ВІЛ-1 і в медицині, для конструювання тест-систем придатних для виявлення антитіл до ВІЛ-1 в сироватках крові пацієнтів. Прототипами винаходу є сімейство бактеріальних експресіонних векторів типу pEX1-3 (Keith K Stanley and Paul Lusio., Construction of a new family of high efflcienty bacterial expression vectors: identification of cDNA clones for human liver proteins // EMBO Journel, vol.3, №6, pp.1429 - 1434). Ці вектори походять від cro-lacZ злитних плазмид, які експресують велику кількість злитних білків під контролем Pr промотору фагу лямбда. В основу винаходу покладене завдання створити генно-інженерну конструкцію, яка забезпечить микробіологічний синтез в E.Coli злитного білка Env ВІЛ-1, у склад якого входять послідовності амінокислот білків Env ВІЛ-1: gp120, gp41. Суть винаходу полягає в одержанні модифікованої послідовності плазмідної ДНК, відповідаючої за синтез злитного білка Env-1 ВІЛ-1 в бактеріях E.Coli (штам ITG-71). Для цього була створена рекомбінантна плазміда pK41, яка містить наступні інсерціонні фрагменти ДНК: фрагмент гену cro розміром 51п.о., фрагмент Laci, розміром 114п.о., делетований фрагмент LacZ, розміром 400п.о., фрагмент ДНК, відповідаючий за послідовність білка Env-1, розміром 1167п.о. Фрагменти ДНК з'єднували ДНК-лігазою фага T4 і одержаним лігатом трансформували клітини E.Coli. Рекомбінантні клони E.Coli нарощували і тестували методом імуноблотінгу, використовуючи сироватки крові людини, які утримували антитіла до ВІЛ1. Подальша модифікація плазмиди складалась в одержанні делеції розміром 400п.о. в області бетагалактозідазного гена рестріктазою Hpa-1. Фізична карта одержаного плазмидного вектора приведена на фіг.1, 2. Плазмида pK41 кодує гібридний білок молекулярною масою 65443Д. Штам - продуцент гібридного білка (ITG-71) одержували трансформацією клітин E.Coli Y1090 плазмидою pK41. Клітини - продуценти ростуть добре на простих поживних середовищах при температурах 32 - 42 градуси. При рості на м'ясо-пептонному поживному агарі формують гладкі, круглі, плоскі, сірі, блискучі колонії з рівними краями. При рості на рідких поживних середовищах утворюють інтенсивну муть. Джерелом вуглеводів для клітин є вуглеводи, спирти, органічні кислоти. Клітини не споживають ацетат, аданіт, лактозу, ксилозу. Джерелом азоту з'являються пептон, амінокислоти і мінеральні солі в амонійній і нітратній формах. Клітини ростуть при pH 5,0 - 8,0. Синтез гібридного білка відбувається при вирощуванні культури E.Coli ITG-71 при температурі 32 - 42 градуси C. В оптимальних умовах ферментації рекомбінантного штама гібридний білок нагромаджується усередині клітин в нерозчиненій формі у вигляді тілець включення і по кількості складає до 10% всього білка клітин. Гликозилювання білка відсутнє. Клітини рекомбінантного штамму виявляють стійкість до ампіциліну, обумовлену рекомбінантною плазмидою pK41. Амінокислотна послідовність рекомбінантного білка pEnv-1 ВІЛ-1, 531 амінокислота. Молекулярна маса рекомбінантного білка 65443Д. Ізоелектрична точка рекомбінантного білка PI = 9,38.