Тест-система імуноферментна для кількісного визначення антитіл класу igg проти toxoplasma gondii в сироватці крові людини (dia-toxo-igg)

Винахід належить до біотехнології, імунохімії та медицини і може бути використаний для оцінки імунного статусу жінок до або на початку вагітності, а також для проведення сероепідемічних досліджень. В Україні тест-системи для виявлення зараженості людей, особливо вагітних жінок та немовлят токсоплазмою не виробляється. В Росії випускається тест-система "ВектоТоксо-антитела" (ЗАО "Вектор-Бест", Новосибірськ), в складі якої на твердій фазі використовуються рекомбінантні поліпептиди-аналоги білків Toxoplasma gondii; сироватки досліджуються після попереднього розведення 1:100, а як кон'югат беруть антивидові антитіла проти імуноглобулінів класу G людини, мічені пероксидазою [1]. В основу винаходу покладено завдання створити імуноферментну тест-систему на основі імуносорбенту з очищеними поверхневими білками-антигенами Toxoplasma gondii. Антигени сорбують на поверхні полістиролових планшетів. Досліджувані сироватки використовують в розведенні 1:10. В складі кон'югатів беруть моноклональні антитіла проти імуноглобулінів людини класу G, мічені ферментом-пероксидазою. Ферментативну реакцію визначають за допомогою субстратного розчину з хромогеном. За одну постановку (2 години) можна проаналізувати 88 сироваток. Приклад 1 Визначення антитіл проти Toxoplasma gondii у сироватці крові хворої Л. 1977 року народження. Визначення проводять за відомою методикою [2] твердофазного імуноферментного аналізу. Для цього вносять у лунки планшета-імуносорбента з фіксованими на ньому білками-антигенами Toxoplasma gondii по 90мкл розчину для розведення сироваток та по 10мкл сироватки крові хворої для виявлення антитіл класу G (IgG). В чотири лунки вносять по 90мкл розчину для розведення сироваток та контрольні зразки: в три лунки - по 10мкл позитивних контрольних зразків-сироваток з визначеними титрами антитіл (для будування калібрувальної кривої), а в одну -10мкл негативного контролю. Накривають планшет клейкою плівкою або кришкою та інкубують при температурі 37°С протягом 60хв. Після закінчення інкубації видаляють вміст лунок за допомогою промивача або 8-канальної піпетки та промивають лунки чотири рази розчином для промивання планшетів. В лунки планшету вносять по 100мкл розчину моноклонального кон'югату проти імуноглобулінів людини, мічених пероксидазою, та інкубують планшет при 37°С у термостаті 30хв. Після закінчення інкубації промивають лунки шість разів і вносять по 100мкл розчину проявника (субстратний розчин з хромогеном) та інкубують при 18-22°С у темряві 30хв. Зупиняють кольорову реакцію, вносячи до всіх проб по 100мкл стоп-реагента. Не більш як через 1хв. після зупинення кольорової реакції визначають оптичну густин у (ОГ) в лунках у двохвильовому режимі за допомогою спектрофотометра. Значення ОГ зразка прямо пропорційне кількості антитіл у сироватці. Значення кількості антитіл проти Toxoplasma gondii у сироватці хворої, визначене при застосуванні нашої тест-системи, порівнювали зі значеннями, отриманими при використанні тест-системи виробництва ЗАО "ВекторБест" (Росія). Досліджені сироватки хворої було ідентифіковано як позитивні на наявність антитіл проти антигенів Toxoplasma gondii. Приклад 2 Визначення чутливості та специфічності пропонованої тест-системи. Використовуючи названі тест-системи, досліджували сироватки крові (по 20 достеменно позитивних та 100 достеменно негативних сироваток). Усі сироватки досліджували у дво х повторностях кожною тест-системою за описаною методикою. Усі 20 позитивних сироваток показали наявність антитіл проти Toxoplasma gondii, що складає 100% чутливості. З 100 негативних сироваток виявилися справді негативними всі 100 (специфічність 100%) у пропонованій тест-системі. В порівнюваній тест-системі з Росії з 20 достеменно позитивних сироваток 19 були позитивними. Одну низькотитражну сироватку не виявлено. Чутли вість тест-системи становила 95%. З 100 негативних сироваток - 2 сироватки були виявлені як хибнопозитивні. Специфічність порівняльної тест-системи становила 98%. Таким чином, пропонована тест-система забезпечує виявлення антитіл класу IgG проти антигенів Toxoplasma gondii у сироватках людей. Проста і надійна в роботі, проявляє високу чутливість та специфічність. Використана література 1. Инструкция по применению тест-системы "ВектоТоксо-антитела" производства ЗАО "Вектор-Бест", п. Кольцове, Новосибирской обл., 2003, 3с. 2. А.Т. Ми хайлов, В.Н. Симирский "Методы иммунохимического анализа в биологии развития". М, "Наука", 1981.