Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Спосіб ідентифікації генотипів ячменю, що включає молекулярно-генетичний аналіз на основі полімеразної ланцюгової реакції, який відрізняється тим, що використовує систему мікросателітних ДНК-маркерів.

Текст

Винахід відноситься до біотехнології і може бути використаний в рослинництві при аналізі генотипів ячменю. Сучасний рівень досліджень дозволяє ідентифікацію генотипів найважливіших видів сільськогосподарських рослин, зокрема ячменю, на основі молекулярних маркерів. Такі маркери можна отримати шляхом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), зокрема аналізом мікросателітних локусів. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення є спосіб ідентифікації генотипів ячменю, який наведений у журналі "Цитологія і генетика", 1998р, т.32, №6, с.35-41. [1]. Цей спосіб передбачає використання для генотипової ідентифікації ДНК-маркерів, отриманих на основі RAPD (довільно ампліфікована поліморфна ДНК, від англ. Random Amplified Polymorphic DNA). 39 поліморфних RAPD-продуктів, які виявлені з використанням 8 RAPD-праймерів, обрані для ідентифікації сортів ячменю. Кожен з поліморфних продуктів, тобто RAPD-локус певного праймеру позначається згідно з порядком літер латинського алфавіту, наприклад, самий верхній продукт ампліфікації - А, за ним нижче - В, потім С і так далі. Праймери позначаються відповідно №№1, 2, 3 і так далі. Для кожного праймеру наявність продукту ампліфікації позначається як літера певного відповідного локусу, відсутність продукту не детектується, у сумнівних випадках позначається знаком питання. Даний спосіб вибрано як прототип. RAPD-підход є одним із основних джерел одержання молекулярних маркерів на основі ДНК. Однак, його застосування для ідентифікації генотипів має деякі недоліки. RAPD у багатьох випадках не дає стабільну відтворюваність ампліфікації, що викликає її неоднозначність та неадекватність інтерпретації результатів молекулярно-генетичного аналізу, тому використання системи ДНКмаркерів на основі RAPD для ідентифікації генотипів має бути проблематичним. Задачею винаходу є створення способу ідентифікациї генотипів ячменю, який дозволив би запобігти вказаних вище недоліків при молекулярно-генетичному аналізі та вдосконалити існуючу систему генотипової ідентифікації. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб ідентифікації генотипів ячменю включає молекулярногенетичний аналіз на основі полімеразної ланцюгової реакції згідно винаходу використовує систему мікросателітних ДНК-маркерів. Відмінним від прототипу є використання для генотипової ідентифікації системи ДНК-маркерів на основі аналізу поліморфізму SSRs (поліморфізм простих повторювальних послідовностей, від англ. Simple Seguens Repeats Polymorphisms). Спосіб здійснюється наступним чином. Для проведення ідентифікації кожного з сортів ячменю, ДНК виділяли з зернівок експрес-методом. Зернівку розтирали з лікуючим буфером. Використовували лізуючий буфер такого складу: 100мМ NaCl, 100мМ Nа2ЕДТА, 100мМ Трис-НСІ, рН8,5 (25°С), 1% SDS). Зразки інкубували за температурою 60°С на протязі 45хвил. Після інкубації обробляли три рази сумішшю хлороформ/ізоаміловий спирт у співвідношенні 24:1 для інактивації білків. Потім до водно-сольового шару додавали рівний ізопропилового спирту і цетрифугували у мікроцентрифузі Eppendorf 5415 протягом 4хв. при 14000об/хв. ДНК промивали 70% етанолом і розчиняли в 500мкл ТЕ-буфера (10мМ трис- НСl, рН7,4 (25°С), 1мМ Nа2ЕДТА) з 1мкг/мкл РНКази А. Якість виділеної ДНК визначали стандартним способом (електрофорез у 0,8% агарозному гелі). Для ампліфікації використовують полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) з спрямованими праймерами до мікросателітних локусів. Реакційна суміш для проведення полімеразної ланцюгової реакції мала такий склад: 50мМ КСl, 20мМ Трис-НСІ, рН8,4 (25°С), 1 - 4мМ MgCl2 (залежно від праймерів), 0,01% Tween-20, 0,2мМ кожного dNTP, 0,25 мкМ праймера. Суміш об'ємом 25мкл вміщувала 100-150нг ДНК і 2од. Taq-полімерази. У кожну пробірку нашаровували по 30мкл мінеральної олії (Bajol F). Умови реакції такі: 45 циклів: денатурація - 94°С, 1,5хв. (початкова), далі 1хв.; відпал - 55°С протягом 1хв.; синтез - 72°С, 2 хв., заключна елонгація - 10хв. при 72°С. Ампліфікацію ДНК проводили на термоциклері "Терцик" ("ДНК-технологія", Росія). Продукти реакції ампліфікації розділяли методом електрофорезу в 4% агарозному і 10% денатур уючому поліакриламідному гелях в 1хТВЕ. Документували ампліфіковані фрагменти, використовуючи систему для відеодокументації "Image Master VDS" ("Amersham pharmacia biotech", США). Для аналізу використали систему з 20 мікросателітних локусів [2], які позначені відповідно: HVM3 - A, HVM4 В, HVM9 - С, H VM13 - D, H VM20 - Е, H VM30 - F, HVM33 - G, H VM36 - Н, HVM40 –І, HVM44 - J, H VM49 - К, HVM 54 L, HVM62 - М, HVM65 - N, HVM67 - О, HVM68 - Р, HVM74 - Q, HVM77 - R, HVBKASI - S, HVCSG - Т. Кожному локусу присвоєно код у вигляді певної літери латинського алфавіту. Розмір алеля у парах нуклеотидів (п.н.), виявлений після проведення SSRP-аналізу в еталоних зразках певного сорта за будь-яким мікросателітним локусом, який використовується, додається до відповідної літери у ви гляді цифрового індексу. Іденти фікація кожного сорту проводиться на основі результатів молекулярно-генетичного аналізу по певній кількості встановлених мікросателітних локусів при відповідності розмірів алелів мікросателітів в генотипі, який досліджується, еталонному зразку. Приклад конкретного використання способу. Молекулярно-генетичний аналіз сорту ячменю. ДНК виділяли експрес-методом з зернівок. Для ампліфікації використовували полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) з спрямованими праймерами до мікросателітних локусів. SSRP-аналіз проводили по 20 локусам. В еталоном зразку ДНК певного сорту за 20 локусами, які позначені відповідними кодовими літерами, виявлені певні алелі. Ідентифікація сорту проводиться на основі порівняння результатів молекулярно-генетичного аналізу по встановленим мікросателітним локусам при відповідності розмірів алелів мікросателітів у зразку ДНК, який необхідно проаналізувати і еталонного зразку ДНК певного сорту. Наприклад, за SSRP-аналізом ДНК отримані ті ж самі результати, що і в е талонному зразку ДНК певного сорту: за локусом HVM3, який позначений кодовою літерою А, виявлено алель розміром 190п.н., за локусом HVM4, який позначений літерою В, виявлено алель 200п.н., локус HVM9, що позначений відповідно літерою С, має алель розміром 230п.н. і так далі за всіма локусами, які обрані для аналізу. Таким чином, молекулярногенетичним аналізом встановлюється відповідність дослідженої ДНК певному сорту ячменю. Список літератури: 1. Сиволап Ю.М., Календарь Р.Н. Исследование внутривидового полиморфизма, идентификация генотипов ячменя (Hordeum vulgare L.). 2. Liu Z., Biyashev R. Saghai Maroof M. A. De velopment of simple sequence repeat DNA markers and their integration into a barley linkage map /Theor. Appl. Genet. -1996. -Vol.93. -P.869-876.

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Method for identifying the barley genotypes

Автори англійською

Syvolap Yurii Mykhailovych

Назва патенту російською

Способ идентификации генотипов ячменя

Автори російською

Сиволап Юрий Михайлович

МПК / Мітки

МПК: A01H 1/04

Мітки: ячменю, спосіб, ідентифікації, генотипів

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/1-67905-sposib-identifikaci-genotipiv-yachmenyu.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб ідентифікації генотипів ячменю</a>

Подібні патенти