Спосіб виділення тотальної днк ячменю

Винахід відноситься до біотехнології і може бути використаний в рослинництві при аналізі генотипів ячменю. Сучасні дослідження генетичної мінливості найважливіших видів сільськогосподарських рослин, зокрема ячменю, здійснюються на рівні ДНК. При цьому, для аналізу молекулярно-генетичного поліморфізму ячменю, наприклад, шляхом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), ДНК виділяють з етіольованих паростків із застосуванням різних лізуючих агентів. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення є метод виділення ДНК з 3-4-добових етіольованих паростків, що надається у науково-методичній збірці «Использование ПЦР-анализа в генетикоселекционных исследованиях» [1]. Зернівки пророщували на вологому фільтрувальну папірі у термостаті при температурі 220С протягом 3-4 діб. Папір зволожували декілька разів водою. Етіольовані паростки розтирали скляною палочкою з 0,5мл лізуючого буферного розчину: 1,4М NaCl, 20мМ Na2EДTA, 100мМ трис-НСl, рН8,0 (250С), 2% СТАВ; та інкубували протягом 1 години при 55-600С. Депротеїнізували сумішшю хлороформу та ізопентанолу (24:1). ДНК осаджували з водно-сольової фази (0,5мл) рівним об'ємом ізопропилового спирту і центрифугували у мікроцентрифузі Eppendorf 5415 протягом 4хв. при 14000об/хв. ДНК промивали 70% етанолом і розчиняли в 500мкл ТЕ-буфера (10мМ трис-НСl, рН7,4 (250С), 1мМ Na2EДTA) з 1мкг/мкл РНКази А. Однак, застосування вказаного вище метода для виділення ДНК ячменю має декілька недоліків. Потрібна тривала підготовка матеріалу: 3-4 доби для пророщування, необхідні додаткові засоби: термостат, фільтрувальний папір, зволожування водою, часто з'являється грибкова та бактеріальна інфекція, що може привести до загибелі зародків, при пророщуванні зникає можливість подальшого дослідження саме цього зразку, що особливо має значення при аналізі обмеженої кількості рослинного матеріалу. З метою усунення вказаних недоліків пропонується спосіб, заснований на виділенні ДНК ячменю безпосередньо з зернівки. В основу винаходу поставлена задача вдосконалення способу виділення ДНК, скорочення технологічних етапів, та терміну виділення ДНК ячменю. Це забезпечить підвищення темпів проведення підготовчого етапу молекулярно-генетичного аналізу ячменю, який пов’язаний з процедурою отримання тотальної ДНК. Спосіб забезпечує можливість виділення великої кількості зразків ДНК, безпосередньо з насіння, без витрати будь-якого додаткового часу, коштовного обладнання та реактивів. Поставлена задача вирішується тим, що, згідно винаходу, на першому етапі виділення ДНК вимикають етап пророщування зернівок ячменю і процедури, які з цим пов'язані. Спосіб здійснюється наступним чином. Зернівку розтирають з лізуючим буфером такого складу: 100мМ NaCl, 100мМ Na2EДTA, 100мМ Трис-НСІ, рН8,5 (25°С), 1% SDS). Зразки інкубують при температурі 600С на протязі 45хв. Після інкубації зразки обробляють сумішшю хлороформ/ізоаміловий спирт у співвідношенні 24:1 для інактивації білків. Потім до водно-сольового шару додавають рівний об'єм ізопропилового спирту і центрифугують у мікроцентрифузі Eppendorf 5415 протягом 4хв. при 14000об/хв. ДНК промивають 70% етанолом і розчиняють в 500мкл ТЕ-буфера (10мМ трис-НСl, рН7,4 (250С), 1мМ Nа2ЕДТА) з 1мкг/мкл РНКази А. Якість виділеної ДНК визначається стандартним способом (електрофорез у 0,8% агарозному гелі). Таким чином, використання запропонованого способу запобігає етап 3-4 добового пророщування зернівок для отримання паростків, що значно скорочує тривалість проведення процедури виділення ДНК, у цілому, зменшує її складність. Приклади використання способу Перевірка генотипної однорідності сортів ячменю. Запропонований спосіб виділення ДНК із зернівок використали при аналізі генотипів ячменю з метою перевірки генотипної чистоти сортів методом ПЛР. Це дозволило скоротити термін виділення багатої кількості зразків ДНК, необхідних для аналізу. Аналіз генотипів при отриманні молекулярних маркерів для картування геному ячменю. Картування геномів передбачає використання сегрегуючих популяцій, чисельність яких близько 100 зразків та більш. Запропонований засіб сприятиме скорішому виділенню ДНК із досліджених об'єктів. В порівнянні з прототипом запропоноване технічне рішення дозволяє проводити дослідження поліморфізму ДНК ячменю та молекулярно-генетичний аналіз генотипів безпосередньо після отримання насіння і не витрачати час на отримання паростків. Література: 1. Использование ПЦР-анализа в генетико-селекционных исследованиях: Научно-метод. рук-во / Под ред. Ю. М. Сиволапа. - К.: Аграрна наука, 1998. -156с.