Спосіб ідентифікації гібридів сільськогосподарських культур за днк-маркерами

Винахід відноситься до сільського господарства та може бути використаний в селекції та насінництві сільськогосподарських культур. Найбільш близьким до запропонованого способу є спосіб ідентифікації генотипів соняшнику, який включає підбір мікросателітних послідовностей ДНК (SSR) (один із типів ДНК маркерів), що характеризуються поліморфізмом, визначення генотипу за досліджуваними локусами, та порівняння генотипу зразка із відомими генотипами [А.Е. Солоденько, А.В. Саналатий, Ю.М. Сиволап Идентификация генотипов подсолнечника с помощью микросателитных маркеров // Цитология и генетика №2.- 2004]. Створення тест-системи, виділення ДНК, ідентифікація генотипу гібриду, порівняння генотипу зразка із відомими генотипами спільні суттєві ознаки відомого способу та винаходу. Недоліком прототипу є те, що на відміну від винаходу спільні суттєві ознаки не забезпечують збільшення інформативності тест-системи, оскільки ідентифікується тільки генотип гібриду, не враховуючи які алелі потрапили від материнського організму а які від батьківського. В основу винаходу поставлено задачу збільшити розподільчу здатність способу ідентифікації гібридів, шляхом окремого виділення ДНК та ідентифікації генотипу материнських тканин насінини та окремого виділення ДНК та ідентифікації генотипу гібридних тканин насінини. Поставлена задача вирішується тим, що у способі ідентифікації гібридів сільськогосподарських культур, що включає створення тест системи (підбір ДНК маркерів, що характеризуються поліморфізмом), виділення ДНК, визначення алельного стану досліджуваних локусів, порівняння генотипу зразка із відомими генотипами, згідно винаходу окремо виділяють ДНК та ідентифікують генотип (визначають алельний стан досліджуваних локусів) материнської тканини насінини і окремо виділяють ДНК та ідентифікують генотип гібридної тканини насінини. Запропонований спосіб характеризується такими суттєвими ознаками. Створення тест системи (підбір ДНК маркерів, що характеризуються поліморфізмом), окреме виділення ДНК та ідентифікація генотипу (визначення алельного стану досліджуваних локусів) материнської тканини насінини і окреме виділення ДНК та ідентифікація генотипу гібридних тканин насінини, порівняння генотипів зразка із відомими генотипами. Окреме виділення ДНК та ідентифікація генотипу (визначення алельного стану досліджуваних локусів) материнської тканини насінини і окреме виділення ДНК та ідентифікація генотипу гібридної тканини є відмінною ознакою запропонованого способу. Нова, відмінна від прототипу, ознака забезпечує більшу інформативність тест-системи на основі ДНК маркерів, що збільшує розподільчу здатність способу ідентифікації гібридів сільськогосподарських культур. Плід (у господарському значенні насінина) більшості сільськогосподарських культур складається із двох типів тканин: материнської, що формує здебільшого покривні тканини, та гібридної - зародок та запасаючі тканини. ДНК маркери (певна послідовність нуклеотидів) найбільш зручний для ідентифікації вид маркерів, так як за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) можна створити необмежену кількість копій ділянок ДНК що вивчаються і відповідно визначити їх довжину, за якою спостерігається поліморфізм. Метод ПЛР має дуже високу чутливість, для його реалізації достатньо кількох молекул ДНК, що дає можливість відділити незначну частину материнської тканини та ідентифікувати генотип материнської форми. Зменшення об'єму роботи по ідентифікації гібриду можна досягти шляхом проведення однієї реакції ПЛР та подальшого розподілу продуктів ампліфікації методом електрофорезу на одній доріжці. Це значно ускладнює підбір маркерів, які в цьому випадку повинні бути відмінними за довжиною один від одного. Підвищення розподільчої здатності тест-системи дозволяє використовува ти меншу кількість маркерів і відповідно проводити ідентифікацію зразка із меншими затратами матеріалів. При різних генотипах батьківських форм їх гібриди можуть мати один і той же генотип. Наприклад при схрещуванні материнської форми з генотипом ААввсс з батьківською формою, яка має генотип ааВВСС гібрид буде мати генотип АаВвСс, такий же генотип буде формуватись при схрещуванні батьківських форм ААввСС та ааВВсс. В наведеному прикладі трьох маркерів АВС буде не достатньо для ідентифікації гібридів, тобто тестсистема буде малоінформативною. При ідентифікації окремо материнської та окремо гібридної тканини в наведеному прикладі цихтрьох маркерів буде достатньо для ідентифікації гібриду, що за маркерами має генотип АаВвСс. Спосіб здійснюється таким чином. Підбирають маркери, що характеризуються поліморфізмом. Із насіння досліджуваного зразка відділяють частину материнської тканини, таким чином, щоб в зразок, що відділяється не потрапила гібридна тканина. Із відділеної тканини і решти насінини (насіння) окремо виділяють ДНК. Окремо із цими пробами ДНК проводять ПЛР-реакцію за участю праймерів до підібраних в тест-систему маркерів. Продукти ампліфікації розділяють за допомогою методу гель-електрофорезу. Порівнюють спектр материнської тканини та гібридної визначаючи які алелі потрапили від материнського організму, а які від батьківського, порівнюють генотип зразка із відомими генотипами. Ідентифікація гібридів, необхідний елемент контролю насінництва, а також забезпечення авторських прав на гібриди сільськогосподарських культур.