Спосіб ідентифікації захворювання лейкозом у сільськогосподарських тварин

1 Спосіб ідентифікації захворювання лейкозом у сільськогосподарських тварин, що полягає у дослідженні проб біологічної речовини тварини, який відрізняється тим, що дослідження ведуть імуноферментним методом, в якому вносять до планшета підготовлені негативний контроль та позитивний контроль біологічної речовини, інкубують її, промивають планшет і вносять до нього імунопероксидазний кон'югант на основі моноклональних антитіл та інкубують, після інкубації планшет промивають і вносять туди розчин проявника та інкубують, при цьому як проявник використовують хромоген - ортофенілендіамін або хромоген - тетраметилбензидин, зупиняють кольорову реакцію стоп-реагентом і визначають оптичну густину в лунках у двохвильовому режимі 2 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що як біологічну речовину тварини використовують кров тварини або и сечу, або молоко Корисна модель відноситься до ветеринарної медицини, а саме до імуноферментного аналізу для виявлення інфікованості збудниками лейкозу тварин Лейкоз тварин (Leucosis mammalium), лейкемія, білокрів'я, пухлинні захворювання кровотворної тканини, що характеризуються головним чином системним розмноженням незрілих кровотворних кліток в різних органах і тканинах Лейкоз великої рогатої худоби часто називають «ензоотичним лейкозом», «лимфосаркомой» Серед сільськогосподарських тваринних лейкоз частіше зустрічаються у великої рогатої худоби, рідше - у овець, коней, свиней, собак і кішок Лейкоз, особливо великої рогатої худоби, реєструються майже у всіх країнах світу Встановлена підвищена захворюваність серед тварин ряду порід, сімейств і ЛІНІЙ ЕТІОЛОГІЯ І патогенез лейкозу вивчені недостатньо В їх розвитку грають роль біологічні, фізичні, ХІМІЧНІ І генетичні чинники За даними ряду ДОСЛІДНИКІВ, В етіології лейкозу (кішок, собак, мишей і ін ) велику роль грають онкорнавіруси типу 3, що відносяться до сімейства Retravindae Ці віруси проявляють свою дію на певному імунобюлопчному фоні і за наявності генетичної схильності Проводяться роботи по вивченню ролі онкорнавірусів, генетичних і імунологічних чинників при лейкозі великої рогатої худоби Відомий спосіб виявлення захворювання на лейкоз у великої рогатої худоби, що полягає у проведенні на основі реакції імунодифузи (РІД) з лейкозним антигеном серологічних досліджень всіх тварин починаючи з 4-6 місячного віку Серологічні дослідження проводяться через кожні 10 днів (UA 44416) Недоліком цього способу для ветеринарної медицини є те, що процес ідентифікації розтягується у часі і дає результат з великою похибкою, при цьому застосовується тільки для великої рогатої худоби, а обєктом досліджування використовують виключно її кров В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб ідентифікації захворювання лейкозом у сільськогосподарських тварин шляхом застосуванням нового набору реагентів та вибору оптимальних режимів їх використання, що дозволяло би підвищити універсальність, скоротити час та автоматизувати цей спосіб ідентифікації, підвищити його надійність, при цьому спосіб дозволяє використовувати ІНШІ НІЖ кров біологічні рідини тварини Поставлена задача вирішується у способі ідентифікації захворювання лейкозом у сільськогос (24)15 11 2005 со 00 О) 10148 подарських тварин, що полягає у дослідженні проб біологічної речовини тварини, відповідно до технічної задачі реалізованої в корисній моделі, дослідження ведуть імуноферментним методом, в якому вносять до планшета підготовлені негативний контроль та позитивний контроль біологічної речовини, інкубують її, промивають планшет і вносять до нього імунопероксидазний кон'югант на основі моноклональних антитіл та інкубують, після інкубації планшет промивають і вносять туди розчин проявника та інкубують, при цьому як проявник використовують хромоген -ортофенілендіамін або хромоген - тетраметилбензидин, зупиняють кольорову реакцію стоп-реагентом і визначають оптичну густину в лунках у двохвильовому режимі. Як біологічна речовина тварини використовується кров тварини або її сеча, або молоко. Для реалізації способу використовуються слідуючи реагенти. Імунопероксидазний кон'югат (кон'югат)- світло-солом'яна опалесцентна рідина являє собою: - модифіковані моноклональні антитіла до імуноглобулінів класу G великої рогатої худоби, пероксидаза хрону; Позитивний контроль (К+) - світло-солом'яна трохи опалесцуюча рідина являє собою сироватку, наприклад, крові тварини проімунізованих лейкозним антигеном, що позитивно реагує у ІФА. Негативний контроль (К-) - світло-солом'яна трохи опалесцуюча рідина сироватка, наприклад, крові тварини, що не містить антитіл до вірусу лейкозу; Хромоген - ортофенілендіамін (ОФД) - таблетка білого з сіруватим відтінком кольору, хромоген тетраметилбензидин (ТМБ) - прозора безбарвна рідина, 3,3'Д5'-тетраметилбензидин; Розчини: - розчин для промивання (розчин № 1) - безбарвна опалесцуюча рідина, допускається розшарування та випадіння кристалічного осаду, що розчинюється при температурі (35-37)°С протягом 15-20 хвилин; - стоп-реагент (розчин № 2) - прозора, безбарвна рідина; - розчин для розведення сироваток (розчин № 3) - фіолетова трохи опалесцуюча рідина; - розчин для приготування проявника (розчин № 5) - прозора безбарвна рідина; До складу розчинів входять: - нагрій фосфорнокислий двозаміщений дванадцятиводний згідно з ГОСТ 4172; - натрій фосфорнокислий однозаміщений двоводний згідно з ГОСТ 245; - натрій хлористий згідно з ГОСТ 4233; - сечовина згідно з ГОСТ 6691; - тритон Х-100 імпортований, фірми Aldrich, кат, № 23,472-9; - твін-20 імпортований, фірми Aldrich, кат, № 27,434-8; - мертіолат імпортований, фірми "Serva" кат. №11340; - білок G імпортований, фірми "ICN" кат. № 672651; - білок G-HrP імпортований, фірми "ICN" кат. №672681; - протеїн G, рекомбінантний імпортований, фірми "Fluka" кат. № 82509; - альбумін бичачий імпортований, фірми "Sigma" кат. № А 7030; - альбумін конячий імпортований, фірми "Sigma" кат. № А 9888; - альбумін вівці імпортований, фірми "Sigma" кат. № А 2514; пероксидази стабілізуючий буфер імпортований, фірми "Sigma" кат.№Р9209; - протеїназа К імпортована, фірми "Sigma" кат. № Р 2308; - агароза імпортована, фірми "Sigma" кат. № А 9414; - Ni-CAM HC целюлоза імпортована, фірми "Sigma" кат. № N 3158; - DEAE-650S целюлоза імпортована, фірми "Sigma" кат. № 8-07472; - SP-650S целюлоза імпортована, фірми "Sigma" кат. № 8-08437; - СМ-650С целюлоза імпортована, фірми "Sigma" кат. № 8-07475; - бензойна кислота згідно з ГОСТ 10521; - бромкрезоловий пурпурний за діючою нормативною документацією; - фенолфталеїновий червоний за діючою нормативною документацією; - сухе знежирене молоко згідно ГОСТ 10970; - лимонна кислота згідно ГОСТ 3652; - гідроперит згідно ФС 42-2140; - кислота сірчана згідно з ГОСТ 4204; - вода очищена згідно ФС 42-2619. Імуносорбент - очищені антигени вірусу лейкозу, отримані в лабораторних умовах згідно з вимогами технологічних інструкцій, який сорбовано на поверхні лунок полістирольних планшетів. Таблетки ОФД розчинюють у 9см 3 очищеної води при 20±2°С при струшуванні протягом 5-10 хвилин. Концентрація водневих іонів (рН) розчинів № 1, № 3-7,3±0,1, а № 5 - 5,3±0,1 (при розчиненні 12см3 розчину у 350мл очищеної води). Номінальний об'єм розчинів: кон'югат від 0,1 до 0,2 см 3 ; позитивний контроль від 0,1 до 0,2 см 3 ; негативний контроль від 0,1 до 0,2 см 3 . розчин № 1 - 12см3; розчин № 2 стоп-реагент- 12см3; розчин № 3 - 12см3; розчин № 5 - Зсм 3 ; хромоген ТМБ - 12см3 Використовується тест-система наступним чином. Приготування розчину для промивання планшета (розчин № 1) Вміст флакона концентрату розчина № 1 інтенсивно струшують і розводять у 435см 3 очищеної води та перемішують. Якщо концентрат розчину кристалізований, його нагрівають перед застосуванням при (35-37)°С до повного розчинення кристалів. Розчин можна зберігати при температурі (2-8)°С не довше 5 діб. Приготування розчину кон'югату. В окремий флакон вносять 12см3 приготованого розчину № 5. В ампулу з кон'югатом вносять(0,3-0,4)см3 розчину № 5. Після повного розчинення вміст ампули переносять у флакон. Вміст 10148 флакона ретельно перемішують піпетуванням, не та інкубують при температурі 37°С 60 хвилин. По допускаючи піноутворення. Цю процедуру повтозакінченні інкубації видаляють вміст лунок за дорюють тричі з метою повного вилучення кон'югату помогою промивача або 8-канальної піпетки та з ампули. Розчин кон'югату готують безпосередньо промивають лунки чотири рази розчином № 1, перед використанням. після чого позбавляються зайвої вологи, постукуючи планшетом по фільтрувальному паперу. Приготування розчину проявника. В чистий флакон вносять таблетку хромогена Готують розчин кон'югату. ОФД і додають 9см 3 очищеної води, інтенсивно В лунки планшету вносять по 0,1м 3 розчину струшують і залишають флакон у темному місці до кон'югату. Накривають планшет клейкою плівкою повного розчинення хромогену. Безпосередньо або кришкою та інкубують при 37°С у термостаті перед внесенням у лунки стрипів у флакон з роз20 хвилин. По закінченні інкубації видаляють розчином № 5 додають розчин хромогену, суміш чин кон'югату з лунок за допомогою промивача інтенсивно струшують. Розчин готують безпосеабо 8-канальної піпетки та промивають лунки редньо перед використанням. Розчин проявника шість разів розчином № 1, після чого позбавлянеобхідно оберігати від попадання світла та конються зайвої вологи, постукуючи планшетом по такту з металами або іонами металів. Перед викофільтрувальному паперу. ристанням розчин проявника повинен бути безПроведення випробування з використанням барвним. хромогену ОФД Готують розчин проявника. Підготовка зразків до випробування. Вносять в лунки планшету по 0,1м 3 розчину Підготовка зразків сироваток крові тварин. проявника. Накривають планшет клейкою плівкою Зразки сироваток, які містять осад необхідно або кришкою та інкубують при (18-22) °С в темному освітлювати центрифугуванням. Зразки сироваток місці до ЗО хвилин. зберігають (2-6)°С протягом трьох діб; якщо немає можливості провести аналіз в даний термін, зразки Зупиняють кольорову реакцію внесенням до необхідно заморозити. Процес заморожування та всіх лунок по 0,05м3 розчину № 2 (стоп-реагенту). відтавання може повторюватися не більше 2 разів. Не більше як через 1 хвилину після зупинення Зразки з гемолізом та бактеріальним проростом кольорової реакції визначають оптичну густину для аналізу не придатні. (ОГ) в лунках у двохвильовому режимі (492м відносно 620нм). Підготовка зразків сироваток крові для дослідження в пулах. Як виняток, ОГ можна визначати в однохвильЗразки 10 сироваток, що підготовлені для овому режимі (492нм) відносно порожньої лунки аналізу, змішують в однакових пропорціях (по (бланк). Необхідно передбачити порожню лунку 0,1см3) в окремій пробірці. Ретельно перемішують при аналізі. При роботі в однохвильовому режимі та використовують для аналізу. Пули сироваток знижується чутливість та точність аналізу. зберіганню не підлягають. Підготовка зразків сиПроведення випробування з використання роваток молока. хромогену ТМБ. Вносять в лунки планшету по 0,1см3 розчину Свіжовідібране молоко піддають центрифугухромогену ТМБ. Накривають планшет клейкою ванню при 1500 об/хв. протягом 10 хвилин для плівкою або кришкою та інкубують при (18-22)°С в отримання молочної сироватки. Центрифужні статемному місці протягом 20 хвилин. канчики залишають при (4±2)°С протягом ЗО хвилин, після чого проводять відбір молочної сироЗупиняють кольорову реакцію внесенням до ватки з під шару сливок. Зразки молочної всіх лунок по 0,05см3 розчину № 2 (стоп-реагенту). сироватки довгостроково зберігають в заморожеНе більше як через 1 хвилину після зупинення ному стані. Процес заморожування та відтавання кольорової реакції визначають ОГ в лунках в одзразків сироватки може повторюватися не більше нохвильовому режимі (450нм), 2 разів. Облік результатів аналізу. Проведення випробування. Розраховують середнє значення ОГ для лунок Готують розчин № 1 негативного контролю (ОГ К-) і для позитивного Виймають імуносорбент з пакувального пакету контролю (ОГ К+). Проведення аналізу вважають та вносять в усі лунки по 0,35см3 розчину № 1, коректним, якщо ОГ К- не вище 0,2 оптичної одивитримують залитим 30-40 секунд і видаляють ниці (00), а ОГ К + не нижче 0,600. розчин з лунок за допомогою промивача або 8Якщо одне з трьох значень ОГ К- більше 0,2 канальної піпетки, після чого позбавляються зай00 його відкидають та ОГ К-розраховують за решвої вологи, постукуючи планшетом по фільтруватою значень ОГ К-. Граничне значення ОГ (ГЗ). ГЗ льному паперу. В кожну лунку вносять по 0,09см3 розраховують, додаючи константну для кожної розчину № 3 для розведення сироваток. В лунки серії наборів величину до значення ОГ К-. планшету вносять по 0,01см3 зразків Значення константної величини встановлює досліджуваних сироваток, залишивши вільними 5 для кожної серії тест-систем виробник, і вказує лунок першого ряду (лунки для контролів). В дві його в настанові по використанню тест-системи. лунки (А1, В 1) вносять по 0,01см3 позитивного "Сіра зона" - зона значень ОГ, яка простягається контролю (К+), а в три інші (D1- Е 1) - по 0,01см3 від ГЗ до значень менших ГЗ на 10%. Результати негативного контролю (К-). При внесенні конаналізу вважаються негативними, якщо значення трольних та досліджуваних зразків необхідно обеОГ досліджуваного зразка менше рівня ОГ "сірої режно піпетувати суміш. Під час піпетування зони". відбувається зміна кольору розчину в лунках. Накривають планшет клейкою плівкою або кришкою 7 10148 8 Результати аналізу вважаються позитивними, програмування автоматичного спектрофотометра якщо значення ОГ досліджуваного зразка більше (ридера) та користування програмою додається по ГЗ. вимозі користувача. Для автоматичного обліку результатів аналізу застосовують обчислювальну програму. Порядок Комп'ютерна верстка Г. Паяльніков Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 4 2 , 01601