Спосіб виявлення бактерій роду salmonella у продуктах харчування, патологічному матеріалі та об’єктах зовнішнього середовища за допомогою полімеразної ланцюгової реакції

Спосіб виявлення бактерій роду Salmonella у продуктах харчування, патологічному матеріалі та об'єктах зовнішнього середовища. Винахід відноситься до ветеринарної медицини, зокрема ветеринарної бактеріології. Принцип методу полімеразної ланцюгової реакції був розроблений американським біохіміком фірми "Cetus" Кери Мюллісом [Mullis K.B., Falona F.A., ScharfS. et al. // Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology.- New York, 1986.-P.263-273]. He дивлячись на те, що вивчення сальмонельозу триває понад 100 років, наявність значної кількості сероварів збудників (більш ніж 2200) ускладнює їх діагностику. Лабораторна діагностика сальмонел, з моменту посіву дослідного матеріалу на живильні середовища і закінчуючи визначенням їх культуральних, серологічних та біохімічних властивостей триває близько 4 днів. В зв'язку з цим звертає на себе увагу розробка більш ефективного і швидкого методу детекції збудника. Задача: створити новий спосіб детекції бактерій роду Salmonella у продуктах харчування, патологічному матеріалі та об'єктах зовнішнього середовища. Завдання досягається тим, що в досліджуваних зразках виявляємо специфічні фрагменти нуклеїнових кислот (ДНК) за допомогою полімеразної ланцюгової реакції-ПЛР - ферментативної реакції і двох штучно синтезованих олігонуклеотидів (праймерів), які дозволяють багаторазово копіювати специфічні ділянки ДНК інфекційних агентів при температурних і часови х параметрах та кількості циклів: № циклу 5 5 хв. 1 1 хв. 64°С 1 хв. 1 хв. 0,5 хв. 62°С 0,5 хв. 73°С 4 95°С 94°С 3 Кількість циклів 74°С 2 Час 94°С 1 Температура 0,5 хв. 72°С 5 хв. 5 35 1 Зберігання Праймери мають послідовність: Sal 1 - 5' - GGTAAATCCGGTTCACTTTAAC AC Sal 2 - 5' - CGAGTAAATCACTTCACCTACGTG Приклад: пробу (продукти, харчування, звиви з обладнання, тощо) (1 гр.) помішують у пластикову пробірку ємністю 1,5 мл.і додають 500 мкл. дистильованої води. Суміш зтрушують і центрифугують, після чого проводимо виділення ДНК набором реагентів для виділення ДНК. Отриману чисту ДНК (3-5мкл) помішуємо у пробірку ємністю 0,5 мл. і додаємо 15 мкл ПЦР-буфера, 2,5 мкл dNTP, по 2.5 мкл праймерів, 0,25 мкл Tag-полімерази та 1 краплю мінерального масла. Вміст пробірки струшуємо і центрифугуємо, а потім помішуємо в ампліфікатор "Терцик", якому задаємо вищевказану програму. Детекція результату проводиться в 1,5 % агарозному гелі з барвником - бромистим етідієм. В гелеві лунки вносять 10-12 мкл ампліфікованої суміші Після проведення електрофорезу фрагменти ДНК згруповуються в смужки, які виявляють флуоресцентне. Результат ПЛР може бути оцінений візуально по наявності смужок, що відповідають продуктам реакції. Промислове застосування - для виявлення бактерій роду Salmonella у продуктах харчування, патологічному матеріалі та об'єктах зовнішнього середовища.