Спосіб визначення алкалоїдів чорнокореня лікарського в кормах і патологічному матеріалі

Спосіб визначення алкалоїдів чорнокореня лікарського в кормах і патологічному матеріалі, що включає вилучення алкалоїдів із рослинного матеріалу і паренхіматозних органів, очищення фільтруванням, перерозподіл екстрагентів та хроматографію, який відрізняється тим, що вилучення алкалоїдів здійснюють розчином лимонної кислоти, а при хроматографуванні використовують рухливий розчинник - етиловий спирт та оцтову кислоту при співвідношенні 9 1 Винахід, що передбачається, відноситься до ветеринари, а саме до способів визначення алкалоїдів при діагностиці отруєнь сільськогосподарських тварин Отруйними речовинами чорнокореня лікарського є алкалоїди, а саме ціноглосин, ціноглосеш, консолідин і гелюсупін Алкалоїди - специфічні отрути печінки, накопичуючись в ній, руйнують гепатоцити, створюючи умови до розвитку незворотніх патологічних процесів Чорнокорінь лікарський (Cynoglossum officmale L) відноситься до родини бурачникових (Borragmaceae), росте повсюди, але особливо сильно забруднює посіви еспарцету, який є кормом для сільськогосподарських тварин Існують способи визначення алкалоїдів із проб, які є дослідними Так, є спосіб виділення алкалоїдів (Патент Роси, Приор ДЕ, Per номер заявки №96124780/04, від 27 05 1994) Цей спосіб виділення алкалоїдів з рослин, за яким алкалоїдний екстракт його фракції розчиняється у воді Після ЧОГО ЗДІЙСНЮЮТЬ екстракцію рідини в рідину простим ефіром та виділенням органічної фази від рідинної фази В органічній фазі знаходиться алкалоїд - лупанін Цей спосіб є не зовсім точним, так як алкалоїди вилучаються не повністю Існує спосіб КІЛЬКІСНОГО визначення алкалоїдів чемериці Лобеля (Патент Роси, №1561682, від 12 05 1988) Цей спосіб здійснюють потенціометричним титруванням алкалоїдів в розчинах мурашиної кислоти-метилетилкетон і оцтової кислотиметилетилкетон При здійсненні цього способу необхідні великі затрати та велика КІЛЬКІСТЬ реактивів Є спосіб хроматографічного визначення алкалоїдів в патологічному матеріалі та в рослинах (Методика, 1976г, авторы В И Серов, В А Волкова, Киргизский НИИ животноводства и ветеринарии) Спосіб заснован на витягуванні алкалоїдів, визначенні їх в залишках шляхом постановки кольорової реакції на хроматографічному папері з послідуючою ідентифікацією хроматографією у тонкому шарі Цей спосіб може бути прототипом Але цей спосіб є трудомістким і великозатратним В основу винаходу, що передбачається, поставлено задачу розробити спосіб визначення алкалоїдів чорнокореня лікарського в кормах і патологічному матеріалі шляхом вилучення алкалоїдів із рослинного матеріалу і паренхіматозних органів, очищення фільтруванням, перерозподілу екстрагентів та хроматографії, при цьому вилучення алкалоїдів здійснюють розчином лимонної кислоти, а при хроматографуванні використовують рухливий розчинник - етиловий спирт та оцтову кислоту при співвідношенні 9 1, що дає змогу забезпечити чистоту одержання алкалоїдів та зменшити затрати на реактиви Спосіб визначення алкалоїдів чорнокореня лікарського, вилучення алкалоїдів, очищення фільтруванням, перерозподіл екстрагентів в неполярний органічний розчинник та кінцевим визначенням тонкошаровою хроматографією у прототипі є спільними ознаками зі способом, що заявляється Для здійснення запропонованого способу проводять вилучення алкалоїдів чорнокореня лікарського із рослинного матеріалу і паренхіматозних органів розчином лимонної кислоти, очищення фільтруванням, перерозподіл екстрагентів в неполярний органічний розчинник та кінцеве визначен о о> со ю 53909 ня тонкошаровою хроматографією Спосіб здійснюють у такій ПОСЛІДОВНОСТІ Готують реактив Драгендорфа (Государственная фармакопея, Изд Медицина, М, 1968г, с 900) Основний реактив 16,5г лужного азотнокислого вісмуту розчиняють в 500мл 25% концентрованої оцтової кислоти Окремо розчиняють 80г йодистого калію в 200мл дистильованої води Обидва розчини змішують і зберігають в склянці із темного скла Реактив придатний для використання на протязі місяця Робочий реактив Безпосередньо для проявлення готують робочий реактив Для цього змішують 20мл основного реактива, 20мл льодяної оцтової кислоти і ЮОмл дистильованої води Приготування паперових пластинок для хроматографії Для хроматографічних пластинок використовують папір хроматографічний марки „М", розрізаючи на пластинки розміром 9x12см Для придатності пластинки обов'язково пропускають через дистильовану воду Висушують і зберігають в ексікаторах Проводять відбір проб для дослідження Потім проводять екстракцію та первинну очистку екстрактів Приклад 1 Рослинна сировина Витягування алкалоїдів проводять у вигляді солей Для цього 10г подрібненої рослинної сировини заливають ЮОмл 1% розчину лимонної кислоти (рН«3,0) Потім все перемішують і ставлять на водяну баню при температурі +40°С на 2 години при періодичному перемішуванні, або залишають при кімнатній температурі (18-22°С) на1-2доби Лимонно-кислотну витяжку із рослинної сировини фільтрують через паперовий фільтр в розділову лійку і проводять реекстракцію 2 рази по 20,0мл хлороформом Цю фракцію відкидають Далі проводять підлужнення лимоннокислотної витяжки 2,5% розчином NaOH («20,0мл) до рН=9 Підлужнену лимонно-кислотну фракцію обробляють знову хлороформом 2 рази по 25,0мл шляхом легкого змішування на протязі 5-7 хвилин Хлороформні реекстракти об'єднують і випарюють у випарювальних чашках досуха Чашки змивають 1-2мл хлороформу і екстракти використовують для хроматографування Приклад 2 Патологічний матеріал Беруть наважку подрібнених неконсервованих органів (печінка, вміст рубця або шлунка) в КІЛЬКОСТІ 10,0Г Проби хорошо подрібнюють і переносять в колби, заливаючи їх 1% розчином лимонної кислоти Вміст колб декілька раз перемішують і ставлять на водяну баню на 1 годину при температурі +40°С або залишають при кімнатній температурі (18 22°С) на 1-2 доби Після настоювання рідину з проб зливають і фільтрують через бумажний фільтр в суху колбу і розміщують в морозильну камеру побутового холодильника на 1-2 години для виморожування жиру Після цього вміст колб фільтрують в розділову лійку і проводять реекстракцію 2 рази по 20,0мл хлороформом Цю фракцію відкидають Далі проводять підлужнення лимоннокислотної витяжки 2,5% розчином NaOH («20,0мл) до рН=9 Підлужнену лимонно-кислотну фракцію обробляють знову хлороформом 2 рази по 25,0мл шляхом легкого змішування на протязі 5-7 хвилин Хлороформні реекстракти обєднують і випарюють у випарювальних чашках досуха Чашки змивають 1-2 мл хлороформу і екстракти використовують для хроматографування Приклад 3 Хроматографування Використовують попередньо приготовлені хроматографічні пластинки, на які відступивши 1,5см від нижнього краю і бокових сторін, наносять ізольовано із проб залишки так, щоб діаметр плями не перевищував 0,5см з допомогою мікропіпетки Для контролю поряд наносять стандартні зразки алкалоїдів Хроматографічну пластинку з нанесеними пробами ставлять в хроматографічну камеру, на дно якої за 20 хвилин до внесення пластинки наливають рухливий розчинник етиловий спирт і оцтова кислота в співвідношенні 9 1, приготовлений за 1-2 години до аналізу Після того, як фронт розчинника підніметься, не дійшовши 1см до верхнього краю, пластинки витягують її із камери і залишають для випарювання розчинника Висушена пластинка бризгається реактивом Драгендорфа При цьому алкалоїди проявляються у вигляді жовто-гарячих плям на загальному жовтому фоні Ідентифікація алкалоїдів в дослідних зразках проводиться на основі співпадання плям дослідних проб і плям стандартів Співпадання плям дає можливість зробити заключения про наявність суми алкалоїдів чорнокореня лікарського в рослинних кормах та патологічному матеріалі і поставити діагноз на отруєння тварин Для документування проведених досліджень роблять фотокопію або відбиток пластинки на кальку, які потім підклеюють до експертизи хімікотоксиколопчного дослідження Спосіб визначення алкалоїдів чорнокореня лікарського в кормах і патологічному матеріалі є ефективним, потребуючим менших витрат і таким, який забезпечує найбільшу чистоту при вилученні алкалоїдів із досліджуемих зразків ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24