Спосіб покращення якості препаратів інтерфазних ядер клітин кісткового мозку хворих на множинну мієлому з метою підвищення діагностичних та прогностичних оцінок

Реферат: Спосіб покращення якості препаратів інтерфазних ядер клітин кісткового мозку хворих на множинну мієлому з метою підвищення діагностичних та прогностичних оцінок включає культивування клітин в поживному середовищі, обробку клітин культури розчином колцеміду та гіпотонічним розчином, фіксацію клітин на предметне скло, денатурацію ДНК, гібридизацію з ДНК пробами, постгібридизаційне промивання препаратів та візуалізацію гібридизації. При культивуванні клітин кісткового мозку підібрано режим, під час якого до 1 мл матеріалу кісткового мозку додається 10 мл поживного середовища RPMI 1640 та інкубується протягом 24-х годин. На 24-й годині до культури додається 100 мкл розчину колцеміду та витримується 25 хвилин. В процесі передгібридизаційної підготовки препарати необхідно прогріти на термоплиті при температурі 60 °C протягом 30 хвилин. При постгібридизаційній відмивці препарати витримуються по 10 хвилин в трьох розчинах 50 % формаміду, 5 хвилин в розчині 2×SSC та 2 хвилини в розчині 0,4×SSC/0,3 % NP-40 за температури 42 °C. З останнього розчину препарати переносять на 1 хвилину в розчин 2×SSC/0,1 % NP-40 кімнатної температури. UA 107457 U (12) UA 107457 U UA 107457 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Заявка належить до медицини, а саме до онкогематології, і може бути використана для визначення хромосомних аномалій у хворих на хронічні лімфопроліферативні новоутворення, а саме множинну мієлому (MM). Актуальність розробки полягає в тому, що запропонований спосіб дозволить визначати хромосомні і геномні перебудови, котрі обумовлюють розвиток та прогресію множинної мієломи, верифікувати діагноз та більш точно визначати підтип пухлинного новоутворення, надавати прогностичну оцінку щодо перебігу хвороби, оптимізувати програми протипухлинної терапії, з метою надання підвищення ефективності та максимальної індивідуалізації лікування. Досягнення генетики і молекулярної біології в останні десятиріччя поглибили розуміння природи ініціації і прогресії злоякісних новоутворень В-клітинного походження. Для множинної мієломи отримані найбільш вагомі результати в розумінні їх природи, в розробці сучасних високоефективних методів діагностики та лікування даної патології. Характерною особливістю даної групи онкогематологічних захворювань є різнорідність та значна варіабельність хромосомних порушень в пухлинних клітинах при різних підтипах і у різних пацієнтів. Проте для кожного злоякісного новоутворення з цієї групи визначено найбільш часті повторювані зміни в генотипі, котрі мають важливе значення для прогнозування, стадіювання та вибору протипухлинної терапії для хворих на MM [1-3]. А отже, точне визначення хромосомних порушень є критичним в дослідженні цієї патології та терапії таких хворих. Довгий час цитогенетий метод, а саме каріотипування, був єдиним доступним методом для дослідження хромосомних аномалій. Як з'ясувалося пізніше, цитогенетичний аналіз, на жаль, не відображає повної картини хромосомних порушень, присутніх в трансформованих пухлинних клітинах у хворих на MM [1]. Так, методами традиційної цитогенетики виявляють від 30 до 50 % хромосомних перебудов, коли на сьогодні вже відомо, що аномалії каріотипу спостерігаються у 90-98 % таких хворих [4, 5]. Щонайменше три проблеми постають перед методами традиційної цитогенетики при дослідженні біологічного матеріалу хворих на MM. По-перше, пухлинні клітини мають дуже низький мітотичний індекс, навіть, при їх культивуванні in vitro з додаванням різноманітних цитокінів, включаючи IL-6. Метафазні хромосоми можна отримати лише в 30 % випадків, причому успіх в отриманні метафазних пластинок корелює з кількістю хромосомних порушень та стадією захворювання. По-друге, переважна більшість випадків MM мають аномальні каріотипи, а в багатьох пухлинах виявляють численні та складні хромосомні перебудови, включаючи нереципрокні перебудови, які ускладнюють ідентифікацію хромосом. По-третє, багато партнерів імуноглобулінових транслокацій мають теломерне (4р 16) або субтеломерне (16q23) розміщення, як і сам IGH локус (14q32), що знаходиться на теломері q плеча 14 хромосоми [6-8]. Метод інтерфазної FISH із використанням різних типів проб дозволяє проводити всеохоплюючу оцінку IGH транслокацій, анеуплоїдій (моносомій, трисомій, тетрасомій) та делецій хромосом 13 та 17 у всіх пухлинних клітинах. Основними вимогами до препаратів інтерфазних ядер та метафазних хромосом, підготовлених для гібридизації, є наступні: достатня кількість ядер або метафазних пластинок; ізольоване розміщення ядер, без формування конгломератів; відсутність залишків цитоплазматичних білків, а також жирних крапель навколо ядер та хромосом. Низька якість препаратів призводить до: - Формування хибно-позитивного сигналу; - Наявності додаткових сигналів; - Унеможливлення детекції внаслідок формування слабкого сигналу; - Забрудненості фону, наявності дуже яскравих сигналів, що зумовлює пригнічення свічення безпосередньо гібридизаційних сигналів; - Локалізації сигналу на різних рівнях - складність у виведенні на екран. За прототип нами вибрано спосіб флуоресцентної in situ гібридизації на суспензії плазматичних клітин кісткового мозку [9], за яким досліджують аномалії хромосом у хворих на ММ за допомогою методу FISH. Проведення аналізу включає такі етапи: денатурація ДНК, гібридизація з ДНК пробами, постгібридизаційне промивання препаратів, візуалізація гібридизації. Позитивним в прототипі є те, що метод FISH на суспензії плазматичних клітин кісткового мозку є надійним та легко відтворюваним методом дослідження. Недоліком прототипу є те, що препарат для FISH-аналізу досить часто має незадовільну якість і, як наслідок, збільшується етапність і вартість процесу. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб покращення якості препаратів інтерфазних ядер клітин кісткового мозку хворих на MM з метою підвищення 1 UA 107457 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 діагностичних та прогностичних оцінок, що дасть можливість оптимізувати програми протипухлинної терапії вже на перших етапах діагностики та лікування. Основними напрямками в покращенні якості препаратів інтерфазних ядер клітин кісткового мозку пацієнтів з MM були: підбір режиму культивування клітин кісткового мозку, передгібридизаційна підготовка препаратів та постгібридизаційна відмивка препаратів. Поставлена задача вирішується наступним чином: Для отримання препаратів інтерфазних ядер кісткового мозку задовільної та високої якості здійснювався підбір режиму культивування зразків кісткового мозку для перших 10 пацієнтів. Для кожного зразка кісткового мозку ставилися чотири культури на різні режими, що були модифікаціями стандартної методики [10]. Перший режим – пряме культивування: до 0,5 мл матеріалу кісткового мозку додавали 4,5 мл поживного середовища RPMI 1640 (Sigma, США) та 100 мкл розчину колцеміду (Sigma, США), інкубували 20 хв. Подальша фіксація здійснювалась за стандартною методикою [9]. Другий режим: до 1 мл матеріалу кісткового мозку додавали 10 мл поживного середовища RPMI 1640 (Sigma, США), 100 мкл розчину колцеміду (Sigma, США), інкубували 24 години. Подальша фіксація здійснювалась за стандартною методикою [9]. Третій режим: до 1 мл матеріалу кісткового мозку додавали 10 мл поживного середовища RPMI 1640 (Sigma, США) та інкубували 24 години. На 24-й годині до культури додавали 100 мкл розчину колцеміду (Sigma, США) та витримували 25 хв. Подальша фіксація здійснювалась за стандартною методикою [9]. Четвертий режим: до 1 мл матеріалу кісткового мозку додавали 10 мл поживного середовища RPMI 1640 (Sigma, США), інкубували 48 годин. На 48-й годині до культури додавали 100 мкл колцеміду (Sigma, США) з подальшою інкубацією протягом 25 хв. Наступна фіксація проводилась за стандартною методикою [9]. Процедура гібридизації - послідовна експозиція препаратів в наступних розчинах: 3 хв. в свіжо приготованому розчині пепсину (10 мкл 10 % розчину пепсину, 99 мл дистильованої води, 1 мл 1N розчину НСl), 5 хв. в 1×PBS, 5 хв. в 2М розчині MgCl2, 4 хв. в розчині Post-Fix, 5 хв. в 1×PBS, по 2 хв. в розчинах етанолу: 70 %, 85 % та 100 %, денатурація в денатуруючому розчині формаміду - 5 хв. при 72 °C, зупинка денатурації в холодному 70 % розчині етанолу, відмивка по 2 хв. в розчинах етанолу 70 %, 85 % та 100 %. Після денатурації перед нанесенням проби препарати висушували на термоплиті при температурі від 40 до 55 °C. Приготування проб та денатурація за температури 72 °C здійснювали відповідно до протоколів виробника (Vysis, США). Інкубація проби з денатурованою ДНК на препараті тривала від 8 до 16 годин (зазвичай на ніч). Постгібридизаційна відмивка препаратів: Виробником (Vysis, США) пропонуються 2 шляхи пост-гібридизаційного відмивання препаратів: швидкий та повільний. Швидкий спосіб: препарат з попередньо видаленим покривним склом витримували 2 хв. в розчині 0,4×SSC/0,3 % NP-40, нагрітому до 73±1 °C, а потім переносили на 1 хв. в розчин 2×SSC/0,1 % NP-40 кімнатної температури. Препарати висушували в темному місці за кімнатної температури з подальшим нанесенням на зону гібридизації 10 мкл DAPI II. Більш тривала методика також передбачає зняття покривного скла з гібридизаційним клеєм, подальше витримування препаратів по 10 хв. в 3-х розчинах 50 % формаміду, по 5 хв. в 2-х розчинах 2×SSC та 5 хв. 0,2×SSC. Розчини формаміду та 2×SSC попередньо нагрівали до 42 °C. Після витримування в розчині 0,2×SSC препарати висушували при кімнатній температурі та наносили 10 мкл DAPI II. В подальшій нашій роботі ми використовували модифікацію цих двох способів. При цьому отримані препарати були високої якості та скорочувався час постгібридизаційної відмивки, порівняно з повільним шляхом. Ця модифікація передбачала витримування препаратів по 10 хв. в 3-х розчинах 50 % формаміду, 5 хв. в розчині 2×SSC та 2 хв. в розчині 0,4×SSC/0,3 % NP-40. Всі розчини нагрівались до 42 °C. З останнього розчину препарати переносили на 1 хв. в розчин 2×SSC/0,1 % NP-40 кімнатної температури. Висушували препарати за кімнатної температури в темряві. Далі на зони гібридизації наносився розчин DAPI II і накривався склом. Аналіз препаратів здійснювали за допомогою програмно-апаратного комплексу CytoVision (в-во Applied Imaging, UK) на базі мікроскопа Olympus ВХ51, Японія. Найвища якість препаратів відмічалась при культивуванні протягом 24 годин з додаванням розчину колцеміду на 24-й годині (третій режим) (Фіг. 1). При цьому в культурах було одержано метафазні пластинки задовільної якості. В результаті культивування протягом 48 годин також отримували препарати задовільної якості. Проте, тривалість культивування не виправдовує одержуваної якості препаратів. Треба відмітити відсутність покращення якості препаратів двох 2 UA 107457 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 пацієнтів з множинною мієломою з перших 10 зразків незалежно від режиму культивування. Препарати у цих випадках відзначались низькою якістю: мала кількість ядер та відсутність метафаз. Це може бути пов'язане з ранньою стадією захворювання, яка характеризується низькою проліферативною активністю аномальних клітин. При подальшому аналізі даних препаратів спостерігалась або повна відсутність плазматичних клітин з генетичними аномаліями або їх низький відсоток. Таким чином, із врахуванням тривалості культивування та вихідної якості препаратів, для проведення I-FISH найкраще культивувати клітини кісткового мозку за методикою, що використовується для третього режиму культивування. В результаті подальшого культивування клітин кісткового мозку в умовах третього режиму у 85 % випадків відмічалась висока та задовільна якість препаратів. Лише у 15 % випадків препарати характеризувались низькою якістю, що може бути пов'язане з початковою стадією захворювання. Невід'ємним етапом в підготовці препаратів інтерфазних ядер кісткового мозку є процес їх фіксації. В багатьох випадках при використанні стандартної методики відмивки для мієломних клітин виявляються незадовільної якості через наявність білкових включень та жирових крапель навколо ядер, а в деяких випадках плівки, що вкриває препарат. Для позбавлення даних негативних факторів та підвищення якості препарату нами запропоновано перенести суспензію клітин в іншу пробірку та додатково відмити в фіксаторі 3 рази, що не передбачено стандартною методикою. Крім того, для покращення якості препаратів в процесі їх передгібридизаційної підготовки необхідно їх прогріти на термоплитці за температури 60 °C протягом 30 хв. Це полегшує подальший аналіз, оскільки сигнали стають більш чіткими та в більшості клітин виявляються на одному рівні. Наступна підготовка препаратів та сам процес гібридизації проводиться за методикою прототипу [10]. Проте, при використанні даного способу постгібрилизаційної відмивки препарати виходили низької якості: значний фон (т. зв. "background") та велика кількість побічних сигналів значно ускладнювало проведення детекції результатів (Фіг. 2). Якість гібридизації, сила зв'язування проб, інтенсивність сигналів, наявність та інтенсивність фону також значно залежали від самих препаратів. Відмічалась схожість в якості препаратів на різні проби для одного пацієнта: якщо певна проба погано зв'язувалась, зумовлюючи наявність слабких сигналів, то простежувалась тенденція, що і препарати на інші проби для цього ж пацієнта будуть поганої якості. Таким чином, оптимізація режиму культивування, модифікація передгібридизаційної підготовки та підбір режиму гібридизації дозволили позбавитися таких негативних чинників як білкові включення та жирові краплини навколо ядер, а в деяких випадках плівка, яка вкривала препарати, що особливо характерно для препаратів клітин кісткового мозку хворих на MM. Це значно покращило якість препаратів та зменшило ризик помилкової детекції хибно-позитивних або негативних результатів при аналізі зразків. Переконливими прикладами ефективності запропонованого способу є представлені результати молекулярно-цитогенетичного аналізу зразків двох хворих, для яких готували препарати паралельно за стандартною методикою [9] та запропонованим способом: Приклад 1 Хворий К. (чоловік) 1964 р.н., № історії 400, у грудні 2011 р. знаходився на обстеженні у відділенні трансплантації кісткового мозку Київського центру трансплантації кісткового мозку. На підставі клініко-гематологічних даних пацієнта було встановлено діагноз - Мієломна хвороба, Gк, IIІ А ст., з ураженням хребта, лопаток, ребер, черепа. Трепанобіоптат кісткового мозку хворого був направлений для молекулярно-цитогенетичного дослідження з використанням флуоресцентної in situ гібридизації до лабораторії імуногенетики відділу гематології та трансплантології ННЦРМ. Молекулярно-цитогенетичне дослідження проводили за стандартною методикою [9], яка включала етапи: культивування клітин в поживному середовищі RPMI-1640 (Sigma, США), обробку клітин культури розчином колцеміду (Sigma, США), обробку клітин гіпотонічним розчином 0,55 М розчином хлористого калію (Sigma, США), обробку клітин фіксуючою сумішшю, до складу якої входять метиловий спирт та крижана оцтова кислота у співвідношенні 3:1 та приготування безпосередньо препаратів за допомогою нанесення на предметне скло осаду із зафіксованими клітинами, швидкий спосіб відмивки препаратів згідно з рекомендаціями виробника (Vysis, США) та візуалізації гібридизації. Проведення дослідження запропонованим способом включало наступні етапи: 3 UA 107457 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 - У стерильні відцентрові пробірки ємкістю 15 мл вносили 10 мл живильного середовища RPMI-1640 (Sigma, США) та 1 мл матеріалу кісткового мозку. Вміст пробірок обережно перемішували. - Суспензію клітин інкубували в термостаті при 37 °C протягом 24 годин. На 24-й годині до культури клітин додавали 100 мкл розчину колцеміду (Sigma, США) і витримували 25 хв. - Після закінчення культивування вміст пробірок центрифугували при 1500 об./хв. Видаляли надосадову рідину. - Потім проводили гіпотонічну обробку клітин, підігрітим до 38 °C, приготованим ex tempore, 0,56 % розчином хлористого калію (Sigma, США) протягом 20 хв в термостаті при 37 °C (з розрахунку 1 мл гіпотонічного розчину на осад, отриманий з 1 мл культури). - Гіпотоновану суспензію клітин центрифугували при 1500 об./хв. Видаляли надосадову рідину залишаючи 0,5 мл. - Осад клітин ресуспендували в невеликій кількості гіпотонічного розчину, після чого переносили в іншу пробірку. - До суспензії клітин додавали 8 мл приготованого ex tempore і охолодженого фіксатора Карнуа. Клітини обережно ресуспендували та інкубували при температурі 2-8 °C протягом 20 хв. - Вміст пробірок центрифугували при 1500 об./хв. Видаляли надосадову рідину. Заміну фіксатора Карнуа проводили тричі. За наявності жирових крапель, білкових включень та скупчених клітин в осаді вміст пробірки переносили в нову та проводили заміну фіксатора Карнуа ще тричі. - Отриману суспензію клітин наносили на предметні скельця. Під мікроскопом відмічали зону гібридизації та окреслювали її за допомогою алмазного олівця. - Препарати інкубували на термоплиті при 60 °C протягом 30 хв. - Переносили скельця до склянки із свіжоприготованим розчином пепсину (10 мкл 10 % розчину пепсину, 99 мл дистильованої води, 1 мл IN розчину НСl) і витримували 3 хв. - Потім переносили препарати в 100 мл розчину 1×PBS на 5 хв. - Далі препарати поміщали в 2М розчин MgCl2 (100 мл) на 5 хв. - Переносили препарати в 100 мл розчину Post-Fix на 4 хв. - Потім занурювали препарати в 100 мл розчину 1×PBS на 5 хв. - Для дегідратації скельця переносили до склянок зі спиртами в зростаючих концентраціях 70 %, 85 %, 100 % й витримували по 2 хв. - Сушили препарати при 37 °C на термоплиті протягом 5 хв. для випаровування спирту. - Денатурацію препарату проводили в попередньо прогрітому до 72±1 °C на водяній бані денатуруючому розчині 50 % формаміду/2×SSС (100 мл) - 5 хв. за температури 72 °C. - Скельця переносили до охолоджених склянок зі спиртами в зростаючих концентраціях 70 %, 90 %, 96 % й витримували по 2 хв. - Після денатурації перед нанесенням проби препарати висушували на термоплитці за температури 37 °C. - Готували пробу в затемненій кімнаті за інструкцією виробника (Abbott Molecular, США). Центрифугували пробірки з пробою 1-3 секунди. Перемішували на вортексі і відцентрифуговували знову. Денатурували 5 хв. при 73±1 °C на водяній бані за температури 72 °C. - Наносили пробу на відмічену зону гібридизації, накривали її покривним скельцем, заклеювали краї покривного скельця спеціальним клеєм та поміщали у вологу камеру термобрайту за температури 37 °C на 8-16 годин. Всі наступні маніпуляції проводили в затемненій кімнаті. - За допомогою пінцета знімали клей з покривного скельця. - Далі переносили препарати в 100 мл розчину 2×SSC за кімнатної температури і обережно видаляли покривне скельце. - Препарати відмивали в попередньо приготовленому і прогрітому до 42±1 °C на водяній бані розчині 50 % формамід/2×SSС (300 мл). Переносили скельця до склянок з розчином і витримували по 10 хв. в кожній склянці (3 склянки). - Далі препарати поміщали на 5 хв. в розчин 2×SSC (прогрітий до 42 °C). - Потім на 2 хв. переносили препарати в 100 мл розчину 0.4×SSC та 0,3 % NP-40 прогрітим до 42 °C на водяній бані. - Потім переносили препарати в 100 мл розчину 2×SSC та 0,1 % NP-40 за кімнатної температури на 1 хв. - Відмиті препарати сушили у вертикальному положенні за кімнатної температури в затемненому місці протягом 20 хв. 4 UA 107457 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - На зону гібридизації наносили 10 мкл контрастуючого розчину DAPI II (Vysis, США) та накривали покривним скельцем (15×15 мм). - Після 20 хв. інкубації з контрастуючим розчином за кімнатної температури препарати аналізували. Зберігали препарати при -20 °C в захищеному від світла місці довгостроково. Детекцію результатів проводили на програмно-апаратному комплексі CytoVision (Applied Imaging, UK) на базі мікроскопа Olympus BX51, Японія. За результатами проведених досліджень у хворого К. було отримано якісні препарати з чіткими сигналами на інтерфазних ядрах та виявлено делецію хромосоми 13 в 34,5 % проаналізованих клітин (Фіг. 3), делецію гену ТР53 (хромосома 17) в 20 % ядер та делецію хромосоми 8 (8р23) - 28 %. Приклад 2 Хвора Є. (жінка) 1955 р. н., № історії 371, у квітні 2011 р. була на обстеженні у відділенні радіаційної гематології та трансплантології ННЦРМ. На підставі клініко-гематологічних даних та аналізу особливостей імунного статусу пацієнтки було встановлено діагноз - множинна мієлома. Трепанобіоптат кісткового мозку хворої Є. був направлений для молекулярно-цитогенетичного дослідження з використанням флуоресцентної in situ гібридизації до лабораторії імуногенетики відділу гематології та трансплантології ННЦРМ. Молекулярно-цитогенетичне дослідження проводили за стандартною методикою [9], яка включала етапи: культивування клітин в поживному середовищі RPMI-1640 (Sigma, США), обробку клітин культури розчином колцеміду (Sigma, США), обробку клітин гіпотонічним розчином 0,55 М розчином хлористого калію (Sigma, США), обробку клітин фіксуючою сумішшю, до складу якої входять метиловий спирт та крижана оцтова кислота у співвідношенні 3:1 та приготування безпосередньо препаратів за допомогою нанесення на предметне скло осаду із зафіксованими клітинами, швидкий спосіб відмивки препаратів згідно рекомендацій виробника (Vysis, США) та візуалізації гібридизації. Проведення дослідження запропонованим способом включало наступні етапи: - У стерильні відцентрові пробірки ємкістю 15 мл вносили 10 мл живильного середовища RPMI-1640 (Sigma, США) та 1 мл матеріалу кісткового мозку. Вміст пробірок обережно перемішували. - Суспензію клітин інкубували в термостаті при 37 °C протягом 24 годин. На 24-й годині до культури клітин додавали 100 мкл розчину колцеміду (Sigma, США) і витримували 25 хв. - Після закінчення культивування вміст пробірок центрифугували при 1500 об./хв. Видаляли надосадову рідину. - Потім проводили гіпотонічну обробку клітин, підігрітим до 38 °C, приготованим ex tempore, 0,56 % розчином хлористого калію (Sigma, США) протягом 20 хв. в термостаті при 37 °C (з розрахунку 1 мл гіпотонічного розчину на осад, отриманий з 1 мл культури). - Гіпотоновану суспензію клітин центрифугували при 1500 об./хв. Видаляли надосадову рідину залишаючи 0,5 мл. - Осад клітин ресуспендували в невеликій кількості гіпотонічного розчину, після чого переносили в іншу пробірку. - До суспензії клітин додавали 8 мл приготованого ex tempore і охолодженого фіксатора Карнуа. Клітини обережно ресуспендували та інкубували за температури 2-8 °C протягом 20 хв. - Вміст пробірок центрифугували при 1500 об./хв. Видаляли надосадову рідину. Заміну фіксатора Карнуа проводили тричі. За наявності жирових крапель, білкових включень та скупчених клітин в осаді вміст пробірки переносили в нову та проводили заміну фіксатора Карнуа ще тричі. - Отриману суспензію клітин наносили на предметні скельця. Під мікроскопом відмічали зону гібридизації та окреслювали її за допомогою алмазного олівця. - Препарати інкубували на термоплиті при 60 °C протягом 30 хв. - Переносили скельця до склянки із свіжоприготованим розчином пепсину (10 мкл 10 % розчину пепсину, 99 мл дистильованої води, 1 мл IN розчину НСl) і витримували 3 хв. - Потім переносили препарати в 100 мл розчину 1×PBS на 5 хв. - Далі препарати поміщали в 2М розчин MgCl2 (100 мл) на 5 хв. - Переносили препарати в 100 мл розчину Post-Fix на 4 хв. - Потім занурювали препарати в 100 мл розчину 1×PBS на 5 хв. - Для дегідратації скельця переносили до склянок зі спиртами в зростаючих концентраціях 70 %, 85 %, 100 % й витримували по 2 хв. - Сушили препарати при 37 °C на термоплиті протягом 5 хв для випаровування спирту. - Денатурацію препарату проводили в попередньо прогрітому до 72±1 °C на водяній бані денатуруючому розчині 50 % формаміду/2×SSС (100 мл) - 5 хв. за температури 72 °C. 5 UA 107457 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - Скельця переносили до охолоджених склянок зі спиртами в зростаючих концентраціях 70 %, 90 %, 96 % й витримували по 2 хв. - Після денатурації перед нанесенням проби препарати висушували на термоплиті за температури 37 °C. - Готували пробу в затемненій кімнаті за інструкцією виробника (Abbott Molecular, США). Центрифугували пробірки з пробою 1-3 секунди. Перемішували на вортексі і відцентрифуговували знову. Денатурували 5 хв. при 73±1 °C на водяній бані за температури 72 °C. Наносили пробу на відмічену зону гібридизації, накривали її покривним скельцем, заклеювали краї покривного скельця спеціальним клеєм та поміщали у вологу камеру термобрайту за температури 37 °C на 8-16 годин. Всі наступні маніпуляції проводили в затемненій кімнаті. - За допомогою пінцета знімали клей з покривного скельця. - Далі переносили препарати в 100 мл розчину 2×SSC за кімнатної температури і обережно видаляли покривне скельце. - Препарати відмивали в попередньо приготовленому і прогрітому до 42±1 °C на водяній бані розчині 50 % формамід/2×SSС (300 мл). Переносили скельця до склянок з розчином і вигримували по 10 хв. в кожній склянці (3 склянки). - Далі препарати поміщали на 5 хв. в розчин 2×SSC (прогрітий до 42 °C). - Потім на 2 хв. переносили препарати в 100 мл розчину 0,4×SSC та 0,3 % NP-40 прогрітим до 42 °C на водяній бані. - Потім переносили препарати в 100 мл розчину 2×SSC та 0,1 % NP-40 за кімнатної температури на 1 хв. - Відмиті зрізи сушили у вертикальному положенні за кімнатної температури в затемненому місці протягом 20 хв. - На зону гібридизації наносили 12 мкл контрастуючого розчину DAPI II (Vysis, США) та накривали великим покривним скельцем (15×15 мм). - Після 20 хв. інкубації з контрастуючим розчином за кімнатної температури препарати аналізували. Зберігали препарати за температури - 20 °C в захищеному від світла місці довгостроково. Детекцію результатів проводили на програмно-апаратному комплексі CytoVision (Applied Imaging, UK) на базі мікроскопа Olympus BX51, Японія. В результаті проведених досліджень у хворої Є. препарати мали високу якість з чіткими, розташованими в одній площині сигналами на інтерфазних ядрах, та було виявлено делецію хромосоми 13 в 30 % проаналізованих клітин та транслокація генів IGH і FGFR3 t(4;14)(p16;q32) - 26 % (Фіг. 4). Джерела інформації: 1. Guidance for fluorescence in situ hybridization testing in hematologic disorders /D.J. Wolff, A. Bagg, L.D. Cooley [et al. J //Journal of Molecular Diagnostics. - 2007. - Vol. 9, № 2. - P. 134-143. 2. Chesi, M. Many Multiple Myelomas: Making More of the Molecular /M. Chesi, P. Leif Bergsagel //Hematology Am Soc Hematol Educ Program. - 2011. - Vol.2011. - P. 344-353. 3. Leif Bergsagel, P. Improving overall survival and overcoming adverse prognosis in the treatment of cytogenetically high-risk multiple myeloma /P. Leif Bergsagel, M. - V. Mateos //Blood. 2013. - Vol. 121. - N. 6. - P. 884-892. 4. Bridger J.M. Fluorescence in situ Hybridization (FISH): Protocols and Applications /J.M. Bridger, E.V. Volpi. - Springer, 2010. - 451 p. 5. Chen Z. A practical approach to the detection of prognostically significant genomic aberrations in multiple myeloma /Z. Chen, B. Issa, S. Huang [et al.j //J. Моl. Diagn. - 2005. - Vol. 7. - № 5. - P. 560-565. 6. Wan T.S. Molecular cytogenetics: an indispensable tool for cancer Diagnosis /T.S. Wan, E. S. Ma //Chang. Gung. Med. J. - 2012. - Vol. 35, № 2. - P. 96-110. 7. Munshi, N.С. Genomics in Multiple Myeloma /N.С. Munshi, H. Avet-Loiseau //Clin. Cancer Res. - 2011. - Vol. 17. - N. 6. - P. 1234-1242. 8. Liehr T. The current state of molecular cytogenetics in cancer diagnosis /T. Liehr, M.A. Othman, K. Rittscher, E. Alhourani //Expert Rev. Мої. Diagn. - 2015. - Vol. 15, № 4. - P. 517-26. 9. Campbell L.J. Cancer Cytogenetics. Methods and Protocols /edited by L.J. Campbell. - [Second Edition]. - Humana Press, 2011. - 273 p. (прототип) 10. Цитогенетичні методи дослідження хромосом людини: метод, рек. /уклад. Т.Е. ЗероваЛюбимова, Н.Г. Горовенко. - Київ, 2003. - 24 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 6 UA 107457 U 5 10 15 Спосіб покращення якості препаратів інтерфазних ядер клітин кісткового мозку хворих на множинну мієлому з метою підвищення діагностичних та прогностичних оцінок, що включає культивування клітин в поживному середовищі, обробку клітин культури розчином колцеміду та гіпотонічним розчином, фіксацію клітин на предметне скло, денатурацію ДНК, гібридизацію з ДНК пробами, постгібридизаційне промивання препаратів та візуалізацію гібридизації, який відрізняється тим, що при культивуванні клітин кісткового мозку підібрано режим, під час якого до 1 мл матеріалу кісткового мозку додається 10 мл поживного середовища RPMI 1640 та інкубується протягом 24-х годин, а на 24-й годині до культуридодається 100 мкл розчину колцеміду та витримується 25 хвилин, при цьому в процесі передгібридизаційної підготовки препарати необхідно прогріти на термоплиті при температурі 60 °C протягом 30 хвилин, а при постгібридизаційній відмивці препарати витримуються по 10 хвилин в трьох розчинах 50 % формаміду, 5 хвилин в розчині 2×SSC та 2 хвилини в розчині 0,4×SSC/0,3 % NP-40 за температури 42 °C, а з останнього розчину препарати переносять на 1 хвилину в розчин 2×SSC/0,1 % NP-40 кімнатної температури. 7 UA 107457 U Комп’ютерна верстка О. Рябко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 8