Застосування солей 3-карбоксі-n-етил-n,n-диметилпропан-1-амінію в лікуванні серцево-судинної хвороби

Реферат: Солі 3-карбоксі-N-етил-N,N-диметилпропан-1-амінію, спосіб їх отримання і застосування в лікуванні серцево-судинного захворювання. UA 109933 C2 (12) UA 109933 C2 UA 109933 C2 Галузь техніки Даний винахід стосується солей нової сполуки 3-карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1амінію і способу її отримання (сполука формули 4) N AcO R1 = 20 25 30 35 40 45 50 COOH O COOH , - OOC 15 R1 4 5 10 + -OOC HN , -OOC COOH NH O , -OOC H2PO4 , . Даний винахід стосується також застосування солей 3-карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан1-амінію в лікуванні серцево-судинної хвороби. Рівень техніки Серцево-судинні хвороби (ССХ) - це група розладів серця і кровоносних судин. За оцінкою 16,7 мільйону або 29,2 % смертей у світі є результатом різних форм серцевосудинної хвороби (ССХ). Інфаркт міокарду (серцевий напад) є серйозним результатом хвороби коронарних артерій. Інфаркт міокарду (ІМ) - це необоротний некроз серцевого м'язу, вторинний до пролонгованої ішемії. Серцевий напад або інфаркт міокарду є станом, який представляє собою загрозу життю і вимагає термінової медичної допомоги, коли постачання крові до серця раптово і сильно зменшується або припиняється, спричинюючи до загибелі м'язу через нестачу кисню. Щороку понад 1,1 мільйону людей зазнають серцевого нападу (інфаркту міокарду), і для багатьох з них цей серцевий напад є їх першим симптомом хвороби коронарних артерій. Серцевий напад може бути достатньо тяжким, щоб викликати смерть, або він може бути мовчазним. Одна людина з кожних п'яти має тільки слабкі симптоми або не має їх зовсім, і серцевий напад може бути виявленим тільки при рутинній електрокардіографії, здійсненій дещо пізніше. Серцевий напад (інфаркт міокарду) звичайно викликається згустком крові, який блокує артерію серця. Ця артерія часто вже є звуженою жировими відкладеннями на її стінках. Такі відкладення можуть розриватись або прориватись, зменшуючи потік крові і вивільнюючи речовини, які роблять тромбоцити крові клейкими і такими, що легко утворюють згустки. Деколи згусток утворюється всередині самого серця, потім відривається і застрягає в артерії, яка живить серце. Спазм в одній з таких артерій призводить до припинення кровотоку. γ-Бутиробетаїн, з якого організм ссавця синтезує карнітин, спочатку був охарактеризований як токсична речовина, яка прискорює дихання, викликає слинотечу і сльозотечу, розширення зіниці ока, вазоконстрикцію і зупинку серця в діастолі LINNEWEH, W. Gamma-Butyrobetain, Crotonbetain und Carnitin im tierischen Stoffwechsel. Hoppe-Seylers Zeitschrift für physiologische Chemie. 1929, vol.181, p.42-53. В той самий час, в пізніших статтях інших авторів з'ясувалось, що γ-бутиробетаїн є вкрай низько токсичним (LD50>7000 мг/кг при підшкірному введенні) ROTZSCH, W. lber die Toxizitat des Carnitins und einiger verwandter Stoffe. Acta biol. med. germ… 1959, vol.3, p.28-36. В літературі дані щодо незаміщених серцево-судинних ефектів γ-бутиробетаїну є відсутніми, хоча в публікації HOSEIN, E.A. Pharmacological actions of γ-butyrobetaine. Nature. 1959, vol.183, p.328-329 повідомлялось, що γ-бутиробетаїн є речовиною, подібною до ацетилхоліну з пролонгованою дією. Однак пізніше ті ж автори повідомили, що через помилку в проведених експериментах в дійсності не γ-бутиробетаїн, а його метиловий ефір володіє холінергічними властивостями. На відміну від попередньої характеристики γ-бутиробетаїну, його було охарактеризовано як фармакологічно інертну речовину HOSEIN, E.A. Isolation and probable functions of betaine esters in brain metabolism. Nature. 1960, vol.187, p.321-322. Структурно споріднені з солями 3-карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1-амінію сполуки є описаними в: - GB 1238868 A 14.07.1971: описані бетаїни, такі як 4-триметиламоніобутаноат, використовувані для отримання полімерів. Однак жодних фармакологічних властивостей цих бетаїнів не представлено; - US 5973026 A (XEROX CORP) 26.10.1999: описані 4-триметиламоніобутаноат і 3[діетил(метил)амоніо]пропіонат для використання у рецептурах чорнила; - LLOYD ANDREW, et al. A comparison of glycine, sarcosine, N,N-dimethylglycine, glycinebetaine and N-modified betaines as liposome cryoprotectants. Journal of pharmacy and pharmacology. 1992, 1 UA 109933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 vol.44, no.6, p.507-511: описаний 2-[етил(диметил)амоніо]ацетат, використовуваний як кріопротектор для ліпосомів; - DAVID B., THOMAS, et al. Synthesis, Characterization, and Aqueous Solution Behavior of Electrolyte-and pH-Responsive Carboxybetaine-Containing Cyclocopolymers. Macromolecules. 2003, vol.36, no.26, p.9710-9715: описаний 4-[диаліл(метил)амоніо]бутаноат і його синтез, виходячи з N,N-диаліл-N-метиламонію і етил 4-бромбутаноату. Вільна кислота отримується зі складного ефіру на другому етапі з використанням іонообмінної смоли Амберліт. Цей продукт використовується як проміжний продукт для синтезу полімерів; - Prelog V. 1930, vol.2, p.712-722: описаний синтез 4-триметиламоніобутаноату, виходячи з 4диметиламоніобутаноату і метилйодиду; - JP 2009096766 A (KONAN GAKUEN) 07.05.2009: описаний 4-триметиламоніобутаноат і його синтез, починаючи з триметиламіну і етил 4-бромбутаноату. Вільна кислота отримується зі складного ефіру на другому етапі з використанням іонообмінної смоли Амберліт; - WO 2008/055843 A (KALVINSH IVARS; CHERNOBROVIJS ALEKSANDRS; VARACHEVA LARISA; PUGOVICHS OSVALDS) 15.05.2008: описаний 4-триметиламоніобутаноат і його синтез, який починається з відповідного складного ефіру і використовує розчин KOH; - CA 2508094 A (VIVIER CANADA INC) 20.11.2006: описані бетаїни, такі як 4триметиламоніобутаноат, для використання в якості медикаменту для прискорення синтезу колагену; - US 5965615 A (TAIHO PHARMACEUTICAL CO LTD; VALSTS ZINATNISKA IESTADE BEZP) 12.10.1999: описаний 4-триметиламоніобутаноат як медикамент для лікування метаболічного розладу міокарду; ту ж саму сполуку було описано в US 2007191381 A (CONCERT PHARMACEUTICALS INC) 16.08.2007 для лікування інфаркта міокарду. 3-(2,2,2-Триметилгідразиній) пропіонат дигідрат є відомим як сполука з кардіопротекторними властивостями (ця речовина є відомою під міжнародною невласною назвою Мелдоній). 3-(2,2,2Триметилгідразиній) пропіонат є описаним в US 4481218 (INST ORGANICHESKOGO SINTEZA) 06.11.1984, а також в US 4451485 A (INSTITU ORCH SINTEZA AKADEMII) 29.05.1984. Добре відомо, що 3-(2,2,2-триметилгідразиній) пропіонат як дигідрат широко використовується для контролювання співвідношення концентрацій карнітину і гаммабутиробетаїну і, відповідно, швидкості бета-окислення жирних кислот в організмі. DAMBROVA M., LIEPINSH E., KALVINSH I. I. Mildronate: cardioprotective action through carnitine-lowering effect. Trends in Cardiovascular Medicine, 2002, vol.12, no.6, p.275-279. Завдяки цим властивостям Мелдоній екстенсивно застосовується в медицині в якості протиішемічного препарату, протектора від стресу і кардіопротекторного препарату в лікуванні різних серцево-судинних захворювань та інших патологій, повязаних з ішемією тканин. KARPOV R.S., KOSHELSKAYA O.A., VRUBLEVSKY A.V., SOKOLOV A.A., TEPLYAKOV A.T., SKARDA I., DZERVE V., KLINTSARE D., VITOLS A., KALNINS U., KALVINSH I., MATVEYA L., URBANE D. Clinical Efficacy and Safety of Mildronate in Patients With Ischemic Heart Disease and Chronic Heart Failure. Kardiologiya. 2000, no.6, p.69-74. В лікуванні серцево-судинних захворювань механізм дії 3-(2,2,2-триметилгідразиній) пропіонату базується на обмеженні швидкості біосинтезу карнітину і пов'язаному з цим обмеженні транспорту жирних кислот з довгим ланцюгом через мітохондріальні мембрани. SIMKHOVICH B.Z., SHUTENKO Z.V., MEIRENA D.V., KHAGI K.B., MEZHAPUKE R.J., MOLODCHINA T.N., KALVINS I.J., LUKEVICS E. 3-(2,2,2,-Trimethylhydrazinium)propionate (THP) - a novel gamma-butyrobetaine hydroxylase inhibitor with cardioprotective properties. Biochemical Pharmacology. 1988, vol.37, p.195-202. KIRIMOTO T., ASAKA N., NAKANO M., TAJIMA K., MIYAKE H., MATSUURA N. Beneficial effects of MET-88, a γ-butyrobetaine hydroxylase inhibitor in rats with heart failure following myocardial infarction. European Journal of Pharmacology. 2000, vol.395, no.3, p.217-224. Суть винаходу Так, було відомо, що Мелдонію дигідрат має кардіопротекторний ефект, однак не було жодних даних про те, що γ-бутиробетаїн сам по собі має виражену кардіопротекторну дію. В патенті EP 0845986 B (KALVINSH IVARS, VEVERIS MARIS) 02.04.2003 описана фармацевтична композиція Мелдонію дигідрату і γ-бутиробетаїну для застосування в лікуванні серцевосудинних захворювань. Метою даного виходу є запропонувати сполуку, яка має виражений кардіопротекторний ефект. Вищеозачена мета досягається забезпеченням нових сполук - солей 3-карбокси-N-етил-N,Nдиметилпропан-1-амінію (сполука формули 4), що мають структуру, подібну до Мелдонію або γбутиробетаїну 60 2 UA 109933 C2 N + R1 COOH 4 AcO R1 = , - OOC 5 10 O COOH HN , -OOC COOH NH O -OOC , H2PO4 , -OOC . На наш подив, солі 3-карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1-амінію володіють вираженим кардіопротекторним ефектом і є більш ефективними ніж Мелдонію дигідрат в моделях інфаркту міокарда in vivo; завдяки цій властивості солі 3-карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1-амінію можуть використовуватись в медцині. Солі 3-карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1-амінію можуть використовуватись як розчин для ін'єкцій. Наступною метою даного винаходу є спосіб приготування вказаної сполуки формули 4. Тут описується процес, який може бути використаний з метою отримання цільової сполуки солей 3-карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1-амінію формули 4, дивись схему далі. EtMe2N COOEt Br N + Br COOEt 2 1 R1H N + N + COO 3 R1 COOH 4 15 20 25 30 35 40 Процес отримання солі 3-карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1-амінію формули 4 включає наступні етапи: а) додавання N,N-диметилетиламіну до етил 4-бромбутаноату (1) у відповідному розчиннику з отриманням 4-етокси-N-етил-N,N-диметил-4-оксо-1-бутанамінію броміду (2); b) пропускання 4-етокси-N-етил-N,N-диметил-4-оксо-1-бутанамінію броміду (2) через колонку з іонообмінною смолою з отриманням 4-[етил(диметил)амоніо] бутаноату (3); с) додавання кислоти, яка вибирається з 2-(ацетилокси)бензойної кислоти (4 a), або (E)цитраконової кислоти (4 b), або бурштинової кислоти (4 c), або 2,6-діоксо-1,2,3,6тетрагідропіримідин-4-карбонової кислоти моногідрату (4 d), або фосфорної кислоти (4 e), до 4[етил(диметил)амоніо] бутаноату (3) у відповідному розчиннику з отриманням солі 3-карбоксиN-етил-N,N-диметилпропан-1-амінію (4). Опис варіантів здійснення винаходу Даний винахід буде описаний більш докладно з посиланням на наступні необмежуючі приклади. Приготування 4-етокси-N-етил-N,N-диметил-4-оксо-1-бутанамінію броміду (2) Методика А До розчину етил 4-бромбутаноату (1) (20,0 г; 102,5 ммоль) в ацетонітрилі (70 мл) додали N,N-диметилетиламін (15 мл, 139 ммоль) і перемішували при температурі оточуючого середовища впродовж 3 днів. Реакційну суміш випарили, залишок розтерли з ацетоном (50 мл), профільтрували, промили ефіром і висушили, щоб отримати 26,051 г (94,8 %) 4-етокси-N-етил+ - + N,N-диметил-4-оксо-1-бутанамінію броміду. РХМС (ESI , m/z): [M-Br ] 188, чистота 98,9 %. 1 H ЯМР (CDCl3, HMDSO) : 1,26 (t, J=7,2 Гц, 3H); 1,44 (t, J=7,4 Гц, 3H); 2,00-2,11 (m, 2H); 2,52 (t, J=6,6 Гц, 2H); 3,40 (s, 6H); 3,64-3,73 (m, 2H); 3,69 (q, J=7,4 Гц, 2H); 4,14 (q, J=7,2 Гц, 2H). Методика В До розчину етил 4-бромбутаноату (1) (19,5 г; 100 ммоль) в ацетоні (70 мл) додали N,Nдиметилетиламін (15 мл, 139 ммоль) і перемішували при температурі оточуючого середовища впродовж 3 днів. Реакційну суміш профільтрували; тверду фазу промили ацетоном, ефіром і висушили, щоб отримати 24,19 г (90,2 %) титульної сполуки 2. Фільтрат випарили; залишок 3 UA 109933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (2,147 г) розтерли з ефіром і висушили, щоб отримати додаткову порцію (0,962 г, 3.6 %) продукту 2 тієї ж якості, що й основна порція. Випаровування ефірних промивок дозволило відновити 0,956 г (4,9 ммоль, 4,9 %) вихідного матеріалу 1. 4-етокси-N-етил-N,N-диметил-4+ - + оксо-1-бутанамінію бромід: РХМС (ESI , m/z): [M-Br ] 188, чистота 98,4 %. 1 H ЯМР (CDCl3, HMDSO) : 1,26 (t, J=7,2 Гц, 3H); 1,44 (t, J=7,4 Гц, 3H); 2,00-2,11 (m, 2H); 2,52 (t, J=6,6 Гц, 2H); 3,40 (s, 6H); 3,64-3,73 (m, 2H); 3,69 (q, J=7,4 Гц, 2H); 4,14 (q, J=7,2 Гц, 2H). Приготування 4-[етил(диметил)амоніо]бутаноату (3) Розчин 4-етокси-N-етил-N,N-диметил-4-оксо-1-бутанамінію броміду (2) (12,00 г, 44,7 ммоль) у воді (10 мл) пропустили через колонку з іонообмінною смолою Amberlite® IRA-410 (OH) (250 мл), повільно вимиваючи (ca. 10 крапель/хв.) етиловим спиртом (контроль ТШХ). Елюат випарили, а залишок (12 г) розчинили у воді (50 л). До цього розчину додали іонообмінну смолу DOWEX® 50WX8 (5 г) і перемішували при температурі оточуючого середовища впродовж 0,5 години. Реакційну суміш профільтрували через целіт (1 см), а елюат випарили. Залишок азеотропно висушили ізопропанолом, ацетонітрилом і ацетоном. Отриману тверду речовину розтерли з ацетоном (10 мл), і цю суміш витримали при 0 °C впродовж 2 годин. Осад відфільтрували і висушили in vacuo над P2O5, щоб отримати 4,65 г (65 %) 4[етил(диметил)амоніо]бутаноату (3). (DMSO-d6, HMDSO) : 1,24 (t, J=7,3 Гц, 3H); 1,66-1,76 (m, 2H); 1,81 (t, J=6,4 Гц, 2H); 2,95 (s, + + 6H); 3,16-3,23 (m, 2H); 3,29 (q, J=7,3 Гц, 2H). РХМС (ESI , m/z): 160 [M+H] . Аналітичне обчислення для C8H17NO2·1,55 H2O: C 51,34; H 10,82; N 7,48. Виявили: C 51,36; H 11,40; N 7,34. Приготування 3-карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1-аміній 2-(ацетилокси) бензоату (4 a) 3-Карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1-аміній 2-(ацетилокси)бензоат було отримано у формі суміші з водою. Так, ca. 90 % 4-[етил-(диметил)амоніо]бутаноат (3) (2,20 г; 12,44 ммоль) і 2-(ацетилокси)-бензойну кислоту (2,266 г; 12,57 ммоль) помістили в мірну колбу і розвели водою до 100 мл. Вміст колби розчиняється при нагріванні і осаджується при зниженні температури. 1 Згідно H-ЯМР, осаджений твердий матеріал складається з майже чистої 2-(ацетилокси)бензойної кислоти. Приготування 3-карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1-аміній (2E)-3-карбоксиакрилату (4 b) До розчину 4-[етил(диметил)амоніо]бутаноату (3) (2,0 г; 12,56 ммоль) в безводному етиловому спирті (10 мл) додали гарячий (60 °C) розчин (E)-цитраконової кислоти (1,46 г; 12,56 ммоль) в етиловому спирті (50 мл). Реакційній суміші дали постояти при температурі оточуючого середовища впродовж 2 годин, осаджені кристали відфільтрували і висушили над P2O5, щоб отримати 2,98 г (85 %) 3-карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1-аміній (2E)-3карбоксиакрилату. Температура плавлення 122-123 °C. 1 H-ЯМР (D2O, DSS) : 1,36 (tt, J=1,9; 7,3 Гц, 3H); 2,06 (m, 2H); 2,49 (t, J=7,1 Гц, 2H); 3,06 (s, + + 6H); 3,31 (m, 2H); 3,40 (q, J=7,3 Гц, 2H); 6,75 (s, 1,9H, CH=CH). РХМС ESI (m/z): 160 [M+H] . Титрометричні аналізи: вміст води (Фішер) 0,13 %, вміст бетаїну (HClO4) 93,0 %, вміст (E)цитраконової кислоти 46,1 %. Аналітичні обчислення для C8H17NO2·1,2 C4H4O4 (46,7 %): C 51,50; H 7,36, N 4,69. Виявлено: C 51,52; H 7,35, N 4,61. Приготування 3-карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1-аміній 3-карбоксипропаноату (4 c) 3-Карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1-аміній 3-карбоксипропаноат було отримано у формі водного розчину. Так, ca. 90 % 4-[етил-(диметил)амоніо]бутаноат (3) (2,20 г; 12,44 ммоль) і бурштинову кислоту (1,49 г; 12,62 ммоль) помістили в мірну колбу, розчинили у воді і розвели водою до 100 мл. Приготування 3-карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1-аміній 2,6-діоксо-1,2,3,6тетрагідропіримідин-4-карбоксилату (4 d) До розчину 4-[етил(диметил)амоніо]бутаноату (3) (2,0 г; 12,56 ммоль) в ізопропанолі (100 мл) додали 2,6-діоксо-1,2,3,6-тетрагідропіримідин-4-карбонової кислоти моногідрат (2,187 г; 12,56 ммоль), і реакційну суміш нагрівали зі зворотним холодильником, доки не розчинилась вся карбонова кислота. Реакційній суміші дали охолонути до температури оточуючого середовища, осаджені кристали відфільтрували, промили ізопропанолом (5 мл) і діетиловим ефіром (20 мл) і висушили над P2O5, щоб отримати 3,238 г (97,4 %) 3-карбокси-N-етил-N,Nдиметилпропан-1-аміній 2,6-діоксо-1,2,3,6-тетрагідропіримідин-4-карбоксилату. Температура плавлення 150,7 °C. 1 H-ЯМР (D2O, DSS) : 1,36 (tt, J=2,0; 7,3 Гц, 3H); 2,05 (m, 2H); 2,47 (t, J=7,0 Гц, 2H); 3,07 (s, 6H); 3,31 (m, 2H); 3,41 (q, J=7,3 Гц, 2H); 6,20 (s, 1H, C=CH). + + РХМС ESI (m/z): 160 [M+H] . Аналітичне обчислення для C8H17NO2·C5H4N2O4 (49,5 %): C 49,52; H 6,71; N 13,33. 4 UA 109933 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Виявлено: C 49,59; H 6,69; N 13,26. Приготування 3-карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1-аміній дигідрофосфат (4 e) До розчину 4-[етил(диметил)амоніо]бутаноату (3) (6,4 г; 40 ммоль) у воді (10 мл) додали розчин 85 % водної H3PO4 (4,73 г, 40 ммоль) в ацетоні (10 мл), і результуючий розчин перемішували при температурі оточуючого середовища впродовж 10 хвилин. Реакційну суміш випарили і азеотропно висушили кілька разів ацетоном на ротаційному випарнику при 45 °C. Отриману білу кристалічну речовину висушили над P2O5, щоб отримати 9,82 г (95 %) 3карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1-аміній дигідрофосфату. Температура плавлення 110135 °C. 1 H-ЯМР (D2O, DSS) : 1,36 (tt, J=1,8; 7,3 Гц, 3H); 2,06 (m, 2H); 2,50 (t, J=7,0 Гц, 2H); 3,06 (s, + + 6H); 3,32 (m, 2H); 3,41 (q, J=7,3 Гц, 2H). РХМС ESI (m/z): 160 [M+H] . Титрометричні аналізи: вміст води (Фішер) 0,356 %, вміст бетаїну (HClO4) - 95,682 %. Аналітичне обчислення для C8H17NO2·0,052 H2O (0,356 %) · 1,07 H3PO4 (39,6 %): C 36,26; H 7,73; N 5,29. Виявлено: C 36,20; H 7,72; N 5,11. Чистоту отриманого 3-карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1-аміній дигідрофосфату було поліпшено кристалізацією з метилового спирту. Так, 3-карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1аміній дигідрофосфат (6,9 г) був кристалізований з метилового спирту (40 мл), щоб дати 5,326 г (77 %) очищеного 3-карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1-аміній дигідрофосфату з температурою плавлення 139 °C. Аналітичне обчислення для C8H17NO2·H3PO4 (38,1 %): C 37,36; H 7,84; N 5,45. Виявлено: C 37,52; H 7,85; N 5,39. Кардіопротекторна активність П'ятдесят самців 10-тижневих щурів Wistar вагою 200-250 г помістили в стандартні умови ° (21-23 С, 12-годинний цикл світла-темряви) з необмеженим доступом до корму (раціон R3, Lactamin AB, Швеція) і води. Щури адаптувались до місцевих умов впродовж двох тижнів перед початком обробки. Мелдонію дигідрат в дозі 20 мг/кг, гамма-бутиробетаїн в дозі 20 мг/кг і солі 3-карбокси-N-етилN,N-диметилпропан-1-амінію в дозі 20 мг/кг вводились перорально щоденно впродовж 8 тижнів. Контрольні щури отримували воду. Дослідження інфаркту на ізольованому серці щура Експеримент на ізольованому серці щура було проведено суттєво так, як було описано раніше (Liepinsh et al., J. Cardiovasc. Pharmacol. 2006; 48(6):314-9). Через 24 години після останнього введення препарату серце висікали і здійснювали ретроградну перфузію через аорту при постійному тиску оксигенованим буфером Krebs-Henseleit при 37°. Постійно реєстрували частоту скорочень серця, тиск в лівому шлуночку в кінці діастоли і тиск, який розвивається в лівому шлуночку. Коронарний кровотік вимірювали за допомогою ультразвукового детектору потоку (HSE) і системи PowerLab 8 /30 від ADInstruments. Перфузію серця здійснювали 20 хвилин, щоб стабілізувати гемодинамічні функції, а потім викликали оклюзію на 60 хвилин, затягуючи нитки через пластикову трубку. Успішна оклюзія підтверджувалась зменшенням коронарного кровотоку приблизно на 40 %. Реперфузія досягалась розпусканням ниток. В кінці 150-хвилинного періоду реперфузії 0,1 % метиленовим синім обводили зону ризику. Потім серце розсікали поперек від верхівки до основи на п'ять зрізів 2 мм завтовшки і інкубували їх в 1 % трифенілтетразолії хлориді у фосфатному буфері (pH 7,4; 37 °C) впродовж 10 хвилин, щоб зафарбувати життєздатну тканину червоним, а некротичну тканину білим. Комп'ютеризований планіметричний аналіз фотографій Sony A900 був здійснений з використанням програмного забезпечення Image-Pro Plus 6.3 для визначення площі ризику і площі некрозу, виражених як % від площі лівого шлуночку. Отримані величини були потім використані для обчислення розміру інфаркту як % від площі ризику у відповідності до формули: Розмір інфаркту = Площа некрозу/Площа ризику  100 %. Ефекти, спостережувані в моделі інфаркту на ізольованому серці щура Анти-інфарктний ефект тестових речовин досліджувався на моделі інфаркту в ізольованому серці щура. Під час оклюзії лівої коронарної артерії коронарний кровотік у всіх експериментальних групах зменшувався на 40 % (з 11 мл/хв. до 7 мл/хв.). Більше того, спостерігалось падіння на 50 % тиску, який розвивається в лівому шлуночку. Частота серцевих скорочень під час періоду оклюзії суттєво не змінювалась. На стадії реперфузії коронарний кровотік, тиск, який розвивається в лівому шлуночку, і величини ±dp/dt відновлювались тільки на близько 80 % від контрольного рівня. Достовірної різниці між контрольною групою і групами, в яких вводились тестові речовини, не спостерігалось. 5 UA 109933 C2 Вплив Мелдонію дигідрату в дозі 20 мг/кг, гамма-бутиробетаїну в дозі 20 мг/кг і солей 3карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1-амінію в дозі 20 мг/кг після 2 тижнів введення цих тестових речовин на розмір інфаркту при експериментальному інфаркті на ізольованому серці щура є показаним в Таблиці 1, Таблиці 2, Таблиці 3, Таблиці 4 і Таблиці 5. 5 Таблиця 1 Вплив Мелдонію дигідрату, гамма-бутиробетаїну і 3-карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1-аміній 2(ацетилокси)бензоату на розмір інфаркту Контроль Мелдонію дигідрат 20 мг/кг Гамма-бутиробетаїн 20 мг/кг 3-Карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1-аміній 2(ацетилокси)бензоат 20 мг/кг Розмір інфаркту, % від контролю 100,0±5,9 117,9±7,9 87,6±11,4 ,#,$ 61,6±6,7* Таблиця 2 Вплив Мелдонію дигідрату, гамма-бутиробетаїну і 3-карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1-аміній (2Е)-3-карбоксиакрилату на розмір інфаркту Контроль Мелдонію дигідрат 20 мг/кг Гамма-бутиробетаїн 20 мг/кг 3-Карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1-аміній (2Е)-3карбоксиакрилат 20 мг/кг Розмір інфаркту, % від контролю 100,0±5,9 117,9±7,9 87,6±11,4 ,#,$ 46,5±7,0* Таблиця 3 Вплив Мелдонію дигідрату, гамма-бутиробетаїну і 3-карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1аміній 2,6-діоксо-1,2,3,6-тетрагідропіримідин-4-карбоксилату на розмір інфаркту Контроль Мелдонію дигідрат 20 мг/кг Гамма-бутиробетаїн 20 мг/кг 3-Карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1-аміній 2,6-діоксо1,2,3,6-тетрагідропіримідин-4-карбоксилат 20 мг/кг Розмір інфаркту, % від контролю 100,0±5,9 117,9±7,9 87,6±11,4 ,#,$ 60,6±6,7* Таблиця 4 Вплив Мелдонію дигідрату, гамма-бутиробетаїну і 3-карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1-аміній дигідрофосфату на розмір інфаркту Контроль Мелдонію дигідрат 20 мг/кг Гамма-бутиробетаїн 20 мг/кг 3-Карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1-аміній дигідрофосфат 20 мг/кг 10 6 Розмір інфаркту, % від контролю 100,0±5,9 117,9±7,9 87,6±11,4 ,#,$ 56,1±4,4* UA 109933 C2 Таблиця 5 Вплив Мелдонію дигідрату, гамма-бутиробетаїну і 3-карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1-аміній 3-карбоксипропаноату на розмір інфаркту Розмір інфаркту, % від контролю 100,0±5,9 117,9±7,9 87,6±11,4 Контроль Мелдонію дигідрат 20 мг/кг Гамма-бутиробетаїн 20 мг/кг 3-Карбокси-N-етил-N,N-диметилпропан-1-аміній 3карбоксипропаноат 20 мг/кг 5 10 15 ,#,$ 62,9±4,7* Кожна величина в Таблицях 1-5 представляє собою середнє значення ± стандартна похибка середнього значення для 9-10 тварин. # *p