Синбіотична композиція

Реферат: Синбіотична композиція включає живі клітини штамів Bacillus subtilis IMB В-7142 та Bacillus 8 10 subtilis IMB В-7143 з титром клітин 10 -10 КУО/мл у співвідношенні 1-2:2-1. Додатково містить преобітик лактит та/або лактулозу у концентрації 10-15 мас. %. UA 70017 U (12) UA 70017 U UA 70017 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі біотехнології, а саме до нових синбіотичних препаратів на основі мікроорганізмів, призначених для відновлення нормальної мікрофлори кишечнику. Зокрема, запропоноване технічне рішення стосується синбіотичної композиції на основі бактерій роду Bacillus та лактиту та/або лактулози. Заявлена корисна модель може знайти своє застосування у медицині, ветеринарії, харчовій та фармацевтичній промисловості, для лікування та профілактики дисбіозів та гострих шлунково-кишкових інфекцій, що викликані патогенними та умовно патогенними мікроорганізмами, у тварин та людини. На сьогоднішній день пробіотики на основі біфідобактерій, лактобактерій, аеробних спороутворюючих бактерій роду Bacillus знаходять широке застосування для профілактики та лікування інфекційних захворювань людини, сільськогосподарських тварин та птахів. Бацили, що складають основу багатьох добре відомих пробіотичних препаратів (бактисубтил, біосубтил, біоспорин, споробактерин, ентерогермін, субалін та інші), характеризуються різними спектрами антимікробної активності. Ефективність таких пробіотичних препаратів визначається широтою спектра та силою антагоністичної активності штамів, що входять до його складу. Серед пробіотиків на основі штамів Bacillus subtilis на Україні застосовується біопрепарат Ендоспорин, що являє собою етіотропний пробіотик для лікування та профілактики кишкових та гнійних інфекцій та післяпологових ендометритів у сільськогосподарських тварин (UA7669, А61К 35/74, опубл. 01.08.2006). Він характеризується антагоністичною активністю щодо штамів родів Pseudomonas, Streptococcus, Acinetobacter, Staphylococcus, Escherichia, Proteus, Salmonella, Shigella, Candida. Ендоспорин стимулює імунні реакції організму та пригнічує патогенну мікрофлору шлунково-кишкового тракту. До його складу входять ліофілізовані життєздатні клітини штамів Bacillus subtilis IMB В-7142 та В.subtilis IMB В-7143, які доповнюють один одного за біологічною активністю, стабілізатор, кріопротектор та сухий залишок середовища росту. Проте недоліком даного препарату можна вважати його недостатньо високу ефективність, яка зумовлена частковою нейтралізацією пробіотичної складової травними соками шлунковокишкового тракту, що є характерним для усіх пробіотиків. Вказана проблема може вирішуватися за рахунок комбінування пробіотичної мікрофлори з добавками, які стимулюють її ріст - пребіотиками, з одержанням синбіотиків. Пребіотики являють собою неперетравлювану субстанцію, найчастіше вуглеводи з низькою молекулярною вагою - олігосахариди. Як пребіотики найчастіше використовують фруктоолігосахариди або інші вуглеводи, які не ферментуються ензимами травної системи макроорганізму, але активно використовуються облігатною сахаролітичною мікрофлорою товстої кишки як джерело харчування. На сьогоднішній день відомі синбіотичні препарати, складаються з біомаси штамів біфідо- та/або лактобактерій та пребіотиків. Підвищений інтерес до синбіотиків обумовлений тим, що вони забезпечують більш високу терапевтичну дію, ніж пробіотики та пребіотики, узяті окремо. Відомий синбіотичний лікарський засіб для корекції дисбіотичних розладів (UA 25909, МПК А61К 35/74, А61К 9/20, опубл. 27.08.2007). Засіб, що містить 60,0-70,0 мас. % біфідумбактерину, використовується у формі таблеток, вкритих оболонкою, які розчиняються у кишечнику. Як стимулятор росту біфідобактерій використовують інулін або мультисорб, вміст яких складає 2,55,0 мас. %. Допоміжні агенти вибирають з наступних: кроскармелоза натрію, крохмаль кукурудзяний, МКЦ, аеросил, тальк, стеарат магнію. Недоліком є наявність у складі препарату лише біфідобактерій, що звужує спектр антагоністичної активності препарату та не сприяє ефективному відновленню мікрофлори кишечнику. Публікація міжнародної заявки WO 2004089115 описує композицію синбіотика, яка включає штам Lactobacillus NCIMB 41114 або його еквівалент та принаймні один неперетравлюваний у кишечнику олігосахарид, який є вибраним з галактоолігосахариду, фруктоолігосахариду, ксилоолігосахариду, соєвого олігосахариду, ізомальтоолігосахариду, фруктану, інуліну, лактулози, глюкосахариду та лактосахарози. Як і в попередньому випадку, наявність мікроорганізмів одного виду є причиною обмеженого спектра антагоністичної активності. У патенті UA46404 (МПК А61К 35/74, А61К 9/20, опубл. 25.12.2009) описаний комбінований синбіотичний лікарський засіб у формі таблеток, що включає пробіотики біфідумбактерин (45,065,0 мас. %) та лактобактерин (0,4-0,6 мас. %), а також пребіотик, що являє собою інутан та/або лактулакс у кількості 8,0-14,0 мас. %, та допоміжні формоутворюючі речовини. Зазначений синбіотик характеризується високою терапевтичною активністю, збереженням життєздатності бактерій у процесі зберігання і вживання, а також зручністю застосування. Вказаний синбіотичний препарат є вибраним як прототип запропонованої корисної моделі. Недоліками синбіотичного препарату за патентом UA46404 є обмеженість спектра його антагоністичної ефективності проти збудників кишкових інфекцій та умовно патогенних мікроорганізмів, зокрема таких як Pseudomonas spp., Sytreptococcus spp., Enterococcus spp. 1 UA 70017 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В основу корисної моделі поставлена задача розробки синбіотичної композиції, яка характеризується більш широким спектром антагоністичної активності за рахунок підбору штамів аеробних спороутворюючих бактерій роду Bacillus, зокрема, таких Bacillus subtilis, які взаємодоповнюють один одного за спектром антагоністичної активності та проявляють синергетичну біологічну активність при одночасному застосуванні. Крім того, запропонований комплексний пробіотичний препарат є зручним для виробництва та може бути рецептований у вигляді різноманітних препаративних форм. Технічним результатом, що досягається при застосуванні синбіотичної композиції, згідно з корисною моделлю, є підвищення ефективності профілактики та лікування дисбактеріозів та інфекційних захворювань шлунково-кишкового тракту, швидка нормалізація його мікробіоценозу. Поставлена задача вирішується за рахунок створення синбіотичної композиції, яка включає 810 живі клітини штамів В.subtilis IMB В-7142 та В.subtilis IMB В-7143 з титром клітин 10 10 КУО/мл у співвідношенні 1-2:2-1, а також преобітик лактулозу та/або лактит у концентрації 10-15 мас. %. Штами Bacillus subtilis IMB В-7142 та В.subtilis IMB В-7143, які входять до складу запропонованої синбіотичної композиції як пробіотична основа, характеризуються високою взаємодоповнюючою антагоністичною активністю стосовно широкого спектра патогенних та умовно патогенних мікроорганізмів та проявляють синергетичний ефект, який проявляється у підвищенні антагоністичної, лізоцимстимулюючої та імуномоделюючої активності препарату у порівнянні із кожним зі штамів, узятих окремо. При цьому В. subtilis IMB В-7142 інгібує штами E.coli, Proteus та різні види грибів, а В. subtilis IMB В-7143 демонструє виражену антагоністичну активність щодо культур бактерій Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter sp., Ps. syringae pv. atrofaciens, Agrobacterium tumefaciens, Clavibacter michiganensis subs, michiganensis. У складі 810 запропонованої композиції зазначені штами, вирощені до одержання титру 10 10 КУО/мл, використовуються у співвідношенні 1-2:2-1. У переважному втіленні, згідно з корисною моделлю, співвідношення пробіотичних штамів 10 Bacillus subtilis IMB В-7142 та Bacillus subtilis IMB В-7143, вирощених до титра 10 КУО/мл, складає 1:1. Як пребіотичний компонент, що посилює інгібування росту патогенних та умовно патогенних мікроорганізмів, запропонований синбіотик містить лактит або лактулозу, що виявляють високу біосумісність з пробіотичними штамами Bacillus subtilis IMB В-7142 та Bacillus subtilis IMB В7143. Зазначені олігосахариди поліпшують умови для розвитку клітин Bacillus subtilis за рахунок збагачення середовища факторами, що стимулюють ріст мікроорганізмів при одночасному доповненні складу препарату фізіологічно корисними компонентами. Пребіотики лактит та лактулоза сприяють підтримці ефективної кількості бацил, біфідо- та лактобактерій у шлунковокишковому тракті. Слід зазначити, що лактит та лактулоза раніше використовувалися у синбіотичних препаратах тільки як лактогенні та біфідогенні пребіотики, тобто такі, що стимулюють ріст лактобацил та біфідобактерій. Для застосування у складі синбіотичних препаратів на основі бацил зазначені пребіотики вперше були використані авторами даної корисної моделі. Лактит та лактулоза належать до синтетичних дисахаридів. Оскільки в організмі людини відсутні специфічні ферменти, лактит та лактулоза не піддаються ферментативному розщепленню у верхніх відділах травного тракту, у незмінному вигляді досягають порожнини товстого кишечнику, де вони стають джерелом енергії та поживних речовин для нормальної мікрофлори кишечнику. При пероральному введенні зазначені дисахариди не всмоктуються у шлунково-кишковому тракті. Було продемонстровано здатність лактиту та лактулози інгібувати ріст сальмонел, шигел та грибів роду Candida у товстому кишечнику. Лактит та лактулоза сприяють утворенню коротколанцюгових жирних кислот, викликаючи таким чином зниження кислотності вмісту кишечнику, що призводить до пригнічення росту чужорідної для даного біотопу протеолітичної мікрофлори. Крім того застосування вказаних олігосахаридів підвищує бар'єрні функції слизової оболонки кишечнику та інгібування процесу транслокації ентеропатогенних мікроорганізмів та продуктів їх метаболізму з травного тракту у внутрішні органи. У переважному втіленні синбіотична композиція включає лактит або лактулозу у концентрації 15 мас. %. На Фігурі 1 приведені діаграми, що ілюструють інгібування росту тест-культур умовно патогенних мікроорганізмів при дії заявленої синбіотичної композиції при використанні різних вихідних титрів бацил (співвідношення Bacillus subtilis IMB В-7142 та Bacillus subtilis IMB В-7143 складало 1:1). 2 UA 70017 U 5 10 15 20 25 На Фігурі 2 представлені діаграми, які характеризують мікрофлору кишечнику (як нормальну, так і умовно патогенних мікроорганізмів) експериментальних тварин для усіх варіантів досліду на 11 день лікування. Корисна модель може бути проілюстрована наступними прикладами. Приклад 1. Одержання рідкої синбіотичної композиції. Бактерії штамів В.subtilis IMB В-7142 та В.subtilis IMB В-7143 вирощували у періодичній культурі на качалці (200 об./хв.) при 37 °C у колбах об'ємом 750 мл з 50 мл поживного середовища, що містить (г/л): глюкоза - 15,0; цитрат натрію - 1,29; (NH4)2HPO4-4,75; KH2PO4-9,6; Mg2SO4 × 7Η2Ο - 0,18, pΗ середовища 7,0±0,2. Час культивування 24 години. Суспензії штамів бацил з вихідними титрами клітин lgKYO 9 змішували у співвідношенні 1:1, до них додавали лактит або лактулозу до одержання концентрації у синбіотичному препараті 15 мас. %. При цьому одержували біопрепарат із вмістом біомаси штаму В. subtilis IMB В-7142 у 8 8 титрі 5 × 10 КУО/мл та біомаси штаму В. subtilis IMB В-7143 у титрі 5 × 10 КУО/мл. Одержаний таким чином препарат використовували для дослідження антагоністичної активності, контролю ростових та мікробіологічних показників. Приклад 2. Дослідження антагоністичної активності. Антагоністичну активність визначали на середовищі Гаузе-2 при сумісному культивуванні штамів тест-культур мікроорганізмів та синбіотичної композиції, згідно з корисною моделлю, при 37 °C протягом 24 годин. Так, після одержання синбіотичної композиції так, як описано у Прикладі 1, 0,1 мл суспензії висівали на диференційно-діагностичні середовища: Ендо для визначення кількості життєздатних клітин Escherichia coli (штам УКМ В-930), стафілококовий агар - Staphylococcus aureus (штам УКМ В-4001); малахітовий агар - Pseudomonas aeruginosa (штам УКМ В-329) та сабуро-агар - Candida albicans (штам УКМ Y-690). Кількість життєздатних клітин умовно патогенних мікроорганізмів визначали до та після їх сумісного культивування з різними варіантами запропонованої синбіотичної композиції. Одержані результати виражали у lgKУO/мл. Дані стосовно впливу запропонованої синбіотичної композиції різного складу на концентрацію клітин УПМ представлені у Таблиці 1. На Фігурі 1 приведені діаграми, які ілюструють ступінь інгібування росту тест-культур УПМ, яку виражали у вигляді втрати останніх у %. 30 3 UA 70017 U Таблиця 1 Вплив заявленої синбіотичної композиції на основі В. subtilis IMB В-7142, В. subtilis IMB В-7143 10 (використовуваний титр 10 КУО/мл) та лактиту або лактулози на кількість клітин умовно патогенних мікроорганізмів в результаті сумісного культивування Staphylococcus aureus, Escherichia coli Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa. Варіанти співвідношення компонентів композиції B.s. IMB B.s. IMB ВЛактит В-7142 7143 1 1 5 1 1 10 1 1 15 1 2 5 1 2 10 1 2 15 2 1 5 2 1 10 2 1 15 B.s. IMB B.s. IMB BЛактулоза B-7142 7143 1 1 5 1 1 10 1 1 15 1 2 5 1 2 10 1 2 15 2 1 5 2 1 10 2 1 15 5 10 15 20 25 Кількість життєздатних клітин УПМ в процесі культивування, lgКУО/мл S. aureus Е. coli С.albicans P. aeruginosa до після до після до після до після 9,4 5,3 9,9 5,5 9,6 4,2 9,5 6,4 9,4 5,1 9,9 5,0 9,6 4,0 9,5 6,3 9,4 4,2 9,9 4,8 9,6 3,6 9,5 6,0 9,4 5,4 9,9 5,1 9,6 4,4 9,5 6,5 9,4 5,3 9,9 5,5 9,6 4,2 9,5 5,5 9,4 5,3 9,9 5,5 9,6 4,2 9,5 6,5 9,4 6,3 9,9 5,5 9,6 4,1 9,5 6,5 9,4 5,3 9,9 5,5 9,6 4,1 9,5 6,5 9,4 5,3 9,9 5,0 9,6 5,0 9,5 6,3 10,4 10,4 10,4 10,4 10,4 10,4 10,4 10,4 10,4 6,3 6,2 6,0 6,4 6,4 6,4 6,3 6,3 6,2 9,9 9,9 9,9 9,9 9,9 9,9 9,9 9,9 9,9 6,5 6,5 6,4 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 9,7 9,7 9,7 9,7 9,7 9,7 9,7 9,7 9,7 5,2 5,2 5,1 5,2 5,3 5,2 5,2 5,2 5,2 9,5 9,5 9,5 9,5 9,5 9,5 9,5 9,5 9,5 7,1 7,0 7,0 7,1 7,0 7,0 7,1 7,2 7,3 Аналогічні дані були одержані при використанні титрів бацил у запропонованій синбіотичній 8 9 композиції 10 та 10 КУО/мл. Як свідчать представлені дані, при сумісному культивуванні заявленої композиції на основі Bacillus subtilis IMB B-7142, Bacillus subtilis IMB B-7143 та лактиту/лактулози спостерігали виражену антагоністичну активність стосовно тест-культур умовно патогенних мікроорганізмів (УПМ). Приклад 3. Дослідження ефективності симбіотичної композиції на тваринах. Для досліду на тваринах використовували безпородних мишей вагою 18-20 г. Для одержання експериментальної моделі дисбактеріозу тваринам протягом 14 днів перорально вводили один раз на добу 0,2 мл розчину антибіотика ампіциліну, що відповідало дозі 4 мг ампіциліну на мишу. Тварин випадковим чином розподіляли на 9 груп (10 тварин у кожній групі). Усі тварини утримувалися в однакових умовах та одержували однаковий раціон харчування. Контрольна група тварин (група 1) не одержувала антибіотиків. Група 2 тварин з експериментальним дисбактеріозом не піддавалася лікуванню наслідків антибіотикотерапії. Третя група одержувала тільки пробіотичний штам Bacillus subtilis IMB В-7142, четверта Bacillus subtilis IMB B-7143, п'ята - тільки лактит, шоста - тільки лактулозу, сьома - композицію на основі пробіотичних штамів Bacillus subtilis IMB В-7142 та Bacillus subtilis IMB B-7143, узятих у співвідношенні 1:1, восьма - синбіотичну композицію на основі штамів Bacillus subtilis IMB В7142 та Bacillus subtilis IMB В-7143 та лактиту, дев'ята - синбіотичну композицію на основі штамів Bacillus subtilis IMB В-7142 та Bacillus subtilis IMB В-7143 та лактулози. Лікування тварин при використанні вказаних варіантів досліду проводили протягом 11 днів. Бактеріологічні дослідження здійснювали на 4, 7 та 11 день. Визначення видового та кількісного складу мікрофлори вмісту товстого кишечнику лабораторних тварин проводили шляхом висівання десятикратних розведень фекалій на стандартний набір селективних та диференційно-діагностичних середовищ для виділення аеробних та анаеробних мікроорганізмів (Методические рекомендации. Применение бактериальных биологических препаратов в 4 UA 70017 U 5 10 15 20 практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение дисбактериозов кишечника. - М., 1986.-23 с.). Вивчення впливу досліджуваних композицій на швидкість нормалізації мікрофлори після експериментального дисбактеріозу проводили шляхом визначення вмісту життєздатних клітин мікроорганізмів різних систематичних груп у фекаліях досліджуваних тварин та мікроскопії забарвлених за Грамом мазків. Кількісний вміст біфідобактерій визначали шляхом висівання 0,1 мл суспензії, узятої у 59 розведеннях 10- 10- , на напіврідке середовище Блаукока. Молочнокислі бактерії 59 (лактобацили) визначали шляхом висівання 0,1 мл суспензії, узятої у розведеннях 10- 10- , на тверде МРС-середовище. Мікроорганізми родини Enterobacteriaceae визначали при висіванні 56 розведень 10- 10- на середовище Ендо. Ентерококи визначали при висіванні суспензії на 35 середовище Диф 3 розведень 10- 10- . Стафілококи визначали при висіванні 0,1 мл суспензії 35 на жовтково-сольовий агар розведень 10- 10- та через 2 доби підраховували кількість колоній стафілококів, що виросли. Дріжджоподібні гриби роду Candida визначали на середовищі Сабуро 56 при висіванні розведень 10- 10- , через 2 доби культивування при t=27 °C підраховували біломатові опуклі колонії. Кількість аеробних спороутворюючих бактерій визначали на середовищі 35 Громико, використовуючи розведення 10- 10- . Дані стосовно видового складу мікрофлори кишечнику для варіантів 1 та 2 є представленими у Таблиці 2. У Таблиці 3 представлені результати дослідження застосування композицій для відновлення нормальної мікрофлори кишечнику на 4, 7 та 11 дні лікування. Фігура 2 представляє дані стосовно ефекту введення досліджуваних композицій (групи І-ІХ) на кількість представників нормофлори кишечнику та умовно патогенних мікроорганізмів на 11 день лікування. Таблиця 2 Видовий склад мікрофлори кишечнику лабораторних мишей контрольної групи та групи, яка одержувала антибіотик Мікроорганізм Bifidobacteria Lactobacteria L+Ecsherichia L-Ecsherichia L+Ecsherichia Proteus Enterococcus Staphylococcus Pseudomonas Candida Bacillus Контрольна група 10 1×10 8 4,4×10 7 5,3×10 4 3,1×10 6 3,4×10 4 3,2×10 4 3,6×10 3 2,4×10 2 1×10 3 3,2×10 2 3,2×10 25 5 Група після антибіотикотерапії 6 1×10 5 2,1×10 4 3,2×10 9 3,5×10 9 4,1×10 7 4,2×10 6 5,4×10 6 6,7×10 4 1×10 5 7,0×10 3 5,4×10 UA 70017 U Таблиця 3 Відновлення нормофлори кишечнику лабораторних мишей при використанні запропонованої композиції День проведення корекції 4-й 7-й 11-й 5 10 15 20 25 30 Мікроорганізми Bifidobacteria Lactobacteria L+Ecsherichia Bifidobacteria Lactobacteria L+Ecsherichia Bifidobacteria Lactobacteria L+Ecsherichia Підвищення кількості КУО в процесі корекції експериментального дисбактеріозу В. subtilis IMB В-7142 і Б. В. subtilis IMB В-7142 і В. subtilis subtilis IMB B-7143(1:1) + IMB B-7143(1:1) + лактулоза лактит у 100 разів у 1000 разів на 120,7 % на 244,8 % у 12,2 разів у 12,4 разів у 10000 разів у 10000 разів у 223,5 разів у 220,6 разів у 988 разів у 971 разів у 10000 разів у 10000 разів у 780 разів у 756 разів у 1036 разів у 1024 разів З приведених даних видно, що пробіотичні штами Bacillus subtilis IMB В-7142 та Bacillus subtilis IMB В-7143 сприяють відновленню та підтриманню нормобіозу кишечнику тварин, проте наявність у складі композиції пребіотичних речовин - лактиту та лактулози приводила до значного підвищення ефективності композиції, що виявлялося у підвищенні кількості мікроорганізмів нормальної мікрофлори кишечнику, зокрема, таких родів Bifidobacterium, Lactobacterium та позитивних за лактозою кишкових паличок та значному зниженні кількості патогенних та умовно патогенних мікроорганізмів та. На фоні застосування запропонованої синбіотичної композиції у дослідних мишей вже через 4 доби після початку лікування був поліпшений мікробіоценоз товстого кишечнику, при цьому рівень облігатної мікрофлори вже через 4 доби почав наближатися до нормальних рівнів. Усі ці зміни мікробіоценозу супроводжувалися нормалізацією травлення та загального стану здоров'я досліджуваних тварин. Проведені дослідження продемонстрували, що через 11 днів застосування запропонованої синбіотичної композиції було досягнуто повної елімінації стафілокока, протея, псевдомонад, а також грибів роду Candida. Поліпшення клінічного стану тварин співпадало із нормалізацією мікробіоценоза кишечнику. Крім того, було показано, що на відміну від пробіотиків та преобіотиків, узятих окремо, запропонована синбіотична композиція на основі штамів Bacillus subtilis IMB В-7142 та Bacillus subtilis IMB В-7143 та лактиту або лактулози виявляла свій вплив на мікрофлору кишечнику швидше, клінічний ефект досягався вже на 7-10 день їх застосування на тваринах. Таким чином, описана у даній корисній моделі синбіотична композиція забезпечувала високий клініко-бактеріологічний ефект при лікуванні дисбактеріозів та нормалізації мікрофлори кишечнику. В результаті лікування лабораторних тварин при використанні запропонованої синбіотичної композиції на 11-й день мікробіоценоз кишечнику як стосовно нормофлори (біфідо-, лактобактерії та позитивні за лактозою ешерихії), так і умовно патогенних мікроорганізмів, нормалізувався в усіх досліджуваних тварин. У групах, де застосовували запропоновану композицію, вдалося скоротити час нормалізації мікрофлори кишечнику при експериментальному дисбактеріозі. На 11 день лікування було досягнуто повної елімінації протея, стафілокока, псевдомонад, а також грибів роду Candida. Покращення клінічного стану мишей співпадало з нормалізацією мікробіоценозу кишечнику. Таким чином, застосування запропонованої композиції забезпечувало клінікобактеріологічний ефект, що підтверджує високу лікувальну ефективність запропонованої синбіотичної композиції. 35 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 40 Синбіотична композиція, що включає живі клітини штамів Bacillus subtilis IMB В-7142 та Bacillus 8 10 subtilis IMB В-7143 з титром клітин 10 -10 КУО/мл у співвідношенні 1-2:2-1, яка відрізняється тим, що додатково містить преобітик лактит та/або лактулозу у концентрації 10-15 мас. %. 6 UA 70017 U 7 UA 70017 U Комп’ютерна верстка Л. Купенко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 8