Спосіб визначення порушень сперматогенезу у чоловіків із забруднених радіонуклідами регіонів

Реферат: Спосіб визначення порушень сперматогенезу у чоловіків із забруднених радіонуклідами регіонів включає визначення імуногістохімічної експресії протеїну та морфометричних показників в тканині яєчка. Визначають екскреторно-обтураційну або секреторну, або поєднану форму чоловічої неплідності. UA 72142 U (12) UA 72142 U UA 72142 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Спосіб належить до галузі медицини, а саме до сексопатології, і може бути використаний для визначення особливостей порушення сперматогенезу у чоловіків, які проживають на забруднених радіонуклідами територіях України. Постійне зростання кількості неплідних шлюбів в останні десятиріччя свідчить про суттєві медико-соціальні проблеми, пов'язані з негативним впливом факторів зовнішнього середовища, зокрема - іонізуючого опромінення, на генеративну функцію чоловіків. Після відкриття нового механізму внутрішньоклітинного розщеплення білків, яка дістала назву убіквітинопосередкованої нанотехнології, встановлено, що убіквітин-піротеолізна система (ubiquitin protein li-gase) контролює регуляцію клітинного циклу, репарацію ДНК, тривалість життя клітини, розщеплення внутрішньоклітинних білків. Виявлено також, що інактивація ubiquitin protein ligase, локалізованої в чоловічих статевих клітинах, призводить до блокування сперматогенезу та розвитку неплідності. Враховуючи це, можна передбачити, що структурні та функціональні пошкодження компонентів убіквітин-протеасомної системи можуть відігравати значну роль в патогенезі чоловічої неплідності різної етіології, і, зокрема, при дії іонізуючого опромінення. Відомий спосіб визначення імуногістохімічної експресії протеїнів екстра-целюлярного матриксу та морфометричних показників в тканині яєчка (1), прийнятий за найближчий аналог, який полягає в імуногістохімічному визначенні експресії протеїнів fibronectin, vimentin, laminin, collagen type IV позаклітинного матриксу та морфометричних показників в перитубулярній тканині яєчка. Недоліком даного способу є те, що визначають імуногістохімічні особливості протеїнів позаклітинного матриксу та морфометричні показники в перитубулярній тканині яєчка. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити спосіб визначення порушень сперматогенезу у чоловіків із забруднених радіонуклідами регіонів шляхом визначення імуногістохімічних особливостей протеїну Ubiquitin та морфометричних показників в структурних елементах біоптата яєчка, які оцінюють в балах, та при наявності зрілих сперматозоїдів в канальцях визначають екскреторно-обтураційну форму неплідності у хворих, які проживають в забруднених радіонуклідами регіонах, та при певних значеннях імуногістохімічного коефіцієнта в клітинах Сертолі і в клітинах Лейдіга діагностують поєднану форму чоловічої неплідності, що потребує додаткової до хірургічного лікування корекції ендокринних та секреторних порушень сперматогенезу, хворі ж на секреторну неплідність, при значенні імуногістохімічного коефіцієнта в клітинах Сертолі: в ядрі - 6,9±0,36, в цитоплазмі - 5,8±0,14 бала, в клітинах Лейдіга: в ядрі - 0, а в цитоплазмі - 5,5±0,07 бала, мають несприятливий прогноз щодо відновлення сперматогенезу. Поставлена задача вирішується тим, що в способі визначення порушень сперматогенезу у чоловіків із забруднених радіонуклідами регіонів, що включає визначення імуногістохімічної експресії протеїну та морфометричних показників в тканині яєчка, згідно з корисною моделлю, визначають імуногістохімічні особливості експресії протеїну Ubiquitin, які оцінюють в балах і в структурних елементах біоптата яєчка, та при наявності зрілих сперматозоїдів в канальцях визначають екскреторно-обтураційну форму неплідності із значеннями імуногістохімічного коефіцієнта в клітинах Сертолі: в ядрі - 5,1±0,45, цитоплазмі - 2,7±0,09 бала, в клітинах Лейдіга: в ядрі - 4,3±0,54 і цитоплазмі - 2,7±0,27 бала, при їх відсутності - секреторну, при значенні імуногістохімічного коефіцієнта в клітинах Сертолі: в ядрі -5,8±0,17, цитоплазмі - 4,8±0,17 бала, в клітинах Лейдіга: в ядрі -0,3±0,16 і цитоплазмі 4,9±0,08 бала, у хворих, які проживають в забруднених радіонуклідами регіонах, при екскреторно-обтураційній формі неплідності при значенні імуногістохімічного коефіцієнта в клітинах Сертолі: в ядрі - 6,8±0,5, цитоплазмі - 5,3±0,5 бала, в клітинах Лейдіга: в ядрі - 1,51±0,5 і цитоплазмі -4,6±0,67 бала, діагностують поєднану форму чоловічої неплідності, що потребує додаткової до хірургічного лікування корекції ендокринних та секреторних порушень сперматогенезу, хворі же на секреторну неплідність, при значенні імуногістохімічного коефіцієнта в клітинах Сертолі: в ядрі - 6,9±0,36, в цитоплазмі 5,8±0,14 бала, в клітинах Лейдіга: в ядрі - 0, а в цитоплазмі - 5,5±0,07 бала, мають несприятливий прогноз щодо відновлення сперматогенезу. Запропонований спосіб виконують наступним чином: для гістологічного дослідження біоптати тканини яєчка фіксують в рідині Буена і заливають в парафін, з парафінових блоків виготовляють зрізи завтовшки 5 мкм, які фарбують гематоксилін-еозином. Імуногістохімічний аналіз здійснюють з використанням стандартного авідин-біотинового (ABC) методу, при цьому біоптати фіксують у 12 % формаліні, заливають в парафін і виготовляють зрізи, які після депарафінізації в ксилолі і дегідратації в батареї спиртів, для блокади активності ендогенної пероксидази, вміщують на 5 хвилин у 0,3 % розчин перекису водню, розведений на фосфатному буфері (рН 7,4). Після промивання дистильованою водою зрізи інкубують у мікрохвильовій печі при температурі 98° С в 0,1 Μ цитратному буфері (рН 6,0) 1 UA 72142 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 протягом 30 хв і негайно охолоджують. Далі зрізи преінкубують протягом 15 хв. у 1 % розчині конячого сироваткового альбуміну, розведенного на фосфатному буфері, інкубують з первинними антитілами Ubiquitin в розведенні 1:800 протягом 18 годин при температурі 4° С. Із вторинними мишачими моноклональними антитілами зрізи інкубують у вологій камері 30 хв при кімнатній температурі. Після чого зрізи інкубують в авідин-біотиновому комплексі 30 хвилин при кімнатній температурі, який готують за 30 хвилин до використання. Кожний етап закінчують триразовим промиванням по 5 хв. у фосфатному буфері. Після проявлення 1-2 хв. у 0,05 % розчині діамінбензидину зрізи дофарбовують гематоксиліном та поміщають в канадський бальзам. Як позитивний контроль використовують зрізи тканин із відомим заздалегідь високим вмістом протеїну Ubiquitin, як негативний - служать зрізи без обробки первинними антитілами. В кожному випадку для імуногістохімії аналізують 12-16 зрізів. Розповсюдженість та інтенсивність імуногістохімічної реакції оцінюють за напівкількісним методом в балах. Розповсюдженість реакції або кількість забарвлених ядер чи цитоплазми клітин оцінюють від 0 до 3 балів за такими критеріями: 0 - відсутність клітин із видимим забарвленням, 1 - забарвлено менше 10 % клітин, 2 - забарвлено більше 10 %, але менше 50 % клітин, 3 - рівномірно забарвлено більше 50 % клітин клітинного шару. Інтенсивність забарвлення ядер або цитоплазми оцінюють за такими критеріями: 0 - відсутність видимого забарвлення, 1 - слабо забарвлені ядра або цитоплазма, 2 - помірно забарвлені ядра або цитоплазма, 3 - інтенсивно забарвлені ядра або цитоплазма. Загальний результат імуногістохімічної реакції визначають за показниками імуногістохімічного коефіцієнта від 0 до 9 балів, який одержують перемножуванням оцінок розповсюдженості та інтенсивності забарвлення. Проводять статистичний аналіз отриманих результатів. Дані морфологічного дослідження пояснюють ілюстративними матеріалами. На фіг. 1 представлена екскреторно-обтураційна неплідність. Слабка ядерна та цитоплазматична експресія протеїну Ubiquitin у клітинах сперматогенного шару. Помірна ядерна та слабка цитоплазматична експресія убіквітину в клітинах Сертолі та клітинах Лейдіга. Імунопероксидазний ABC-метод, х 200. Фіг. 2 - Секреторна неплідність. Помірна ядерна та цитоплазматична експресія протеїну Ubiquitin в клітинах Сертолі. Імунопероксидазний АВС-метод. х200. Фіг. 3 - Секреторна неплідність - в просвітах канальців лише клітини Сертолі. Помірна ядерна та цитоплазматична експресія протеїну Ubiquitin в клітинах Сертолі. Відсутність ядерної експресії та помірна цитоплазматична експресія убіквітину в клітинах Лейдіга. Імунопероксидазний ABC-метод, х 200. Фіг. 4 - Екскреторно-обтураційна неплідність ("забруднені" регіони). Помірна ядерна та слабка цитоплазматична експресія убіквітину у більшості клітин. Імунопероксидазний ABCметод, х 200. Фіг. 5 - Секреторна неплідність ("забруднені" регіони). Виразна ядерна та помірна цитоплазматична експресія убіквітину в клітинах Сертолі. Відсутність ядерної експресії убіквітину та його помірна цитоплазматична експресія в клітинах Лейдіга. Імунопероксидазний АВС-мето'д. х 200. Фіг. 6 - Секреторна неплідність - в просвітах канальців лише клітини Сертолі ("забруднені" регіони). Виразна ядерна та цитоплазматична експресія убіквітину в клітинах Сертолі. Імунопероксидазний АВС-метод. х 200. Апробація запропонованого способу проведена у відділі патоморфології ДУ "Інститут урології НАМН України" при дослідженні 54 хворих із азооспермією, матеріал отриманий під час інцизійної біопсії, з наступним гістологічним та імуногістохімічним дослідженням біоптата. Для встановлення клінічного діагнозу форми неплідності використувують загальноприйняту класифікацію. При визначенні заключного діагнозу враховують дані морфологічного дослідження біоптата яєчка та результати гормональних досліджень. При розподілі хворих на групи враховують місце їх проживання згідно з документом. Відповідно, виділяють пацієнтів, які 137 проживають на забруднених радіонуклідами Cs територіях України, що зазначені у згаданому документі, та пацієнтів із "чистих" регіонів, дані про які відсутні у зазначеному документі. Згідно з встановленим діагнозом і місцем проживання пацієнтів було розділено на три групи: 1 група - 17 хворих, у яких встановлений діагноз екскреторно-обтураційна неплідність, серед яких 11 137 пацієнтів - із "чистих'районів, і 6 - із забруднених радіонуклідами Cs регіонів України, середній вік хворих складає 33,6 року; 2 група - 26 пацієнтів, у яких встановлено діагноз секреторної неплідності з блоком сперматогенезу на рівні сперматогоній, сперматоцитів 1 і 2 порядку чи сперматид, серед яких 12 пацієнтів - із "чистих" районів та 14 хворих - із забруднених, середній вік хворих складає 29,5 року; 3 група - 11 пацієнтів із синдромом "лише клітини Сертолі", серед хворих цієї групи 5 пацієнтів - із "чистих'районів та 6 хворих - із забруднених радіонуклідами 2 UA 72142 U 137 5 Cs регіонів, середній вік хворих складає 28,5 року. Результати імуногістохімічної експресії, які визначають за показниками імуногістохімічного коефіцієнта, в біоптатах яєчка у хворих на екскреторно-обтураційну та секреторну форми чоловічої неплідності, які проживають в "чистих" 137 та забруднених радіонуклідами Cs регіонах України представлені в таблиці 1. Як свідчать наведені в таблиці дані, при дослідженні імуногістохімічної експресії протеїну Ubiquitin в групі хворих на екскреторно-обтураційну неплідність із збереженим сперматогенезом із "чистих" регіонів, в клітинах Сертолі спостерігають слабке ядерне зафарбування (імуногістохімічний коефіцієнт 1-3 бали) Таблиця 1 Показники імуногістохімічного коефіцієнта експресії протеїну Ubiquitin в біоптатах яєчка у хворих на екскреторно-обтураційну та секреторну форми чоловічої неплідності, які проживають в 137 "чистих" та забруднених радіонуклідами Cs регіонах України (в балах) Структурні елементи біоптата яєчка Сперматозоїди: ядро цитоплазма Сперматиди: ядро цитоплазма Сперматоцити: ядро цитоплазма Сперматогонії: ядро цитоплазма Клітини Сертолі: ядро цитоплазма Клітини Лейдіга: ядро цитоплазма Форми неплідності у чоловіків ЕкскреторноСиндром "лише клітини Секреторна n=26 обтураційна n=17 Сертолі" "чисті" "забруднені" "забруднені" "забруднені" "чисті" n=12 "чисті" n=5 n=11 n=6 n=14 n=6 0 0 0 0 2,3±0,09* 2,8±0,17* 2,6±0,17 2,8±0,07 2,2±0,09* 3,2±0,33* 2,6±0,17** 4,5±0,21** 2,3±0,09* 2,8±0,17* 2,1±0,1** 2,8±0,07** 2,2±0,09* 3,2±0,33* 1,9±0,17** 4,5±0,21** 2,2±0,09* 2,8±0,17* 2,1±0,17** 2,8±0,07** 2,2±0,09* 3,2±0,33* 2,2±0,17** 3,6±0,21** 5,1±0,45* 6,8±0,5* 5,8±0,17** 6,9±0,36** 5,9±0,4*** 8,8±0,33*** 2,7±0,09* 5,3±0,5* 4,8±0,17** 5,8±0,14** 7,4±0,6 7,8±0,5 4,3±0,54* 1,51±0,5* 0,3±0,16 0 0,3±0,2 0 2,7±0,27* 4,6±0,67* 4,9±0,08** 5,5±0,07** 5,6±0,6 5,9±0,5 *, **, *** - достовірно між групами; р  0,001. 10 15 20 25 30 35 в 4 спостереженнях (45 %), в 6 випадках (55 %) спостерігають помірне ядерне зафарбування (4-6 балів), середнє значення імуногістохімічного коефіцієнта дорівнює 5,1±0,45 бала. Цитоплазматична експресія протеїну Ubiquitin в клітинах Сертолі слабка (1-3 бали) в усіх випадках (100 %), середнє значення імуногістохімічного коефіцієнта дорівнює 2,7±0,09 бала. Клітини сперматогенного епітелію - 1 сперматогонії, сперматоцити 1 і 2 порядку, сперматиди виявляють слабку ядерну та цитоплазматичну експресію протеїну Ubiquitin в усіх спостереженнях (100 %) даної групи, імуногістохімічний коефіцієнт, при цьому, становить 2-3 бали, в середньому - 2,3±0,09 та 2,2±0,09 бала відповідно. Необхідно зазначити, що зрілі сперматозоїди характеризуються відсутністю імуногістохімічної експресії протеїну Ubiquitin (0 балів) в усіх випадках (100 %). В клітинах Лейдіга помірну ядерну експресію в 6 балів спостерігають у 3 випадках (27 %); в 6 спостереженнях (54,5 %) виявляють слабке ядерне зафарбування (1-3 бали) та в 2 спостереженнях (18 %) ядерна експресія протеїну Ubiquitin відсутня (0 балів), середнє значення імуногістохімічного коефіцієнта дорівнює 4,3±0,54 бала. Слабку цитоплазматичну експресію убіквітину (2-3 бали) визначають в 9 випадках (81 %) (фіг. 1) та її відсутність в 2 випадках (19 %) (0 балів), середнє значення імуногістохімічного коефіцієнта дорівнює 2,7±0,27 балів. В групі хворих на секреторну неплідність із блоком сперматогенезу на рівні сперматогоній, сперматоцитів 1 і 2 порядку чи сперматид (всього 12 пацієнтів), в клітинах Сертолі спостерігають помірне ядерне зафарбування (імуногістохімічний коефіцієнт 4-6 бали) в усіх 12 спостереженнях (100 %). Середнє значення - 5,8±0,17 бала. Цитоплазматична експресія протеїну Ubiquitin в клітинах Сертолі слабка (коефіцієнт 2-3) в 4 випадках (33,3 %) та помірна (46 балів) - у 8 випадках (66,7 %). Середнє значення імуногістохімічного коефіцієнта дорівнює 4,8±0,17 бала. Клітини сперматогенного епітелію - сперматогонії, сперматоцити 1 і 2 порядку, сперматиди виявляють слабку ядерну та цитоплазматичну експресію протеїну Ubiquitin в усіх спостереженнях (100 %) даної групи, імуногістохімічний коефіцієнт, при цьому, становить 1-3 3 UA 72142 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 бали, середнє його значення в ядрі та цитоплазмі дорівнює відповідно в сперматогоніях 2,1±0,17 та 2,2±0,17 бала; в сперматоцитах - 2,1±0,17 та 1,9±0,17; в сперматидах - 2,6±0,17 бала. В клітинах Лейдіга ядерна експресія протеїну Ubiquitin була відсутня (коефіцієнт 0) в 9 спостереженнях (75 %) та в 3 випадках (25 %) була слабкою (імуногістохімічний коефіцієнт 1-3), в середньому - 0,3±0,16 бала. При цьому, в 6 випадках (50 %) спостерігають слабке цитоплазматичне зафарбування (2-3 бали), в інших 6 спостереженнях (50 %) - мало місце помірне цитоплазматичне зафарбування інтерстиційних ендокриноцитів (4-6 балів) (фіг. 2), імуногістохімічний коефіцієнт в середньому - 4,9±0,08 бала. В групі хворих на секреторну неплідність із синдромом "лише клітини Сертолі" (5 пацієнтів), в клітинах Сертолі спостерігають помірне ядерне зафарбування (4-6 балів) в усіх спостереженнях (100 %), імуногістохімічний коефіцієнт в середньому - 5,9±0,4 бала. Цитоплазматична експресія протеїну Ubiquitin в сустентоцитах помірна (6 балів) в 3 випадках (60 %) та виразна в двох спостереженнях (40 %), середнє значення імуногістохімічного коефіцієнта - 7,4±0,6 бала. В клітинах Лейдіга ядерна експресія убіквітину відсутня (0 балів) в 4 спостереженнях (80 %), в одному випадку (20 %) визначають слабке ядерне зафарбування (1 бал), в середньому імуногістохімічний коефіцієнт дорівнювало 0,3±0,2 бала. При цьому, в 4 випадках (80 %) спостерігають помірне цитоплазматичне зафарбування (4-6 бали) та в одному випадку (20 %) визначають слабку цитоплазматичну експресію (3 бали) (Фіг. 3). Середнє значення імуногістохімічного коефіцієнта - 5,6±0,6 балів. Таким чином, імуногістохімічне дослідження протеїну Ubiquitin у хворих із "чистих" регіонів України показало достовірне підвищення його цитоплазматичної експресії в клітинах Сертолі при секреторній неплідності та синдромі "лише клітини Сертолі", порівняно із ексреторнообтураційною неплідністю, а також посилення цитоплазматичної експресії з одночасним зменшенням його ядерної експресії в інтерстиційних ендокриноцитах - клітинах Лейдіга при секреторній формі чоловічої неплідності порівняно із екскреторно-обтураційною неплідністю. При дослідженні імуногістохімічної експресії убіквітину в групі хворих на екскреторнообтураційну неплідність із збереженим сперматогенезом, які мешкають в забруднених 137 радіонуклідами Cs регіонах України (6 пацієнтів), в клітинах Сертолі спостерігають помірне ядерне зафарбування (6 балів) в 4 спостереженнях (66,5 %), в двох випадках (33,5 %) виявлена виразна ядерна експресія убіквітину (9 балів), в середньому значення імуногістохімічного коефіцієнта дорівнює 6,8±0,5 бала. Цитоплазматична експресія убіквітину в клітинах Сертолі слабка (3 бали) в 2 випадках (33,5 %) та помірна (4-6 балів) у 4 пацієнтів (66,5 %), в середньому - 5,3±0,5 бала. Клітини сперматогенного епітелію - сперматогонії, сперматоцити 1 і 2 порядку, сперматиди виявляють слабку ядерну експресію убіквітину в усіх спостереженнях (100 %) - 2-3 бали, в середньому 2,8±0,17 бали. Цитоплазматичне зафарбування слабке з імуногістохімічним коефіцієнтом в 2-3 бали у 4 випадках (66,5 %) та помірним (4-6 бали) в 2 спостереженнях (33,5 %), в середньому 3,2±0,33 бала. Необхідно зазначити, що і в даній групі зрілі сперматозоїди характеризуються відсутністю імуногістохімічної експресії убіквітину (0 балів) в усіх випадках (100 %). В клітинах Лейдіга в 1 спостереженні (16,5 %) виявлено слабке ядерне зафарбування (3 бали) та в 5 спостереженнях (83,5 %) ядерна експресія убіквітину відсутня (0 балів), середнє значення імуногістохімічного коефіцієнта дорівнює 1,51±0,5. Слабка цитоплазматична експресія убіквітину (2-3 бали) визначена в 3 випадках (50 %), в 3 спостереженнях (50 %) виявляють помірну цитоплазматичну експресію (4-6 бали), в середньому імуногістохімічний коефіцієнт становить 4,6±0,67 бала (Фіг. 4). В клітинах Лейдіга в 1 спостереженні (16,5 %) виявлено слабке ядерне зафарбування (3 бали) та в 5 спостереженнях (83,5 %) ядерна експресія убіквітину відсутня (0 балів), середнє значення імуногістохімічного коефіцієнта дорівнює 1,51±0,5. Слабка цитоплазматична експресія убіквітину (2-3 бали) визначена в 3 випадках (50 %), в 3 спостереженнях (50 %) виявляють помірну цитоплазматичну експресію (4-6 бали), в середньому імуногістохімічний коефіцієнт становить 4,6±0,67 бала (Фіг. 4).; Клітини сперматогенного епітелію - сперматогонії, сперматоцити 1 і 2 порядку, сперматиди виявляють слабку ядерну експресію убіквітину в усіх спостереженнях (100 %), імуногістохімічний коефіцієнт, при цьому, становить 2-3 бали, в середньому 2,8±0,07 бала. Цитоплазматичне зафарбування слабке із імуногістохімічним коефіцієнтом в 3 бали у 7 випадках (50 %) та помірним (4-6 балів) в 7 спостереженнях (50 %), в середньому 3,6±0,07 - в цитоплазмі сперматогоній, та 4,5±0,21бали - в цитоплазмі сперматоцитів та сперматид. 4 UA 72142 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В клітинах Лейдіга ядерна експресія убіквітину відсутня (0 балів) в усіх спостереженнях (100 %), при цьому, в 13 випадках (93 %) спостерігають помірне цитоплазматичне зафарбування (4-6 балів) та в одному спостереженні (7 %) виявлено слабку цитоплазматичну експресію в 3 бали, в середньому 5,5±0,07 бала (Фіг. 5). В групі хворих на секреторну неплідність із синдромом "лише клітини Сертолі", які мешкають в забруднених радіонуклідами регіонах України (6 пацієнтів), в клітинах Сертолі спостерігають виразне ядерне зафарбування (8-9 балів) в усіх спостереженнях (100 %). Цитоплазматична експресія убіквітину в сустентоцитах була помірною (6 балів) в 3 випадках (50 %) та виразною в трьох спостереженнях (50 %), в середньому значення імуногістохімічного коефіцієнта дорівнює 7,8±0,5 бала. В клітинах Лейдіга ядерна експресія убіквітину відсутня (0 балів) в 6 спостереженнях (100 %), при цьому, в усіх 6 випадках спостерігають помірне цитоплазматичне зафарбування (56 балів), в середньому імуногістохімічний коефіцієнт дорівнює 5,9±0,5 бала (Фіг. 6). Таким чином, в усіх групах хворих із забруднених радіонуклідами Cs регіонів України виявляють статистично достовірне зростання цитоплазматичної експресії убіквітину в клітинах Сертолі, сперматогенному епітелії та клітинах Лейдіга, порівняно з аналогічними спостереженнями із "чистих" регіонів України. Одночасно із цим, ядерна експресія убіквітину в клітинах Лейдіга у зазначених хворих достовірно знижена порівняно з аналогічними пацієнтами із "чистих" регіонів. Наводимо приклади практичного застосування запропонованого способу. Приклад 1. Хворий Д., мешканець м. Сімферопіль, і. хв. № 549 та № 1039, 33 років, неплідний шлюб протягом 3 років. Спермограма: клітин сперматогенезу та сперматозоїдів не виявлено, лейкоцити 1-2 в полі зору, фруктоза 13 ммоль/л. При лабораторних дослідженнях урогенітальної інфекції не виявлено. Гормональні дослідження: ФСГ (фолікулостимулюючий гормон), ЛГ (лютеїнізуючий гормон), пролактин тестостерону - в нормі. Виконана інцизійна біопсія правого яєчка. Біопсійний матеріал досліджений згідно з запропонованим способом. При гістологічному дослідженні в сім'яних канальцях виявлені численні сперматозоїди. Імуногістохімічна експресія протеїну Ubiquitin та показники імуногістохімічного коефіцієнта в структурних елементах біоптата яєчка становлять в клітинах Сертолі: в ядрі - 4,9, цитоплазмі 2,7 бала, в клітинах Лейдіга: в ядрі - 4,4 і цитоплазмі - 2,8 бала. Встановлений діагноз екскреторно-обтураційної неплідності. Виконана операція епідідімовазоанастомозу 14.03.02. Через три місяці в спермограмі виявлені сперматозоїди 1 × 106-1,5 × 106/мл. Приклад 2. Хворий В., мешканець Житомирської області, і. хв. № 1374, 34 років, неплідний шлюб протягом 3 років. Спермограма: клітин сперматогенезу та сперматозоїдів не виявлено, лейкоцити 1-3 в полі зору, фруктоза 12 ммоль/л. В анамнезі двосторонній епідідіміт. При лабораторних дослідженнях урогенітальної інфекції не виявлено. Дані гормональних досліджень (ФСГ, ЛГ, пролактин, тестостерон) в нормі. Виконана інцизійна біопсія правого яєчка. Біопсійний матеріал досліджений згідно з запропонованим способом. При гістологічному дослідженні в сім'яних канальцях виявлені поодинокі сперматозоїди. Імуногістохімічна експресія протеїну Ubiquitin та показники імуногістохімічного коефіцієнта в структурних елементах біоптата яєчка становлять в клітинах Сертолі: в ядрі - 6,7, цитоплазмі - 5,1 балів; в клітинах Лейдіга: в ядрі - 1,4, цитоплазмі - 4,8 бали. Діагностовано поєднану форму чоловічої неплідності. Виконана операція епідідімовазоанастомозу. При контрольних дослідженнях після операції сперматозоїди в спермограмі не виявлені. Призначене лікування: аєвіт - 1 капсула на день протягом місяця; пентоксифілін по 800 мг протягом місяця; магнітотерапія (10-15 сеансів через день). Приклад 3. Хворий У., мешканець Київської області, і. хв. № 2217, 22 років, неплідний шлюб протягом 3 років. Спермограма: клітин сперматогенезу та сперматозоїдів не виявлено, лейкоцити 0-1, в полі зору, фруктоза 14 ммоль/л. При лабораторних дослідженнях урогенітальної інфекції не виявлено. Гормональні дослідження: ФСГ, ЛГ, пролактин тестостерон - в нормі. Виконана інцизійна біопсія правого яєчка. Біопсійний матеріал досліджений згідно з запропонованим способом. При гістологічному дослідженні в сім'яних канальцях зрілі сперматозоїди не виявлені. Імуногістохімічна експресія протеїну Ubiquitin та показники імуногістохімічного коефіцієнта в структурних елементах біоптата яєчка становлять в клітинах Сертолі: в ядрі - 6,8, в цитоплазмі - 5,7 бала, в клітинах Лейдіга: в ядрі - 0, а в цитоплазмі - 5,5 бала. Встановлений діагноз секреторної неплідності, прогноз відновлення фертильності несприятливий, пацієнту запропоноване використання допоміжних репродуктивних технологій. Таким чином, запропонований спосіб дає можливість встановити остаточний діагноз за результатами морфологічного дослідження структурних елементів біоптата яєчка з визначенням наявності або відсутності сперматозоїдів в сім'яних канальцях, а також з 5 UA 72142 U 5 10 урахуванням показників імуногістохімічної експресії протеїну Ubiquitin в біоптаті яєчка. При наявності відповідних показників імуногістохімічних коефіцієнтів в клітинах визначають екскреторно-обтураційну, секреторну чи поєднану форму чоловічої неплідності, а також визначають спосіб лікування неплідності та подальший прогноз щодо відновлення фертильності. Ефективність способу 98,9 %. Джерела інформації: при експертизі 1. Expression of extracellular matrix proteins and vimentin in testes of azoo-spermic man: an immunohistochemical and morphometric study Вираз білки позаклітинного матриксу і віментин в сім'яниках азооспермія людини: імуногістохіміч-ного та морфометричні дослідження // Gulkesen K.H., Erdogru Т., Sargin C.F., Karpuzoglu G. // Asian J..Androl.-2002.-Vol-.4,N1.-P.55-60 (прототип). ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 25 30 Спосіб визначення порушень сперматогенезу у чоловіків із забруднених радіонуклідами регіонів, що включає визначення імуногістохімічної експресії протеїну та морфометричних показників в тканині яєчка, який відрізняється тим, що визначають імуногістохімічні особливості експресії протеїну Ubiquitin, які оцінюють в балах і в структурних елементах біоптата яєчка, та при наявності зрілих сперматозоїдів в канальцях визначають екскреторнообтураційну форму неплідності із значеннями імуногістохімічного коефіцієнта в клітинах Сертолі: в ядрі - 5,1±0,45, в цитоплазмі - 2,7±0,09 бала, в клітинах Лейдіга: в ядрі - 4,3±0,54 і цитоплазмі - 2,7±0,27 бала, при їх відсутності - секреторну, при значенні імуногістохімічного коефіцієнта в клітинах Сертолі: в ядрі -5,8±0,17, цитоплазмі -4,8±0,17 бала, в клітинах Лейдіга: в ядрі - 0,3±0,16 і цитоплазмі 4,9±0,08 бала, у хворих, які проживають в забруднених радіонуклідами регіонах, при екскреторно-обтураційній формі неплідності при значенні імуногістохімічного коефіцієнта в клітинах Сертолі: в ядрі - 6,8±0,5, цитоплазмі - 5,3±0,5 бала, в клітинах Лейдіга: в ядрі - 1,51±0,5 і цитоплазмі - 4,6±0,67 бала, діагностують поєднану форму чоловічої неплідності, що потребує додаткової до хірургічного лікування корекції ендокринних та секреторних порушень сперматогенезу, хворі ж на секреторну неплідність, при значенні імуногістохімічного коефіцієнта в клітинах Сертолі: в ядрі - 6,9±0,36, в цитоплазмі - 5,8±0,14 бала, в клітинах Лейдіга: в ядрі -0, а в цитоплазмі - 5,5±0,07 бала, мають несприятливий прогноз щодо відновлення сперматогенезу. 6 UA 72142 U 7 UA 72142 U Комп’ютерна верстка Л. Купенко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 8