Спосіб модуляції фагоцитарних клітин

Реферат: Спосіб модуляції фагоцитарних клітин включає використання модуляторів фагоцитарної активності імунокомпетентних клітин на тлі запальних процесів. Як модулятор використовують водну дисперсію фулерену FC60. UA 72143 U (12) UA 72143 U UA 72143 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини та фармакології, стосується імунного захисту організму, розробки нових фармакологічних препаратів цілеспрямованої дії на клітини-мішені. Розвиток технологій та активний науковий пошук сприяє появі нових препаратів цілеспрямованої дії на клітини-мішені. Одними з найбільш перспективних претендентів цього напрямку стали наночастинки - фулерени. На сьогодні найбільш вивчений фулерен С 60 (FC60), який завдяки здатності до взаємодії з клітинами та біологічними молекулами проявляє антивірусну, антибактеріальну, антиоксидантну та цитпротекторну властивості, впливає на апоптоз [Freitas R.A. Basic capabilities by Robert A..Freitas / Robert A Freitas. Jr. - Austin, Texas U.S.A. Landes BiocenceAUSTIN, TEXAS U.S.A. LANDES BIOSCIENCE, 1999. - 509 p. (Nanomedicine, volume І); Saton M. Pharmacological studies on fullerene C60, a novel carbon allotrope, and its derivate / Saton M., Takayanagi I. // J Pharmcol Sci. - 2006. - Vol. 100. - P. 513-518]. Тому актуальним є пошук нових ефективних препаратів, які впливають на активність клітин фагоцитарної системи. Відомо про розробку хімічно зв'язаного імуногенного комплексу клітинних стінок та антигенів з сибіревиразкового мікроба, досліджена імуномодулююча активність арабіногалактану і сквалену, а також показані шляхи корекції функціонального стану системи мононуклеарних фагоцитів арабіногалактаном і скваленом при взаємодії з сибіревиразковим мікробом [Влияние комплексного антигенного препарата Bacillus anthracis и иммуномодуляторов на функциональную активность клеток фагоцитарной системы в эксперименте [В.И. Дубровина, А.В., Родзиковский, О.Б. Колесникова и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. 2007. - вып. 93. - С. 73-76]. В літературних джерелах представлені результати вивчення впливу антигенних комплексів Y. pestis EV на функціональну активність клітин фагоцитарної системи клітин морських свинок та білих мишей. Показано, що препарат, виготовлений на основі F-1 антигену, мембранної фракції Y. pestis EV та імуномодулятора - арабіноалактану модрини сибірської (АГ), викликає підвищення функціональної активності клітин фагоцитарної системи експериментальних тварин (морських свинок), підсилює адгезивну та поглинальну здатність перитонеальних макрофагів, інтенсивність утворення активних форм кисню і монооксиду азоту, проявляє стимулюючий ефект на активність мієлопероксидази та синтез неферментативних катіонних білків поліморфноядерних лейкоцитів. Антигенний комплекс, виготовлений на основі F-1 антигену, мембранної фракції Y. pestis EV та АГ, має стимулюючу дію на цитокініндукуючу функцію макрофагів білих мишей, що виражається в підсиленні продукції цитокінів ІЛ-1, ІЛ-6, ФНО-ά [Влияние комплексного антигенного препарата YERSINIA PESTIS EV на функциональную активность клеток фагоцитарной системы в эксперименте [В.И. Дубровина, Е.П. Голубский, С.А. Витязева и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. 2008. - вып. 97. - С. 56-60]. Групою науковців проведено порівняльне вивчення імуномодулюючих властивостей високомолекулярного хітозану та його похідних: низькомолекулярного хітозану, карбоксиметилхітозану, карбоксіетилхітозану, карбоксипропілхітозану. Встановлено, що хімічна модифікація хітозану впливає на його біологічну активність. Синтезовані похідні хітозану мають покращені фізико-хімічні властивості (висока розчинність в нейтральних та лужних розчинах, низька в'язкість в кислих розчинах, хороша всмоктуваність із шлунково-кишкового тракту) в порівнянні з вихідним високомолекулярним хітозаном, мають імуномодулюючі властивості та є перспективними речовинами для створення лікарських препаратів і біологічно активних домішок до їжі (БАД) [Сравнительное изучение иммуномодулирующих свойств хитозана и его производных [Л.И. Иванушко, Т.Ф. Соловьева, Т.С. Запорожец и др.] // Медицинская иммунология. - 2007. - Т. 9, № 4-5. - С. 397-404]. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб лікування захворювань, при яких доцільна активація фагоцитозу в організмі [Пат. 85922 С2 Україна, МПК А61K/27, А61Р37/04. Спосіб лікування захворювань, при яких є доцільною активація фагоцитозу в організмі / Новак В.Л., Курган Д.Н., Ординська З.В., Примак С.В., заявник и патентовласник Державна установа "Інститут патології крові та трансфузійної медицини АМН України". - № а 200706135; заявл. 04.06.07; опубл. 10.03.09, Бюл. № 5]. Відповідно до способу стимуляція поглинаючої здатності фагоцитів для активації імунного захисту макроорганізму від агресії у внутрішнє середовище сторонніми об'єктами досягнута тим, що довенно або підшкірно вводять нефракціонований гепарин дозою 180-230 МО/кг маси тіла. Підвищення фагоцитарної активності в організмі відмічено на 8-10 хв після інфузії, далі вона зростає й визначається більше доби. Недоліком існуючого способу є використання гепарину для стимуляції поглинаючої здатності фагоцитів для активації імунного захисту макроорганізму від агресії у внутрішнє середовище лише сторонніх об'єктів, що не дає можливості оцінити розвиток запальних процесів в клітинахмішенях. 1 UA 72143 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Тому в основу корисної моделі поставлена задача створити спосіб модуляції фагоцитарних клітин при патологічних станах шляхом удосконалення відомого, використовуючи терапевтичні агенти у вигляді водної дисперсії FC60 в концентраціях 0,01 та 0,1 M/л. Поставлена задача вирішується шляхом створення способу модуляції фагоцитарних клітин, що включає використання модуляторів фагоцитарної активності імунокомпетентних клітин на тлі запальних процесів, який відрізняється тим, що як модулятор використовують водну дисперсію FC60 в концентраціях 0,01 та 0,1 М/л. Запропонований спосіб дозволяє високоспецифічно впливати на різні етапи та механізми фагоцитозу під час розвитку запальних процесів. Це дає можливість використовувати FC60 в медичній практиці, як засіб дії на вибіркові механізми імунного захисту організму, що суттєво підвищить ефективність лікувально-профілактичних заходів та покращить надання медичної допомоги при захворюваннях. Технічний результат досягають шляхом використання наночастинок FC 60, які мають високу біологічну активність, можуть проникати крізь клітинну мембрану, викликають адгезію та міграцію нейтрофілів і макрофагів в середовище запалення з наступним знаходженням їх у фаголізосомальних клітинах [Morimoto Y. Inlfammogenic effect of well-characterized fullerenes in inhalation and intratracheal instillation studies / Morimoto Y., Hirohashi M., Ogami A. // Particle Fibre Toxicology. 2010. - Vol. 7-P. 1-4]. Заявлений спосіб виконується наступним чином: У дослідженні використовували периферичну кров 10 практично здорових донорів обох статей віком 28-45 років, отриману з ліктьової вени в пробірки з гепарином (Vacutainer Systems, Великобританія). У пацієнтів отримували письмову згоду на обстеження, всі маніпуляції проводили з дозволу комісії з біоетики Української медичної стоматологічної академії. Водну дисперсію FC60 отримували шляхом перемішування FC60 (Sigma, США) з деіонізованої водою на магнітній мішалці протягом 2-х місяців [Dhavan A., Taurozzi J.S., Pandey A.K. et al Stable colloidal dispersion of C60 fullerenes in water: evidence for genotoxicity //Environ. Sci. Technol. - 2006. - Vol. 40. P. 7394-7401.]. Клітини цільної крові в обсязі 1 мл інкубували з водною дисперсією FC60 в кінцевій концентрації 0,01 М/л і 0,1 M/л протягом 10 хв. при 37 С. Дози препарату підбирали з урахуванням відсутності критичних деструктивних впливів на вітальні параметри клітин [Fumelli С, Marconi A., Salvioli S., et al. Carboxyfullerenes protect human keratinocytes from ultraviolet-Binduced apoptosis //J. Invest. Dermatol. - 2000. - Vol. 155. - P. 835-841]. Експресію молекул міжклітинної адгезії CD54 (ІСАМ-1) визначали на клітинах цільної крові. Кров інкубували з моноклональннми антитілами LT54 до молекул CD54 і з анти-F(аb)2антитілами, міченими флюоресцеініозотіоціанатом (Сорбент, Росія). Для лізису еритроцитів використовували лізуючий розчин (Callag, США). Флюоресценцію реєстрували в реакції непрямої імунофлюоресценції на проточному цитофлюориметр ЕРІХ LX-MCL (Beckman Coulter, США) за допомогою програми System ІІТМ software [Пинегін Б.В. Проточная лазерная цитометрия в оценке иммунной системы человека /Б.В. Пинегин, А.А. Ярилин, Д.В. Мазуров и др. // Микробиол. - 2002. - № 6. - С. 105-111]. Фагоцитарну активність нейтрофілів оцінювали за фагоцитарним показником (відсоток фагоцитуючих клітин) в тесті з монодисперсними частинками латексу (Діам, Росія) [Методи клінічних та експериментальних досліджень в медицині /Беркало Л.В., Бобович О.В., Боброва Н.А. і др. /Під ред. Проф… Кайдашева І.П. - Полтава: Полімет, 2003. - 320 с.]. Стан кисеньзалежних механізмів нейтрофілів визначали в тесті з нітросинім тетразолієм (НСТ) (Діам, Росія), Облік реакції проводили за ступенем інтенсивності специфічного забарвлення, розраховували середній цитохімічний коефіцієнт (СЦК), виражали в умовних одиницях (ум. од.) [Методи клінічних та експериментальних досліджень в медицині /Беркало Л.В., Бобович О.В., Боброва Н.А. і др.; Під ред. Проф… Кайдашева І.П. - Полтава: Полімет, 2003. - 320 с.|. Активність мієлопероксидази визначали по окисленню хромогену (бензидину) за методом Грехема-Кнолля, розраховували СЦК і результат виражали в ум. од, [Методи клінічних та експериментальних досліджень в медицині /Беркало Л.В., Бобович О.В., Боброва Н.А. і др.; Під ред. Проф… Кайдашева І.П. - Полтава: Полімет, 2003. - 320 с.]. Продукцію активних форм кисню визначали за люмінолзалежною хемілюмінесценцією (ХЛ) [Митерева Д.Е., Агафонов В.Е. Модификация метода хемилюминесцентного анализа для оценки активности фагоцитов цельной крови сенсибилизированных животных //Клиническая лабораторная диагностика. - 2004. - № 3. - С. 47-50.]. Максимальну інтенсивність світіння реєстрували послідовно протягом 10 хвилин, при яких відбувалася стабілізація її інтенсивності при 37 °C (спонтанна ХЛ). Респіраторний вибух клітин активували додаванням 100 мкл 0,1 % суспензії зімозану (НВО "Біолар", Латвія) і визначали стимульовану ХЛ. Виміри проводили на біолюмінометрі БХЛ-06 (Нижній Новгород, Росія), результати представляли в імп/сек. 2 UA 72143 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Вміст лізосомальних катіонних білків (ЛКБ) визначали в еозинофілах, розраховували СЦК і виражали в ум. од. [Методи клінічних та експериментальних досліджень в медицині //Беркало Л.В., Бобович О.В., Боброва Н.А. і др.; Під ред. Проф. Кайдашева І.П. - Полтава: Полімет, 2003. - 320 с]. Вивчено зміну рівня експресії молекул CD54 на моноцитах, лімфоцитах і нейтрофілах під впливом FC60. На моноцитах експресія CD54 достовірно знижувалася під впливом FC60 в дозі 0,1 М/л, на лімфоцитах - при використанні FC60 в обох дозах. На нейтрофілах достовірних змін рівня експресії CD54 не спостерігалося. Фагоцитарна активність нейтрофілів достовірно не змінювалася при використанні FC60 в обох дюзах (табл.). Використання FC60 в дозі 0,01 М/л сприяло достовірному підвищенню показників кисень-стимулюючої активності нейтрофілів в НСТ-тесті і достовірного зниження активності мієлопероксидази в нейтрофілах (табл.). Не відзначено достовірного впливу дози 0,1 М/л. При оцінці здатності клітин генерувати, активні форми кисню під впливом FC 60 спостерігали зниження рівня індукованої ХЛ порівняно з контролем в 2,6 разу (р