Спосіб оцінки порушень сперматогенезу

УКРАЇНА (19) UA (и) 35451 (із) А (51) 6G01N33/48 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ОПИС ДО ДЕКЛАРАЦІЙНОГО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД видається під відповідальність власника патенту (54) СПОСІБ ОЦІНКИ ПОРУШЕНЬ СПЕРМАТОГЕНЕЗУ (21)99105629 тогоиій на гістологічних препаратах поперечних зрізів сім'яників лабораторних білих щурів, який відрізняється тим, що додатково визначають кількість сперматид у стандартній площі зрізу звивистих сім'яних канальців на VI* та IX* стадіях сперматогенезу, обчислюють співвідношення середньої кількості сперматид на стадіях VI* та IX е і по величині його значення оцінюють ступінь порушення диференційовки спермзгид. Винахід відноситься до профілактичної медицини, а саме до морфологічних способів досліджень і може бути використаний у гігієнічних дослідженнях на лабораторних білих щурах для виявлення гонадотокснчно'і дії хімічних та фізичних факторів навколишнього середовища Відомі декілька способів оцінки стану клітин сперматогенного ряду шляхом обліку частки канальців у поперечному зрізі сім'яника, які вміщують окремі тили статевих клітин [1), визначення кількості окремих тилів сперматогенних клітин у середньому на поперечний зріз сім'яного канальця [2] та в гомогенаті сім'яника (3,4] Проте ці способи трудоємкі. суб'єктивні та малочутливі, не враховують особливостей процесів диференційовки клітин сперматогенного ряду, що може привести до отримання недостовірних результатів. Деякі з них [3.4] вивчають цитологічні параметри сперматогенезу і не дозволяють оцінювати структурні зміни в паренхіматозних елементах сім'яників, в зв'язку з чим для повної характеристики морфо-функціонального стану клітин сім'яників вони повинні бути доповнені дослідженнямгістологічногопрепарата. Самостійно вказані способи можуть бути використані тільки як експресні для скринінгоао) оцінки впливу факторів навколишнього середовища на гонади. Відомий спосіб оцінки порушень сперматогенезу, який заключається в підрахунку в кожному з 100 канальців на поперечному зрізі сім'яника кіль» кості шарів клітин, які відносяться до сперматогоній, слерматоцитів, сперматид та сперматозоїдів, з обчисленням індексе сперматогенезу І • La/100, де а • кількість шарів сперматогенного ряду клітин у кожному канальці, 100 - число підрахованих канальців [1] Вказаний спосіб не враховує стадій сперматогенезу, в зв'язку з чим вибір дослідником 100 канальців для перегляду випадковий Це зумовлює низьку точність дослідження t дозволяє віднести спосіб до розряду иалшкількісних. Спосіб малочутливий, так як для отримання істотних розбіжностей з контролем за індексом сперматогенезу в значній частці канальців повинен бути відсутнім один або кілька шарів сперматогенних клітин, що спостерігається при достатньо високих рівнях хімічної або фізичної дії Відомий спосіб оцінки порушень сперматогенезу. який заключається в підрахунку в 20 канальцях на поперечному зрізі сім'яника кількості сперматогенних клітин у кожному з 4-х шарів (сперматогоній. сперматоцитів. сперматид та сперматозоїдів) з наступним визначенням Гх середнього числа [2]. Вказаний спосіб оцінки клітин сперматогенного ряду до певно) міри підвищує точність і чутливість визначення Проте він є суб'єктивним, трудоемким та відрізняється малою відтворюваністю результатів, так як не передбачає попередньої ідентифікаф стадії сперматогенезу. (22)14.10.1999 (24)15.03.2001 (46) 15 03.2001, Бюл. № 2. 2001 р. (72) Яценко Валентин Порфирович, Анісімова Інна Гаврилівна, Залривода Лариса Петрівна (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ О.О БОГОМОЛЬЦЯ (57) Спосіб оцінки порушень сперматогенезу, що включає кількісний морфологічний аналіз сперма* Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення є спосіб оцінки порушень сперма* тогеиезу, оснований на підрахунку на поперечному зрізі сім'яника числа сперматогоній у 20 канальцях. що знаходяться на V - IX стадіях сперматогенезу, який має достатню об'єктивність і відтворюваність, проте недостатньо чутливий і мало інформативний, так як оцінює стан тільки одного шару клітин сперматогенного ряду [5]. 35451 В основі заявленого винаходу поставлене завдання створити спосіб, який на основі використання кількісних критеріїв з високою зіставленістю та Інформативністю результатів дозволив би об'єктивно оцінювати початкові порушення сперматогенезу, здатні виникати при мінімальних (порогових) рівнях діТ хімічних та фізичних факторів навколишнього середовища, і дозволив би судити про механізми порушень сперматогенезу, зокрема, процесу диференційовки сперматогенних клітин. Поставлене завдання досягається тим, що згідно винаходу, в пропонованому способі на по* перечних зрізах сім'яників підраховують кількість сперматогоній і сперматид в тих звивистих сім'яних канальцях, в яких сперматогенез знаходиться е е на стадіях VI і IX за класифікацією [6] з доповненнями [7], з наступним обчисленням показника ступеня диференційовки сперматид (ПСДС) за розробленою авторами програмою для комп'ютерної обробки результатів В інтактних білих щурів показник ступеня диференційовки сперматид близький до 1, при порушеннях процесу сперматогенезу він істотно знижується. Заявлений спосіб відповідає критерію «новизна», так як на відміну від відомих технічних рішень у даній області, які по суті використовують різні способи підрахунку сперматогенних клітин, базується на системному підході, що передбачає можливість кількісного аналізу клітинних та міжклітинних взаємодій Такий підхід зумовлений тим, що на протязі VI е - IX* стадій послідовно проходять дуже важливі етапи цитодиференційовки, які включають істотну та необоротну трансформацію таких органел клітини як клітинний центр і комплекс Гольджі, похідні яких (хвостовий в'щділ, акросома) забезпечують дві важливі функції сперматозоїдів рухливість та процес запліднення Крім того, на стадії IX" істотно змінююються міжклітинні взаємодії між клітинами Сертолі і слерматогенними клітинами - зрілі сперматозоїди втрачають зв'язок з клітинами Сертолі і переміщуються в просвіт сім'яного канальця. При цьому встановлюються більш тісні морфо-функціональні взаємовідносини між підтримуючими клітинами і новою генерацією сперматид, які диференціюються. Отже, в основу пропонованого способу покладений кількісний аналіз послідовності здійснюваних стадій сперматогенезу, що забезпечує заявленому способу істотну новизну Заявлений спосіб має переваги в порівнянні з аналогами і прототипом по інформативності, так як не тільки констатує факт наявності певної кількості сперматогенних клітин, але також характеризує процес сперматогенезу в розвитку шляхом визначення ступеня диференційовки сперматид. Застосування кількісної оцінки сперматогенних КЛІТИН на певних стадіях (VI а • IXs), коли відмічається найбільш чітка ідентифікація сперматогоній І закінчуються основні перетворення сперматид, підвищує точність та відтворюваність способу, що буде визначати високу зіставленість результатів, отриманих різними дослідниками. Виявлення зменшення показника ступеня диференційовки сперматид при мінімальних рівнях дії, при яких відомими способами не вдається виявити якихось порушень сперматогенезу, свідчить про підвищення чутливості пропонованого способу. Використання принципу обчислення середнього значення показника ступеня диференційовки сперматид з його помилкою шляхом об'єднання виборок по окремих полях дослідження з врахуванням їх помилок та наступного обліку цих статистичних параметрів при обчисленні показника ступеня диференційовки сперматид, дозволяє визначити показник ступеня диференційовки сперматид з його вірогіднісною характеристикою для кожного індивідуума зокрема. Спосіб .здійснюється наступним чином, після фіксації сім'яників білих щурів у суміші Карнуа проводять заливку матеріалу в парафін згідно з загальноприйнятою схемою Готують серійні поперечні зрізи товщиною 6-7 мкм, фарбують гематоксиліном і еозином В кожному препараті сім'яника в 20 канальцях з VI е стадією сперматогенезу підраховують кількість сперматогоній, визначають середнє значення. Потім досліджують по 5 канальців на стадіях VI а і IXа сперматогенезу. Проводять вимірювання зовнішнього діаметру канальця (Д) і діаметра просвіту (d) Якщо зріз проведений через каналець не строго поперечно і його профіль має еліпсовидну форму, то за значення Д приймають значення найменшого діаметра. Потім у стандартній площі поля зору (може вибиратися дослідником довільно), який включає всю товщу сперматогенного ряду клітин, підраховують кількість сперматид (Р). Для кожного досліджуваного канальця такий підрахунок здійснюють в чотирьох полях зору, Таким чином в кожному препараті, що вивчається, проводять підрахунок числа сперматид у 20 полях зору. Результати досліджень та підрахунків заносять у таблиці. За розробленою нами комп'ютерною програмою здійснюють визначення показника ступеня диференційовки сперматид, який обчислюють за формулою. ПСДС' р;м Дв: Sj 4 и 1 Р./ »-уі К3 Р) Ьі -у, 1 * 35451 jix ' elV *!V о "ЇХ IV pIV p K Середнє -значення з середньої кількості сперматид в стандартній площі зрізу звивистих сім'яних канальців відповідно на стадіях VI а і IXа сперматогенезу в даному спостереженні Середнє значення кількості сперматид в стандартній площі зрізу звивистих сім'яних канальців відповідно на стадіях VI а і IXа для вивчених полів зору даного спостереження IV ВІДПОВІДНІ ПОМИЛКИ Ps,j , P sїх tj Кількість сперматид в одиничному полі зору $-*. ^гу-гх ' ^vi-w ' Кз Площа, в якій підраховувалась кількість сперматид відповідно для звивистих сім'яних канальців на стадії VI а і IXа сперматогенезу для вивчених пол • зору даного спостереження Основа і висота прямокутника площі стінки досліджуваного звивистого сім'яного канальця в полі зору, що вивчається Зовнішній діаметр та діаметр просвіту досліджуваного канальця Константи При проведенні порівняльної оцінки стану сперматогенезу з допомогою заявленого способу та способу прототипа отримані наступні результати Приклад 1. Показники стану сперматогенезу білих щурів після внутрішньошлункового введення ацетату свинцю на протязі циклу сперматогенезу в мінімальній (пороговій) дозі • 0,0015мг/кг маси тіла Група тварин Показники стану сперматогенезу Спосіб заявленого рішення Контроль 45,13+1,42 47 t 53 ± 2,66 Кількість сперматогоній 45,13+1,42 47,53 + 2,66 ПСДС 0,91 + 0,02 0,85 + 0,02* Спосіб прототипу Кількість сперматогоній Дослід *- розбіжності з контролем статистично значущі (р < 0,05). Приклад 2. Показники стану сперматогенезу білих щурів після 4-х місячної інгаляційної дії ле тучих компонентів епоксидної смоли ЄД-22ф в пороговій концентрації - 0,98 ± 0,02 мг/м3 Група тварин Показники стану сперматогенезу Контроль Дослід 43.92 ±2,03 48,89 ±2.24 Кількість сперматогоній 43,92 ±2,03 48,89 ± 2,24 ПСДС Спосіб прототипу 0,94±0,02 0,86 ±0.02* Спосіб заявленого рішення Кількість сперматогоній *- розбіжності з контролем статистично значущі (р < 0,05). 6 кожному з приведених прикладів показано, що при дії низьких рівнів хімічних факторів (свинець, епоксидна смола) порушення процесів сперматогенезу не виявляються способом прототипу, а реєструються тільки запропонованим способом, що підтверджує більш високу точність визначення і чутливість заявленого способу. Переваги запропонованого винаходу в порівнянні з відомими способами. 1. підвищення інформативності дослідження; 2. підвищення точності дослідження; 3. підвищення відтворюваності та зіставленості результатів дослідження; 4. підвищений чутливості визначення; 5. можливість вірогіднісноТ оцінки окремого визначення. Використана література: 1. Fogg J.C. and Cowing R.F. The changes In cell morphology and histochemistry of the testis following irradiation and their relation to other induced testicular changes. I. Quantitative random sampling of germinal cells at intervals following direct irradiation // Cancer res. -1951. - N 1 1 . - P.23 - 30. 2. Жорно Л.Я., Сурикова K.K. Реакция спврматогенного эпителия у мышей на длительное хроническое облучение малыми дозами гамма-лучей Со 80 // Докл. АН СССР. -1963. - Т.150. N*1. С.170-173. 3. Мамина В. П., Семенов Д И. Метод определения количества сперматогенных клеток семенника в клеточной суспензии // Цитология. 1976.-T.XVIII, NB7. -С.913-914. 4. Иванов Ю.В Ускоренные методы оценки гонадотоксического действия химических веществ 35451 // Ускоренное прогнозирование отдаленных проявлений реакции живых систем на химические воздействия / Сб. научных трудов. - Рязань. -1983. • Т.80 - С. 17 - 20, S. Щербаков Г.Г. Функционально-морфологические обоснования стабилизации количественных показателей состояния гонад экспериментальных животных при изучении гонадотоксического действия химических веществ // Гигиена труда, состояние здоровья работающих и вопросы токсикологии сложных неорганических композиций - Ставрополь. -1974. - С.98 -109. 6. teblond СР., Clermonf J. Definition of the stages of the cycle of the seminiferous epithelium in the rat // Aun. N J. Acad. Sci. - 1952. - V55. - P.548 • 573. 7. Perey В., Clermont J., Leblond C.P. The Weve of the seminiferous epithelium in the rat /' Amer. J. Anat. -1961. -V 108, N»1. - P.47 - 75. Тираж 50 екз. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000. м. Ужгород, вул. Гагаріиа, 101 (03122)3-72-89 (03122)2-57-03