Водна композиція інсуліну, що містить маніт, та спосіб одержання композиції, яка містить як розчинений, так і кристалічний інсулін

Даний винахід стосується водних інсулінових композицій, що містять інсулін людини, або його аналог, або похідну, ці композиції мають надзвичайну фізичну стабільність. Крім того, винахід стосується композицій для парентерального призначення, які включають такі інсулінові композиції, та способу поліпшення фізичної стабільності інсулінових препаратів. Діабет - загальний термін, який позначає порушення у людини, що має надмірне виділення сечі, як при цукровому, так і нецукровому діабеті. Цукровий діабет є метаболічним порушенням, при якому повністю або частково втрачається здатність до засвоєння глюкози. Від діабету страждають близько 2% усіх людей. З часу першого введення інсуліну у 1920-х роках постійно робляться кроки у напрямку поліпшення лікування цукрового діабету. Щоб запобігти виникнення критичного рівня глікемії пацієнти-діабетики часто практикують багаторазові ін'єкції, при яких при кожному вживанні їжі вводиться інсулін. Для лікування цукрового діабету пропонують і застосовують багато різноманітних інсулінових препаратів, таких як звичайний інсулін, інсулін Semilente®, ізофановий інсулін, інсуліно-цинкові суспензії, протаміноцинковий інсулін та інсулін Ultralente®. Оскільки пацієнти-діабетики лікуються інсуліном протягом кількох десятиліть, існує велика потреба в інсулінових препаратах, які були б безпечними та якісними. Деякі з наявних у торгівлі інсулінових препаратів характеризуються швидким початком дії, інші композиції починають діяти відносно пізно, але виявляють більш або менш тривалу дію. Інсулінові композиції, що діють швидко, зазвичай являють собою розчини інсуліну, тоді як інсулінові композиції, що діють із затримкою, можуть бути суспензіями, що містять інсулін у кристалічній та/або аморфній формі, осаджений через додавання тільки солей, або через додавання протаміну, або комбінації того й іншого. Крім того, деякі пацієнти використовують композиції, які і починають швидко діяти, і мають більш тривалу дію. Таким препаратом може бути розчин інсуліну, у якому суспендовані кристали протамінового інсуліну. Деякі пацієнти самі приготовляють готовий препарат шляхом перемішування розчину інсуліну з суспензійним препаратом у співвідношенні, потрібному для даного пацієнта. Як правило, інсулінові композиції вводять шляхом підшкірної ін'єкції. Для пацієнта важливим є графік дії інсулінового препарату, який відображає дію інсуліну на метаболізм глюкози як функцію часу з моменту ін'єкції. У цьому графіку, крім інших даних, важливе значення мають час початку дії, максимальне значення та загальна тривалість дії. Пацієнти потребують різних інсулінових препаратів з різними графіками дії. Один пацієнт може в один і той же день використовувати інсулінові композиції з дуже різними графіками дії. Потрібний графік дії залежить, наприклад, від години дня, кількості та складу будь-якої їжі, спожитої пацієнтом. Однак, так само важливою є фізична стабільність інсулінових препаратів з причини широкого використання шприців типу "авторучка" для ін'єкцій, таких як пристрої, що містять картриджі Penfill®, у яких інсуліновий препарат зберігається до повного спорожнення картриджу. Це може тривати щонайменше 1 - 2 тижні для пристроїв місткістю 1,5-3,0 мл. Перша стабільна нейтральна інсулінова суспензія була розроблена Скоттом та Фішером (J. Pharmacol. Exp. Ther. 58 (1936), 78), які виявили, що присутність надлишку протаміну та цинкової солі (2 мкг цинку на міжнародну одиницю інсуліну) може стабілізувати протаміно-інсуліновий препарат, описаний у роботі Hagedorn et al.: J.Am.Med.Assn. 106(1936), 177- 180. Протаміно-цинковий інсулін, виготовлений згідно з американською або європейськими фармакопеями містить аморфний протаміно-цинковий інсулін, а також кристалічний протаміно-цинковий інсулін. Щойно виготовлений протаміно-цинковий інсулін містить здебільшого аморфний осад, який при зберіганні частково трансформується у кристалічні частинки, що веде до більш тривалої дії. Повністю кристалічний різновид протаміно-цинкового інсуліну, що має назву NPH-інсулін або Ізофановий інсулін, був розроблений Крайєнбюлем та Розенбергом (Krayenbuh! and Rosenberg) (див. Rep. Steno Mem. Hosp. Nord. Insulinlab. 1 (1946), 60 та Датський патент № 64 708). Вони виявили, що інсулін разом з протаміном в ізофанових пропорціях при нейтральному рівні рН у присутності невеликої кількості цинку та фенолу або похідних фенолу або, краще, м-крезолу, утворює аморфний осад, який при відстоюванні поступово але повністю трансформується у видовжені чотирикутні кристали, обмежені на кінцях пірамідальними торцями. Інсулін та протамін лосося спільно кристалізуються у ваговому співвідношенні приблизно 0,09 мг протамінсульфату на 1 мг інсуліну. Для приготування чотирикутних кристалів необхідними є цинк у кількості принаймні 0,15 мкг на IU та фенольна сполука у концентрації понад 0,1%. Раніше кристали такого типу приготовляли з використанням інсуліну свині та великої рогатої худоби з натуральних джерел, але з вісімдесятих років використовують також інсулін людини, вироблений шляхом генної інженерії або напівсинтезу. Інсулін людини складається з двох поліпептидних ланцюгів, так званих ланцюгів А та В, які містять відповідно 21 та 30 амінокислот. Ланцюги А та В з'єднані між собою двома цистиндисульфідними мостами. Більшість інших видів інсуліну має подібну будову, але може не містити у відповідних позиціях ланцюгів таких самих амінокислот, як в інсуліні людини. Розвиток процесу, відомого як генна інженерія, зробив можливим легке приготування найрізноманітніших інсулінових сполук, аналогічних інсуліну людини. У цих аналогах інсулін у одна або кілька амінокислот заміщені іншими амінокислотами, які можуть бути кодовані нуклеотидними послідовностями. Оскільки інсулін людини, як зазначено вище, містить 51 амінокислотний залишок, зрозуміло, що може існувати велика кількість аналогів інсуліну, і фактично було виготовлено велику кількість різних аналогів з цікавими властивостями. У розчинах інсуліну людини з потрібною концентрацією для приготування препаратів для ін'єкцій молекула інсуліну присутня в асоційованій формі як гексамер (Brange et al. Diabetes Care 13, (1990), 923 - 954). Після підшкірної ін'єкції швидкість абсорбції потоком крові має залежати від розміру молекули, і було виявлено, що аналоги інсуліну з амінокислотними замінами, які протидіють утворенню цього гексамеру або інгібують це утворення, мають надзвичайно швидкий початок дії (Brange et al.: Ibid). Цей факт є дуже важливим з терапевтичної точки зору для пацієнта-діабетика. У кристалах протаміно-інсулінових препаратів тривалої дії інсулін також виявлено у формі гексамеру (Balschmidt et al.: Ada Chryst B47,(1991), 975 - 986). Фармацевтичні композиції, в основі яких лежать аналоги інсуліну людини, відомі, наприклад, з таких документів: WO 95/00550 стосується фармацевтичних препаратів на основі кристалів інсуліну, які містять Asp828 інсулін та протамін, які мають швидкий початок дії та тривалу активність при введенні in vivo. Кристали можуть, крім того, містити іони цинку та фенол та/або м-крезол. Як ізотонічний агент до препаратів додають гліцерин. У Патенті США № 5 461 031 описуються різні фармацевтичні композиції для парентерального введення, які включають швидкодіючий мономерний аналог інсуліну, цинк, протамін та похідну фенольної сполуки. Ці сполуки, до того ж, містять гліцерин, який діє як ізотонічний агент. У Патенті США № 5 474 978 описано швидкодіючу сполуку для парентерального введення, яка включає гексамерний комплекс аналогу інсуліну людини, що складається з шести мономерних аналогів інсуліну, іонів цинку та принаймні трьох молекул похідної фенольної сполуки. Оптимальним ізотонічним агентом є гліцерин. На жаль, інсулін має схильність до утворення нерозчинних біологічно неактивних фібрил через нековалентну полімеризацію (пор., наприклад, Jens Brange, Galenics of Insulin, Springer-Verlag, 1987 та посилання, що містяться у цій роботі). Утворенню фібрил сприяє підвищена температура, наприклад, понад 30°С, та супровідні рухи. Цей процес фібриляції, якого дуже важко уникнути, обмежує період, протягом якого може зберігатися інсуліновий препарат, а, отже, й об'єм картриджу Penfills®. Оскільки утворення фібрил в цілому вимагає мономеризації інсуліну, аналоги інсуліну, які не так легко утворюють ди- та гексамери, в результаті дають композиції, що мають меншу фізичну стабільність, зумовлену фібриляцією. Таким чином, задачею даного винаходу є створення інсулінового препарату, який включає інсулін людини, або його аналог, або похідну з поліпшеною фізичною стабільністю. Згідно з винаходом, ця задача досягається шляхом створення водного інсулінового препарату, який включає розчинений та/або осаджений інсулін людини, або його аналог, або похідну та розчинний у воді відновлений або невідновлюючий вуглевод, що містить принаймні 4 атоми вуглецю у головній вуглеводній структурі, або розчинну у воді невідновлюючу естерну та/або ефірну похідну вуглеводу або відновленого вуглеводу, що містить принаймні 4 атоми вуглецю у головній вугле водній структурі, або їхню суміш. фіг. 1 є фотомікрографією (х1000 збільшення) сполуки даного винаходу, яка включає кристали Asp628 інсулін-протаміну людини та маніт. Фіг. 2 є фотомікрографією (х1000 збільшення) сполуки даного винаходу, яка включає кристали інсулінпротаміну людини та маніт. Фіг. 3 є графіком дії препарату даного винаходу, що містить як розчинений, так і кристалічний Asp528 інсулін людини та препарат, що містить як розчинений, так і кристалічний інсулін людини. Обидва композиції, до того ж, містять маніт. Графік представляє реакцію глюкози крові після ін'єкції у свиней. З Фігури видно, що у високостабільного препарату AspB28 інсуліну людини зберігається швидкий початок дії. Визначення Використовуваний нами термін "аналог інсуліну людини" означає інсулін людини, у якому одну або кілька амінокислот видалено та/або заміщено іншими амінокислотами, включаючи амінокислоти, що не кодуються, або інсулін людини, який включає додаткові амінокислоти, тобто більше, ніж 51 амінокислоту. Використовуваний нами термін "похідна інсуліну людини" означає інсулін людини або його аналог, у якому принаймні один органічний замісник є зв'язаним з однією або кількома амінокислотами. У даному контексті термін "розчинний у воді" відповідає розчинності у воді приблизно принаймні 10 ммоль/л, краще - принаймні 50 ммоль/л, при температурі 20°С. Терміни "вуглевод", "відновлений вуглевод", "моносахарид", "дисахарид" та "естерні або ефірні похідні" таких сполук використовуються згідно з настановою К. A. Jensen, "Grundrids af den organiske kemi, Almen Кеті III, 1. Ed,, Jul. Gjellerups forlag, 1969, pp. 299-316. У даному контексті вираз "невідновлюючий вуглевод" означає вуглевод, який є практично нездатним реагувати з амінними групами інсуліну у препаратах даного винаходу для утворення глікованого інсуліну. Це визначення включає вуглеводи, у яких карбонільна(і) група(и) є неактивованою(ими) або блокованою(ими), наприклад, через утворення ангідриду або похідної. В одному з аспектів даний винахід стосується водного інсулінового препарату, який включає: розчинений та/або осаджений інсулін людини або його аналог та/або похідну та 100 - 400 мМ, краще - 150 - 250 мМ, ще краще - 180 - 230 мМ, розчинного у воді відновленого або невідновлюючого вуглеводу, що містить принаймні 4 атоми вуглецю у головній вуглеводній структурі, або розчинну у воді невідновлюючу естерну та/або ефірну похідну вуглеводу або відновленого вуглеводу, що містить принаймні 4 атоми вуглецю у головній вуглеводній структурі, або їхню суміш. В іншому аспекті даний винахід стосується водного інсулінового препарату, який включає: як розчинений, так і осаджений інсулін людини або його аналог та/або похідну та розчинний у воді відновлений або невідновлюючий вуглевод, що містить принаймні 4 атоми вуглецю у головній вуглеводній структурі, або розчинну у воді невідновлюючу естерну або ефірну похідну вуглеводу або відновленого вуглеводу, що містить принаймні 4 атоми вуглецю у головній вуглеводній стр уктурі, або їхню суміш. В іще одному аспекті даний винахід стосується водного препарату аналога інсуліну, який включає: розчинений та/або осаджений аналог інсуліну людини та розчинний у воді відновлений або невідновлюючий вуглевод, що містить принаймні 4 атоми вуглецю у головній вуглеводній структурі, або розчинну у воді невідновлюючу естерну та/або ефірну похідну вуглеводу або відновленого вуглеводу, що містить принаймні 4 атоми вуглецю у головній вуглеводній структурі, або їхню суміш. Вуглевод або вуглеводна похідна, використовувані в інсуліновому препараті даного винаходу в оптимальному варіанті містить від 5 до 18 атомів вуглецю у головній вуглеводній структурі і вибирається зпоміж таких сполук: і) моносахариди, вибрані з групи невідновлюючих альдоз або кетоз, краще - невідновлюючих альдотетроз, кетотетроз, альдопентоз, кетопентоз, альдогексоз та кетогексоз, ще краще - невідновлюючих альдопентоз, кетопентоз, альдогексоз та кетогексоз; іі) відновлені моносахариди, тобто, багатоатомні спирти, такі, як альдити, краще ^вибрані з групи, що складається з відновлених форм альдотетроз, кетотетроз, альдопентоз, кетопентоз, альдогексоз та кетогексоз, ще краще - відновлених форм альдопентоз, кетопентоз, альдогексоз та кетогексоз (тобто, пентитів та гекситів); ііі) невідновлюючі дисахариди, краще - вибрані з-поміж невідновлюючих дигексоз. Конкретними прикладами підходящих відновлених або невідновлюючих вуглеводів є: маніт, сорбіт, ксиліт, інозит, сахароза та трегалоза. Кращими сполуками з пп. і) - Ііі) є маніт та сорбіт, найбільшу перевагу віддають манітові. Кращими естерними та ефірними похідними є відповідно похідні С 1-С4 естерів жирних кислот та С 1-С4 похідні алкільних естерів. У конкретному варіанті втілення винаходу інсуліновий препарат також включає галогенід, краще - хлорид, ще краще - хлорид натрію. Було продемонстровано, що присутність галогеніду в результаті дає композиції, які мають ще більшу фізичну стабільність. Оскільки інсулінові композиції, які включають швидкодіючі аналоги інсуліну людини, як правило, виявляють досить низьку фізичну стабільність, переваги даного винаходу особливо виявляються у зв'язку з препаратами, які включають такі аналоги. Таким чином, інсуліновий препарат згідно з даним винаходом в оптимальному варіанті включає один або кілька швидкодіючих аналогів інсуліну людини, зокрема, аналоги, у яких позицію В28 займає Asp, Lys, Leu, Val або Ala, а позицію В29 займає Lys або Pro; або дез(В28-В30), дез(В27) або дез(В30) інсулін людини. Аналог інсуліну в оптимальному варіанті вибирають з-поміж аналогів інсуліну людини, у яких позицію В28 займає Asp або Lys, а позицію В29 займає Lys або Pro. Найкращими аналогами є AspB28 інсулін людини або LySB28ProB29 інсулін людини. В іншому варіанті втілення інсуліновий препарат згідно з винаходом включає похідну інсуліну, що має видовжений графік дії, таку, як інсуліни, що мають один або кілька ліпофільних замісників. Кращими ліпофільними інсулінами є ацильовані інсуліни, включаючи інсуліни, описані у WO 95/07931 (Novo Nordisk A/S), наприклад, похідні інсуліну людини, у яких ε-амінна група Lys B29 містить ацильний замісник, який включає принаймні 6 атомів вуглецю. Кращими похідними інсуліну є такі: В29-N e-міристоїл-дез(В30)-інсулін людини, B29-Ne-міристоїл інсулін людини, Β29-Νε -пальмітоїл інсулін людини, B28-Ne-міристоїл Lys 828 Pro829 інсулін людини, В28-N e-пальмітоїл Lys 828 Pro829 інсулін людини, B30-N eміристоїл ThrB29Lys B30-інсулін людини, В30-N eпальмітоїл-ТhrВ29L уs взо-інсулін людини, Β29-Νε (Ν-пальмітоїл-углутаміл)-дез(В30) інсулін людини, В29-Ne-(N-літохоліл-у-глутаміл)-дез(В30)-інсулін людини та В29-Ne(w)карбокеигептадеканоїл)-дез(В30)-інсулін людини; найбільшу перевагу віддають В29-N e-міристоїл-дез(В30)інсулінові людини. В оптимальному варіанті інсуліновий препарат включає і розчинений, і осаджений, краще - кристалічний інсулін, або аналог, або похідну інсуліну у ваговому співвідношенні від 1:99 до 99:1, краще - від 20:80 до 80:20, ще краще - від 30:70 до 70:30. У даному варіанті втілення винаходу інсуліновий препарат має ту перевагу, що він включає кристали, які включають: інсулін або аналог інсуліну та протамін, а також, не обов'язково, цинк та/або фенольну сполуку, таку, як фенол, м-крезол або їхню суміш. Кількість протаміну у кристалах в оптимальному варіанті становить 0,20 - 0,40 мг протамінової основи на 100 міжнародних одиниць інсуліну або аналога інсуліну. Співвідношення протаміну з інсуліном у кристалах у варіанті, якому віддають ще більшу перевагу, відповідає співвідношенню ізофану. Цинк в оптимальному варіанті присутній у кількості від 10 до 40 мкг Zn/100 міжнародних одиниць інсуліну, ще краще - від 15 до 35 мкг Ζn/100 міжнародних одиниць інсуліну. Фенол та м-крезол, відповідно, в оптимальному варіанті присутні у кількості, що становить від 0 до 4 мг/мл. Однак, найбільшу перевагу віддають суміші з 1,4 - 2,0 мг/мл м-крезолу та 0,6 - 2,0 мг/мл фенолу. Оптимальний інсуліновий препарат даного винаходу включає: а) 60 - 3000 нмоль/мл, краще - 240 - 1200 нмоль/мл, інсуліну людини або аналога інсуліну та/або похідної інсуліну; б) відновлений або невідновлюючий вуглевод, краще - маніт, у концентрації від 100 до 400 мМ, краще - від 150 до 250 мМ, ще краще - від 180 до 230 мМ; в) а хлорид, краще - хлорид натрію, у концентрації від 0 до 100 мМ, краще - від 5 до 40 мМ, ще краще- від 5 до 20 мМ; і г) фізіологічно прийнятний буфер, краще - фосфатний буфер, такий як динатрійфосфатдигідрат у кількості від 1 до 4 мг/мл. Препарат даного винаходу може, крім того, містити одну або кілька сполук, які зазвичай використовуються як ізотонічні агенти, такі як гліцерин. Значення рН інсулінового препарату в оптимальному варіанті становить від 7,0 до 7,8. Даний винахід, крім того, стосується способу приготування інсулінового препарату, що містить як розчинений, так і осаджений аналог інсуліну; цей спосіб включає такі етапи: а) забезпечення кислотного розчину, який включає аналог інсуліну людини, цинк та субізофанічну кількість протаміну; б) забезпечення лужного розчину, який включає речовину, що діє як буфер при фізіологічному рівні рН; причому принаймні один з зазначених розчинів також включає фенольну сполуку; в) змішування кислотного та лужного розчинів та, не обов'язково, доведення рН до значення у межах від 6,5 до 8,0, краще - від 7,0 до 7,8; і г) залишення отриманої в результаті суспензії для осадження. Цим способом інсуліновий препарат, що містить як розчинений, так і осаджений аналог інсуліну, може бути о триманий дуже просто. Крім того, осад отриманої в результаті суспензії зазвичай складається з видовжених кристалів, яким віддають перевагу у так званих премікс-інсулінових препаратах. Вагове співвідношення аналога інсуліну з протаміном у розчині етапу а) в оптимальному варіанті вибирається таким чином, щоб у кінцевому продукті вагове співвідношення розчиненого аналога інсуліну з осадженим становило у межах від 1:99 до 99:1, краще - від 20:80 до 80:20, ще краще - від 30:70 до 70:30. Точніше, розчин етапу а) в оптимальному варіанті включає від 120 до 6000 нмоль/мл аналога інсуліну та від 0,01 до 5,0 мг/мл протаміну. Розчин етапу а) також включає цинк, краще - у кількості, що становить від 10-40 мкг цинку/100 міжнародних одиниць інсуліну, ще краще - 15-35 мкг цинку/100 IU інсуліну. В оптимальному варіанті розчин а) та/або розчин б) включає хлорид, краще - хлорид натрію, у кількості, що становить у кінцевому продукті від 0 до 100 мМ, краще - від 5 до 40 мМ, ще краще - від 5 до 20 мМ. Рівень рН кислотного розчину етапу а) в оптимальному варіанті є нижчим 5, ще краще - у межах від 2 до 3,5. Аналогом інсуліну в оптимальному варіанті є інсулін людини, у якому позицію В28 займає Asp, Lys, Leu, Val або Ala, а позицію В29 займає Lys або Pro; або дез(В28-В30), дез(В27) або дез(В30) інсулін людини, ще краще - AspB28 інсулін людини або Lys B28ProB29 інсулін людини, найкраще - AspB28 інсулін людини. Фенольною сполукою, яка використовується у розчині етапу а) та/або етапу б), в оптимальному варіанті є фенол, м-крезол або їхня суміш. В оптимальному варіанті розчин етапу а) та/або етапу б) також включає розчинний у воді відновлений або невідновлюючий вуглевод, що містить принаймні 4 атоми вуглецю у головній вуглеводній структурі, або розчинну у воді невідновлюючу естерну та/або ефірну похідн у вуглеводу або відновленого вуглеводу, що містить принаймні 4 атоми вуглецю у головній вуглеводній стр уктурі, або їхню суміш. Вищезгаданий вуглевод або похідна вуглеводу в оптимальному варіанті містить від 5 до 18 атомів вуглецю у головній вуглеводній структурі. Особливу перевагу віддають варіантові, у якому розчин етапу а) та/або етапу б) включає маніт, сорбіт, ксиліт, інозит, трегалозу, са харозу або будь-яку їхню суміш, краще - маніт та/або сорбіт, ще краще - маніт. Буферною речовиною, задіяною у лужному розчині етапу б) в оптимальному варіанті є фізіологічно прийнятний буфер, краще - фосфатний буфер, ще краще - динатрійфосфатдигідрат. Осаджений аналог інсуліну в оптимальному варіанті має форму кристалів, що включають аналог інсуліну та протамін. Суспензію, отриману на етапі г), в оптимальному варіанті залишають для осадження при температурі у межах від 5°С до 40°С, краще - від 20°С до 36 °С, ще краще - від ЗО °С до 34 °С. Даний винахід ілюструють також нижчеподані приклади, які, однак, не є вичерпними. ПРИКЛАД І Препарат І Інсуліновий препарат, що містить як розчинений, так і кристалічний AspB28 інсулін людини, готували таким чином: Розчин А: Розчин AspB28 інсуліну людини у концентрації 200 міжнародних одиниць/мл приготовляли шляхом розчинення 76,5 мг AspB28 інсуліну людини у воді шляхом додавання до нього 326 мкл 0,2 N соляної кислоти та 163 мкл розчину хлориду цинку (0,4 мг/мл). Потім до розчину інсуліну при перемішуванні додавали 6,35 мг протамінсульфату і до цього розчину при перемішуванні додавали суміш, яка складалася з 17,2 мг м-крезолу, 15 мг фенолу та 455 мг маніту. Рівень рН отриманого в результаті прозорого розчину доводили до рН=2,6-2,9 і додавали воду до об'єму 10 мл. Розчин врівноважували при 28-32°С. Розчин Б: 25 мг динатрійфосфатдигідрату розчиняли у воді для ін'єкції. При перемішуванні додавали 17,2 мг мкрезолу, 15 мг фенолу та 455 мг маніту. Рівень рН отриманого в результаті прозорого розчину доводили до 9 і додавали до 10 мл води. Розчин врівноважували при 28-32°С. Змішування розчинів А та Б: Розчин Б додавали до розчину А, і рівень рН підводили до 7,30. Отриману в результаті суспензію залишали при 30°С на 6 днів для кристалізації. В отриманому в результаті препараті вагове співвідношення осадженого інсуліну з розчиненим становило 70:30. Препарат вводили у 1,5 мл картриджі Penfill®. ПРИКЛАД II Препарат 2 Інсуліновий препарат, що містить як розчинений, так і кристалічний AspB28 інсулін людини приготовляли таким чином: і) Кристалічна фракція. Розчин А: Розчин AspB28 інсуліну людини у концентрації 200 міжнародних одиниць/мл приготовляли шляхом розчинення 190,3 мг AspB28 інсуліну людини у воді через додавання до нього 813 мкл 0,2 N соляної кислоти та 410 мкл розчину хлориду цинку (0,4 мг/мл). Потім до розчину інсуліну при перемішуванні додавали 16,1 мг протамінсульфату, і до цього розчину при перемішуванні додавали суміш, що складалася з 43,0 мг м-крезолу, 37,5 мг фенолу, 909 мг маніту та 14,6 мг хлориду натрію. Рівень рН отриманого в результаті прозорого розчину доводили до рН = 2,6-2,9 і додавали воду до об'єму 22 мл. Розчин врівноважували при 32°С. Розчин Б: 62,4 мг динатрійфосфатдигідрату розчиняли у воді. При перемішуванні додавали 43,0 мг м-крезолу, 37,5 мг фенолу, 909 мг маніту та 14,6 мг хлориду натрію. Рівень рН отриманого в результаті прозорого розчину доводили до 9 і додавали воду до об'єму 22 мл. Розчин врівноважували при 32°С. Змішування розчинів А та Б: Розчин Б додавали до розчину А, рівень рН доводили до 7,30 і додавали до 50 мл води. Отриману в результаті суспензію залишали при 32°С на 4 дні для кристалізації. В отриманому в результаті препараті вагове співвідношення осадженого інсуліну з розчиненим становило 70:30. Препарат вводили у 1,5 мл картриджі Penfill®. ПРИКЛАДИ III-VI Композиції 3 - 6 Інсуліновий препарат, що містить як розчинений, так і кристалічний AspB28 інсулін людини, приготовляли, як описано у Прикладі II, за винятком того, що кількість маніту, використаного у Розчинах А та Б становила відповідно 818 мг, 1005 мг, 1047 мг та 1137 мг. Композиції вводили у 1,5 мл картриджі Penfill®. ПРИКЛАД VII Препарат 7 Інсуліновий препарат, що містить як розчинений, так і кристалічний Lys B28ProB29 інсулін людини, приготовляли таким чином: і) Кристалічна фракція. Розчин А: Розчин Lys B28ProB29 інсуліну людини у концентрації 200 міжнародних одиниць/мл приготовляли шляхом суспендування 69,7 мг Lys B28ProB29 інсуліну людини у воді. До цього розчину при перемішуванні додавали суміш, що складалася з 16,0 мг м-крезолу, 6,5 мг фенолу, 364 мг маніту та 25,1 мг динатрійдифосфатдигідрату. Потім додавали 50 мкл розчину хлориду цинку (10 мг/мл). Рівень рН отриманого в результаті прозорого розчину доводили до 7,40 і додавали воду до Об'єму 10 мл. Розчин врівноважували при 15°С. Розчин Б: Розчин протамінсульфату приготовляли шляхом розчинення 7,61 мг протамінсульфату та 25,1 мг динатрійфосфатдигідрату у воді. При перемішуванні додавали 16,0 мг м-крезолу, 6,5 мг фенолу та 364 мг маніту. Цей розчин при перемішуванні додавали до розчину протамінсульфату. Рівень рН отриманого в результаті прозорого розчину доводили до 7,40 і додавали воду до об'єму 10 мл. Розчин врівноважували при 15°С. Змішування розчинів А та Б: Розчин Б додавали до розчину А і рівень рН доводили до 7,30. Отриману в результаті суспензію залишали при 15°С на 3 дні для кристалізації. it) Розчинена фракція Розчин Lys B28ProB29 інсулін у людини приготовляли шляхом розчинення 34,9 мг Lys B28ProB29 іноулїну людини у воді шля хом додавання до нього 33 мкл 1 N соляної кислоти та 25 мкл розчину хлориду цинку (10 мг/мл). Потім до розчину інсуліну при перемішуванні додавали суміш, яка складалася з 26,1 мг натрійфосфатдигідрату, 6,5 мг фенолу, 16,0 мг м-крезолу та 364 мг маніту. Рівень рН отриманого в результаті прозорого розчину доводили до рН = 7,3 і додавали воду до об'єму 10 мл. 6 мл розчиненої фракції додавали до 14 мл кристалічної фракції і рівень рН доводили до 7,30. В отриманому в результаті препараті вагове співвідношення осадженого та розчиненого інсуліну становило 70:30. Препарат вводили у 1,5 мл картриджі Penfill®. ПРИКЛАД VIII Препарат 8 Інсуліновий препарат, що містить як розчинений, так і кристалічний інсулін людини, приготовляли таким чином: і) Кристалічна фракція Розчин А: Розчин інсуліну людини приготовляли шляхом розчинення 69,7 мг інсуліну людини у воді через додавання до нього 65 мкл 1 N соляної кислоти та 26 мкл розчину хлориду цинку (10 мг/мл). Потім до розчину інсуліну при перемішуванні додавали 6,0 мг протамінсульфату і до цього розчину при перемішуванні додавали суміш, що складалася з 15,0 мг фенолу та 17,2 мг м-крезолу. Рівень рН отриманого в результаті прозорого розчину доводили до рН = 2,7-3,2 і додавали воду до об'єму 10 мл. Розчин Б: 24,9 мг натрійфосфатдигідрату розчиняли у воді. При перемішуванні додавали 15 мг фенолу, 17,2 мг мкрезолу, 728 мг маніту та 11,7 мг хлориду натрію. Рівень рН отриманого в результаті прозорого розчину доводили до рН = 9 і додавали воду до об'єму 10 мл. Розчин Б додавали до розчину А і рівень рН доводили до 7,30. Отриману в результаті суспензію залишали при 22-24°С на добу. іі) Розчинена фракція Розчин інсуліну людини приготовляли шляхом розчинення 34,9 мг інсуліну людини у воді через додавання до нього 33 мкл 1 N соляної кислоти та 13 мкл розчину хлориду цинку (10 мг/мл). Потім до розчину при перемішуванні додавали суміш, яка складалася з 12,5 мг натрійфосфатдигідрату, 15 мг фенолу, 17,2 мг мкрезолу, 364 мг маніту та 5 ,8 мг хлориду натрію. Рівень рН Отриманого в результаті прозорого розчину доводили до рН = 7,3 і додавали воду до об'єму 10 мл. 6 мл розчиненої фракції додавали до 14 мл кристалічної фракції і рівень рН доводили до 7,30. В отриманому в результаті препараті вагове співвідношення осадженого інсуліну з розчиненим становило 70:30. Препарат вводили у 1,5 мл картриджі Penfili®. ПРИКЛАД IX Препарат 9 Інсуліновий препарат, що містить як розчинений, так і кристалічний AspB28 інсулін людини, приготовляли таким чином: Розчин А: Розчин AspB2a інсуліну людини у концентрації 200 міжнародних одиниць/мл приготовляли шляхом розчинення 189,9 мг AspB28 інсуліну людини у воді через додавання до нього 163 мкл 1 N соляної кислоти та 163,5 мкл розчину хлориду цинку (10 мг/мл). Потім при перемішуванні додавали 11,5 мг протамінсульфату у розчині і до цього розчину при перемішуванні додавали суміш, яка складалася з 44,3 мг м-крезолу, 38,6 мг фенолу та 1048 мг маніту та 7,3 мг хлориду натрію. Рівень рН отриманого в результаті прозорого розчину доводили до рН=2,6-2,9 і додавали воду до об'єму 25 мл. Розчин врівноважували при 22-24°С. Розчин Б: 62,3 мг динатрійфосфатдигідрату розчиняли у воді. При перемішуванні додавали 44,3мг м-крезолу, 38,6 мг фенолу, 1048 мг маніту та 7,3 мг хлориду натрію. Рівень рН отриманого в результаті прозорого розчину доводили до 9 і додавали воду до об'єму 25 мл. Розчин врівноважували при 22-24°С. Змішування розчинів А та Б: Розчин Б додавали до розчину А і рівень рН доводили до 7,30. Отриману в результаті суспензію залишали при 32°С на 2 дні для кристалізації. В отриманому в результаті препараті вагове співвідношення осадженого та розчиненого інсуліну становило 50:50. Препарат вводили у 1,5 мл картриджі Penfill®. ПРИКЛАД X (Порівняльний) Препарат 10 Інсуліновий препарат, що містить як розчинений, так і кристалічний AspB28 інсулін людини, приготовляли таким чином: Розчин А: Розчин AspB28 інсуліну людини у концентрації 200 міжнародних одиниць/мл приготовляли шляхом розчинення 76,5 мг AspB28 інсуліну людини у воді через додавання до нього 326 мкл 0,2 N соляної кислоти та 163 мкл розчину хлориду цинку (0,4 мг/мл). Потім до розчину інсуліну при перемішуванні додавали 6,35 мг протамінсульфату у розчині і до цього розчину при перемішуванні додавали суміш, яка складалася з 17,2 мг мкрезолу, 15,0 мг фенолу та 160 мг гліцерину. Рівень рН отриманого в результаті прозорого розчину доводили до рН = 2,6-2,9 і додавали воду до об'єму 10 мл. Розчин врівноважували при 28-32°С. Розчин Б: 25 мг динатрійфосфатдигідрату розчиняли у воді для ін'єкції. При перемішуванні додавали 17,2 мг мкрезолу, 15,0 мг фенолу та 160 мг гліцерину. Рівень рН отриманого в результаті прозорого розчину доводили до 9 і додавали воду до об'єму 10 мл. Розчин врівноважували при 28-32°С. Розчин Б додавали до розчину А і рівень рН доводили до 7,30. Отриману в результаті суспензію залишали при 28-32°С на 2 дні для кристалізації. В отриманому в результаті препараті вагове співвідношення осадженого інсуліну з розчиненим становило 70:30. Препарат вводили у 1,5 мл картриджі Penfill®. ПРИКЛАД XI ТЕСТИ З ДОДАТКОВИ М ФІЗИЧНИМ Н АВАНТАЖЕННЯМ 5 зразків кожного з інсулінових препаратів вводили у картриджі Penfill® й піддавали такому випробуванню з додатковим фізичним навантаженням: Картриджі Penfill® прикріплювали до обертаючого пристрою, розміщеного в інкубаторі, й обертали на 360° по чотири години на день з частотою ЗО обертів за хвилину й при температурі 37°С ± 2°С. Картриджі Penfill®, коли їх не обертали, зберігалися при температурі 37°С ± 2°С. Картриджі Penfill® вивчали під мікроскопом 5 разів на тиждень, і зміни у зовнішньому вигляді сполуки занотовували згідно з такими принципами: і) Картриджі, що містили білу суспензію, яка ресуспендувалася після перемішування й не мала грудок та гранул, класифікувалися як "нефібрильовані". іі) Картриджі, що містили суспензію з грудками та/або гранулами, які не ресуспендувалися після перемішування і/або осідали на стінках картриджу, вважалися "фібрильованими". Це було підтверджено шляхом додавання у картридж 6 мкл 6N НСІ: фібрильовані картриджі, як правило, стають непрозорими після додавання кислоти. Обертання картриджів тривало доти, доки всі зразки не стали фібрильованими. Результати зведено у нижчеподаній Таблиці. ТАБЛИЦЯ Препарат № 1 2 3 4 5 Композиція AspB28 інсуліну 30/70 7 мМ фосфа ту 250 мМ маніту AspB28 інсуліну 30/70 7 мМ фосфа ту 200 мМ маніту 10 мМ хлориду натрію AspB28 інсуліну 30/70 7 мМ фосфа ту 180 мМ маніту 10 мМ хлориду натрію AspB28 інсуліну 30/70 7 мМ фосфа ту 220 мМ маніту 10 мМ хлориду натрію AspB28 інсуліну 30/70 7 мМ фосфа ту 230 мМ маніту 10 мМ Середня кількість днів до фібриляції Перший день фібриляції 20 20 23 23 21 17 19 17 21 18 6 9 10 (порівняльний) хлориду натрію AspB28 інсуліну 30/70 7 мМ фосфа ту 250 мМ маніту 10 мМ хлориду натрію AspB28 інсуліну 50/50 7 мМ фосфа ту 230 мМ маніту 10 мМ хлориду натрію AspB28 інсуліну 30/70 7 мМ фосфа ту 174 мМ гліцерину 22 22 >30 >30 11 9