Спосіб поетапного приєднання частин поліетиленгліколю до поліпептиду

1. Спосіб поетапного приєднання частин поліетиленгліколю (ПЕГ) послідовно до поліпептиду, що включає стадії: взаємодії поліпептиду з гетеробіфункціональною або гомобіфункціональною ПЕГ-частиною, що має низьку молекулярну масу, яка має наступну формулу: W-CH2CH2О(СН2СН2О)nСН2СН2-Х, де W і Х є гр упами, які незалежно реагують з аміногрупою, сульфгідрильною, карбоксильною або гідроксильною функціональною групою для приєднання ПЕГ-частини з низькою молекулярною масою до поліпептиду, і взаємодії приєднаної до поліпептиду ПЕГ-частини з низькою молекулярною масою з монофункціональною або біфункціональною ПЕГ-частиною для приєднання монофункціональної або біфункціональної ПЕГ-частини до вільного кінця ПЕГ-частини з низькою молекулярною масою і утворенням кон'югата ПЕГ-поліпептид. 2. Спосіб за п. 1, де монофункціональна або біфункціональна ПЕГ-частина має наступну формулу: Y-CH2СН2O(CH2СН2O) mCH2СН2-Z, де Y є групою, реакційноздатною по відношенню до термінальної групи на вільному кінці ПЕГчастини з низькою молекулярною масою, приєднаною до поліпептиду, і Z є метоксигрупою або 2 (19) 1 3 79430 За даною заявкою був заявлений пріоритет у відповідності до [ст. 35 U.S.C.§ 119(е), за датою подання первинної тимчасової заявки США №60/083339], повний зміст якої включений сюди як посилання. Даний винахід відноситься до способу поетапного приєднання двох або більше частини поліетиленгліколю (ПЕГ) до поліпептиду, зокрема, до способу одержання кон'югатів поліетиленглікольb-інтерферон (ΠΕΓ-b-ΙΦΗ), в яких поліольна частина ковалентно пов'язана з Cys 17, а також до використання продуктів, одержаних даним способом в терапії, прогнозуванні або діагностиці бактеріальних інфекцій, вірусних інфекцій, аутоімунних захворювань і запалювальних захворювань. Інтерферон фібробластів людини (b-ΙΦΗ) володіє противірусною активністю і може також стимулювати природні клітини-кілери проти пухлинних клітин. Це поліпептид з масою близько 20.000Да, що індукується вірусами і двохнитковими РНК. З нуклеотидної послідовності гена фібробластного інтерферону, клонованого за допомогою технології з використанням рекомбінантної ДНК, [Derynk і інш. (Nature, 285:542-547, 1980)] встановили повну амінокислотну послідовність протеїну. Вона має довжину в 166 амінокислот. [Shepard et al. (Nature, 294:563-565, 1981)] описали мутацію при основі 842 (Cys-Tyr в положенні 141), яка знищувала противірусну активність інтерферону, і варіантний клон з делецією нуклеотидів 1119-1121. [Mark і інш. (Ргос. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81(18):5662-5666, 1984)] здійснили штучн у мутацію шляхом заміни основи 469 (Т) на (А), викликавши заміну амінокислоти Cys-Ser в положенні 17. Повідомлялося, що одержаний в результаті b-ΙΦΗ був так само активний, як "нативний" b-ΙΦΗ, і стійкий при тривалому зберіганні (-70°С). Ковалентне приєднання до молекул гідрофільного полімерного поліетиленгліколю (ПЕГ), також відомого як поліетиленоксид (ПЕО), має важливе застосування в біотехнології і медицині. У своїй найбільш загальній формі ПЕГ є лінійним полімером з гідроксильними групами на кожному кінці: НО-СН2-СН2О(СН2СН2О)nСН2СН2-ОН. Ця формула може бути стисло представлена як НО-ПЕГ-ОН, де мається на увазі, що -ПЕГ- являє собою основний ланцюг полімеру без кінцевих груп: "-ПЕГ-" означає -СН2СН2О(СН2СН2О)nСН2СН2-. ПЕГ звичайно використовується у ви гляді метокси-ПЕГ-ОН (м-ПЕГ), в якому один кінець є відносно інертною метоксигрупою, в той час як інший кінець являє собою гідроксильну групу, яка є об'єктом хімічної модифікації. СН3О-(СН2СН2)Оn-СН2СН2-ОН Також звичайно використовуються розгалужені ПЕГ. Розгалужені ПЕГ можуть бути позначені як R(-ПЕГ-OH)m, де R являє собою центральне ядро, таке, як, наприклад, пентаеритрит або гліцерин, і 4 m означає число відгалужень. Число відгалужень (m) може варіюватися від трьох до ста або більше. Гідроксильні групи є об'єктом хімічних модифікацій. Інша розгалужена форма, така, як описана в публікації [міжнародної патентної заявки WO 96/21469], має єдиний кінець, який є об'єктом хімічної модифікації. Цей тип ПЕГ може бути представлений як (CH3O- ПЕГ-)pR-X, де p дорівнює 2 або 3, R являє собою центральне ядро, таке, як наприклад, лізин або гліцерин, і X означає функціональну гр упу, таку, як наприклад, карбоксильну, яка є об'єктом хімічної активації. Ще одна розгалужена форма, "ПЕГ з бічними ланцюгами", має реакційноздатні групи, такі, як наприклад, карбоксильна, вздовж основного ланцюга ПЕГ, а не на кінці ланцюгів ПЕГ. У доповнення до цих форм ПЕГ, полімер може бути також одержаний зі слабими або здатними до розщеплення зв'язками в основному ланцюгу. Наприклад, [Harris в заявці на патент США 06/026716] показав, що ПЕГ може бути одержаний зі складноефірними зв'язками в полімерному основному ланцюгу, які є об'єктом гідролізу. Цей гідроліз приводить до розщеплення полімеру на фрагменти з більш низькою молекулярною масою згідно зі схемою реакції: -ПЕГ-СО2-ПЕГ- + Н2О®ПЕГ-СО2Н+НО-ПЕГ-. Згідно з даним винаходом термін поліетиленгліколь або ПЕГ включає всі описані вище похідні. Співполімери етиленоксиду і пропіленоксиду близькі до ПЕГ за своїми хімічними властивостями, і вони можуть бути використані замість ПЕГ в багатьох випадках його застосування. Вони мають наступну загальну формулу: HO-CH2CHRO(CH2CHRO)nCH2CHR-OH, де R означає Η або СН3. ПЕГ є корисним полімером, що має високу розчинність у воді, а також високу розчинність в багатьох органічних розчинниках. ПЕГ також нетоксичний і не є імуногенним. Коли ПЕГ приєднують хімічно (приєднання ПЕГ) до нерозчинних у воді сполук, одержаний в результаті кон'югат звичайно розчинний у воді, а також розчинний в багатьох органічних розчинниках. Кон'югати ПЕГ-білок в цей час використовуються в білок-замісній терапії і для інших терапевтичних цілей. Наприклад, пов'язана з ПЕГ аденозиндезаміназа (ADAGENÒ) використовується для лікування серйозних комплексних імунодефіцитних захворювань, пов'язана з ПЕГ L-аспарагіназа (ONCAPSPARÒ) застосовується для лікування гострого лімфобластного лейкозу і пов'язаної з ПЕГ a-інтерферон (INTRON(R) А) знаходиться на III стадії випробувань з лікування гепатиту С. Загальний огляд кон'югатів ПЕГ-білок, що мають клінічну ефективність, поданий в [NX. Burnham, Am. J. Hosp. Pharm., 15:210-218, 1994]. Був розроблений ряд способів приєднання ПЕГ до білків. Звичайно проводять приєднання ПЕГ до реакційноздатних груп білка, використовуючи похідні ПЕГ з підвищеною електрофільністю. 5 79430 6 групи похідне ПЕГ для такого сайт-специфічного Приєднання ПЕГ до a- і e-аміногруп, що є в залишприєднання ПЕГ. Було показано, що стійке похідне ках лізину, і до N-кінця дає кон'югат, що складається з суміші продуктів. ПЕГ, захищене по тіольній групі ортопіридилдисульфідною (ο-Π-SS-) реакційноздатною групою спеЗвичайно такі кон'югати включають ряд декіцифічно кон'югується з вільним цистеїном в білку, лькох молекул ПЕГ, приєднаних до молекули білка папаїні. Знову утворений дисульфідний зв'язок між ("ПЕГ-заходи") в кількості в межах від нуля до чиспапаїном і ПЕГ міг бути розщеплений в м'яких відла, відповідного числу аміногруп в білку. Для молекули білка, яка була одноразово модифікована, новних умовах для регенерації нативного білка. Цитування тут будь-якого документа не пеодиниця ПЕГ може бути приєднана до ряду різних редбачає визнання, що такий документ є раннім амінних сайтів. прототипом, або може бути розглянутий як матеріТакий тип неспецифічного приєднання ПЕГ ал відносно патентоздатності будь-якого пункту приводив до ряду кон'югатів, які ставали майже неактивними. Зниження активності звичайно виданої заявки. Будь-яка заява, що стосується вмісту або дати кликається екрануванням активного зв'язуючого будь-якого документа, основується на доступній домену білка, як у випадку багатьох цитокінів і анзаявникам інформації на момент представлення титіл. Наприклад, [Katre і інш. в патенті США документа і не є визнанням правильності такої №4766106 і патенті США №4917888] описують заяви. приєднання ПЕГ до b-ΙΦΗ і інтерлейкіну 2 (ІЛ-2) з Даний винахід далі стосується способу поетавикористанням великого надлишку метоксиполіепного приєднання ПЕГ-частин послідовно до політиленгліколілового ефіру Νпептиду, зокрема, способу одержання кон'югатів сукцинімідилглутарової кислоти і метоксиполіетиполіетиленгіколь-b-ΙΦΗ. Такі кон'югати, як очікуленгліколілового ефіру Ν-сукцинимідилянтарної ють, демонструють підвищену ефективність in кислоти. Обидва білки продукувались в мікробних vi vo. Метою винаходу є досягнення підвищеної клітинах-хазяях, що робило можливою сайтрозчинності при нейтральних значеннях рН, підспецифічну мутацію вільного цистеїну в серин. вищеній стабільності (знижена агрегація), зниженій Мутація була необхідна при мікробній експресії bімуногенності і відсутності втрати активності по ΙΦΗ для полегшення складання білка. Зокрема, bвідношенню до "нативного" b-ІФН. Результати таΙΦΗ, що використовується в ци х експериментах, є кої кон'югації можуть зменшити число доз, необтоварним продуктом BetaseronÒ, в якому залишок хідних для очікуваної дії, спростять і зроблять стаCys 17 замінений серином. Крім того, відсутність більною препаративну форму фармацевтичної глікозидування зменшувала розчинність продукту композиції і збільшать тривалість дії. у водному розчині. Неспецифічне приєднання ПЕГ На Фіг.1 показана крива капілярного електроприводило в результаті до підвищеної розчинності, форезу (КЕ) кон'югату ΠΕΓ-b-ІФН до очищення. але головною проблемою був знижений рівень Фіг.2А-2С показують очищення кон'югату ΠΕΓактивності і вихід. [Заявка на європейський патент ЕР 593868, b-ΙΦΗ, проведене за допомогою ексклюзійної за розмірами хроматографії (супероза 12): Фіг.2А названа "Кон'югати ПЕГ-інтерферон"], описує одеперше проходження; Фіг.2В - друге проходження; ржання кон'югатів ПЕГ-a-ІФН. Однак реакція приФіг.2С - третє проходження. єднання ПЕГ не є сайт-специфічною, і тому вихоФіг.3 являє собою хроматографію за допомодить суміш ізомерів положення кон'югатів ПЕГ-aгою електрофорезу в поліакриламідному гелі в ІФН [див. також Monkarsh і інш., ACS Symp.Ser., присутності додецилсульфату натрію (SDS-PAGE) 680:207-216, 1997]. кон'югату ΠΕΓ-b-ΙΦΗ, очищеного після третього [Kinstler і інш. в заявці на європейський патент проходження хроматографії. Смуги 1 і 4 являють ЕР 675201] продемонстрували селективну модисобою стандарти білків певної молекулярної маси, фікацію N-кінцевого залишку фактора росту і розсмуга 2 означає "нативний" b-ΙΦΗ, і смуга 3 являє витку мегакаріоцитів м-ПЕГ-пропіоновим альдегідом. Це дозволило здійснити відтворювані собою кон'югат ΠΕΓ-b-ΙΦΗ. приєднання ПЕГ і фармакокінетику від серії до Фіг.4 являє собою криву капілярного електросерії. [Gilbert і інш. в патенті США №5711944] покафорезу (КЕ) очищеного кон'югату ΠΕΓ-b-ΙΦΗ, в зали, що приєднання ПЕГ до a-ΙΦΗ може бути якому b-ΙΦΗ приєднаний до ПЕГ використанням мпроведено з оптимальним рівнем активності. У ПЕГ-o-n-SS5k. цьому випадку була потрібна трудомістка стадія Фіг.5 являє собою мас-спектр лазерної десорочищення для одержання оптимального кон'югату. бції і іонізації з матриці (MALDI-MS) очищеного Більшість цитокінів, як і інші білки, не володікон'югату ΠΕΓ-b-ΙΦΗ. ють специфічним сайтом для приєднання ПЕГ і, Фіг.6 показує порівняння антивірусної активнокрім згаданих вище прикладів, дуже можливо, що сті "нативного" b-ΙΦΗ і кон'югату ΠΕΓ-b-ΙΦΗ. Клі тидеякі з ізомерів, які одержуються при реакції прини WISH інкубували з вказаними концентраціями єднання ПЕГ, є частково або повністю неактивнизразків b-ΙΦΗ протягом 24 годин до контрольного ми, викликаючи таким чином втрату активності зараження цитопатичною дозою вірусу везикуляркінцевої суміші. ного стоматиту. Цитопатичний ефект визначали Сайт-специфічна реакція приєднання однієї після додаткових 48 годин при перетворенні із заодиниці ПЕГ є, таким чином, бажаною метою при стосуванням МТТ (3-[4,5-диметилтіазол-2-іл]-2,5одержанні таких білкових кон'югатів. дифенілтетразолійбромід, тіазоліловий синій). [Woghiren і інш., Bioconjugate Chem., 4 (5): 314Фіг.7 являє собою криву скріплення b-ΙΦΗ і 318, 1993], синтезували селективне до тіольної ПЕГ-ІФН в клітинах Daudi. 7 79430 8 динну хроматографію, рідинну хроматографію Фіг.8 демонструє фармокінетичну криву b-ΙΦΗ високого тиску (високоефективну), іонообмінну і ПЕГ-ІФН у мишей після внутрішньовенного введення. Пунктирні лінії вказують аналіз нижньої хроматографію, абсорбційну хроматографію, афінну хроматографію, розподільну хроматограмежі, що спостерігається (log-аналіз) для кожної фію, хроматографію з гідрофобною взаємодією, стандартної кривої. зворотно-фазову хроматографію, гель-фільтрацію, Фіг.9 демонструє фармакокінетичну криву bультрафільтрацію або тонкошарову хроматограΙΦΗ і ПЕГ-ІФН у мишей після підшкірного введенфію. ня. Пунктирні лінії означають LOQ-аналіз для кожТермін "b-ΙΦΗ", що використовується тут, ної стандартної кривої. означає інтерферон фібробластів людини, одерДаний винахід відноситься до способу поетапжаний шляхом виділення з біологічних рідин або ного приєднання двох або більше ПЕГ-частин до одержаний за допомогою методик з рекомбінантполіпептиду. Цей спосіб основується на виявленні ної ДНК з прокаріотичних або еукаріотичних клітого, що активований ПЕГ з низькою молекуляртин-хазяїв, а також його солі, функціональні похідною масою реагує більш повно зі стерично усклані, попередники і активні фракції за умови, що дненим реакційним сайтом на білку, ніж активовавони містять залишок цистеїну, який знаходиться в ний ПЕГ з високою молекулярною масою. ПЕГположенні 17 у формі, що зустрічається природі. модифікація дорогих терапевтичних білків повинна Поняття "солі", що використовується тут, відбути е фективною за вартістю, щоб приготування носиться як до солей карбоксильних гр уп, так і до кон'югатів ПЕГ було доцільним. Крім того, щоб солей аміногруп, одержаних відомими способами. зменшити фільтрацію від конгломератів і оптиміСолі карбоксильних груп включають неорганічні зувати фармакологічні властивості кон'югатів ПЕГсолі, такі як, наприклад, натрієві, калієві, кальцієві білок, кон'югати повинні мати ефективний розмір, солі і солі з органічними основами, такі, як утворееквівалентний такому для білка з молекулярною ні з аміном, таким як, наприклад, триетаноламін, масою в 70 кДа. Це означає, що для сайтаргінін або лізин. Солі аміногруп включають, наспецифічної модифікації, коли приєднується один приклад, солі з неорганічними кислотами, такими залишок ПЕГ, переважно приєднується похідне як соляна кислота, і з органічними кислотами, таПЕГ з молекулярною масою більшою ніж 20кДа. кими як оцтова кислота. Якщо сайт модифікації стерично навантажений, Поняття "функціональні похідні", що викорисреакційноздатна група на великій ПЕГ-частині мотовуються тут, відноситься до похідних, які можуть же мати складності в досягненні сайту модифікабути одержані, завдяки функціональним групам, ції, і це приведе до низьких виходів. Переважний присутнім в бічних ланцюгах амінокислотних діляспосіб приєднання ПЕГ до поліпептиду згідно з нок або в кінцевих N- або С- групах, відповідно до даним винаходом підвищує вихід сайтвідомих способів і включаються в даний винахід, специфічного приєднання ПЕГ шляхом того, що коли вони є фармацевтично прийнятними, тобто спочатку приєднується невелика гетеро- або гомоколи вони не придушують активність білка або не біфункціональна ПЕГ-частина, яка, завдяки своєму додають токсичності фармацевтичним композицівідносно меншому розміру, може реагувати зі стеям, що їх містять. Такі похідні включають, наприрично навантаженими сайтами. Подальше приєдклад, складні ефіри або аліфатичні аміди карбокнання похідного ПЕГ з великою молекулярною сильних груп і N-ацилпохідні вільних аміногруп або масою до невеликого ПЕГ приводить до високого О-ацилпохідні вільних гідроксильних груп і утвовиходу бажаного білка з приєднаним ПЕГ. рюються з ацильними групами, такими як, наприСпосіб поетапного приєднання двох або декіклад, алканоїльна або ароїльна групи. лькох ПЕГ-частин послідовно до поліпептиду згід"Попередники" являють собою сполуки, які пено з даним винаходом включає приєднання гетеробіфункціональної або гомобіфункціональної ретворюються в b-ΙΦΗ в організмі людини або ПЕГ-частини з низькою молекулярною масою спотварини. чатку до поліпептиду і потім приєднання монофунЯк "активні фракції" білка даний винахід має кціональної або біфункціональної ПЕГ-частини до на увазі будь-який фрагмент або попередник полівільного кінця ПЕГ-частини з низькою молекулярпептидного ланцюга самої сполуки, однієї або в ною масою, яка приєднана до поліпептиду. Після комбінації з родинними молекулами або з пов'язапоетапного приєднання двох або більше ПЕГними з ним залишками, наприклад, залишки цукрів частин послідовно до поліпептиду, який переважабо фосфатів, або агрегати поліпептидної молекули, коли такі фрагменти або попередники виявляно є b-ΙΦΗ і в якому Cys 17, розташований в стерично навантаженому сайті, є переважним сайтом ють таку ж активність, як b-ΙΦΗ, як лікарський заприєднання ПЕГ, кон'югат ПЕГ-поліпептид може сіб. ПЕГ-частина з низькою молекулярною масою бути очи щений з використанням однієї або більше має формулу: хроматографічних методів. W-CH2CH2O(СН2СН2О)nСН2СН2-Х, "Хроматографічний метод" має на увазі будьде W і X є групами, які незалежно реагують з яку методику, що використовується для розділенаміном, сульфгідрильною, карбоксильною або гідня компонентів суміші при їх нанесенні на носій роксильною функціональною групою для приєд(стаціонарна фаза), через який пропускають рознання ПЕГ-частини з низькою молекулярною мачинник (рухома фаза). Принципи розділення при сою до поліпептиду. W і X вибираються незалежно хроматографії основуються на різних фізичних переважно з ортопіридилдисульфіду, імідів малеївластивостях стаціонарної і рухомої фази. нової кислоти, вінілсульфонів, йодацетамідів, аміДеякі особливі види хроматографічних метонів, тіолів, карбоксилів, активних складних ефірів, дів, які добре відомі в літературі, включають: рібензотриазолкарбонатів, п-нітрофенолкарбонатів, 9 79430 10 ізоціанатів і біотину. ПЕГ-частина з низькою молечайними методиками. кулярною масою переважно має молекулярну маДаний винахід описаний з посиланням на консу в діапазоні від 100 до 5000дальтон. кретні варіанти здійснення винаходу, але вміст Монофункціональна або біфункціональна ПЕГопису включає всі модифікації і заміни, які можуть частина для приєднання до вільного кінця ПЕГ з бути зроблені фахівцем в даній області без рознизькою молекулярною масою, який пов'язаний з ширення об'єму і мети, визначеного формулою поліпептидом, має переважно молекулярну масу в винаходу. діапазоні приблизно від 100дальтон до 200кДа і Винахід далі буде описаний за допомогою наявляє собою переважно метокси-ПЕГ, розгалужеступних прикладів, які не повинні бути розглянуті ний ПЕГ, гідролітично або ферментативно розклаяк такі, що будь-яким чином обмежують даний дальний ПЕГ, доповнений ПЕГ або дендримірний винахід. ПЕГ. Монофункціональний або біфункціональний Приклад 1: Одержання кон'югату ΠΕΓ-b-ΙΦΗ ПЕГ має, крім того, формулу: Модифікація b-ΙΦΗ за допомогою м-ПET5k-SSY-CH2CH2O(CH2CH2O)м CH2CH2-Z, П-o. де Υ є реакційноздатним залишком по відноРекомбінантний b-ΙΦΗ людини, стійкий при шенню до кінцевої групи на вільному кінці ПЕГконцентрації 0,37мг/мл в 50мМ буфері з ацетатом частини з низькою молекулярною масою, яка принатрію, рН 3,6, використовували для одержання єднана до поліпептиду, і Ζ є метоксигрупою або кон'югату ΠΕΓ-b-ΙΦΗ. Приблизно 1,0мл 6М сечовиреакційно здатною групою для утворення біфункни додавали до 2мл b-ΙΦΗ в концентрації ціонального кон'югату. 0,37мг/мл (0,74мг, 3,7´10-8моль). Додавали мКон'югат ПЕГ-поліпептид, одержаний вищезаПET5k-SS-П-o з молярним лишком 50моль на один значеним способом поетапного приєднання двох моль b-ΙΦΗ і обидва компоненти реагували в поліабо більше ПЕГ-частин, може бути застосований пропіленовій пробірці або протягом 2 годин при як активний інгредієнт для одержання лікарського 37°С, або протягом 1 години при 50°С. Реакційну засобу або фармацевтичної композиції для лікусуміш перед будь-яким очищенням аналізували з вання захворювань або порушень, по відношенню використанням кривої капілярного електрофорезу до яких поліпептиди є ефективними. (КЕ) для визначення міри утворення кон'югату Іншим об'єктом даного винаходу є одержання ПЕГ-р-ІФН при реакції приєднання ПЕГ (Фіг.1). кон'югатів в по суті очищеній формі, для того, щоб Типовий вихід ΠΕΓ-b-ΙΦΗ для цієї реакції становони були придатні для використання в фармацевить 50%. Продукти реакції відфільтровували від втичних композиціях як активні інгредієнти для реакційної суміші із застосуванням шприцевого лікування, діагностики або прогнозування бактефільтра діаметром 0,22мм і відфільтрований розрійних або вірусних інфекцій, а також аутоімунних, чин потім завантажували в колонку для ексклюзизапальних захворювань і пухлин. вної за розмірами хроматографії (або супероза 12, Нелімітуючі приклади вищезгаданих захворюабо супердекс 75, Pharmacia) і елюювали буфером вань включають: септичний шок, СНІД, ревматоїдз рН 7,0, що містить 50мМ фосфат натрію, 150мМ ний артрит, червоний вовчак і розсіяний склероз. NaCl. На Фіг.2А представлена крива елюювання Подальші варіанти здійснення винаходу і пепісля очищення кон'югату ΠΕΓ-b-ΙΦΗ на колонці із реваги винаходу будуть очевидні з наступного суперозою 12 для виштовхувальної за розмірами опису. хроматографії. Піки збирали і аналізували за доВаріантом здійснення винаходу є введення помогою електрофорезу в поліакриламідному гелі фармакологічно активної кількості кон'югатів за в присутності додецилсульфату натрію (Фіг.3). винаходом суб'єктам з ризиком розвитку одного з Фракції, що містять кон'югат ΠΕΓ-b-ΙΦΗ, об'єднувищезазначених захворювань або суб'єктам, що вали і концентрат потім повторно завантажували в вже має такі патології. таку ж колонку для виштовхувальної за розмірами Може бути використаний будь-який спосіб хроматографії з метою подальшого очищення введення, сумісний з діючим початком. Парентекон'югату ΠΕΓ-b-ΙΦΗ через близькість піку "нативральне введення, як, наприклад, підшкірне, внутного" b-ΙΦΗ (Фіг.2В). Цю процедуру повторювали рішньом'язова або внутрішньовенна ін'єкції пере(третє проходження), щоб гарантува ти чистоту важно. Доза активного інгредієнта, яку потрібно (Фіг.2С). Фіг.4 і Фіг.5 представляють відповідно ввести, залежить від медичного припису відповідкриву капілярного електрофорезу і мас-спектр но до віку, ваги і індивідуальної реакції хворого. лазерної десорбції і іонізації з матриці очищеного Доза може бути в інтервалі від 10мкг до 1мг на кон'югату ПЕГ-b-ΙΦΗ. день для середньої ваги тіла 75кг, переважна денМодифікація b-ΙΦΗ за допомогою м-ПET30k-SSна доза знаходиться в інтервалі від 20мкг до П-o. 200мкг. Фармацевтичні композиції для парентеральноНаданий рекомбінантний людський b-ΙΦΗ стійкий в розчині в концентрації 0,36мг/мл в 50мМ наго введення можуть бути одержані у вигляді ін'єктованої форми, що складається з активного початтрій-ацетатному буфері, рН 3,6. Приблизно 36мг ку і відповідного носія. Носії для парентерального м-ПЕГ 30k-SS-Π-ο в 3мл деіонізованої води додававведення добре відомі в цій області і включають, ли до 3мл b-ΙΦΗ в концентрації 0,36мг/мл (1,08мг, наприклад, воду, фізіологічний розчин, розчин Рін4,9´10-8моль) і обидва продукти реагували в полігера і/або декстрозу. Носій може містити невеликі пропіленовій пробірці протягом 2 годин при 50°С. кількості наповнювачів для підтримки стабільності Реакційну суміш аналізували для визначення міри і ізотонічності фармацевтичного препарату. Одермодифікації за допомогою капілярного електрофожання розчинів може бути здійснено згідно із звирезу. Звичайні виходи для цієї реакції становлять 11 79430 12 80% в залежності від чистоти ПЕГ реагенту і умов реакції. Після повного опису даного винаходу фа хівцям в цій області зрозуміло, що те ж саме може бути здійснено у більшому діапазоні еквівалентних параметрів, концентрацій і умов без відступу від об'єму і суті винаходу і без надмірного експериментування. Хоча цей винахід був описаний в зв'язку з конкретним варіантом його здійснення, зрозуміло, що він допускає подальші модифікації. Ця заявка передбачає поширення на будь-які варіанти, використання або адаптацію винаходів, що дотримуються в більшості випадків принципів винаходу і що включають і такі відхилення від даного розкриття, як такі, що зустрічаються в рамках відомої або звичної практики в області, до якої відноситься винахід, і які можуть бути застосовані до основних істотних ознак, вказаних вище в заявлених пунктах формули винаходу. Всі зазначені тут посилальні матеріали, включаючи статті в журналах і реферати, опубліковані або неопубліковані заявки на патенти США або заявки на іноземні патенти, опубліковані патенти США або іноземні патенти або будь-які інші посилання, повністю включені сюди як посилання, включаючи всі дані, таблиці, малюнки і текст цитованих посилань. Крім цього, повний зміст посилальних матеріалів в приведених тут посиланнях також повністю включений як посилання. Посилання на відомі стадії методів, стадії звичайних методів, відомі методи або звичайні методи ні в якій мірі не є допущенням того, що будь 17 79430 18 який аспект, опис або здійснення даного винаходу дотримуванні представлених тут вказівок, передрозкривається, вивчається або пропонується в бачається, що такі адаптації і модифікації знахорівні техніки. дяться в межах об'єму і суті еквівалентів варіантів Приведений вище опис конкретних варіантів здійснення винаходу, що розкриваються. Потрібно здійснення винаходу настільки повно розкриває також зрозуміти, що приведена тут фразеологія загальну природу винаходу, що інші можуть, викоабо термінологія використовується з метою опису, ристовуючи знання в межах необхідної в даній а не обмеження, так що термінологія або фразеообласті кваліфікації (включаючи зміст процитовалогія даного технічного опису повинна інтерпретуних посилань), легко модифікувати і/або адаптуваватися кваліфікованим фахівцем в світлі предстати для різних застосувань такі спеціальні варіанти вленого тут навчання і дотримування здійснення винаходу без надмірного експерименпредставлених вказівок в комбінації зі знаннями тування, без відхилення від загальної концепції кваліфікованого фахівця в даній області. даного винаходу. Тому, основуючись на навчанні і 19 Комп’ютерна в ерстка О. Гапоненко 79430 Підписне 20 Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601