Спосіб експресії рекомбінантного поліпептиду рослинною або бактеріальною клітиною-хазяїном, спосіб одержання та вивільнення рекомбінантного поліпептиду з рекомбінантного злитого поліпептиду, спосіб виготовлення

1 Способ экспрессии рекомбинантного полипептида растительной или бактериальной клеткой-хозяином, отличающийся тем, что указанный способ включает а) введение в растительную или бактериальную клетку-хозяина химерной ДНК, включающей первую последовательность ДНК, способную регулировать транскрипцию в указанной клетке-хозяине второй последовательности ДНК, где указанная вторая последовательность кодирует рекомбинантный слитый полипептид и содержит (і) последовательность ДНК, кодирующую часть белка олеозина, достаточную для обеспечения перевода рекомбинантного слитого полипептида в липидную фазу, соединенную в рамке считывания с (м) последовательностью ДНК, кодирующей указанный рекомбинантный полипептид, и третью последовательность ДНК, кодирующую терминирующую область, функциональную в клеткехозяине, и b) культивирование указанной клетки-хозяина для получения рекомбинантного слитого полипептида 2 Способ по п 1, отличающийся тем, что дополнительно включает отделение рекомбинантного слитого полипептида от компонентов клеткихозяина путем селективного распределения в липидную фазу 3 Способ по п 1, отличающийся тем, что дополнительно включает отделение рекомбинантного слитого полипептида от компонентов клеткихозяина путем селективного распределения в липидную фазу, содержащую масляные тела 4 Способ по п 3, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный слитый полипептид отделяют путем добавления компонентов масляного тела и восстановления масляных тел 5 Способ по п 2, отличающийся тем, что дополнительно включает высвобождение рекомбинантного полипептида из рекомбинантного слитого полипептида, связанного с липидной фазой, отличающийся тем, что включает c) встраивание в указанную вторую последовательность ДНК между указанной последовательностью ДНК (і), кодирующей белок олеозин, и последовательностью ДНК (и), кодирующей указанный рекомбинантный полипептид, линкерной последовательности ДНК (ш), кодирующей аминокислотную последовательность, которая может быть специфично расщеплена ферментным или химическим агентом, и d) контактирование липидной фазы с указанным ферментным или химическим агентом таким образом, что указанный рекомбинантный полипептид высвобождается из рекомбинантного слитого полипептида 6 Способ по п 5, отличающийся тем, что указанная аминокислотная последовательность, кодируемая указанной линкерной последовательностью ДНК, может быть расщеплена ферментным агентом 7 Способ по п 6, отличающийся тем, что указанная линкерная последовательность ДНК кодирует О 00 (О (О 46689 d) обеспечение прорастания указанного семени, аминокислотную последовательность, распознапричем указанный фермент, кодируемый указанваемую с помощью протеолитического действия ной второй химерной ДНК экспрессируется и отфермента, выбранного из группы, состоящей из щепляет рекомбинантный полипептид от рекомтромбина, фактора Ха, коллагеназы и химозина бинантного слитого полипептида, связанного с 8 Способ по п 6, отличающийся тем, что указанмасляными телами, во время прорастания семян ный ферментный агент содержит иммобилизовани раннего роста проростка ный фермент 9 Способ по п 8, отличающийся тем, что указан13 Способ изготовления пищи на основе модиный фермент иммобилизован путем связывания фицированных семян путем получения рекомбибелка олеозина, который ассоциирован с маслянантного полипептида, связанного с фракцией ным телом масляных тел семян растения, отличающийся тем, что включает 10 Способ по п 1, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный полипептид представляет a) введение в растительную клетку химерной ДНК, собой фермент содержащей первую последовательность ДНК, способную регулировать транскрипцию в указан11 Способ по п 10, отличающийся тем, что уканой растительной клетке второй последовательзанный рекомбинантный полипептид представляности ДНК, где указанная вторая последовательет собой фермент, который сохраняет свои ферность ДНК кодирует рекомбинантный слитый ментативные свойства, будучи частью полипептид и содержит (і) последовательность рекомбинантного слитого полипептида, связанноДНК, кодирующую часть белка олеозина, достаго с масляным телом точную для обеспечения перехода рекомбинант12 Способ получения и высвобождения рекомбиного слитого полипептида в масляное тело, сонантного полипептида из рекомбинантного слитоединенную в рамке считывания с (м) го полипептида, связанного с фракцией масляных последовательностью ДНК, кодирующей рекомбителрастений во время прорастания семян и роста нантный полипептид, и третью последовательпроростка растения, отличающийся тем, что ность ДНК, кодирующую терминирующую область, включает a) введение в растительную клетку первой химерb) регенерирование растения из указанной растиной ДНК, содержащей первую последовательтельной клетки и выращивание указанного растеность ДНК, способную регулировать транскрипцию ния с получением семян, посредством чего эксв указанной растительной клетке второй последопрессируется и связывается с масляными телами вательности ДНК, где указанная вторая последоуказанный рекомбинантный слитый полипептид, и вательность ДНК кодирует рекомбинантный слиc) измельчение указанных семян и изготовление тый полипептид и содержит (і) пищи на основе модифицированных семян последовательность ДНК, кодирующую часть бел14 Способ получения фермента, связанного с ка олеозина, достаточную для обеспечения перемасляным телом, в растительной или бактериальхода рекомбинантного слитого полипептида в ной клетке-хозяине и высвобождения указанного масляное тело, соединенную в рамке считывания фермента из масляного тела, отличающийся тем, с (м) последовательностью ДНК, кодирующей речто включает комбинантный полипептид, и (їм) линкерную поa) трансформирование растительной или бактеследовательность ДНК, кодирующую аминокисриальной клетки-хозяина химерной ДНК, содерлотную последовательность, которая может быть жащей первую последовательность ДНК, способспецифично расщеплена ферментным агентом, ную регулировать транскрипцию второй где указанная линкерная последовательность ДНК последовательности ДНК, где указанная вторая (ш) расположена между указанной последовапоследовательность ДНК кодирует рекомбинанттельностью ДНК (і), кодирующей белок олеозин, и ный слитый полипептид и содержит (і) последовауказанной последовательностью ДНК (м), кодительность ДНК, кодирующую часть белка олеозирующей рекомбинантный полипептид, и третью на, достаточную для обеспечения перехода последовательность ДНК, кодирующую терминирекомбинантного слитого полипептида в масляное рующую область, тело, (м) последовательность ДНК, кодирующую фермент, и (ш) линкерную последовательность b) последовательное или одновременное введеДНК, расположенную между указанной последоние в геном указанного растения второй химерной вательностью ДНК (і), кодирующей белок олеозин, ДНК, содержащей первую последовательность и указанной последовательностью ДНК (и), кодиДНК, способную во время прорастания семян и рующей фермент, где указанная последовательроста проростка специфично регулировать трансность ДНК (ш) кодирует аминокислотную последокрипцию второй последовательности ДНК, кодивательность, которая может быть расщеплена рующей специфичный фермент, который спософерментом, кодируемым последовательностью бен расщеплять линкерную последовательность ДНК (м), и третью последовательность ДНК, кодиДНК из указанной первой химерной ДНК, и третью рующую терминирующую область, функциональпоследовательность ДНК, кодирующую термининую в указанной клетке-хозяине, рующую область, c) регенерирование растения из указанной растительной клетки и выращивание указанного растения с получением семян, посредством чего экспрессируется и связывается с масляными телами указанный рекомбинантный слитый полипептид, и b) культивирование клетки-хозяина с получением рекомбинантного слитого полипептида в условиях, при которых фермент неактивен, c) выделение масляных тел, содержащих рекомбинантный слитый полипептид, и 46689 c) культивирование указанной первой клеткихозяина в условиях, при которых первый рекомбинантный слитый полипептид экспрессируется и связывается с масляными телами с получением первой фракции масляных тел, содержащих первый рекомбинантный слитый полипептид, d) культивирование указанной второй клеткихозяина в условиях, при которых второй рекомбинантный слитый полипептид экспрессируется и связывается с масляными телами с получением второй фракции масляных тел, содержащих второй рекомбинантный слитый полипептид, e) взаимодействие первой фракции масляных тел со стадии (с) со второй фракцией масляных тел со стадии (d) в таких условиях, что ферментная часть второго рекомбинантного слитого полипептида отщепляет первый рекомбинантный полипептид от первого рекомбинантного слитого полипептида 17 Способ по п 1, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный полипептид представляет собой интерлейкин 18 Способ по п 1, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный полипептид представляет собой ингибитор тромбина 19 Способ по п 1, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный полипептид представляет собой гирудин 20 Способ по п 1, отличающийся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой растительную клетку 21 Способ по п 20, отличающийся тем, что указанное растение является двудольным 22 Способ по п 20, отличающийся тем, что указанное растение относится к семейству Brassicaсеае 23 Способ по п 1, отличающийся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку b) трансформирование второй растительной или бактериальной клетки-хозяина второй химерной 24 Способ по п 1, отличающийся тем, что в укаДНК, содержащей первую последовательность занной второй последовательности ДНК последоДНК, способную во время прорастания семян и вательность ДНК (і) представляет собой ген олеороста проростка специфично регулировать трансзина, полученный из растения семейства крипцию второй последовательности ДНК, где Brassicaceae указанная вторая последовательность кодирует 25 Способ по п 1, отличающийся тем, что в укавторой рекомбинантный слитый полипептид и созанной второй последовательности ДНК последодержит (і) последовательность ДНК, кодирующую вательность ДНК (і) представляет собой ген олеочасть белка олеозина, достаточную для обеспечезина, полученный из Arabidopsis thahana ния перехода рекомбинантного слитого полипеп26 Способ по п 25, отличающийся тем, что укатида в липидную фазу, соединенную в рамке счизанная первая последовательность ДНК получена тывания с (и) последовательностью ДНК, из гена олеозина из растения Arabidopsis thahana кодирующей специфичный фермент, который спо27 Способ по п 25, отличающийся тем, что укасобен расщеплять линкерную последовательность занная ДНК (і) имеет следующую последовательДНК указанной первой химерной ДНК, и третью ность SEQ ID NO 1 последовательность ДНК, кодирующую терминирующую область, d) изменение условий среды, окружающей масляные тела, таким образом, что фермент активируется и отщепляется от рекомбинантного слитого полипептида 15 Способ по п 14, отличающийся тем, что указанный фермент активируется путем понижения значения рН среды, окружающей масляные тела 16 Способ экспрессии рекомбинантного полипептида, связанного с масляным телом, растительной или бактериальной клеткой-хозяином и выделения указанного рекомбинантного полипептида из масляного тела, отличающийся тем, что включает a) трансформирование первой растительной или бактериальной клетки-хозяина первой химерной ДНК, содержащей первую последовательность ДНК, способную регулировать транскрипцию в указанной клетке-хозяине второй последовательности ДНК, где указанная вторая последовательность кодирует первый рекомбинантный слитый полипептид и содержит (і) последовательность ДНК, кодирующую часть белка олеозина, достаточную для обеспечения перехода рекомбинантного слитого полипептида в липидную фазу, соединенную в рамке считывания с (м) последовательностью ДНК, кодирующей указанный рекомбинантный полипептид, и (ш) линкерную последовательность ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность, которая может быть специфично расщеплена ферментным агентом, где указанная линкерная последовательность ДНК (ш) расположена между указанной последовательностью ДНК (і), кодирующей белок олеозин, и указанной последовательностью ДНК (м), кодирующей рекомбинантный полипептид, и третью последовательность ДНК, кодирующую терминирующую область, функциональную в указанной клетке-хозяине, 46689 CCATGGCTAT ACTCCCCAGA TCGTCGGGTC CCGAATCGAG GAGGTTTGAG AGAGAATTGA ACCTGCATTA TATTATTTGT AATCCTAAAT CTATTGAAGG GGTTCGATGC TCCTCTCGTT GCATGATGTC CTCCTACCTC TTCTCTCTAG ATCATCGGCA GGACGAGGAT GCTGGTGGTT ACTGTTGCAA GTTGCACTCC GTTTTCTCTT ATATGTGCAT ATGTAACAAT ACCTAGCTAG TACCTATTGA GACAGTGCAA TACGGACAGC ACTACTTAAG TTAGTTTATG TTGAATCTTT ACCCAACCTC AACAACCGGC CTTGGGCGAT TCTGTTGAAA GGAAAGGACA GAGGTTTAGA TCAAAGCAGT ATCCATTTTC TTTTCTAATT CCCAAACCCA CAACGCCACA AACACATGCA TCCATTGACA TTCCAAAATA TAAACAAGAA GAGACCAGTA CTGACTACTC CCCTCCTTGT CACCTCTGCT TCATCACCGG GGATTTACAA GCATGTGTTG AAGAAATTGC CTTGAATGTG TTGTGAATAG GGATGAAGTT AACATACTGG TTACCCCACT AGGAATAAAG TTGTTATAAG GGTCTTGGTC GCCAAATTGC TGCGGCGGAA GGTTGTTCAT AATGGGTTTG GAGAGATGCG GACGTGGTGA TTCATTGTTC TTGTTGCCAA TACTGACGAG TTCTGAGCTA GCGGCTGCAT CGTGACTTCT TATACACATC CAAAAAAATG CCCGATGATG CAAGTCTAGG TCTCTCCAGC CGTTATCTTC TTTTCTTTCC GTAAGCACAC AGCCAGTAGC AAATTCTAGG TCTGTGTATA GTACGCAACG GGGAAGCAAA TGGGGAACAT GATGTCATCG TGTTTAGAAT TAATGTTTAT ACACCAGGAA CGGAATTGCT GATGGGTCAG TGGGATTTGT GCTCTGGAGA GCGGCGATGA AATTTGGAAC TAGAATGTCG TAGTGGATAT CCCAAAGGTT GGCAAAAAAC GGTGACGCCA CGTCTCCTTT TTTTTGATCA GCGGATACAG GGCCGAGACC CAGATTGCTA CTTACCCTTG AGCCCAATCC TCTGGAGGGT ATTTATCATC TTTGGATCAA GAACATTTGG TCATCTATAT GGAGAGCACC GCTCAGGATC GACCGTGACC TCATAGTCCA TTGATCAGGG GTGTGTTTCT 28 Способ по п 25, отличающийся тем, что указанная последовательность ДНК (і) кодирует поMet Met Gly Arg 1 5 Asp Tyr Ser Lys 20 Ala Gly Gly Ser 35 Val H e Ala Leu 50 H e Leu Val Pro 65 Leu Ser Ser Gly He Tyr Lys Asp Ser Ala 115 Arg Ala Gin 130 Asp Arg Thr 145 Asp Arg Ser Arg Leu Leu Thr Val 29 Химерная ДНК, способная экспрессироваться в связи с масляным телом растительной или бактериальной клетки-хозяина, содержащая первую последовательность ДНК, способную регулировать в указанной растительной или бактериальной клетке-хозяине транскрипцию второй последовательности ДНК, где указанная вторая последовательность ДНК кодирует рекомбинантныи слитый полипептид и содержит (і) последовательность ДНК, кодирующую часть белка олеозина, достаточную для обеспечения перехода рекомбинантного слитого полипептида в липидную фазу, со AGCTAGCTCC CGGAACATCA AGGACGAGAC TGGTCGTCGA GGCTTTAGAG GACGACGAGG CAGATAGATT TTTAAAACTA TAGAAGGAAT TTTATGTTTC TTGAATAGAC GCCTACAATT CTAACAAACA CAAAATCTCA CCATCACGAT CCAGATGTCC TGCTGTCACA CATAGCTTTG TCTCATCACA CGCTATAACC ATTTTGTGCA CGAATAACAA ACGAAATTTG CTTGGTATGA AGACAAGTTG AGCTCAGTAC TGGCCAGCAC TGTCGGGGAG AAAGCCGAGT AAATGGTACC 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1X40 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800. липептид, имеющий следующую аминокислотную SEQ Ю NO последовательность Asp Gin Tyr Gin 10 Gin H e Ala Lys 25 Val Leu Leu Ser 40 Ala Thr Pro Leu 55 H e Thr Val Ala Ala Leu 70 Gly Phe Gly H e 85 Tyr Leu Leu H e Glu 100 Arg Met Lys Leu Gly 120 Tyr Tyr Gly Gin Gin 135 Arg Gly Gly Gin His 150. CTCTCTGGTA GACCTGAAGA CTTGGGCTTG ATACGGAGAT AAGAGAGTGC CGGGAGGAGA TTTTAAGAGG CGGAACAAAT GTGGGCCGTA CGTTTTGCGT AAACGTGTCT TTAACACGTG CTTAATATAT ATCTCTCATT CTAGAGGAAC GAGACCAGTA AAGCTGCAAC TTGGAACTGT TTGTCCCGGC TTGGCATTGC TTACTTCATA TTTTTTTGGT TTAACTAAAT AGGTAAAATG CACAGGGATC TGAAAGACAG GTACTCGTGG ATAACTCCAA GGAGATAATA ATATGTTGTC Met Ser Ala Leu Leu Leu 75 Ala Ala H e 90 His Pro Gin 105 Ser Lya Ala His Thr Gly Gly Arg Gly Ser 15 Ala Thr Ala Val Thr 30 Thr Leu Val Gly Thr 45 Val lie Phe Ser Pro 60 Leu H e Thr Gly Phe 80 Thr Val Phe Ser Trp 95 Gly Ser Asp Lys Leu 110 Gin Asp Leu Lys Asp 125 Gly Glu His Asp Arg 140 Thr Thr единенную в рамке считывания с (м) последовательностью ДНК, кодирующей указанный рекомбинантныи полипептид, и третью последовательность ДНК, кодирующую терминирующую область, функциональную в указанной клетке-хозяине 30 Химерная ДНК по п 29, отличающаяся тем, что указанная последовательность ДНК (м) кодирует фермент 31 Химерная ДНК по п 29, отличающаяся тем, что дополнительно включает (ш) линкерную последовательность ДНК, кодирующую аминокис лотную последовательность, которая может быть специфично расщеплена ферментным агентом, где указанная линкерная последовательность ДНК (ш) расположена между указанной последовательностью ДНК (і), кодирующей белок олеозин, и указанной последовательностью ДНК (м), кодирующей рекомбинантный полипептид 32 Химерная ДНК по п 31, отличающаяся тем, что указанная линкерная последовательность ДНК (ш) кодирует сайт расщепления ферментом, выбранным из группы, состоящей из тромбина, фактора Ха, коллагеназы и химозина 33 Химерная ДНК по п 29, отличающаяся тем, что указанная последовательность ДНК (м) кодирует интерлейкин 34 Химерная ДНК по п 29, отличающаяся тем, что указанная последовательность ДНК (м) кодирует ингибитор тромбина 35 Химерная ДНК по п 29, отличающаяся тем, что указанная последовательность ДНК (м) кодирует гирудин 36 Химерная ДНК по п 29, отличающаяся тем, что указанная последовательность ДНК (і) представляет собой ген олеозина, полученный из растения семейства Brassicaceae Настоящее изобретение относится к рекомбинантному способу получения представляющих интерес протеинов, которые легко выделять из компонентов клеток хозяев Способ иллюстрируется экспрессией представляющего интерес протеина в растениях, особенно в семенах, в форме химерного пептида, содержащего протеин масляного тела и представляющий интерес протеин В растениях были экспрессированы различные протеины Однако, хотя и была продемонстрирована общая доступность осуществления экспрессии чужеродных протеинов в растениях, получение очищенных протеинов из таких источников имеет некоторые ограничения Эти ограничения включают стадию очистки, необходимую для получения чистого протеина, практически не содержащего растительных материалов и продуктов разложения, которые могут образовываться в экстрактах, полученных в процессе очистки, когда полученные рекомбинантные протеины контактируют с водными буферами Растения, имеющие масличные семена, такие как соя, рапс, подсолнечник и ряд других видов растений, таких как кукуруза, морковь и т д , хранят в своих семенах триглицериды В растениях эти триглицериды выполняют роль источника энергии для прорастания семян и последующего роста сеянца Триглицериды широко используют в качестве растительных масел в пище и пищевых продуктах, а также в некоторых областях промышленности Триглицериды не смешиваются с водой и выделяются за счет флотации на поверхности водных растворов или образуют небольшие глобулы или липосомы в виде суспензии в водной фазе Такие глобулы естественно сливаются, если они 46689 10 37 Химерная ДНК по п 29, отличающаяся тем, что указанная последовательность ДНК (і) представляет собой ген олеозина, полученный из Arabidopsis thahana 38 Химерная ДНК по п 29, отличающаяся тем, что указанная первая последовательность ДНК получена из гена олеозина из растения Arabidopsis thahana 39 Химерная ДНК по п 29, отличающаяся тем, что указанная последовательность ДНК (і) представлена в SEQ ID NO 1 40 Химерная ДНК по п 29, отличающаяся тем, что указанная последовательность ДНК (і) кодирует полипептид, имеющий аминокислотную последовательность представленную в SEQ ID NO 5 41 Экспрессирующая кассета, содержащая химерную ДНК, охарактеризованную в п 29 42 Способ получения трансгенного растения, который предусматривает регенерацию указанного растения из культуры растительных клеток, трансформированных химерной последовательностью ДНК, охарактеризованной в п 29 43 Культура растительных клеток, содержащих химерную ДНК, охарактеризованную в п 29 не стабилизированы модифицированным поверхностным слоем Такое слияние может привести к образованию суспензии из глобул случайного размера В семенах же при сохранении триглицеридов масляные глобулы на деле представляют собой капсулированные липидные или масляные тела обычно одинакового размера С поверхностью этих масляных тел ассоциированы полуфрагменты (half unit) мембран, усыпанные несколькими протеинами, которые обычно называют протеинами масляного тела По крайней мере, один класс протеинов масляного тела имеет несколько характеристик, которые существенно консервативны от вида к виду Этот класс протеинов масляного тела называют "олеозинами" Гидрофильные N- и С- концы этих протеинов, по-видимому, совершенно различны, тогда как липофильные внутренние участки (центральное ядро), по-видимому, строго консервативны для, различных видов Олеозины прочно связаны с масляными телами, эта прочная связь с масляными телами может быть, в основном, связана с липофильным характером этих центральных ядер Поэтому представляет интерес определение возможности использования таких протеинов масляного тела, как олеозины, для создания средств для выделения рекомбинантных протеинов из растительных материалов Продуцирование чужеродных (рекомбинантных) пептидов в растениях было исследовано с использованием различных подходов, включая транскрипционные слияния с применением сильного конститутивного растительного промотора (например, из вируса мозаики цветной капусты Siemens etal (1990) Bio/Technology, 8 217-221) и кодирование чужеродного протеина, транскрипци 11 46689 12 онные слияния с органоспецифическими последоMurphy etal (1989) Biochem J, 258 285 - 293, Tayвательностями (Radke et al (1988) Theoret, Appl lor et al (1990) Planta, 181 18-26) Протеины масGenet, 75 685 - 694), и трансляционные слияния, ляных тел были идентифицированы для широкого которые требуют последующего отщепления рекруга таксономически различных видов (Moreau et комбинантного протеина (Vander Kerkove et al, al, (1980) Plant Physiol ,65 1176 - 1180, Qu et al, (1989) Bio/Technology, 7 929 - 932) Чужеродные (1986) Biochem J , 235 57 - 65), и было показало, протеины, которые были экспрессированы в расчто они расположены только в масляных телах, но тительных клетках, включают активные протеины не были обнаружены в органеллах растительных из бактерий (Praley et al (1983) Proc Nat'l Acad тканей В Brassica napus (семена рапса) имеются, Sci USA, 80 4803 - 4807), животных (Miara and по крайней мере, три полипептида, связанные с Gedamu (1989) Tbeor Appl Genet, 78 161 - 168), масляными телами в развивающихся семенах грибков и других видов растений (Fraley et al (Taylor etal (1990), Planta, 181 18-26) Количест(1983) Proc Nat'l Acad Sci USA, 80 4803-4807) во и размеры протеинов, связанных с масляными телами, могут меняться от вида к виду Так наНекоторые протеины, обычно маркеры интепример, в кукурузе существуют два имунологичеграции, были экспрессированы тканески различных класса полипептидов, обнаруженспепдфическим образом, причем некоторые были ных в масляных телах (Bowman-Vance and Huang экспрессированы в семенах (Sen Gupta et al (1985) Proc Nat'l Acad Sci USA, 82 3320-3324), (1988) J Biol Chern 263 1476-1481) Radke et al (1988) Theor Appl Genet, 75 685 Было показано, что олеозины содержат участ694) Эти сообщения концентрируются специфики чередующейся гидрофобности и гидрофильчески на использовании промоторов протеинов ноети (Bowman-Vance and Huang (1987) J, Biol хранения семян как средства обеспечения специChem , 262 11275 - 11279) Аминокислотные пофической для семян экспрессии Используя эти следовательности олеозинов из кукурузы, семян системы, Vanderkerkove et al (1989) Вю/Technol , рапса и моркови были получены См Qu and 7 929 - 932, экспрессировал очень ценный пептид Huang (1990) J Biol Chem , 265 2238 - 2243, Hat(leu-энкефалин) В семенах Arabidopsis thahana and zopou los et al (1990) Plant Cell , 2 457 - 467, соотBrassica napus Выход этих пептидов чрезвычайно ветственно В таких семенах масличных как рапс, низок, но он демонстрирует возможность экспресолеозин может составлять от 8% (Taylor et al сии пептидного гормона животного в ткани расте(1990) Planta, 181 19 - 26) до 20% (Murphy et al ния Олеозин кукурузы был экспрессирован в мас(1989) Biochem, J, 258 285 - 293) от полного соляных телах семян Brassica napus, держания протеина в семенах Столь высокое трансформированных геном олеозина кукурузы содержание сопоставимо с тем, что было обнаруЭтот ген был экспрессирован под контролем регужено для многих протеинов хранения семян ляторних элементов из гена Brassica, кодирующеСообщалось, что получены гены, кодирующие го налин (парт), основной протеин хранения сепротеины масляных тел, для двух видов кукуруза мян Как сообщается, временная регуляция и (Zea mays, Bowman-Vance and Huang (1987) J, ткане-специфичность экспрессии правильны для Biol Chem , 262 11275 - 11279, и Qu and Huang промоторал'ерминатора гена напина См Lee et (1990), J Biol Chem, 265 2238 - 2243) и морковь al , Proc Nat'l Acad Sci USA, (1991) 88 6181 (Hatzopoulosetal (1990) Plant Cell, 2 457-467) 6185 Масляные глобулы, которые образуются в Предложены способы и композиции для осусеменах, по-видимому, все одинакового размера, ществления этих способов получения пептидов, что указывает на их стабилизацию (Huang A H С которые можно легко выделить из протеинов хо(1985) в Modern Meths Plant Analysis v 1 145-151 зяев Этот способ включает стадии получения Sprmger-Verlag, Berlin) При более тщательном химерной конструкции ДНК, которая включает поисследовании было обнаружно, что они представследовательность, кодирующую специфическую ляют собой не просто масляные глобулы, а скорее последовательность масляного тела, содержащую масляные тела, окруженные мембраной Такие кодирующую последовательность гена протеина масляные тела называли по разному электронные масляного тела, специфического для семян, или микроскописты олеосомы, липидные тела и сфепоследовательность, кодирующую, по крайней росомы (Gurr Ml (1980) в The Biochemistry of мере, участок гидрофобного ядра протеина масPlants, 4 205 - 248, Acad Press, Orlando, Fla) Быляного тела, и последовательность, кодирующую ли исследованы масляные тела нескольких видов, нужный пептид, из которых можно получить кассеи пришли к выводу, что они заключены в необычту экспрессии, содержащую химерную конструкные "полу-фрагментарные" мембраны, которые цию ДНК, трансформация клеток хозяина кассетой представляют собой не классический липидный экспрессии в условиях геномной интеграции, и би-слой, а скорее один амфофилъный слой с гидвыращивания полученного трансгенного растения рофобными группами с внутренней стороны и до получения семян, в которых нужный полипепгидрофильными группами с внешней (Huang A H тид экспрессирован как протеин слияния с олеоС (1985) в Modern Meths Plant Analysis, vol 1 145 зином -151 Sprmger-Verlag, Berlin) Представляющий интерес полипептид можно очистить, выделяя масляные тела из клеток сеАнализ содержания липидных тел продемонмян, разрушая масляные тела, так что при этом стрировал, что помимо триглицеридов и материавысвобождается протеин слияния Затем протеила мембран они содержат также несколько полины масляного тела легко отделяются от других пептидов/протеинов, связанных с поверхностью протеинов и полученных из растений материалов или полостью масляного тела (Bowman-Vance and за счет разделения фаз При желании сайт расHuang (1987), J Biol Chera 262 11275 - 11279, 13 46689 14 щеплення может быть расположен, по крайней скую незамещенную аминокислоту или оксизамемере, перед N-концом или после С-конца предщенную аминокислоту, 47 ставляющего интерес полипептида, что обеспечит аа представляет нейтральную алифатичевозможность отщеплять полипептид слияния и скую незамещенную аминокислоту, 59 выделять его за счет фазового разделения на аа представляет нейтральную алифатичесоставляющие его пептиды Таким образом, созскую или ароматическую незамещенную аминодана система, обеспечивающая целенаправленкислоту, ный перенос химерного пептида за счет функциоаа представляет нейтральную алифатиченальности протеина его масляного тела к скую незамещенную или тиозамещенную масляным телам, что, в свою очередь, позволяет аминокислоту, 78 быстро очистить представляющий интерес полиаа представляет нейтральную алифатичепептид Эта система получения находит применескую незамещенную аминокислоту, 83 ние при получении многих пептидов, например, аа представляет нейтральную алифатичетаких пептидов, которые обладают нужными фарскую незамещенную или оксизамещенную аминомацевтическими, энзиматическими, реологичекислоту, 2 скими и адгезивными характеристиками аа представляет нейтральную алифатическую аминокислоту с оксизамещением, В соответствии с настоящим изобретением предложен полипептид слияния, отличающийся аа 96 представляет нейтральную алифатичетем, что может быть обеспечена его доставка к скую тиозамещенную аминокислоту или неймасляному телу, содержащий тральную ароматическую гетероциклическую аминокислоту, а) первый пептид формулы аа 97 представляет нейтральную алифатиче* - aa - V - V - I - L - as *- Р скую незамещенную или тиозамещенную аминокислоту, ~а - L - ей" as - G - G аа 8 представляет нейтральную алифатическую незамещенную аминокислоту или ароматиI, - аа46 - аа - т ' G - I - аа' ческую оксизамещенную аминокислоту, s аа 99 представляет любую аминокислоту, = - L ? - L '- V - К - 7 - Ь аа 100 представляет оксизамещенную аминоV V кислоту, либо алифатическую, либо ароматиче- І* іди скую, _ у - Р - А аа 101 представляет нейтральную незамещен77 ную алифатическую или ароматическую аминоаа - G se кислоту, слитый с L G Ь) вторым пептидом, при условии, что этот аз S второй пептид отличается от части природного т олеозинового протеина из Arabidopsis или і 5 ZC 3 л 39 Jj 73 .93 •- s .101 при условии, что указанный первый пептид отлетается от полноразмерного природного 16Kb олеозина из моркови, или 16Kb или 16Kb олеозина из кукурузы, и где 25 аа представляет любую аминокислоту, 26 аа представляет нейтральную алифатическую аминокислоту, аа 31 представляет нейтральную незамещенную алифатическую аминокислоту, состоящую из 3 - 6 атомов углерода, аа 33 представляет нейтральную незамещенную алифатическую аминокислоту, содержащую 3 - 6 атомов углерода, аа 36 представляет нейтральную алифатическую незамещенную аминокислоту, содержащую 3 - 5 атомов углерода, аа 37 представляет нейтральную незамещенную аминокислоту, аа 39 представляет нейтральную алифатическую незамещенную аминокислоту, аа 41 представляет нейтральную алифатическую незамещенную или оксизамещенную аминокислоту, а а 4 представляет нейтральную алифатическую незамещенную или оксизамещенную аминокислоту, аа 6 представляет нейтральную алифатиче Brassica В настоящем изобретении предложен также полипептид слияния, характеризуемый как способный осуществлять целенаправленный перенос к масляному телу, содержащий а) первый пептид, выбранный из группы, состоящей из (1) пептида, содержащего, по крайней мере, восемь последовательных аминокислот, включенных в следующую аминокислотную последовательность M-H-G-R-D-R-D-Q-Y-Q-M-S-G- -Q-S-D-Y-S-KS-R-Q-I-A-K-A-A-T-A-V-T-A-G-G-S-L-L-V-LS-S-L-TL-V-G-T-V~!-A-L-T-V-A-T-P-L-L-V ft-T-G-S-H-?-Q-C-S-D-K-L-D-S-ft-R-H-K-L-GS-K-A-Q-D-L-K-D-R^A-Q-y-y-G-Q-Q-H-T-G-GE-H-D-ct-D-S-T-R-G-G-Q-a-T-T, (2) пептид, который кодируется ДНК последовательностью, идентифицированной с помощью олигонуклеотидного зонда, сконструированного на основе указанной аминокислотной последовательности (1), или ее фрагмента, при условии, что указанный первый пептид отличается от полноразмерного природного 16Kb олеозина из 15 46689 16 моркови или 18Kb или 16Kb олеозина из кукурузы, тела, которая включает достаточную часть регуслитый с ляторного участка 5' до сайта начала трансляции указанного ОВР гена для обеспечения экспрессии Ь) вторым пептидом, при условии, что указануказанного гена в семенах, где указанная посленый второй пептид отличается от части природнодовательность встроена по такому сайту указанго олеозинового протеина из Arabidopsis ИЛИ ного гена, чтобы быть экспрессированной под конBrassica, тролем указанного регуляторного участка Далее в настоящем изобретении предложена химерная ДНК конструкция, содержащая В настоящем изобретении предложен способ достижения экспрессии целевого пептида в семеa) первую ДНК последовательность, кодинах, причем указанный способ включает трансрующую олеозин или его часть, достаточную для формацию клеток растения - хозяина экспрессиобеспечения целенаправленного переноса к масонной кассетой в условиях геномной интеграции, ляному телу, и где указанная кассета экспрессии содержит в каb) вторую ДБК последовательность, кодируючестве компонентов, в направлении транскрипции, щую пептид, при условии, что указанный пептид первую ДНК последовательность, содержащую отличается от части природного олеозинового достаточную часть участка 5' до сайта начала протеина из Arabidopsis ИЛИ Brassica трансляции гена, экспрессируемого в семенах, Далее в настоящем изобретении предложена для обеспечения экспрессии ДНК последователькассета экспрессии, содержащая ности в семенах, вторую ДНК последовательнов качестве компонентов в направлении трансстью, кодирующую олеозин или достаточную его крипции часть, для обеспечения нацеленного переноса к регуляторную ДНК последовательность, сомасляному телу, причем указанная вторая ДНК держащую достаточную часть участка 5' до сайта последовательность включает, по крайней мере, начала трансляции гена, экспрессируемого в сеодин природный или синтетический рестрикционменах, для обеспечения экспрессии ДНК последоный сайт, в который встроена в рамке считывания вательности в семенах, третья ДНК последовательность, кодирующая химерную ДНК последовательность, содерцелевой пептид, при условии, что указанный пепжащую тид отличается от части природного олеозинового a) первую ДНК последовательность, кодипротеина из Arabidopsis или Brassica, и участок рующую олеозин, или достаточную ее часть для окончания трансляции и транскрипции, где укаобеспечения целенаправленного переноса к масзанные компоненты операбельно связаны, и эксляному телу, причем указанная ДЖ последовапрессия указанной второй ДНК последовательнотельность включает, по крайней мере, один рестсти регулируется указанной первой ДНК рикционный сайт, и последовательностью, для обеспечения экспресb) вторую ДНК последовательность, кодисии в семенах рующую пептид, при условии, что указанный пептид отличается от природного олеозинового проВ настоящем изобретении предложен способ теина из Arabidopsis или Brassica, и получения очищенного целевого пептида, причем указанный способ включает участок окончания трансляции и транскрипции, трансформацию клеток растения хозяина ДНК где указанные компоненты операбельно свяконструкцией в условиях геномной интеграции, где заны, а экспрессия указанной химерной последоуказанная ДНК конструкция содержит первую ДНК вательности ДНК регулируется указанной регуляпоследовательность, кодирующую целевой пепторной ДНК последовательностью тид, при условии, что указанный пептид отличается от части природного олеозинового протеина из В настоящем изобретении предложена также Arabidopsis или Brassica, встроенную в считываюкассета экспрессии, содержащая щую рамку гена протеина масляного тела, которая ген протеина масляного тела (oil body protein = содержит достаточную часть регуляторного участОВР), который включает достаточную часть участка 5' до сайта начала трансляции указанного ОВР ка 5' до сайта начала трансляции для обеспечегена для обеспечения экспрессии указанного гена ния экспрессии указанного гена в клетки семян, и в семенах, причем указанная последовательность который включает, по крайней мере, один рествстроена по такому сайту указанного гена, что рикционный сайт между 5'-концом кодона инициаэкспрессия указанной ДНК последовательности ции метионина, и 5'-сигналом окончания трансляконтролируется, указанным регуляторним участции указанного ОВР гена, и ком, за счет чего указанная ДЖ конструкция инДНК последовательность, встроенную в укатегрируется в геном указанных клеток растения, занный рестрикционный сайт в рамке считывания с указанным ОВР геном, где указанная ДНК последовательность кодирует пептид, который отличается от части нативного олеозинового протеина из Arabidopais или Brassica В настоящем изобретении предложена также кассета экспрессии, содержащая первую ДНК последовательность, кодирующую пептид, при условии, что указанный пептид отличается от части природного олеозинового протеина из Arabidopsis или Brassica, встроенную в рамке считывания в ген протеина масляного выращивание указанного растения до получения семян, в которых целевой пептид экспрессирован как протеин слияния с продуктом экспрессии указанного ОВР гена, выделение масляных тел из клеток указанных семян, разрушение указанных масляных тел, в результате чего выделяется указанный протеин слияния, и очистку указанного целевого пептида Краткое описание чертежей 17 46689 18 Фиг1А представляет нуклеотидную последои анализ целевого рекомбинантного пептида вательность и выведенную аминокислотную поНа фиг 5 схематически представлено констследовательность (17кДа протеин) гена протеина руирование pCGOBPILT Прямоугольник с пунктимасляного тела (олеозина) из Arabidopsis thahana ром представляет олеозиновый промотор, прямоПодчеркнуты прямые повторы (Ri и R2) и инвертугольник, заштрихованный сверху слева-вправо ный повтор (Т), САСА, ТАТА, ТААТ и сигналы повниз представляет олеозиновую кодирующую полиаденилирования следовательность, заштрихованный в клеточку прямоугольник представляет интрон, прямоугольИнтронная последовательность напечатана ник со штрихами представляет 3'мелким шрифтом, а предполагаемый АВАнетранслируемую последовательность,, прямосвязывающий сайт указан жирным шрифтом угольник с редко расположенными полосами На фиг 1В представлено сравнение последосверху слева - вправо вниз, представляет послевательностей протеина 16Kb масляного тела из довательность интерлейкина-І-р, снабженную поморкови и 18КЬ и 16Kb протеинов масляного тела следовательностью, кодирующей сайт расщеплеиз кукурузы и 17КЬ протеина масляного тела из ния протеазы (Фактор Ха или тромбин, Arabidopais thahana, где показаны сохраняющиеся расположенный непосредственно в обратном на(консервативные) и различающиеся участки этих правлении) протеинов, аминокислотные последовательности выровнены, чтобы показать консервативность На фиг 6 представлена конструкция олигонукпоследовательности в центральном участке пролеотида GYRII На фиг ЗА представлена 3' кодитеинов рующая последовательность A thahana oleosm, На фиг 2 представлены конструкции, испольтрансляционно слитая с кодирующей последовазованные для слияния генов протеинов масляного тельностью фактора Xa/IL-1-p, после которой слетела с генами, кодирующими чужеродные пептидует ТАА стоп-кодон Для целей дальнейшего коды IA представляет С-терминальное слияние цедирования включают Pvui и sail рестрикционные левого пептида с ОВР, IB представляет Nсайты Создание Pvul рестрикционного сайта притерминальное слияние целевого пептида с ОВР, II водит к дополнительной кодирующей последовапредставляет внутреннее слияние целевого пептельности для аланина (ala) Подчеркнуты послетида с ОВР, и III представляет меж-димерное довательности распознавания рестрикционного трансляционное слияние целевого пептида, заэнзима Друг над другом расположены последоваключенного между двумя практически полными тельности олеозина A thahana и последовательпоследовательностями протеина масляного тела, ность распознавания фактора Ха Действительобеспечивающими его направленную доставку В ный сайт расщепления обозначен звездочкой На верхней части фиг (А) представлена ДНК констфигЗВ представлена последовательность GVRII рукция, использованная для трансляционного для осуществления слияния с A thahana олеозислияния целевых пептидов с протеинами масляном, праймер GVHII должен быть комплементарен ного тела В нижней части фиг (В) представлены последовательности верхней нити конфигурации генных продуктов, показанных на На фиг 7 представлена нуклеотидная послеверхнем участке трансляции и доставки к маслядовательность OBPILT Подчеркнута последованым телам Ключ к фиг следующий тельность, кодирующая IL-1-p, последовательзаштрихованный снизу слева вверх направо ность, кодирующая сайт распознавания фактора прямоугольник представляет ОВР промотор или Ха, указана жирным шрифтом Терминаторная другой специфический для семян промотор, запоследовательность нопалин-синтетазы указана штрихованный снизу справа вверх налево прямомелкими буквами угольник представляет последовательность, коОписание, предпочтительного варианта дирующую целевой пептид, не заштрихованный В соответствии с целью изобретения предлопрямоугольник представляет последовательность, жены способы и композиции для получения пепкодирующую протеин масляного тела или синтетидов, которые легко поддаются очистке Целевой тическую последовательность, обеспечивающую способ включает стадии получения экспрессионнаправленную доставку, основанную на ОВР конной кассеты, содержащей ДНК последовательсервативных фрагментах, заштрихованные в кленость, кодирующую достаточную часть специфиточку прямоугольники представляют терлинатор ческой последовательности масляного тела, гена, содержащий сигнал полиаденилирования, например, олеозина, для обеспечения направлензаштрихованный кружок представляет фрагмент ного транспорта к масляному телу, и представраспознавания протеазы, спиральная линия предляющий интерес пептид, трансформации эксставляет нативный С- или F -конец ОВР прессионной кассетой клеток растения хозяина, создания трансгенного растения и выращивание ФигЗ представляет подробную структуру конего для получения семян, в которых химерный струкции С-терминального слияния Изображена протеин экспрессирован и перемещен к масляным структура последовательности, кодирующей учателам Химерный пептид включает целевой пепсток распознавания коллагеназы, в качестве линтид и такой протеин масляного тела, как олеозин кера при слиянии типичного гена протеина масляЦелевой пептид обычно является чужеродным ного тела и пептида слияния, который нужно пептидом, который обычно не экспрессируется в связать, используя исої, для клонирова-ния и экссеменах или не находится на масляных телах прессии в растениях Использование протеина масляного тела в качеНа фиг 4 схематически представлен процесс стве носителя или в качестве средства для наконструирования векторов пептида слияния, их правленной доставки обеспечивает простой мехавведение в растения и последующую экстракцию 20 19 46689 низм очистки чужеродного протеина Химерный в высшей степени консервативен среди различпротеин выделяют из массы клеточных протеинов ных видов растений, и его фрагментов и гомолов одну стадию (например, за счет центрифугирогичных последовательностей на аминокислотном вания или флотации), этот протеин также защиуровне щен от разложения в процессах экстракции, так Выведенная последовательность аминокискак при разделении удаляются неспецифические лот для Arabidopsis thahana протеина масляного протеазы из конетакта с масляными телами Ген, тела следующая кодирующий чужеродный пептид, может быть по10 лучен из любого источника, включая растительM-M-G-R-D-R-D-Q-Y-Q-M-S-G-R-G-S-D-Y-S-Kные, бактериальные, грибковые или животные источники 30 40 Желательно, чтобы химерный пептид содержал последовательности, которые позволяли бы 50 60 отщеплять целевой пептид от олеозина Такой S-S-L-T-L-V-G-T-V-I-A-L-T-V-A-T-P-L-L-Vметод можно использовать для экспрессии раз70 80 личных пептидов, которые затем легко поддаются Т . _С_Р _ 7 -Т „1/„ D_ Л _Г _ Т —Т" •*?_ Ь _ У _ 7 _ Т _ Т _ Л Г ~ очистке Обеспечение направленной доставки чуже90 10Q родного рекомбинантно-го протеина к масляному L-S-S-G-G-F-G-I-A-A-I-T-V-F-S-fl-I-Y-K*^телу обеспечивает несколько преимуществ, вклю110 120 чая следующие Протеин можно выделить из клеточной массы после лизиса, клеток за счет цен4-Т _G , E _ K - P - Q - G - S - O - K - L - O - S - A - R - M - K - L - G трифугирования Частицы масляных тел будут 130 140 плавать на поверхности экстракта Протеин можно S-K-A-0-D-L-K-D-R-A-Q-Y-Y-G~Q-Q~H-T-G~Gнеобязательно снабдить пептидным линкером, содержащим сайт распознавания протеазы Это 150 позволяет отделить пептид от масляного тела E-H-D-R-D-R-T-R-G-G-Q-H-T-T Протеин можно ввести в рекомбинантный полиАминокислоты от около 25 до 101 содержат пептид таким образом, чтобы он был внутри лицентральный гидрофобный домен пофильного консервативного участка Это привоОсобый интерес представляют в качестве дит к интернализации рекомбинантного пептида в средств, обеспечивающих направленную доставку масляное тело, таким образом защищая его от для некоторых применении, специфические поатаки протеазы следовательности масляного тела или их фрагЭкспрессионная кассета обычно будет вклюменты следующей формулы, которые обеспечичать в 5' - 3' направлении транскрипции, трансвают направленную доставку к масляному телу крипционный и трансляционный регуляторний участок, обеспечивающие возможность экспресV- Т - L- а а з г А сии в развивающихся семенах, служат типичным А А примером которых промотор, и расположенные в обратном направлении участки, связанные с про.41 аа34- L- аа" теином масляного тела, что обеспечит экспрессию химерного протеина в семенах ДНК последовательность, кодирующую химерный пептид, содерф L- аа а а 47 . I жащий аминокислотную последовательность для S V V обеспечения направленной доставки к масляному телу и целевой протеин, транскрипционный и Р- L - аа59 - L трансляционный терминальные участки функциоV V нальные в растениях Может также присутствовать один или более из интронов Т- S- Р - V _ т о_ А- А 73 аа г Ь Специфическая последовательность масляно.74 .75 го тела встречает аналогию во фрагментах про.77 .78 - G- F - Lтеинов масляного тела, в частности, олеозинов Специфическая последовательность масляного Ь тела может быть той же, что и последователь8? .90 - G- V S- аз ность, получаемая из протеина масляного тела, и I они имеют, достаточную гомологию, чтобы, обеспечить направленную доставку целевого протеина 94 - S .96 .97 .98 к масляному, телу Под "получаемой" подразумевают аминокислотную последовательность, кото100 .101 рая может быть природной, синтетической или РР комбинированной, достаточно близкой к аминогде кислотной последовательности протеина нативнорр и рр одинаковы или различны, и могут го масляного тела, для достижения нужного обесбыть такими же, или могут отличаться от природпечения направленной доставки Особый интерес ного протеина масляного тела, и обычно отличапредставляют центральный гидрофобный домен ются, они могут представлять водорода, что укапротеинов масляного тела, который, по-видимому, зывает на терминальную часть указанного 22 21 46689 полипептида, или они могут быть полипептидами, нин, или нейтральную алифатическую аминокиссодержащими вплоть до 1000 аминокислот, обычлоту, содержащую тио- или окси-замещения, но вплоть до около 500 аминокислот, и могут соособенно метионин илитретонин, 83 держать лишь одну аминокислоту, или могут инаа представляет нейтральную алифатичедивидуально или раздельно быть полипептидами, скую незамещенную или оксизамещенную аминосодержащими от 1 до 100 аминокислот, обычно от кислоту, особенно глицин, серии или треонин, 2 около 1 до 75 аминокислот, и особенно от около 5 аа представляет нейтральную алифатичедо 50 аминокислот, эти полипептиды могут иметь скую аминокислоту с окси-замещением, особенно специфические применения при модификации серии или треонин, 96 специфически описанных последовательностей аа представляет нейтральную алифатичедля заранее определенных целей, скую тиозамещенную аминокислоту или ней5 тральную ароматическую гетероциклическую амиаа может быть любой аминокислотой, в чанокислоту, особенно триптофан, стности, нейтральной алифатической аминокисло97 той, обычно содержащей от 3 до 6 атомов углероаа представляет нейтральную алифатичеда, более конкретно, лейцином или аланином, скую незамещенную или тио-замещенную амино26 кислоту, особенно валин, лейцин, изолей-цин или аа представляет нейтральную алифатичеметионин, скую аминокислоту, особенно аланин или гидроксизамещенную аминокислоту, содержащую от 3 аа 98 представляет нейтральную алифатичедо 4 атомов углерода, в частности, треонин, или скую незамещенную аминокислоту или ароматиосновную аминокислоту, содержащую от 5 до 6 ческую океи-замещенную аминокислоту, особенно атомов углерода, в частности, лизин, аланин лейцин или тирозин, аа 31 представляет нейтральную незамещенаа9 может представлять любую аминокислоную алифатическую аминокислоту, содержащую ту, 100 от 3 до 6 атомов углерода, в частности, аланин, аа представляет окси-замещенную аминовалин или лейцин, или ароматическую незамекислоту, либо алифатическую, либо ароматичещенную аминокислоту, особенно фенилаланин, скую, особенно тирозин или треонин, аа 33 представляет нейтральную незамещенаа 101 представляет нейтральную незамещенную алифатическую аминокислоту, содержащую ную алифатическую или ароматическую аминоот 3 до 6 атомов углерода, особенно аланин, вакислоту, особенно аланин, лейцин или фенилалалин или лейцин, или оксизамещенную алифатиченин скую аминокислоту, особенно треонин, 36 Особый интерес в качестве источника ДНК, аа представляет нейтральную алифатичекодирующей последовательности, способные скую незамещенную аминокислоту, содержащую обеспечить направленную доставку к протеину от 3 до 5 атомов углерода, особенно лейцин, или масляного тела, представляют гены протеинов нейтральную алифатическую оксизамещенную масляных тел, получаемые из Arabidopsis или аминокислоту, содержащую от 3 до 4 атомов угBrassica napus, которые обеспечивают экспрессию лерода особенно треонин или серии, целевого протеина в семенах (См Taylor et al , 3 аа представляет нейтральную незамещен(1990), Planta 181 18-26) Нужные участки и аминую аминокислоту, особенно лейцин или тиозанокислотные последовательности, необходимые мещенную аминокислоту, особенно метионин, для обеспечения способности направленной дос39 аа представляет нейтральную алифатичетавки к масляным телам, должны быть, невидискую незамещенную аминокислоту, особенно вамому, существенно гидрофобным центральным лин, или ароматическую незамещенную аминоучастком протеинов масляного тела кислоту, особенно фенилаланин, Для идентификации других генов протеинов аа 1 представляет нейтральную алифатичемасляного тела, обладающих нужными характескую незамещенную или оксизамещенную аминористиками, где протеин масляного тела уже был кислоту, особенно, аланин, лейцин или серии, выделен, этот протеин можно частично секвениа а 4 представляет нейтральную алифатичеровать, с тем, чтобы можно было сконструировать скую незамещенную или оксизамещенную аминозонд для идентификации мРНК Такой зонд осокислоту, в частности, аланин, изолейцин или требенно ценен, если он сконструирован таким обраонин, зом, чтобы нацелить его к кодирующему району аа 46 представляет нейтральную алифатичецентрального гидрофобного домена, который в скую незамещенную аминокислоту или оксизамевысшей степени консервативен среди различающенную аминокислоту, особенно аланин, валин щихся видов растений Следовательно, ДНК или или треонин, РНК зонд для этого участка может быть особенно 47 полезен для идентификации кодирующих послеаа представляет нейтральную алифатичедовательностей протеинов масляного тела из друскую незамещенную аминокислоту, особенно глигих видов растений Для дальнейшего повышения цин или аланш, концентрации мРНК, можно получить кДНК и эту аа 59 представляет нейтральную алифатичекДНК вычесть с мРНК или кДНК из клеток, продускую или ароматическую незамещенную аминоцирующих немасляные тела Оставшуюся кДНК кислоту, особенно лейцин или фенилаланин, можно затем использовать для зондирования геаа 6 представляет нейтральную алифатиченома для комплементарных последовательноскую незамещенную или тиозамещенную аминостей, используя соответствующе библиотеки, покислоту, особенно аланин, лейцин или метионин, лученные из растительных клеток Затем можно аа 8 представляет нейтральную алифатичевыделить последовательности, которые гибридискую незамещенную аминокислоту, особенно ала 24 23 46689 зуются с кДНК в жестких условиях В некоторых масляного тела (протеины масляных тел из случаях, как указано ранее, использующих зонд Arabidopsis, моркови (Hatzopoulos et al , см ранее) гена протеина масляного тела (консервативный или кукурузы (Huang et al 1987 и 1990 см ранее) участок), зонд можно использовать непосредстТакой участок обычно содержит, по крайней мере, венно для скринирования геномной библиотеки ЮОЬр 5' до начала трансляции последовательнокДНК и идентификации последовательностей, сти, кодирующей структурный ген, вплоть до 2,5kb которые гибридизуются с зондом Выделение 5' до того же начала трансляции Предпочтительможно также осуществить стандартным иммуноно, чтобы все транскрипционные и трансляционлогическим скринированием библиотеки экспресные функциональные элементы участка, контросии кДНК специфической для семян Антитела лирующего инициацию, были получены или их можно легко получить к протеинам масляных тел, можно было бы получить из одного и того же гена используя способы очистки и схемы получения Под выражением "можно получить" подразумеваантител, описанные Taylor et al (Planta, (1990), ют ДНК последовательность, достаточно сходную 181, 18-26) Библиотеку экспрессии кДНКскринис нативнои последовательностью для того, чтобы руют, используя антитела по способу Huynh et al обеспечить целевую специфичность, транскрип(1985 DNA Cloning, Vol 1, a Practical Approach, ed ции ДНК последовательности, кодирующей хиDM Glover, IRL Press, pp 49 - 78) Подтверждемерный протеин Она включает природные и синние структуры последовательности облегчается тетические последовательности и может быть за счет высокого консерватизма, существующего в комбинацией синтетических и природных послецентральном гидрофобном участке (фиг1) ДНК довательностей секвенирование по способу Sanger et al (Proc Уровень транскрипции должен быть достаточNatl Acad Sci USA, (1977) 74 5463 - 5467) или ным для обеспечения такого количества РНК, коMaxam and Gilbert (1980), Meth Enzymol, (1980) 65 торое способно обеспечить получение модифици497 - 560) можно осуществить на всех предполарованных семян Под термином гаемых клонах и осуществить поиски гомологов "модифицированные семена" подразумевают сеГомология последовательностей, кодирующих мена, обладающие заметно отличающимся феноцентральный гидрофобный домен, обычно сотипом от фенотипа семян нетрансформированноставляет > 70%, как на аминокислотном, так и на го растения того же вида, например, не нуклеотидном уровнях между различающимися содержащих рассматриваемой кассеты экспресвидами Если доступно антитело, подтверждение сии в его геноме Представляют интерес различидентичности последовательности можно осущеные изменения в фенотипе Эти изменения вклюствить в экспериментах отбора гибридов и трансчают избыточную экспрессию протеина масляного ляции из препаратов мРНК семян по способу тела или ОВР-накопление на масляном теле, или Sambrook et al (Molecular Cloning, (1990), 2nd Ed , полученного химерного протеина в цитоплазме Cold Spring Harbor Press, pp 8 - 49 до 8 - 51) Представляющим интерес полипептидом может быть любой протеин, и они включают, наприкДНК клоны, полученные из семян, можно мер, энзим, антикоагулянт, нейропептид, гормон скринировать, используя кДНК зонды, полученные или адгезивный предшественник Примеры произ консервативных кодирующих участков любого теинов включают интерлейкин-І-р, антикоагулянт доступного гена протеина масляного тела (наприHirudm, энзим р-глюкуронидазу или одноцепочечмер, Bowman-Vance and Huang (J Biol Chem , ное антитело, содержащее трансляционное слия(1987) 262 11275 - 11279) Отбирают клоны, котоние VH ИЛИ VL, цепей иммуноглобулина ДНК порые обладают степенью гибридизации с ДНК сеследовательность, кодирующая целевой мян, нежели с кДНК сеянцев Скринирование пополипептид, может быть синтетической или привторяют для идентификации конкретной кДНК, родной, или их комбинацией В зависимости от связанной с масляными телами развивающееся характера источника ДНК кодирующей целевой семян, используя прямое скринирование антитеполипептид, может оказаться желательным синтелами или отбор гибридов и трансляцию мРНК, зировать ДНК последовательность с предпочтикомплементарные специфическим кДНК, отсутсттельными растительными колонами Предпочтивуют в других тканях, подвергавшихся тестировательные растительные кодо-ны можно определить нию Затем кДНК используют для скринирования из кодовое, наиболее часто встречающееся в прогеномной библиотеки и отбирают фрагмент, кототеинах, экспрессированных в больших количестрый гибридизуется с нужной кДНК вах в конкретные виды растений, представляющих Для достижения экспрессии химерного гена в интерес в качестве растений-хозяев семена, участок, регулирующий начало транскрипции и участок, регулирующий начало трансИспользуемый терлинаторный участок должен ляции нетранслируемых 5' последовательностей, быть преимущественно одним из обычных, так как "рибосомо-связывающие сайты", ответственные во многих случаях терминационные участки, поза связывание мРНК с рибосомами, и начало видимому, относительно взаимозаменяемы Тертрансляции, получаемые из любого гена, предпочминационный участок монет быть нативным с учатительно экспрессируемого в семенах, могут быть стком инициирования транскрипции, может быть использованы Примеры таких генов включают нативным с ДНК последовательностью, кодируюгены протеинов хранения семян, например из нащей целевой полипептид, или может быть полупина (Josefsson et al ,J Biol, Chem, (1987) 262 чен из другого источника, Удобные терлинацион12196 - 12201, Scofield S R and Crouch M L J, ные участки доступны из Ті-плазмид А Biol Chem (1987)262 12202-12208) Предпочтиtumefaciene, такие как октопин-синтазные и нопательно, чтобы участок был получен из протеина лин-синтазные терминационные участки 25 46689 26 Лигирование ДНК последовательности, кодитрансформации, как например та, которая описана рующей обеспечивающую направленную доставку Moloney et al Plant Cell Rep, (1989) 8 238 - 242 последовательность с геном, кодирующим целеили Hmchee et al Bio Technol , (1988) 6 915 - 922, вой пептид, может осуществляться различными или другие методики, известные специалистам способами, включая терминальное слияние, внутТак например, использование Т-ДНК для трансреннее слияние и полимерное слияние Во всех формации растительных клеток интенсивно исслучаях такие слияния осуществляют таким обраследуется, и подробно описано в ЭРА №120516, зом, чтобы не прерывать считывающую рамку Hoekema, В "The Binary Plant Vector System Offsetпротеина масляного тела, и с тем, чтобы избежать drukkenj Kanters В V , Alblasserdam, 1985, Chapter каких-либо сигналов прекращения трансляции V, Knauf, et al , Genetic Analysis of Host Range внутри или вблизи этих соединений Различные Expression by Agrobactenura, В "Molecular Genetics типы терминальных и внутренних слияний предof the Bacteria Plant Interaction, Puhler, A ed, ставлены на фиг 2 наряду с представлением их Spnnger-Verlag, NY, 1983, p 245, and An et al , конфигураций in vivo EMBO J (1985), 4 277-284 Во всех описанных случаях лигирование гена, кодирующего пептид, предпочтительно должно включать линкер, кодирующий протеазный мишеневый фрагмент Это позволит осуществить выделение пептида после его экстрагирования в виде протеина слияния Потенциальные сайты расщепления, которые можно использовать, являются распознающими фрагментами для тромбина (leu-val-pro-arg-gly) (Fujikawa et al , Biochemistry (1972) 11 4892 - 4899), фактора Ха (phe-glu-gly-arg-aa) (Nagai ef al,, Proc Nat'l Acad Sci USA, (1985 82 7252 - 7255) или коллагеназы (pro-leu-gly-pro) (Scholtissek and Groase Gene (1988)62 55-64) За счет соответствующих манипуляций, таких как рестрикция, переваривание (chewing back) или заполнение липких концов для создания тупых концов, лигирование линкеров или т п , комплементарные концы фрагментов можно получить соединением и лигированием При проведении различных стадий используют клонирование с тем, чтобы умножить количество ДНК и обеспечить возможность анализа ДНК для того, чтобы убедиться, что операция прошла должным образом Доступно множество векторов клонирования, когда вектор клонирования включает функциональную в Е coli систему репликации и маркер, который обеспечивает селекцию трансформированных клеток Иллюстративные векторы включают pBR332, pUC серии, M13mp серии, PACYC184 и д Так, последовательность можно встроить в вектор по соответствующему рестрикционному сайту (сайтам), полученную плазмиду использовать для трансформации Е coli хозяина, вырастить в Е coli в соответствующей питательной среде, собрать клетки, провести лизис и выделить плазмиду Анализ может включать анализ последовательности, рестрикционный анализ, электрофорез или т п После каждой манипуляции ДНК последовательность, которая долина быть использована в окончательной конструкции, может быть рестриктирована и соединена со следующей последовательностью, где каждая из час тайных конструкций может быть клонирована в ту же самую или в отличающуюся плазмиды Для введения ДНК в растительные клетки хозяина существует множество возможных методик Так например, химерные ДНК конструкции можно вводить в клетки хозяев, полученные из двудольных растений, например, табака, и таких масличных видов, как Brassica napus, используя стандартные Agrobactenum векторы, по такой схеме Удобно эксплантаты культивировать с А tumefaciens или A rhizogenes для того, чтобы обеспечить перенос транскрипционной конструкции в растительные клетки После трансформации с использованием Agrobactena, растительные клетки диспергируют в подходящей селективной среде для отбора, выращивают до образования каллуса, проростки и молодые растения регенерируют из каллуса, выращивая в среде для образования корней Agrobactenura хозяин будет содержать плазмиду, содержащую Vir гены, необходимые для переноса Т-ДНК в растительные клетки, и может содержать или не содержать ТДНК Для инъекциии электропорации (см далее) обезоруженные Ti-плазмиды (не содержащие опухолевых генов, особенно Т-ДНК участка) можно вводить в растительные клетки Использование не - Agrohactenum методик позволяет использовать описанные здесь конструкции для осуществления трансформации и экспрессии в широкий круг однодольных и двудольных растений Эти методики особенно подходят для таких видов, которые не дают результатов в Agrobactenum трансформационной системе Другие методики для переноса генов включают биолизис (Sanford, Trends in Bioteeh (1988) 6 299 - 302), электропорацию (Fromra et al (1985) Proc, Hat'l Acad Sci, USA 82 5824 - 5828, Riggs and Bates (1986), Proc Natl Acad Sci (USA) 83, 5602 - 5606 или захват ДНК с помощью PEG (Potrykus et al (1985), Мої Gen Genet, 199 169177) В качестве клеток хозяев можно использовать клетки любых растений, имеющих семена, причем эти клетки получают из таких частей растений, как стебли, листья, корни или семена, или соответствующих виду репродуктивных структур Клетки могут быть как выделенными клетками, так и частями растений, например, листовыми дисками В специфических применениях, таких как с Brassica napus, клетки хозяева обычно получают из семядольных петиолей, как указано Moloney et al Plant Cell Rep, (1989) 8 238 - 242) В других примерах с использованием коммерческих маслосодержащих семян, используют трансформацию семядолей в соевые эксплантаты (Hmchee et al Biotechnology, (1988) 6 915 - 922) и трансформацию стебля хлопка (Umbeck et al, Blo-technology, (1981) 5 263 -266) После трансформации клетки, например, в виде дисков листьев, выращивают на селективной среде После того, как начинают образовываться 28 27 46689 ростки, их иссекают и помещают на корнеобраферу добавляют протеазу, специфичную для зующую среду После достаточного развития корфрагмента распознавания, полученного в резульней растения переносят в почву Затем предполотате трансляции линкерной последовательности жительно трансформированные растения Это приводит к выделению целевого пептида в тестируют на присутствие маркера Осуществляют водную фазу Теперь в результате второй стадии Саузерн-блоттинг на геномной ДНК, используя центрифугирования снова получают плавающую соответствующий зонд, например, A thahana олепленку обработанных масляных тел с присоедиозиновый ген для доказательства интеграции цененными к ним протеинами, и остается водный левой последовательности в геном клетки хозяираствор целевого пептида Этот целевой пептид на можно осадить, химически модифицировать или лиофилизировать, в зависимости от предполагаеЭкспрессионную кассету обычно соединяют с мого применения маркером для селекции в растительных клетках Удобно, чтобы маркер был устойчивым к гербициВ некоторых случаях применения нет необходам, например, антибиотику, такому, как канамидимости отделять химерный протеин от протеинов цин, G418, блеомицин, гигромицин, хлорамфенимасляного тела Такие применения включают слукол и т п Конкретным используемым маркером чаи, в которых пептид слияния включает энзим, должен быть такой, который обеспечит селекцию который толерантен к N- или С-терминалъному трансформированных клеток при сравнении сметслиянию и сохраняет свою активность, такие энками, которые не содержат ДНК, которую вводили зимы могут быть использованы без дальнейшего расщепления и очистки Химерный энзим-ОВР Пептид слияния в кассете экспрессии, сконстбудет контактировать с субстратом как протеин руированной как указано ранее, экспрессируется, слияния Возможно также, при желании, провести по крайней мере, предпочтительно, в развиваюочистку энзим-ОВР протеина слияния, используя щихся семенах Соответственно, трансформироиммуно-афинную колонку, содержащую иммобиванным растениям, выращенным в соответствии с лизованные антитела с высоким титром против принятыми способами, дают возможность завяОВР (см например, Taylor et al , (1990 ранее) зать семена См например, McCormick et al Plant Cell Reports (1986) 5 8 1 - 8 4 Норзерн-блоттинг Возможно другое применение предмета изоможно вести, используя соответствующий генный бретения Так как ОВР содержат высокий процент зонд с РНК, выделенной из ткани, в которой ожипротеинов семян, оказывается возможным снабдается транскрипцій, например, в эмбрионе семедить семена для некоторых целей такими ценныни Затем размеры транскриптов можно сравнить ми свойствами, как высокое содержание лизина, с размерами, предсказанными для транскриптов метионина и т д , просто обогащая протеин слияпротеина слияния ния нужными аминокислотами Этот способ может найти применение особенно при модификации Можно вырастить два или более поколений зерновых, которые прямо или косвенно использутрансгенных растений, и либо опылить их пыльются для корда домашних животных, включая цой от того же трансформированного штамма, скот, птицу, а также для продуктов питания люлибо от других штаммов, контролируя в получендей Может оказаться возможным включать как ном гибриде нужные фенотипические характерипептид слияния, энзим, который облегчит послестики для подтверждения того, что нужные фенодующую обработку масла или муки в обычных типические характеристики стабильно процессах измельчения и экстракции семян массохраняются и наследуются, а затем семена соличных растений, например, за, счет включения бирают для того, чтобы выделить представляютермостабильного липид-модифицирующего энщий интерес пептид, или для того, чтобы получить зима, который останется активным и при повысемена, обладающие новыми фенотипическими шенных температурах измельчения, которые характеристиками обычно наблюдаются в этом процессе обработки Целевой протеин можно экстрагировать из семян, и, тем самым, удастся повысить ценность семян, которые могут быть гомо- или гетерозиготэкстрагированных триглицеридов или протеинов ными, для последующих испытаний, различными способами, которые включают использование Другие применения протеинов слияния вклюводных, забуференных экстракционных сред и чают использование их для повышения устойчиразличные способы измельчения (размалывания, вости сельскохозяйственных растений к неблагораскалывания, пульверизации) для разрушения приятным условиям Так, например, с протеином клеток семян Затем продукты экстракции можно масляного тела можно соединить инсектицидный разделить (например, центрифугированием или за протеин или часть иммуноглобулина, специфичносчет седиментации) на три фракции седимент, го для сельскохозяйственных вредителей, такую или нерастворимый осадок, водный супернатакт и как стенки клеток или мембран грибков, тем саплавающую пленку, содержащую липид хранения мым уменьшая опасность нападения на семена семян и масляные тела Эти масляные тела соконкретных вредителей растений Приводимые держат как нативные протеины масляных тел, так далее примеры представлены лишь в целях или химерные протеины масляных тел, причем полюстрации и не являются ограничивающими следние содержат чужеродные пептиды МасляЭкспериментальная часть ные тела выделяют из водорастворимых протеиПРИМЕР 1 нов и повторно суспендируют в водном буфере Экспрессия терминальных слияния чужеродЕсли в кассету экспрессии был включен линных пептидов с протеинами масляных тел кер, содержащий фрагмент распознавания проА С-терминальные слияния теазы, тогда к повторно суспендированному буГеномный клон гена протеина масляного тела, 30 29 46689 содержащий, по крайней мере ЮОЬр 5' до начала, Семенам дают вызреть (60 - 80 дней), а затем трансляции, клонируют в плазмидном векторе, собирают и измельчают в водном экстракционном способном к репликации в подходящем бактерибуфере (Taylor et al Plant a, (1990) 181 1 8 - 2 6 ) альном хозяине (например, pUC или pBR322 в Е Полученную суспензию центрифугируют при coli) Рестрикционный сайт расположен в участке, 5000xg в течение 20 минут, в результате получают кодирующем гидрофильную С-терминальную на поверхности пленку Ее снова выделяют и сусчасть гена В 19kDa OBP этот участок простираетпендируют при интенсивном встряхивании в колся обычно от кодонов 125 до конца клона Иделагеназном аналитическом буфере (Scholtissek альный рестрикционный сайт является уникальand Grosse, Gene (1988) 62 55 - 64) Добавляют ным, но это не является абсолютно необходимым 5ед коллагеназы, и суспензию инкубируют со Если в этом участке нет удобного рестрикционновстряхиванием в течение 4 часов После этого го сайта, его можно ввести за счет сайтсуспензию снова центрифугируют при 5000хд в направленного мутагенеза, по Kunkel Proc Nat'l, течение 20 минут Удаляют поверхностную пленAcad Sci USA, (1985)82 488-492 Единственным ку, и определяют содержание протеина в водной основным ограничением по встраиванию этого фазе с помощью электрофореза на SDSсайта, является то, что он должен быть располополиакриламидном геле Если обнаруживают пожен в направлении 5' от трансляционного стоп лосу приблизительно того же размера, что и нужсигнала ОВР клона ный пептид, протеин можно осадить, используя сульфат аммония, концентрированно с использоПолучив такой мутантний клон, можно полуванием ультрафильтрации или лиофилизировать чить синтетический олигонуклеотидный адаптер, который содержит кодирующую последовательВ N-терминальное слияние ность для сайта распознавания протеазы, наприГидрофильный N-терминальный конец промер, Pro-Leu-Gly-Pro или его мультимер Это сайт теинов масляных тел позволяет осуществить распознавания для протеазы коллагеназы Адапслияние пептидов с N-концом, обеспечивая при тер следует синтезировать такті образом, чтобы этом сохранение чужеродного пептида на внешобеспечить 4-основной выступ у 5' конца, совмесней поверхности масляного тела Конфигурации тимый с рестракционным сайтом 3' конца ОВР таких слияний представлены на фиг 2IB клона, 4-основной выступ у 3' конца адаптера для Такую конфигурацию молено сконструировать облегчения жирования с последовательностью, из таких же исходных материалов, что были искодирующей чужеродный пептид и дополнительпользованы для С-терминальных слияний, но неными основаниями, при необходимости, чтобы обходима идентификация удобных рестрикционобеспечить отсутствие сдвигов рамки в переходе ных сайтов вблизи начала трансляции гена между ОВР кодирующей последовательностью, протеина масляного тела Удобный сайт можно сайтом распознавания протеазы и последовасоздать для многих генов протеинов масляных тел тельностью, кодирующей чужеродный пептид без изменения в кодирующей последовательности Типичная конструкция такого слияния представза счет введения изменения одного основанім лена на фигЗ Представленный пример использусразу в направлении 5' к первому "ATG" В исслеет существующий Xhol сайт вблизи стоп кодона дованных до настоящего времени протеинах масОВР моркови (Hatzopoulos at al Plant Cell, (1990) ляных тел второй аминокислотой является ала2 457 - 467 Его переваривают и он может быть нин, кодон которого начинается с "G" Контекст лигирован с адаптером, сконструированным из последовательности представлен далее двух описанных олигонуклеотидов Этот адаптер образует прекрасный Xhol выступ на конце и не А-С переход здесь дає? заит будет нарушать трансляционной рамки Другой конец образует Ncol выступ, который выбирают 1 произвольно (подходят любые отрезки из 6 осноЗ', . , ТО Ш АСА АЇ5 GCA . . моркови ваний), ко который содержит ATG из целевого чужеродного пептида Изменение одного основания у аденина перед Окончательный продукт лигирования содер"ATG" дает в обоих случаях CCATGG , что жит, самое большее, полный ОВР ген, последовапредставляет собой Ncol сайт Таким образом тельность, кодирующую фрагмент распознавания модификация этого основания с помощью сайтколлагеназы, и участок, кодирующий целевой пепнаправленного мутагенеза по Kunkel (Proc Nat'l тид, причем все в единой считывающей рамке Acad Sci, USA, (1985) 82 488 - 492) дает возможЭтот состоящий из трех частей фрагмент клодиность подготовить этот клон для использования, руют в Agrobactenum бинарную плазмиду (Bevan предполагая, что в последовательности нет друNucl Acid Res, (1984) 12 8711 - 8721), такую как гих Ncol сайтов обычно используют для переноса чужеродной Кодирующая последовательность для чужеДНК в растения (Praley et al Proc Natl, Acad Sci родного пептида монет потребовать изменении, USA, (1983) 80 4803 - 4807), и это используют для которые обеспечат ее дотирование непосредсттрансформации семян масличных растений, таких венно по Ncol сайту Обычно это мотет потребокак рапс, используя способ Moloney et al Plant Cell вать изменения одного или двух оснований за Rep , (1989) 8 238 - 242) или аналогичную процесчет сайт-направленного мутагенеза (Kunkel, дуру Трансгенные растения могут быть получены 1985, ранее) для создания Ncol сайта около начаиз этого эксперимента по трансформации, и выла трансляции чужеродного пептида Затем этот ращены до цветения Затем получают семена пептид иссекают из его вектора клонирования, растения в результате самоопыления используя Ncol и второй энзим, который разрезает 31 3 ' . . . 1С 5СА АСААШ GCA GAA CGA GGO АСї Ш .. . . , изменить мутацией на Над! 3' ... ТСТСААСА АТй Такое изменение одного кодона позволяет ввести Sphi сайт в кодирующую последовательность Второе изменение, которое можно осуществить в том же цикле мутагенеза, превращает два основания в кодоне 6 до получения GGC, GCC, что представляет Narl сайт Этот полученный в результате мутации ген можно затем раскрыть SphI и Narl до получения отрезка прямого клонирования, который исключает три кодона В этот сайт можно ввести адаптор, содержащий 3' выступ с последовательностью CATG (совместимую с SphI) go 5' выступ с противоположного конца Точная последовательность этого адаптера представлена далее SphI GTACG 32 Этот модифицированный ген вводят в бинарную Agrobactenum плазмиду (Bevan, (1984, ранее) и мобилизуют в Agrobactenum Трансформации осуществляют в соответствии с вышеприведенным описанием Выделение ценного пептида из семян осуществляют по способу, описанному в разделе "С-терминальные слияния" С Внутренние трансляционные слияния Третий тип слияний включает помещение кодирующей ценный пептид последовательности внутрь кодирующей последовательности ОВР Этот тип слияния требует той же стратегии, что и N-терминальное слияние, но может быть функциональным лишь при модификациях в участках с низкой консервативностью, так как считают, что участки с высокой степенью консервативности в этих ОВР существенны для обеспечения направленной доставки зрелого протеина Ключевое отличие в этом типе слияния состоит в необходимости фланкирующих сайтов распознавания коллагеназы для высвобождения протеина Это означает, что вместо стандартной коллагеиазной системы линкер/адаптер, описанной ранее, необходимо иметь линкер следующего вида 46689 вблизи остановки трансляции мишени И снова, используя описанный ранее способ, второй удобный сайт можно ввести за счет сайтнаправленного мутагенеза Было предположено, Qu and Huang (1990, ранее), что N-терминальный метионин может быть удален в процессинге протеина in vivo, и что аланин, который следует непосредственно в прямом направлении от него, гложет быть ацилирован Чтобы учесть эту возможность, монет оказаться необходимым сохранить последовательность Met-Ala no Nтерминальному концу протеина Это легко осуществить, используя различные стратегии введения удобного рестрикционного сайта в кодирующую последовательность в Ala кодон или после него Так например, за счет сайт-направленного мутагенеза последовательность можно модифицировать следующим образом п раз CCG- СТО GGO GAG CCG Иагі GG CCGC Этот адаптер будет воссоздавать как SphI так и Narl рестрикционные сайты, которые можно использовать для диагностических целей SphI сайт теперь можно использовать для раскрытия плазмиды и клона в рамке ДНК фрагмента, содержащего последовательность для нужного пептида Затем следует проанализировать ориентацию клонирования за счет нарезания по любым несимметрично расположенным сайтам и Narl плазмиды Полученные из этих N-терминальных слияний конструкции могут быть типичными примерами IB фиг 2 Они должны содержать ОВР промоторную последовательность в первых нескольких кодонах ОВР гена, представляющего высокую ценность пептида с его собстввенной ATG в качестве стартового сигнала при необходимости, и остальную часть ОВР гена и терминатор Лгакай ОТО РестршсЦЕОННЫЙ сайт CCS CK конец Z Липкие концы I и 2 будут использованы для клонирования адаптера в ОВР клон непосредственно Затем встроенный рестрикционный сайт используют для введения последовательности, кодирующей ценный пептид, фланкированный рестрикционными сайтами или линкерами Ориентацию контролируют, используя ассиметрично расположенный рестрикционный сайт в последовательности, кодирующей ценный пептид и один из двух рестрикционных сайтов, фланкирующих последовательность, кодирующую фрагмент распознавания коллагеназы Мобилизация этих конструкций в Agrobactenum плазмиды, а затем в растения идентична ранее описанной процедуре Выделение ценного протеина из семян трансгенных растений несколько отличается тем, что после того, как масляные тела выделяют и промывают, может понадобиться удалить липиды с масляных тел для того, чтобы сделать доступными сайты распознавания коллагеназы, которые могут быть спрятаны внутри масляных тел в липидной фазе Эта стадия может уменьшить некоторые преимущества использования протеинов масляных тел в качестве носителей, но может, с другой стороны, оказаться очень удобной для последовательностей протеинов, которые лабильны в водной среде или в растительных цитоплазмах Д Интердимерные трансляционные слияния Возможно, создать конструкцию, в которой целиком повторяется кодирующая последовательность ОВР Димерный протеин, получаемый из такой конструкции, может все еще содержать все необходимые факторы для обеспечения направленной доставки ОВР к масляным телам Та 33 34 46689 кая конструкция должна содержать промоторныи участок, полную или почти полную открытую рамку считывания для ОВР, но без остановки трансляции, и затем полную открытую считывающую рамку второго ОВР, на этот раз укомплектованного трансляционным "стоп" и терминаторным участком При конструировании этого химерного гена пару различающихся рестрикционных сайтов либо находят, либо создают в участке соединения этих двух копий Эти сайты используют для обеспечения возможности введения такого линкера, как описанный ранее для внутренних трансляционных слияний Линкеры содержат не только наборы фрагментов распознавания коллагеназы, но также внутренний рестрикционныи сайт, в который вставляют последовательность, кодирующую представляющий высокую ценность протеин Форма такой конструкции представлена на фиг 2111 Введение этой конструкции в Agrobactenum, а затем в растения осуществляется описанным ранее способом Выделение представляющего высокую ценность протеина из семян трансформированных растений осуществляют по способу, описанному ранее для процедуры С-терминального слияния результате скринирования получают выделенный EMBL3A клон (Я.2 1), содержащий 15kb геномный фрагмент из A thahana Олеозин картируют внутри 6,6kb Kpnl вставки, внутри этого 15kb фрагмента (фиг 5) 1,8kb Ncol/Kpn1 фрагмент, содержащий ген олеозина, шлеет тупой конец, и его субклонируют в Smal сайт RFM13mp19 1,8kb вставку переваривают подходящими рестракционными энзимами и субклонируют в М13тр19 для секвенирования Последовательность 1800kb гена олеозина A thahana представлен на фиг 1а Все процедуры копирования осуществляют по Sambrook et al , (1989) (Molecular Cloning A laboratory manual 2nd ed Cold Spring Harbor Laboratory Press) В Конструирование олигонуклеотида, кодирующего IL-1-p IL-1-p состоит из 9 аминокислот (аа), val-glngly-glu-glu-ser-asn-asp-lys (Antoni et al , (1986) J Immunol 137 3201-3204) Протеазный фактор Ха может расщепить последовательность протеина, которая содержит последовательность аминокислот ile-glu-gly-arg Расщепление происходит после аминокислоты arg На основании этих последовательностей конструируют олигонуклеотид (GVRII, фиг 5), который содержит дополнительно к IL-1-p кодирующей последовательности, кодирующую последовательность для сайта расщепления фактора Ха, и 18 нуклеотидов 3' кодирующего участка A thahana олеозина (положения оснований 742 759) Сконструирована IL-1-p кодирующая последовательность, используя оптимальное использование кодона для В napus и A thahana олеозина (таблица I) ПРИМЕР 2 Стратегия клонирования и экспрессии Интерлейкина-1-р (IL-1-p) в результате слияния с олеозинами в растениях А Клонирование и секвенирование гена олеозина Arabidopsis thahana Ген олеозина Brassica napus (Murphy et al , (1991) Biochim Biophys Acta 1088 86 - 94) используют для скринирования геномной библиотеки А thahana(cv Columbia) в EMBL3A (Stratagene) В І Таблица 1 использование ЕоааноБ . k. ЛІ an 3 И В иеркіолеозшов тта phe т с phe т TTA leu F F L TTG leu L СТТ СТС СТА CTG 5 3 _ 4 leu L 10 leu L XI Деи ь _ leu L 6 АТТ ile АТС ile АТА ile ATG mat GTT val GTC val GTA val GTG val I 7 1 13 I 3 M 11 V 11 V 9 V V TCT ser S 8 TCC ser S 10 TCC ser s 2 TGA ser s TAT TAC TAA TAG OCH AMB Z CCT pro p pro ccc pro p CCA p CCG pro p CAT CAC CAA CAG his his gin gin 2 W 2 ACT thr T 11 ДАТ SLBn К ^ AGT ser S ACC thr T 14 AAC sun N 1 AGC ser s АСА thr Y 7 AAA lys К 5 AGA arg R ACG thr T 5 AAG lys К 10 AGG arg R 5 3 5 3 GCT GCC GCA GCG 0 9 GAT asp GAC asp GAA glu GAG gly D 8 D 19 Б 2 E 2 GGT gly G GGC gly G GGA G 14 GGG giy G 5 1 „ _„э...,. . . СУ. сдлп. 1А 2 Lee and Huang (1391) Plant Physical 96i С Создание A Thahana олеозин IL-1-p слияния На основании последовательности 5 CACACCAGGAACTCTCTGGTAAGC3 (положение оснований - 638 до - 814), олигонуклеотид GVR10 5 CACTGCAGGAACTCTCTGGTAAGC3 был сконструирован с с 2 6 1 A 17 A 2 A 10 A 2 H 4 H 6 0 4 Q 17 TCT cys TGC cys TGA OPA TGG trp CGT arg R CGC arg R CGA arg R CGG arg R ala ala ala ala 3 1 4 2 tyr У 6 tyr У 11 GVR10 содержит Pst1 1395-1397. рестрикционныи сайт (подчеркнут) для облегчения клонирования Полимеразная цепная реакция (PCR) была использована для амплификации участка между GVR10 и GVR11 Реакционная смесь содержит 16мкл dNTPs (1,25мМ), Юмкл 10Х PCR буфер (ЮОмМ Tns-HCI рН8,3, 500мМ, KCI, 15мМ 36 35 46689 MgCb, 0,1% (вес/объем) желатин, 5мкл Ь^О Реактем листья 6 раз промывают стерильной водой цию ведут в течение ЗО циклов Каждый цикл Края листьев, а также среднюю жилку иссекают, а включает 1 минуту дешифрирования при 92°С, 1 остальную часть листовой пластины нарезают на минуту отжига при 45°С и 3 минуты удлинения при квадраты 5 х 7мм или диски диаметром 5мм Со72°С В результате реакции PCR получают один бирают около 30 листовых дисков и помещают в фрагмент длиной 1652 нуклеотида небольшую чашку Петри Затем на диски выливают раствор Agrobactenum и инкубируют в течение Д Клонирование A thahana олеозин-И-1-р (OBPIL) слияния 9 минут Затем осуществляют блоттинг на стерильной Ватманской фильтровальной бумаге, и б'ЭаП-нопалин-синтетазную (nos) помещают плоской стороной вниз на среду I (MS, термшаторную EcoRI 3' последовательность вы3% сахарозы и 2мг/л 2,4-Д) Такое совместное деляют из рВИ 21 (Clontech laboratories) и клоникультивирование ведут в течение последующих 48 руют в Sal/EcoRI сайты pUC19 Плазмиду называчасов В этот момент диски листьев переносят на ют pTerm Фрагмент 1652Ьр (описан в разделе С) селекционную среду (MD, 3% сахарозы, 2,5мг/л выделяют и переваривают рестрикционными энВа, 0,1 мг/1 NAA, 500мг/л карбеницциллина и зимами Pstl и Sail Этот фрагмент клонируют в 100мг/л канамицина), где и оставляют затем на 3 pTerm Полученную плазмиду называют 4 недели После появления проростков их иссеpUCOBPILT (фиг 5) Эту плазмиду переваривают кают и помещают на корнеобразующую среду EeoRI и Pstl, и получают в переваре pUC19 вектор (MS, 3% сахарозы, 0,1 мг/І Naa, 500мг/л карбении EcoRI-A thahana олеозин-IL-i-p-nos-Pstl слитый циллина и 50мг/л канамицина) После образоваPstl (OBPILT) Полная последовательность ОВния достаточной корневой системы растения таPILT представлена на фиг 7 OBPILT субклонирубака переносят в почву ют в EcoRI/Pstl сайты pBluescnpt+ Эту плазмиду (pBIOBPILT) переваривают Pstl и Hmdlll, и фрагН Трансфорлация В napus с помощью мент Pstl-OBPILT-Hmdlll субклонируют в бинарную pCGOBPILT Argobactenum плазмиду (Bm19) (Bevan, M , (1984) Трансформация на В napus ведут по способу Nucl Acid Res 12 8711 - 8721), содержащую сеMoloney et al , (1989) Plant Cell Kep , 8 238 - 242 лекционный маркер (неомицинфосфотрансфера(включено сюда по ссылке) зу) и Psti-Hmdlll уникальные сайты Полученную Процедура трансформации плазмиду называют pCGOBPILT Схема процедуОтдельные колонии Agrobactenum tumefaciens ры клонирования представлена на фиг 5 Для штамма EYA101, содержащие бинарную плазмиописания различных бинарных плазмид смотри ду, выращивают в течение ночи при 28°С на АВ pGA642 или 645, An et al (1985) EMBO J 4 277 среде Образец 50мкл надосадочной жидкости 288 или pCGN1558 или 1559, MacBnde and Sumэтой среды выращивают в течение ночи при 28°С merfeldt (1990) Plant Molec Biol 14 269-276 в 5мл бульона MG/L, дополненного соответствующими антибиотиками Эту бактериальную сусP Трансформация pCGOBPILT в Agrobacteпензию осаждают центрифугированием в течение num штамм ЕНА101 15 минут при ЮОООхд, затем повторно суспендиОтдельную ЕНА101 колонию (Hood et al , руют в 10мл MS среды, содержащей 3% сахарозы (1986) J Bact 168 1291 - 1301) используют для при рН5,8 Тонкую пленку этой суспензии испольтого, чтобы инокулировать 5мл LB + 100мкг/мл зуют для выстилания дна чашки Петри диаметром канамицина Эту культуру выращивают в течение 5см Отдельные вырезанные семядоли берут с 48 часов при 28°С 5мл этой культуры используют описанных ранее пластин и срезанную поверхдля инокулирования 500мл LB + 100мкг/мл кананость их петиолеи погружают в эту бактериальную мицина Эту культуру выращивают при 28°С до суспензию на несколько секунд Их немедленно тех пор, пока, плотность культуры не достигает возвращают на те же самые MS пластины, с котоОД600 = 0,5 (приблизительно 4 часа) В результарых их взяли Семядоли культивируют совместно те центрифугирования клетки осаждают (Юмин, с Agrobactenura в течение 72 часов, при этом не 5000хд), и снова суспендируют в 500мл стерильиспользуют питательных слоев ной НгО (повторяют 2 раза) Клетки снова центрифугируют и снова суспендируют в Змл стеПосле совместного культивирования семядорильной НгО, содержащей 10% глицерина ли переносят на регенерационную среду, содерАликвоты по 40мкл помещают в ампулы Эппенжащую MS среду, дополненную 20мкМ бензиладорфа, и либо непосредственно используют для денина, 3% сахарозы, 0,7% фитагара, рН5,8 и электропорации, либо хранят при - 80°С до даль500мг/л карбенициллина (Pyopen, Ayerst) и 15мг/л нейшего использования Электропорацию осущеканамицин-сульфата (Boehnnger-Mannheim) Сноствляют по способу Bower et al, Nucl Acid, Res ва петиоли осторожно вставляют в агар на глуби(1888) 16 6127 - 6145 Мощность импульсного гену 2мм Плотность растений поддерживают около нератора устанавливают 25мкФ, 2,5кВ и 200ом 10 эксплантатов на пластину Более высокая параллельно с камерой образца плотность снижает регенерируемоемость G Трансформация Niootma tabacum (табак) с Отбор и регенерация растений помощью pCGOBPILT Эксплантаты выдерживают на регенерационной среде в специфических условиях освещенноДля трансформации дисков листьев табака сти и температуры в течение 2 - 3 недель За это используют ЕНА101, содержащий pCGOBPILT время более чем на половине эксплантатов появЛистья табака длиной 8 - 10см берут с растений, ляются ростки при относительно небольшом обрастущих в оранжерее, стерилизуют в 70% этаноразовании каллуса Некоторые из этих ростков ле в течение 20 секунд, а затем в 10% хлорной обесцвечиваются к четвертой неделе культивироизвести (например, Javex) в течение 8 минут За 38 37 46689 вания Оставшиеся зеленые ростки субкультивиниях табака РЖ выделяют из развивающихся эмруют на среде для удлинения корней, которая брионов, полученных из трансформированных и представляет собой регенерационную среду, но нетрансформированных растений Нозернбез бензиладенина Одна-две недели на этой блоттинг осуществляют, используя A thahana среде обеспечивают установление апикального олеозин в качестве генного зонда Во всех тестидоминирования из образовавшихся ростковых рованных трансформированных растениях можно кластеров Полученные таким образом ростки пеобнаружить 850-нуклеотвдный транскрипт Размереносят на "корнеобразующую" среду, содержары этих транскриптов соответствуют ожидаемым щую MS среду, 3% сахарозы, 2мг/л индолмасляразмерам мРНК олеозин-IL-l-p Эти транскрипты ной кислоты, 0,7% фитагара и 500мг/л обнаруживаются в не трансформированных раскарбенициллина На этой стадии не используют тениях канамицин, так как было обнаружено, что без сеК Накопление олеозин- IL-1-p протеина лектирующего агента происходит более быстрое Протеины масляных тел выделяют из транскорнеобразование, тогда как очень мало "промаформированных сеыян табака (Holbrook et al , хов" реально наблюдается на корнеобразовании (1991) Plant Physical 97 1051 - 1058 Осуществляпосле двух раундов отбора на регенерационнои и ют PAGE, и протеин переносят из геля на PVDF удлиняющей корни среде мембраны Для определения слияния олеозин-ILl-p в семенах табака используют антитела, котоI Стабильная интеграция OBPILT в геномы рые вырабатываются против 22кДа олеозина В табака и В napus napus Эти антитела распознают все основные Предположительно трансформированные олеозины в В napus и A thahana Кроме того, эти растения тестируют на активность неомицинантитела распознают олеозины табака Олеозины фосфотрансферазы Выделяют геномную ДНК из табака имеют размеры, отличающиеся от олеозирастений, демонстрирующих такую активность нов A thahana и В napus В трансформированных Саузерн-блоттинг осуществляют для демонстрасеменах табака анти-22кДа анитела распознают ции того, что последовательности между Т-ДНК 20кДа - протеин, который отсутствует в семенах границами (OBPILT и геном неомициннетрансформированных растений Предсказанный фосфотрансферазы) стабильно интегрированы в размер олеозин-IL-l-p слияния составляет геномы В napus и табака Саузерн табака зонди20,1 кДа Полученные результаты представлены в руют A Thahana олеозиновнм геном, а геном нетаблице 2 омицин-фосфотрансферазы, В napus Саузерн зондируют геном неомицин-фосфотрансферазы J Экспрессия олеозин-IL-l-p слияния в расте Таблица 2 Результаты экспрессии*^ Стабильная Экспрессия интеграция олеозинТТ—1 _ Р. Саузернило ттннг Нозернблоттжнг I 3 2 В. napus Определение 20 кДа протеина Веотерн-блоттшг 4 ; не траноформзнровано трансфоіиант В 12 I Табак: не трансформировано трансуормант А транспортант В трансформант G трансформант L НО! * 2 3 4 39 40 46689 *) Стабильная интеграция, определенная кар, описано в I Экспрессию олеозин-IL-l-p слияния определяют по способу J Детектирование предполагаемого протеина слияния олеозин-IL-l-p ведут по способу К NT = не тестировали За счет экспрессии представляющего интерес пептида, коньюгированного с протеином масляного тела, или его частью, достаточной для обеспечения его направленного транспорта к масляным телам, представляющий интерес пептид можно легко очистить, то есть, практически отделить его от других клеточных компонентов Протеин слия ния можно расщепить после очистки, или его можно использовать далее без расщепления Рассматриваемые способы и композиции обеспечивают быстрый, простой способ очистки представляющего интерес полипептида Все публикации и патентные заявки, указанные в этом описании, включены сюда по ссылке Далее настоящее изобретение раскрыто полностью, но специалистам должно быть ясно, что не выходя за рамки объема и сути прилагаемой формулы изобретения можно осуществить множество измерений и модификаций ПТСГМ -77 7 7ЛГггіссаігіссттсссс^ -5Э7 Ь.СЇС^ССАСЛАлгз^мГСССй^іїщй'-ї, -IDT -(it 7 rJ£T -2з Ї -1*7 ГГТС™ААГЛЇЛТСТААСЛАЛГиС^^ Л А Й ТлЄтАЛлсліиїад[^іААіииитИМ b 2Н b V t S S L T Т А К С b V e r Г y Jf Я D i A L v - £ A L I T V i l J ; i l T C f L S 3 3+ г т • АС7ЛСТ7ЛЛЕТТ ЛСССС К-ІС АГ Г; It; Д Ї С ТГЛ5ГТ7 AT= fo.i[ Фиг. 1а 41 carrot 19КШ Name ISKOa Maize 16KDa •Arab. 17KDa 42 46689 MA£TCTXAiSQVQVHPQQT./lKQPGGVKS LIPKNSPSTEQV MADRDRSGIYGGAHATVGQQQQQGGGGR1?MGCQVKKG MLIiDKGPTnSQA RGGGGYGDUJKG QQQQKQGAKMTA MMGRDRDQYQHS G FSPVLVPAALTIGLAVTGFLGSGAFGLTGLSSLSWVbS-YP LTVATbFPLGGLLbVSGIAI-TASVVeLAVATPVFLIF AKAATAVTAGGSLLVLLSLTLVGTVIAI.TVATPt.LVI N-концевой гидрофильный домен 1 Центральный гидрофильный домен ~ Интрон присоединения сайта RQASQRVPDOIELAKKryiQAMAAVAGQKTKEVGDTIQSKAJlQflQDraATTGRDTRSTAKDTSRT RQArQRT?DYVEEARIUU.iAEAAAQAGHKTAQAGQAIQGRAQEAGTGGGAGRASS TGKBPPGADQLDI1 ДКАКІЛЗКЛДОІКОАДд !!ЙІ DQAQGS С-концевой амфипатический домен Фиг, 1Ь Конструируют лигирующий ген, используя протезэкую (например колпагенаэную) мишень шона мотав-кодирующих линкеров в Е Coh совместимой плазмвде Вставляют (инсертируют) конструкцию в релликон широкого круга хозяев, содержащий Т-ДНК границы (т е агробактериальный бинарный вегсор) Трансформируют клетки растения, «сполмуя листья стебли, семядольные или черешковые трансплантанты Регенерируют тран стен мые растения •ТШТч Позволяют выделить семя Гомогенизируют семя в водном экстрагируккцем буфере (Тауіог и Др , 1990) Центрифугируют или те отделяют масляные тала Суспендируют промытые масляные тела в буфер коллагеназы для анализа н добавляют 5 единиц очищенной коллагенззы Фиг. 2 Центрифугируют для отделения остаточных масляных тел Xho ї AGC ACT GCT CGA GAC ftCT ГСА AGG ACT МорКОВИ ОВР (CM Nafeopoutas See Thr Ala Arg Asp Thar Ser Srg Thr 3"..AGC ACT GC n TCGA раз мес CCG CTC GGT CCG GC GGC GAG CCA GGC CGGTAC Выделяют освобожденный пептид из проте азы путем обработки осадка сульфатом аммония, хроматографированиш на июне и т д TCG 1'GA CGAGC7 Era Фиг. 3 Leu G l y P r o Когшагеназа узнающий мотив Проводят биологический анализ на выделенном рекомбинантном пептиде Фиг. 4 44 46689 43 СП Е^д ШШ %723 ES5I Ояеозин промотор Ояесшм кодирующая последовательность Интрон 3 нетрансяированная последовательность ij-1 в последовательность Субклон Psti-oSPIl-Sall Hind Я ті(о рТ І Субклои H/ridB -ОЗРІіТ'ессЯІ в окрашенном голубом Sphl Pstl ' /W Sell /f**l pBLOBPILT IL h С^кпон -fis/'/в бинарной плаамаде Pali }—a, Устойчивость к канамиі^іну ILl-p Терн pCGOBPILT Фиг. 5 Интерлейкин а) g v r l l (71-мєр) Д. thala-апз oleosin А талиан олеозин Factor ^3 Фактор Ха gly gly gin his thr thr ala ile glu gly arg val gin gly glu glu aer asn asp lys OCH val asp GGT GGC CAG СДС ACT ACT GCT АТС G&A GGG AGA GTT CAG Pvul GGA GAA GAA TCT AAC GhC AAG ХЯА GTC GAC GG Sail b) 3'CCA CCG GTC GTG TGA TGA CGC TAG CTT CCC TCT CAA G1 CCT CTT CTT AGA TTG CTG TTC ATT CAG C T G C C 5 ' Фиг. 6 * 45 46689 46 PstI CACTGCAGGAACTCTCTGGTAAGCTAGCTCCACTCCCCAGAAACAACCGGCGCCAAATTGCC GGAATTGCT GACCTGAAGACGGAACATCATCGTCGGGTCCTTGGGCGATTGCGGCGGAAGATGGGTCAGCT TGGGCTTGAG G ACGAGAC С CGAATC GAGTC TGTTGAAAGGTTGTTC ATTGGGATTGTATACGGAGATTGGTC GTCGAGAGG TTTGAGGGAAAGGACAAATGGGTTTGGCTCTGGAGAAAGAGAGTGCGGCTTTAGAGAGAGAA TTGAGAGGTT TAGAGAGAGATGCGGC GGCGATG AC GGGAGGAGAGACGAC GAGGACCTGC ATTATC AAAGCA GTGACGTGGT GAAATTTGGAACTTTTAAGAGGCAGATAGATTTATTATTTGTATCCATTTTCTTCATTGTTC TAGAATGTCG С GGAAC AAATTTTAAAACTAAATCC TAAATTTTTCTAATTTTGTTGC CAATAGTGGATATGT GGGCCGTATA GAAGGAATCTATTGAAGGCCCAAACCCATACTGACGAGCCCAAAGGTTCGTTTTGCGTTTTA TGTTTCGGTT CGATGCCAACGCCACATTCTGAGCTAGGCAAAAAACAAACGTGTCTTTGAATAGACTCCTCT CGTTAACACA TGCAGCGGCTGCATGGTGACGCCATTAACACGTGGCCTACAATTGCATGATGTCTCCATTGA CACGTGACTT CTCGTCTCCTTTCTTAATATATCTAACAAACACTCCTACCTCTTCCAAAATATATACACATC TTTTTGATCA ATCTCTCATTCAAAATCTCATTCTCTCTAGTAAACAAGAACAAAAAAATGGCGGATACAGCT AGAGGAACCC ATCACGATATCATCGGCAGAGACCAGTACCCGATGATGGGCCGAGACCGAGACCAGTACCAG ATGTCCGGAC GAGGATCTGACTACTCCAAGTCTAGGCAGATTGCTAAAGCTGCAACTGCTGTCACAGCTGGT GGTTCCCTCC TTGTTCTCTCCAGCCTTACCCTTGTTGGAACTGTCATAGCTTTGACTGTTGCAACACCTCTG CTCGTTATCT TCAGCCCAATCCTTGTC С CGGCTCTCATCACAGTTGC ACTC CTCATCACC GGTTTTCTTTCC TCTGGAGGGT TTGGCATTGCCGCTATAACCGTTTTCTCTTGGATTTACAAGTAAGCACACATTTATCATCTT ACTTCATAAT TTTGTGCAATATGTGCATGCATGTGTTGAGCCAGTAGCTTTGGATCAATTTTTTTGGTCGAA TAACAAATGT AACAATAAGAAATTGCAAATTCTAGGGAACATTTGGTTAACTAAATACGAAATTTGACCTAG CTAGCTTGAA TGTGTCTGTGTATATCATCTATATAGGTAAAATGCTTGGTATGATACCTATTGATTGTGAAT AGGTACGCAA CGGGAGAGCACCCACAGGGATCAGACAAGTTGGACAGTGCAAGGATGAAGTTGGGAAGCAAA GCTCAGGATC TGAAAGACAGAGCTCAGTACTACGGACAGCAACATACTGGTTGGGAACATGACCGTGACCGT ACTCGTGGTG GCCAGCACACTACTGCGATCGAAGGGAGAGTTCAGGGAGAAGAATCTAACGACAAGTAAGTC GACTCTAG ACGGATCTCCCgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatg acgttattta tgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaa atatagcgcg caaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcGGAATTC EcoRI Фиг. 7 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044)456-20- 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71